JP2023541809A - 一炭素基質での合成的増殖 - Google Patents

一炭素基質での合成的増殖 Download PDF

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Abstract

多くのバイオテクノロジー関連生物は、安価で豊富な一炭素原料、例えば、ＣＯ２、ＣＯ、ホルムアルデヒド、メタノール、及びメタンを増殖に利用できず、代わりに糖などの複雑な原料を優先する。ホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して、生物が増殖及び維持のために１つの炭素分子を消費可能とする系を開示する。一炭素原料の利用は、バイオテクノロジー用途において生物を培養する主な手段としての糖の利用と置換できる。これにより、費用対効果が高くなり、論争を引き起こす原料としての食品の使用を回避し得る。ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の中間体もまた、所望の化学産物に変換され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７０，４６４号に関連し、優先権を主張し、全ての目的のために参照により本明細書に援用する。
一炭素（one-carbon）（Ｃ１）化合物は、化学産業にとって可能性のある低コストで豊富な原料を代表するものである（Ｄｕｒｒｅ， Ｐ． ＆ Ｅｉｋｍａｎｎｓ， ＢＪ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３５：６３－７２ （２０１５））。これらの原料はしばしば希薄かつ分散する性質があるため、生化学プロセスは、現在の化学技術が制限されている方法でより低い資本的支出（ＣａｐＥｘ）及び分散製造を可能にすることにより、Ｃ１利用のための効果的な技術になる可能性がある（Ｃｌｏｍｂｕｒｇ， ＪＭ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５：ａａｇ０８０４ （２０１７））。Ｃ１分子は増殖のために生物学によって効果的に利用可能であるが、Ｃ１基質からの様々な工業用化学物質の効率的な生物学的生成は依然として未解決の課題である。
天然（Ｂａｒ－Ｅｖｅｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． ６３：２３２５－４２ （２０１２）； Ｋａｌｙｕｚｈｎａｙａ， ＭＧ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇ． ２９：１４２－１５２ （２０１５））及び合成（Ｂｏｇｏｒａｄ， Ｉ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１１：１５９２８－３３ （２０１４）； Ｓｉｅｇｅｌ， Ｊ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １１２： ３７０４－３７０９ （２０１５）； Ｓｃｈｗａｎｄｅｒ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５４：９００－９０４ （２０１６）； Ｌｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０： １３７８ （２０１９）； Ｋｉｍ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １６：５３８－５４５ （２０２０））の両方の経路を含むＣ１基質からの生物学的産物合成へのアプローチは、共通の代謝構造を共有する傾向がある（図１Ａ）。様々な還元レベルのＣ１分子が最初に同化され、Ｃ２及びＣ３中心代謝物質が生成される。これらのＣ２／Ｃ３代謝物質は、産物合成経路の前駆体であるか、又は中央代謝経路を介してさらに変換されて前記前駆体を生成するかのいずれかである。その結果、炭素同化経路、中央代謝経路、及び産物合成経路を同時に改変して、標的化学物質の効果的な生産を可能にする必要性がある。しかしながら、概念的には、このアーキテクチャはＣ１分子からの化学的生成に必ずしも必要なものではない。炭素－炭素結合を保存する利点がある複数炭素基質の利用とは異なり、Ｃ１分子から開始する場合、全ての炭素－炭素結合を新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）で作成する必要がある。したがって、原則として、複数炭素単位を最初に生成するというさらなる複雑さを伴わずに、Ｃ１の「ビルディングブロック」を使用して、Ｃ１分子から多様な化学産物を構築できるはずである。
Ｃ１原料に基づく燃料及び化学物質の生産は有望であるが、重大な課題がＣ１生物変換（バイオコンバージョン）のための効率的な生体触媒の実装を妨げている。多くのバイオテクノロジー関連生物は、安価で豊富な一炭素原料（one carbon feedstocks）（例えば、ＣＯ２やメタン）を増殖に利用できず、代わりに糖などの複雑な原料を優先する。
本明細書に開示されるように、ホルミル－ＣｏＡは、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ（ＨＡＣＬ）又はオキサリル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＯＸＣ）によって触媒される反応において、Ｃ１ビルディングブロック又は伸長単位として機能することができ、生物が増殖のためにＣ１供給原料を利用することを可能にし、上記の生物を培養するためのより費用対効果の高い方法をもたらす。本明細書でホルミル－ＣｏＡ伸長（ＦＯＲＣＥ）経路と称されるこれらの経路は、生体触媒の増殖又は維持のための増殖基質の生成及び最終的には生化学的産物の合成に使用することができる。いくつかの実施形態では、開示されたＦＯＲＣＥ経路は、Ｃ２基質、Ｃ３基質、Ｃ４基質、Ｃ５基質、Ｃ６基質などの複数炭素基質と共に使用され得る。例えば、複数炭素共基質は、例えば、糖（例えば、グルコース）、グリセロール、アセテート（acetate）、及び脂肪酸を含み得る。
したがって、本明細書において、増殖のためにＣ１基質を本来利用することはできないが（すなわち、従属栄養生物）、利用可能となるよう改変された微生物が開示される。メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ）、フォルマトトローフ（ｆｏｒｍａｔｏｔｒｏｐｈｓ）、又はオートトロフ（ａｕｔｏｔｒｏｐｈｓ）のいずれかとして称されるこれらの生物の改変には、一炭素基質（single carbon substrate）をホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドに変換する第１の代謝酵素のセット、及び代謝酵素が複数炭素天然基質又は代謝物質を生成するのに適した条件下でＣ１基質を前記系に供給する、アルドース又はアルデヒドをホルミル－ＣｏＡ分子で伸長する第２の代謝酵素のセット、並びに、任意選択的に（optionally）、基質又は代謝物質を所望の複数炭素化学物質に変換するための第３の代謝酵素のセットを含む細胞系を提供することが含まれる。
本明細書において、増殖及び産物合成のために一炭素（Ｃ１）基質を利用可能な非天然微生物系が開示される。前記非天然微生物系は、前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする第１の核酸のセット、並びにホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドを、増殖を可能にする天然の複数炭素基質又は代謝物質に変換する酵素をコードする第２の核酸のセットを含み得る。
本明細書には、代謝改変微生物（metabolically engineered microorganism）がさらに開示される。代謝改変微生物は、一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換するための代謝酵素をコードする第１の核酸のセット、及び前記ホルミル－ＣｏＡを伸長単位として使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長するための代謝酵素をコードする第２の核酸のセットを含み得る。
また、一炭素基質を用いて微生物を培養する方法が本明細書に開示される。前記方法は、前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換するための代謝酵素をコードする第１の核酸のセット、及び前記ホルミル－ＣｏＡを伸長単位として使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長するための代謝酵素をコードする第２の核酸のセットを前記微生物に与えることを含み得る。前記方法は、さらに、前記一炭素基質を含む増殖培地で前記微生物を培養することを含み得る。前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体が、前記微生物の増殖基質又は増殖基質の前駆体として機能し得る。
さらに、一炭素基質からの化学産物合成方法が本明細書に開示される。前記方法は、前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換するための代謝酵素をコードする第１の核酸のセット、及び前記ホルミル－ＣｏＡを伸長単位として使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長するための代謝酵素をコードする第２の核酸のセットを微生物に与えることを含み得る。前記方法は、前記微生物に前記一炭素基質を供給することを含み得る。前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体が、化学産物であり得るか、又は化学産物の前駆体として機能し得る。
また、一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換するための第１の代謝酵素のセット、及び前記ホルミル－ＣｏＡを伸長単位として使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長するための第２の代謝酵素のセットを含む無細胞系（cell-free system）が本明細書に開示される。
また、二株微生物系（two-strain microorganism system）が本明細書に開示される。前記二株微生物系は、一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する１又は複数の第１の代謝酵素をコードする核酸と、前記ホルミルＣｏＡからグリコレート（glycolate）を生成する１又は複数の第２の代謝酵素をコードする核酸とを含む第１の微生物を含み得る。前記第１の微生物はグリコレート（glycolate）を消費して増殖しなくてもよい。前記二株微生物系は、前記第１の代謝酵素をコードする核酸と前記第２の代謝酵素をコードする核酸とを欠く第２の微生物をさらに含み得る。前記第２の微生物はグリコレート（glycolate）を消費して増殖しなくてもよい。前記一炭素基質を含有する培地中で、前記第１の微生物及び前記第２の微生物を共培養すると、第２の微生物が増殖することとなり得る。
本発明の１又は複数の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、前記説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
図１は、Ｃ１基質からの産物合成のためのＦＯＲＣＥ経路を示した図である。ａ）ホルミル－ＣｏＡ伸長（ｆｏｒｍｙｌ－ＣｏＡ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ（ＦＯＲＣＥ））経路に基づくＣ１利用のための合成的直交アーキテクチャ。炭素骨格は、活性化Ｃ１単位からホルミル－ＣｏＡの形態で直接構築されるため、産物合成の代謝の「ボウタイ（蝶ネクタイ型）」アーキテクチャをバイパスする。ｂ）一炭素基質は、様々な酸化還元反応を介してＣ１伸長単位ホルミル－ＣｏＡに活性化される（青色ボックス）。ホルミル－ＣｏＡは、ＨＡＣＬによって触媒される反応でアルデヒドを伸長する働きをし、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを生成する。２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡは、さらに還元されて２－ヒドロキシアルデヒドになる場合がある。２－ヒドロキシアルデヒドは、ホルミル－ＣｏＡによってさらに伸長される場合があり、これをアルドース伸長と称する。あるいは、α－還元は、１，２－ジオールへの還元及び非官能化アルデヒドへの脱水を介して行われ得る。生成したアルデヒドは、その後、さらに伸長され得る。ホルミル－ＣｏＡ伸長（ＦＯＲＣＥ）と称されるこれらの伸長のための集合的経路を、緑色ボックス内に示す。これらの伸長経路の様々な中間体は、２－ヒドロキシ酸類、アルドース類、ジオール類、ポリオール類、カルボン酸類、及びアルコール類を含む所望の化学産物（赤色）に変換され得る。これらの産物及び中間体の多くは、グリコール酸、グリセルアルデヒド、及びアセチル－ＣｏＡなどの増殖基質としても機能し得る（橙色で強調表示）。略語：ＭＤＨ：メタノールデヒドロゲナーゼ、ＡＣＲ：アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＦａｌｄＤＨ：ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＣＳ：アシル－ＣｏＡ合成酵素、ＡＣＴ：アシル－ＣｏＡ転移酵素、ＦＯＫ：ギ酸キナーゼ（formate kinase）、ＰＴＡ：ホスホトランスアシラーゼ、ＨＡＣＬ：２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ、ＡＤＨ：アルコールデヒドロゲナーゼ、ＤＤＲ：ジオール脱水酵素（diol dehydratase）、ＴＥＳ：チオエステラーゼ、ＡＬＤＨ：アルデヒドデヒドロゲナーゼ。反応の標準ギブズ自由エネルギーは、矢印で示される方向の各経路反応に対して付与される。 図１は、Ｃ１基質からの産物合成のためのＦＯＲＣＥ経路を示した図である。ａ）ホルミル－ＣｏＡ伸長（ｆｏｒｍｙｌ－ＣｏＡ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ（ＦＯＲＣＥ））経路に基づくＣ１利用のための合成的直交アーキテクチャ。炭素骨格は、活性化Ｃ１単位からホルミル－ＣｏＡの形態で直接構築されるため、産物合成の代謝の「ボウタイ（蝶ネクタイ型）」アーキテクチャをバイパスする。ｂ）一炭素基質は、様々な酸化還元反応を介してＣ１伸長単位ホルミル－ＣｏＡに活性化される（青色ボックス）。ホルミル－ＣｏＡは、ＨＡＣＬによって触媒される反応でアルデヒドを伸長する働きをし、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを生成する。２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡは、さらに還元されて２－ヒドロキシアルデヒドになる場合がある。２－ヒドロキシアルデヒドは、ホルミル－ＣｏＡによってさらに伸長される場合があり、これをアルドース伸長と称する。あるいは、α－還元は、１，２－ジオールへの還元及び非官能化アルデヒドへの脱水を介して行われ得る。生成したアルデヒドは、その後、さらに伸長され得る。ホルミル－ＣｏＡ伸長（ＦＯＲＣＥ）と称されるこれらの伸長のための集合的経路を、緑色ボックス内に示す。これらの伸長経路の様々な中間体は、２－ヒドロキシ酸類、アルドース類、ジオール類、ポリオール類、カルボン酸類、及びアルコール類を含む所望の化学産物（赤色）に変換され得る。これらの産物及び中間体の多くは、グリコール酸、グリセルアルデヒド、及びアセチル－ＣｏＡなどの増殖基質としても機能し得る（橙色で強調表示）。略語：ＭＤＨ：メタノールデヒドロゲナーゼ、ＡＣＲ：アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＦａｌｄＤＨ：ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＣＳ：アシル－ＣｏＡ合成酵素、ＡＣＴ：アシル－ＣｏＡ転移酵素、ＦＯＫ：ギ酸キナーゼ（formate kinase）、ＰＴＡ：ホスホトランスアシラーゼ、ＨＡＣＬ：２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ、ＡＤＨ：アルコールデヒドロゲナーゼ、ＤＤＲ：ジオール脱水酵素、ＴＥＳ：チオエステラーゼ、ＡＬＤＨ：アルデヒドデヒドロゲナーゼ。反応の標準ギブズ自由エネルギーは、矢印で示される方向の各経路反応に対して付与される。 図２は、ＦＯＲＣＥ経路の熱力学的解析を示した図である。熱力学的実現可能性は、特定の変換の最小・最大駆動力（ＭＤＦ）を計算することによって評価した。ａ）合成経路を介したグリコレート（glycolate）又はアセテート（acetate）の生成のための異なるＣ１基質の利用のためのＭＤＦ。棒グラフの空白部分は標準条件（最大基質濃度制限：約１０ｍＭ）を示し、塗りつぶされた部分は、大腸菌に対する各基質のおおよその毒性を反映する調整濃度制限を示す。ギ酸活性化のためのＡＴＰ要件がそれぞれ異なる、ギ酸利用の３つの経路を評価した。ｂ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比、ＡＴＰ消費量、及びギ酸から産物への変換のＭＤＦに対するギ酸濃度などの要因の影響。ｃ）代表的基質としてホルムアルデヒドを使用し、産物が示された鎖長に対応するアルドース又はアルデヒドである、産物の炭素鎖長の関数としての反復性ＦＯＲＣＥ経路のＭＤＦ。これらのアルドース及びアルデヒド伸長経路を図２に示す（ホルミル－ＣｏＡ伸長パネルを参照）。 図２は、ＦＯＲＣＥ経路の熱力学的解析を示した図である。熱力学的実現可能性は、特定の変換の最小・最大駆動力（ＭＤＦ）を計算することによって評価した。ａ）合成経路を介したグリコレート（glycolate）又はアセテート（acetate）の生成のための異なるＣ１基質の利用のためのＭＤＦ。棒グラフの空白部分は標準条件（最大基質濃度制限：約１０ｍＭ）を示し、塗りつぶされた部分は、大腸菌に対する各基質のおおよその毒性を反映する調整濃度制限を示す。ギ酸活性化のためのＡＴＰ要件がそれぞれ異なる、ギ酸利用の３つの経路を評価した。ｂ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比、ＡＴＰ消費量、及びギ酸から産物への変換のＭＤＦに対するギ酸濃度などの要因の影響。ｃ）代表的基質としてホルムアルデヒドを使用し、産物が示された鎖長に対応するアルドース又はアルデヒドである、産物の炭素鎖長の関数としての反復性ＦＯＲＣＥ経路のＭＤＦ。これらのアルドース及びアルデヒド伸長経路を図２に示す（ホルミル－ＣｏＡ伸長パネルを参照）。 図２は、ＦＯＲＣＥ経路の熱力学的解析を示した図である。熱力学的実現可能性は、特定の変換の最小・最大駆動力（ＭＤＦ）を計算することによって評価した。ａ）合成経路を介したグリコレート（glycolate）又はアセテート（acetate）の生成のための異なるＣ１基質の利用のためのＭＤＦ。棒グラフの空白部分は標準条件（最大基質濃度制限：約１０ｍＭ）を示し、塗りつぶされた部分は、大腸菌に対する各基質のおおよその毒性を反映する調整濃度制限を示す。ギ酸活性化のためのＡＴＰ要件がそれぞれ異なる、ギ酸利用の３つの経路を評価した。ｂ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比、ＡＴＰ消費量、及びギ酸から産物への変換のＭＤＦに対するギ酸濃度などの要因の影響。ｃ）代表的基質としてホルムアルデヒドを使用し、産物が示された鎖長に対応するアルドース又はアルデヒドである、産物の炭素鎖長の関数としての反復性ＦＯＲＣＥ経路のＭＤＦ。これらのアルドース及びアルデヒド伸長経路を図２に示す（ホルミル－ＣｏＡ伸長パネルを参照）。 図２は、ＦＯＲＣＥ経路の熱力学的解析を示した図である。熱力学的実現可能性は、特定の変換の最小・最大駆動力（ＭＤＦ）を計算することによって評価した。ａ）合成経路を介したグリコレート（glycolate）又はアセテート（acetate）の生成のための異なるＣ１基質の利用のためのＭＤＦ。棒グラフの空白部分は標準条件（最大基質濃度制限：約１０ｍＭ）を示し、塗りつぶされた部分は、大腸菌に対する各基質のおおよその毒性を反映する調整濃度制限を示す。ギ酸活性化のためのＡＴＰ要件がそれぞれ異なる、ギ酸利用の３つの経路を評価した。ｂ）ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比、ＡＴＰ消費量、及びギ酸から産物への変換のＭＤＦに対するギ酸濃度などの要因の影響。ｃ）代表的基質としてホルムアルデヒドを使用し、産物が示された鎖長に対応するアルドース又はアルデヒドである、産物の炭素鎖長の関数としての反復性ＦＯＲＣＥ経路のＭＤＦ。これらのアルドース及びアルデヒド伸長経路を図２に示す（ホルミル－ＣｏＡ伸長パネルを参照）。 図３は、精製酵素を用いたＦＯＲＣＥ経路のコアモジュールのインビトロ評価を示した図である。ａ）Ｃ１基質であるホルムアルデヒド及びホルメート（formate）（別個及び組み合わせ）のグリコリル－ＣｏＡへの変換経路。各工程の酵素及び補因子が示されている。添加した基質を、太字及び下線で示す。ｂ）ホルミル－ＣｏＡの液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）抽出イオンクロマトグラフィー（ＥＩＣ）及びＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｂ．０５．００の「Ｆｉｎｄ Ｂｙ Ｆｏｒｍｕｌａ （ＦＢＦ）」機能によるグリコリル－ＣｏＡ。データは２連実験の代表的なものである。ｃ）インビトロ試料中のホルミル－ＣｏＡ及びグリコリル－ＣｏＡの相対的存在量。ホルミル－ＣｏＡ及びグリコリル－ＣｏＡは、ＬＣ－ＭＳ分析によるＥＩＣピーク面積に基づいて定量化した。グリコリル－ＣｏＡの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）加水分解後、試料中に生成したＣ２をグリコール酸としてさらに定量化した。全てのデータは、テクニカルレプリケート（ｎ＝２）について示され、棒グラフは平均値に描画されている。 図３は、精製酵素を用いたＦＯＲＣＥ経路のコアモジュールのインビトロ評価を示した図である。ａ）Ｃ１基質であるホルムアルデヒド及びホルメート（formate）（別個及び組み合わせ）のグリコリル－ＣｏＡへの変換経路。各工程の酵素及び補因子が示されている。添加した基質を、太字及び下線で示す。ｂ）ホルミル－ＣｏＡの液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）抽出イオンクロマトグラフィー（ＥＩＣ）及びＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｂ．０５．００の「Ｆｉｎｄ Ｂｙ Ｆｏｒｍｕｌａ （ＦＢＦ）」機能によるグリコリル－ＣｏＡ。データは２連実験の代表的なものである。ｃ）インビトロ試料中のホルミル－ＣｏＡ及びグリコリル－ＣｏＡの相対的存在量。ホルミル－ＣｏＡ及びグリコリル－ＣｏＡは、ＬＣ－ＭＳ分析によるＥＩＣピーク面積に基づいて定量化した。グリコリル－ＣｏＡの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）加水分解後、試料中に生成したＣ２をグリコール酸としてさらに定量化した。全てのデータは、テクニカルレプリケート（ｎ＝２）について示され、棒グラフは平均値に描画されている。 図３は、精製酵素を用いたＦＯＲＣＥ経路のコアモジュールのインビトロ評価を示した図である。ａ）Ｃ１基質であるホルムアルデヒド及びホルメート（formate）（別個及び組み合わせ）のグリコリル－ＣｏＡへの変換経路。各工程の酵素及び補因子が示されている。添加した基質を、太字及び下線で示す。ｂ）ホルミル－ＣｏＡの液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）抽出イオンクロマトグラフィー（ＥＩＣ）及びＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｂ．０５．００の「Ｆｉｎｄ Ｂｙ Ｆｏｒｍｕｌａ （ＦＢＦ）」機能によるグリコリル－ＣｏＡ。データは２連実験の代表的なものである。ｃ）インビトロ試料中のホルミル－ＣｏＡ及びグリコリル－ＣｏＡの相対的存在量。ホルミル－ＣｏＡ及びグリコリル－ＣｏＡは、ＬＣ－ＭＳ分析によるＥＩＣピーク面積に基づいて定量化した。グリコリル－ＣｏＡの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）加水分解後、試料中に生成したＣ２をグリコール酸としてさらに定量化した。全てのデータは、テクニカルレプリケート（ｎ＝２）について示され、棒グラフは平均値に描画されている。 図４は、ＦＯＲＣＥ産物合成経路のα還元バリアントの無細胞プロトタイピングを示した図であるａ）ホルムアルデヒドから様々なＣ２産物を生成するための、試作したα還元経路の概要。本研究で検出された産物を、実線で囲んでいる。酵素の略語：ＤＤＲ：クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ジオール脱水酵素、Ｅｎｄ．（１）：内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｅｎｄ．（２）：内因性チオエステラーゼ、Ｅｎｄ．（３）：内因性アルコールデヒドロゲナーゼ、ＦｕｃＯ：大腸菌１，２－ジオールオキシドレダクターゼ、ＬｍＡＣＲ：リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＲｕＨＡＣＬ：ロドスピリルム目細菌ＵＲＨＤ００１７ ＨＡＣＬ。ｂ）カルボキシレート（carboxylates）が酸形態で検出される条件下でＨＰＬＣによって検出される、示された経路酵素を含む無細胞系の産物及び基質プロファイル。濃度は炭素に基づいて付与される。全てのデータ点は、３連のテクニカルレプリケートに対して示されている。標準偏差を示すエラーバーを用いて、平均値に線が引かれている。 図４は、ＦＯＲＣＥ産物合成経路のα還元バリアントの無細胞プロトタイピングを示した図であるａ）ホルムアルデヒドから様々なＣ２産物を生成するための、試作したα還元経路の概要。本研究で検出された産物を、実線で囲んでいる。酵素の略語：ＤＤＲ：クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ジオール脱水酵素、Ｅｎｄ．（１）：内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｅｎｄ．（２）：内因性チオエステラーゼ、Ｅｎｄ．（３）：内因性アルコールデヒドロゲナーゼ、ＦｕｃＯ：大腸菌１，２－ジオールオキシドレダクターゼ、ＬｍＡＣＲ：リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＲｕＨＡＣＬ：ロドスピリルム目細菌ＵＲＨＤ００１７ ＨＡＣＬ。ｂ）カルボキシレート（carboxylates）が酸形態で検出される条件下でＨＰＬＣによって検出される、示された経路酵素を含む無細胞系の産物及び基質プロファイル。濃度は炭素に基づいて付与される。全てのデータ点は、３連のテクニカルレプリケートに対して示されている。標準偏差を示すエラーバーを用いて、平均値に線が引かれている。 図５は、ＦＯＲＣＥ経路のアルドース伸長及びα還元バリアントを使用した、Ｃ１基質ホルムアルデヒドの休止細胞生物変換を示した図である。ａ）ホルムアルデヒドからのＦＯＲＣＥ経路を使用した多様な産物合成を実証するために、本研究で使用した戦略。検出された産物及び副産物を、実線で囲んでいる。副産物の合成を低減するためのノックアウト戦略を赤色で示す。ｂ）ＯＤ６００＝１０（５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）並びに０時間及び１．５時間での１０ｍＭホルムアルデヒドの２回の添加による２４時間の休止細胞生物変換後、ＦＯＲＣＥ経路を使用してホルムアルデヒドから産物を合成するように改変された株の代謝物質プロファイル。凡例では、「＋」は示された酵素の過剰発現を表す。Δａｌｄｈは、アルデヒドデヒドロゲナーゼのノックアウトを指す：ΔａｌｄＡ ΔａｌｄＢ ΔｐａｔＤ ΔｐｕｕＣ。Ｅｎｄ．ｔｅｓは、内因性チオエステラーゼ及び自発的なチオエステル加水分解を指す。ＲｕＨＡＣＬを伴わずにＬｍＡＣＲ及びＥｃＡｌｄＡのみを発現している菌株では、複数炭素産物は観察されなかった。濃度は炭素に基づいて付与し、カルボキシレート（carboxylates）が酸形態で検出される条件下でＨＰＬＣによって測定した。全てのデータ点は、２連のテクニカルレプリケートに対して示されている。棒グラフは平均値に描画されている。ｃ）１３Ｃ標識ホルムアルデヒドを使用した実験から生成された複数炭素産物のスペクトルと非標識ホルムアルデヒドからの産物との比較。［Ｍ－１５］＋イオンが示されている。グリコール酸及びエチレングリコールでは、ｍ／ｚの＋２シフトが観察され、グリセリン酸では、ｍ／ｚの＋３シフトが観察される。 図５は、ＦＯＲＣＥ経路のアルドース伸長及びα還元バリアントを使用した、Ｃ１基質ホルムアルデヒドの休止細胞生物変換を示した図である。ａ）ホルムアルデヒドからのＦＯＲＣＥ経路を使用した多様な産物合成を実証するために、本研究で使用した戦略。検出された産物及び副産物を、実線で囲んでいる。副産物の合成を低減するためのノックアウト戦略を赤色で示す。ｂ）ＯＤ６００＝１０（５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）並びに０時間及び１．５時間での１０ｍＭホルムアルデヒドの２回の添加による２４時間の休止細胞生物変換後、ＦＯＲＣＥ経路を使用してホルムアルデヒドから産物を合成するように改変された株の代謝物質プロファイル。凡例では、「＋」は示された酵素の過剰発現を表す。Δａｌｄｈは、アルデヒドデヒドロゲナーゼのノックアウトを指す：ΔａｌｄＡ ΔａｌｄＢ ΔｐａｔＤ ΔｐｕｕＣ。Ｅｎｄ．ｔｅｓは、内因性チオエステラーゼ及び自発的なチオエステル加水分解を指す。ＲｕＨＡＣＬを伴わずにＬｍＡＣＲ及びＥｃＡｌｄＡのみを発現している菌株では、複数炭素産物は観察されなかった。濃度は炭素に基づいて付与し、カルボキシレート（carboxylates）が酸形態で検出される条件下でＨＰＬＣによって測定した。全てのデータ点は、２連のテクニカルレプリケートに対して示されている。棒グラフは平均値に描画されている。ｃ）１３Ｃ標識ホルムアルデヒドを使用した実験から生成された複数炭素産物のスペクトルと非標識ホルムアルデヒドからの産物との比較。［Ｍ－１５］＋イオンが示されている。グリコール酸及びエチレングリコールでは、ｍ／ｚの＋２シフトが観察され、グリセリン酸では、ｍ／ｚの＋３シフトが観察される。 図５は、ＦＯＲＣＥ経路のアルドース伸長及びα還元バリアントを使用した、Ｃ１基質ホルムアルデヒドの休止細胞生物変換を示した図である。ａ）ホルムアルデヒドからのＦＯＲＣＥ経路を使用した多様な産物合成を実証するために、本研究で使用した戦略。検出された産物及び副産物を、実線で囲んでいる。副産物の合成を低減するためのノックアウト戦略を赤色で示す。ｂ）ＯＤ６００＝１０（５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）並びに０時間及び１．５時間での１０ｍＭホルムアルデヒドの２回の添加による２４時間の休止細胞生物変換後、ＦＯＲＣＥ経路を使用してホルムアルデヒドから産物を合成するように改変された株の代謝物質プロファイル。凡例では、「＋」は示された酵素の過剰発現を表す。Δａｌｄｈは、アルデヒドデヒドロゲナーゼのノックアウトを指す：ΔａｌｄＡ ΔａｌｄＢ ΔｐａｔＤ ΔｐｕｕＣ。Ｅｎｄ．ｔｅｓは、内因性チオエステラーゼ及び自発的なチオエステル加水分解を指す。ＲｕＨＡＣＬを伴わずにＬｍＡＣＲ及びＥｃＡｌｄＡのみを発現している菌株では、複数炭素産物は観察されなかった。濃度は炭素に基づいて付与し、カルボキシレート（carboxylates）が酸形態で検出される条件下でＨＰＬＣによって測定した。全てのデータ点は、２連のテクニカルレプリケートに対して示されている。棒グラフは平均値に描画されている。ｃ）１３Ｃ標識ホルムアルデヒドを使用した実験から生成された複数炭素産物のスペクトルと非標識ホルムアルデヒドからの産物との比較。［Ｍ－１５］＋イオンが示されている。グリコール酸及びエチレングリコールでは、ｍ／ｚの＋２シフトが観察され、グリセリン酸では、ｍ／ｚの＋３シフトが観察される。 図６は、Ｃ１基質としてメタノールを使用した細胞培養の増殖におけるＦＯＲＣＥ経路の実装を示した図である。ａ）活発に増殖する大腸菌培養物におけるメタノールからのグリコール酸の生成のための宿主及び経路の設計。副産物の合成を低減させてグリコール酸の利用を防止するためのノックアウト戦略は赤色で示され、宿主株ＡＣ４４０に対応する。ΔＴＥは、内因性チオエステラーゼのノックアウトを指す（ΔｙｃｉＡ ΔｔｅｓＡ ΔｔｅｓＢ ΔｙｂｇＣ ΔｙｄｉＩ ΔｆａｄＭ）。Ｅｎｄ．（１）は、内因性アルデヒド酸化活性を指す。酵素の略語：ＢｍＭＤＨ２ＭＧＡ３：バチルス・メタノリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）ＭＧＡ３ ＮＡＤ＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼ、ＬｍＡＣＲ：リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ：ロドスピリルム目細菌ＵＲＨＤ００１７ ＨＡＣＬ（Ｇ３９０Ｎ）、ＢｓｍＨＡＣＬ：ビーチサンド（Ｂｅａｃｈ ｓａｎｄ）メタゲノムＨＡＣＬ、ＥｃＡｌｄＡ：大腸菌アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ、ＣｂＡｂｆＴ：クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＣｏＡ転移酵素。ｂ）メタノールからのグリコール酸及びギ酸の生成の時間経過。ＦＯＲＣＥ経路設計は、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎの有無にかかわらず、ＬｍＡＣＲ、ＥｃＡｌｄＡ、及びＢｍＭｄｈＭＧＡ３を過剰発現させることによって実装した。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含まない試料ではｎ＝２）。標準偏差を示すエラーバーを用いて、平均値に線が引かれている。濃度は炭素に基づいて付与される。ｃ）合理的改変による大腸菌培養の増殖におけるメタノールからのグリコレート（glycolate）生成の改善。グリコール酸及びギ酸の濃度は、７２時間時点の炭素に基づいて付与される。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、その他ではｎ＝４）。棒グラフは平均値に描画されている。ｄ）１２Ｃ（非標識）又は１３Ｃ（標識）メタノールのいずれかとインキュベートした大腸菌によって産生されたグリコール酸の２ＴＭＳ誘導体の［Ｍ－１５］＋イオンのスペクトル。 図６は、Ｃ１基質としてメタノールを使用した細胞培養の増殖におけるＦＯＲＣＥ経路の実装を示した図である。ａ）活発に増殖する大腸菌培養物におけるメタノールからのグリコール酸の生成のための宿主及び経路の設計。副産物の合成を低減させてグリコール酸の利用を防止するためのノックアウト戦略は赤色で示され、宿主株ＡＣ４４０に対応する。ΔＴＥは、内因性チオエステラーゼのノックアウトを指す（ΔｙｃｉＡ ΔｔｅｓＡ ΔｔｅｓＢ ΔｙｂｇＣ ΔｙｄｉＩ ΔｆａｄＭ）。Ｅｎｄ．（１）は、内因性アルデヒド酸化活性を指す。酵素の略語：ＢｍＭＤＨ２ＭＧＡ３：バチルス・メタノリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）ＭＧＡ３ ＮＡＤ＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼ、ＬｍＡＣＲ：リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ：ロドスピリルム目細菌ＵＲＨＤ００１７ ＨＡＣＬ（Ｇ３９０Ｎ）、ＢｓｍＨＡＣＬ：ビーチサンド（Ｂｅａｃｈ ｓａｎｄ）メタゲノムＨＡＣＬ、ＥｃＡｌｄＡ：大腸菌アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ、ＣｂＡｂｆＴ：クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＣｏＡ転移酵素。ｂ）メタノールからのグリコール酸及びギ酸の生成の時間経過。ＦＯＲＣＥ経路設計は、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎの有無にかかわらず、ＬｍＡＣＲ、ＥｃＡｌｄＡ、及びＢｍＭｄｈＭＧＡ３を過剰発現させることによって実装した。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含まない試料ではｎ＝２）。標準偏差を示すエラーバーを用いて、平均値に線が引かれている。濃度は炭素に基づいて付与される。ｃ）合理的改変による大腸菌培養の増殖におけるメタノールからのグリコレート（glycolate）生成の改善。グリコール酸及びギ酸の濃度は、７２時間時点の炭素に基づいて付与される。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、その他ではｎ＝４）。棒グラフは平均値に描画されている。ｄ）１２Ｃ（非標識）又は１３Ｃ（標識）メタノールのいずれかとインキュベートした大腸菌によって産生されたグリコール酸の２ＴＭＳ誘導体の［Ｍ－１５］＋イオンのスペクトル。 図６は、Ｃ１基質としてメタノールを使用した細胞培養の増殖におけるＦＯＲＣＥ経路の実装を示した図である。ａ）活発に増殖する大腸菌培養物におけるメタノールからのグリコール酸の生成のための宿主及び経路の設計。副産物の合成を低減させてグリコール酸の利用を防止するためのノックアウト戦略は赤色で示され、宿主株ＡＣ４４０に対応する。ΔＴＥは、内因性チオエステラーゼのノックアウトを指す（ΔｙｃｉＡ ΔｔｅｓＡ ΔｔｅｓＢ ΔｙｂｇＣ ΔｙｄｉＩ ΔｆａｄＭ）。Ｅｎｄ．（１）は、内因性アルデヒド酸化活性を指す。酵素の略語：ＢｍＭＤＨ２ＭＧＡ３：バチルス・メタノリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）ＭＧＡ３ ＮＡＤ＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼ、ＬｍＡＣＲ：リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ：ロドスピリルム目細菌ＵＲＨＤ００１７ ＨＡＣＬ（Ｇ３９０Ｎ）、ＢｓｍＨＡＣＬ：ビーチサンド（Ｂｅａｃｈ ｓａｎｄ）メタゲノムＨＡＣＬ、ＥｃＡｌｄＡ：大腸菌アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ、ＣｂＡｂｆＴ：クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＣｏＡ転移酵素。ｂ）メタノールからのグリコール酸及びギ酸の生成の時間経過。ＦＯＲＣＥ経路設計は、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎの有無にかかわらず、ＬｍＡＣＲ、ＥｃＡｌｄＡ、及びＢｍＭｄｈＭＧＡ３を過剰発現させることによって実装した。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含まない試料ではｎ＝２）。標準偏差を示すエラーバーを用いて、平均値に線が引かれている。濃度は炭素に基づいて付与される。ｃ）合理的改変による大腸菌培養の増殖におけるメタノールからのグリコレート（glycolate）生成の改善。グリコール酸及びギ酸の濃度は、７２時間時点の炭素に基づいて付与される。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、その他ではｎ＝４）。棒グラフは平均値に描画されている。ｄ）１２Ｃ（非標識）又は１３Ｃ（標識）メタノールのいずれかとインキュベートした大腸菌によって産生されたグリコール酸の２ＴＭＳ誘導体の［Ｍ－１５］＋イオンのスペクトル。 図６は、Ｃ１基質としてメタノールを使用した細胞培養の増殖におけるＦＯＲＣＥ経路の実装を示した図である。ａ）活発に増殖する大腸菌培養物におけるメタノールからのグリコール酸の生成のための宿主及び経路の設計。副産物の合成を低減させてグリコール酸の利用を防止するためのノックアウト戦略は赤色で示され、宿主株ＡＣ４４０に対応する。ΔＴＥは、内因性チオエステラーゼのノックアウトを指す（ΔｙｃｉＡ ΔｔｅｓＡ ΔｔｅｓＢ ΔｙｂｇＣ ΔｙｄｉＩ ΔｆａｄＭ）。Ｅｎｄ．（１）は、内因性アルデヒド酸化活性を指す。酵素の略語：ＢｍＭＤＨ２ＭＧＡ３：バチルス・メタノリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）ＭＧＡ３ ＮＡＤ＋依存性メタノールデヒドロゲナーゼ、ＬｍＡＣＲ：リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）アシル－ＣｏＡレダクターゼ、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ：ロドスピリルム目細菌ＵＲＨＤ００１７ ＨＡＣＬ（Ｇ３９０Ｎ）、ＢｓｍＨＡＣＬ：ビーチサンド（Ｂｅａｃｈ ｓａｎｄ）メタゲノムＨＡＣＬ、ＥｃＡｌｄＡ：大腸菌アルデヒドデヒドロゲナーゼＡ、ＣｂＡｂｆＴ：クロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）ＣｏＡ転移酵素。ｂ）メタノールからのグリコール酸及びギ酸の生成の時間経過。ＦＯＲＣＥ経路設計は、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎの有無にかかわらず、ＬｍＡＣＲ、ＥｃＡｌｄＡ、及びＢｍＭｄｈＭＧＡ３を過剰発現させることによって実装した。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含まない試料ではｎ＝２）。標準偏差を示すエラーバーを用いて、平均値に線が引かれている。濃度は炭素に基づいて付与される。ｃ）合理的改変による大腸菌培養の増殖におけるメタノールからのグリコレート（glycolate）生成の改善。グリコール酸及びギ酸の濃度は、７２時間時点の炭素に基づいて付与される。全てのデータは、生物学的レプリケートについて示されている（ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを含む試料ではｎ＝３、その他ではｎ＝４）。棒グラフは平均値に描画されている。ｄ）１２Ｃ（非標識）又は１３Ｃ（標識）メタノールのいずれかとインキュベートした大腸菌によって産生されたグリコール酸の２ＴＭＳ誘導体の［Ｍ－１５］＋イオンのスペクトル。 図７は、ＦＯＲＣＥ経路バリアントを使用した増殖のためのゲノムスケール大腸菌モデルからシミュレートされたフラックスマップを示した図である：ａ）（ホルム）アルデヒド伸長、ｂ）α還元、ｃ）アルドース伸長。基質取り込み反応を緑色で示す。各ＦＯＲＣＥ経路バリアントに対して実装された反応は、青色で描画されている。ＦＯＲＣＥ経路の終結を橙色で示す。ＣＯ２排出としての炭素異化は赤色で強調表示されている。フラックスは、ミリモル／ｇ－ＤＣＷ／ｈｒで付与される。明確にするために、主要なフラックス（閾値を＞μとして設定）のみが描画されている。パネルｂでは、エリスロース４－リン酸からグリセルアルデヒド３－リン酸への転位をもたらすペントースリン酸経路の反応が簡略化されている。 図７は、ＦＯＲＣＥ経路バリアントを使用した増殖のためのゲノムスケール大腸菌モデルからシミュレートされたフラックスマップを示した図である：ａ）（ホルム）アルデヒド伸長、ｂ）α還元、ｃ）アルドース伸長。基質取り込み反応を緑色で示す。各ＦＯＲＣＥ経路バリアントに対して実装された反応は、青色で描画されている。ＦＯＲＣＥ経路の終結を橙色で示す。ＣＯ２排出としての炭素異化は赤色で強調表示されている。フラックスは、ミリモル／ｇ－ＤＣＷ／ｈｒで付与される。明確にするために、主要なフラックス（閾値を＞μとして設定）のみが描画されている。パネルｂでは、エリスロース４－リン酸からグリセルアルデヒド３－リン酸への転位をもたらすペントースリン酸経路の反応が簡略化されている。 図７は、ＦＯＲＣＥ経路バリアントを使用した増殖のためのゲノムスケール大腸菌モデルからシミュレートされたフラックスマップを示した図である：ａ）（ホルム）アルデヒド伸長、ｂ）α還元、ｃ）アルドース伸長。基質取り込み反応を緑色で示す。各ＦＯＲＣＥ経路バリアントに対して実装された反応は、青色で描画されている。ＦＯＲＣＥ経路の終結を橙色で示す。ＣＯ２排出としての炭素異化は赤色で強調表示されている。フラックスは、ミリモル／ｇ－ＤＣＷ／ｈｒで付与される。明確にするために、主要なフラックス（閾値を＞μとして設定）のみが描画されている。パネルｂでは、エリスロース４－リン酸からグリセルアルデヒド３－リン酸への転位をもたらすペントースリン酸経路の反応が簡略化されている。 図８は、ＦＯＲＣＥ経路がＣ１基質での増殖を可能にする能力を評価するための二株系を示した図である。ａ）ＦＯＲＣＥ経路は、非天然のＣ１基質を、炭素源及びエネルギー源として機能する天然の複数炭素基質に変換することにより、合成メチロトロフィ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｙ）を可能にすることができる。ｂ）二株系の概念図。グリコレート（glycolate）を消費できない生産（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）株（黄色の輪郭線）は、３つのＣ１基質のいずれかからグリコレート（glycolate）を生成するように設計された：メタノール（赤色）、（パラ）ホルムアルデヒド（青色）、又はギ酸及びホルムアルデヒド（緑色）。グリコレート（glycolate）を消費可能な２番目の消費（ｃｏｎｓｕｍｅｒ）株を培養液に加え、増殖を評価するための検出可能なシグナルとして機能させた。ｃ）唯一の炭素源として（パラ）ホルムアルデヒドを使用した二株系におけるグリコレート（glycolate）濃度（青色）及び細胞増殖（橙色）の時間経過。ＬｍＡＣＲ、ＡｌｄＡ、及びＢｓｍＨＡＣＬを発現するＡＣ４４０（３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）に５ｍＭ（質量当量）のパラホルムアルデヒドを添加した。全てのデータ点は、２連のレプリケートに対して示されている。グリコレート（glycolate）濃度の線グラフは平均値に描画されている。細胞増殖の線グラフは、最小二乗回帰による指数関数的増殖に対するデータの適合であり、比増殖率（μ）の計算に使用した。対照試料を含む、完全な代謝物質及び細胞増殖プロファイルを図１６に示す。ｄ）ＨＡＣＬを含む（＋）又は含まない（－）関連する生産株及び示されたＣ１基質と示された時間インキュベートした場合の消費株の増殖（ｐＦＡＬＤ：パラホルムアルデヒド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＦＡＬＤ：ホルムアルデヒド、ＦＡ：ギ酸ナトリウム）図１６～図１８も参照のこと。全てのデータは、２連のテクニカルレプリケートについて示され、棒グラフは平均値に描画されている。ｅ）パネルｄの条件に対応する消費株の増殖を示すプレート画像。 図８は、ＦＯＲＣＥ経路がＣ１基質での増殖を可能にする能力を評価するための二株系を示した図である。ａ）ＦＯＲＣＥ経路は、非天然のＣ１基質を、炭素源及びエネルギー源として機能する天然の複数炭素基質に変換することにより、合成メチロトロフィ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｙ）を可能にすることができる。ｂ）二株系の概念図。グリコレート（glycolate）を消費できない生産（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）株（黄色の輪郭線）は、３つのＣ１基質のいずれかからグリコレート（glycolate）を生成するように設計された：メタノール（赤色）、（パラ）ホルムアルデヒド（青色）、又はギ酸及びホルムアルデヒド（緑色）。グリコレート（glycolate）を消費可能な２番目の消費（ｃｏｎｓｕｍｅｒ）株を培養液に加え、増殖を評価するための検出可能なシグナルとして機能させた。ｃ）唯一の炭素源として（パラ）ホルムアルデヒドを使用した二株系におけるグリコレート（glycolate）濃度（青色）及び細胞増殖（橙色）の時間経過。ＬｍＡＣＲ、ＡｌｄＡ、及びＢｓｍＨＡＣＬを発現するＡＣ４４０（３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）に５ｍＭ（質量当量）のパラホルムアルデヒドを添加した。全てのデータ点は、２連のレプリケートに対して示されている。グリコレート（glycolate）濃度の線グラフは平均値に描画されている。細胞増殖の線グラフは、最小二乗回帰による指数関数的増殖に対するデータの適合であり、比増殖率（μ）の計算に使用した。対照試料を含む、完全な代謝物質及び細胞増殖プロファイルを図１６に示す。ｄ）ＨＡＣＬを含む（＋）又は含まない（－）関連する生産株及び示されたＣ１基質と示された時間インキュベートした場合の消費株の増殖（ｐＦＡＬＤ：パラホルムアルデヒド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＦＡＬＤ：ホルムアルデヒド、ＦＡ：ギ酸ナトリウム）図１６～図１８も参照のこと。全てのデータは、２連のテクニカルレプリケートについて示され、棒グラフは平均値に描画されている。ｅ）パネルｄの条件に対応する消費株の増殖を示すプレート画像。 図８は、ＦＯＲＣＥ経路がＣ１基質での増殖を可能にする能力を評価するための二株系を示した図である。ａ）ＦＯＲＣＥ経路は、非天然のＣ１基質を、炭素源及びエネルギー源として機能する天然の複数炭素基質に変換することにより、合成メチロトロフィ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｙ）を可能にすることができる。ｂ）二株系の概念図。グリコレート（glycolate）を消費できない生産（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）株（黄色の輪郭線）は、３つのＣ１基質のいずれかからグリコレート（glycolate）を生成するように設計された：メタノール（赤色）、（パラ）ホルムアルデヒド（青色）、又はギ酸及びホルムアルデヒド（緑色）。グリコレート（glycolate）を消費可能な２番目の消費（ｃｏｎｓｕｍｅｒ）株を培養液に加え、増殖を評価するための検出可能なシグナルとして機能させた。ｃ）唯一の炭素源として（パラ）ホルムアルデヒドを使用した二株系におけるグリコレート（glycolate）濃度（青色）及び細胞増殖（橙色）の時間経過。ＬｍＡＣＲ、ＡｌｄＡ、及びＢｓｍＨＡＣＬを発現するＡＣ４４０（３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）に５ｍＭ（質量当量）のパラホルムアルデヒドを添加した。全てのデータ点は、２連のレプリケートに対して示されている。グリコレート（glycolate）濃度の線グラフは平均値に描画されている。細胞増殖の線グラフは、最小二乗回帰による指数関数的増殖に対するデータの適合であり、比増殖率（μ）の計算に使用した。対照試料を含む、完全な代謝物質及び細胞増殖プロファイルを図１６に示す。ｄ）ＨＡＣＬを含む（＋）又は含まない（－）関連する生産株及び示されたＣ１基質と示された時間インキュベートした場合の消費株の増殖（ｐＦＡＬＤ：パラホルムアルデヒド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＦＡＬＤ：ホルムアルデヒド、ＦＡ：ギ酸ナトリウム）図１６～図１８も参照のこと。全てのデータは、２連のテクニカルレプリケートについて示され、棒グラフは平均値に描画されている。ｅ）パネルｄの条件に対応する消費株の増殖を示すプレート画像。 図８は、ＦＯＲＣＥ経路がＣ１基質での増殖を可能にする能力を評価するための二株系を示した図である。ａ）ＦＯＲＣＥ経路は、非天然のＣ１基質を、炭素源及びエネルギー源として機能する天然の複数炭素基質に変換することにより、合成メチロトロフィ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｙ）を可能にすることができる。ｂ）二株系の概念図。グリコレート（glycolate）を消費できない生産（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）株（黄色の輪郭線）は、３つのＣ１基質のいずれかからグリコレート（glycolate）を生成するように設計された：メタノール（赤色）、（パラ）ホルムアルデヒド（青色）、又はギ酸及びホルムアルデヒド（緑色）。グリコレート（glycolate）を消費可能な２番目の消費（ｃｏｎｓｕｍｅｒ）株を培養液に加え、増殖を評価するための検出可能なシグナルとして機能させた。ｃ）唯一の炭素源として（パラ）ホルムアルデヒドを使用した二株系におけるグリコレート（glycolate）濃度（青色）及び細胞増殖（橙色）の時間経過。ＬｍＡＣＲ、ＡｌｄＡ、及びＢｓｍＨＡＣＬを発現するＡＣ４４０（３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）に５ｍＭ（質量当量）のパラホルムアルデヒドを添加した。全てのデータ点は、２連のレプリケートに対して示されている。グリコレート（glycolate）濃度の線グラフは平均値に描画されている。細胞増殖の線グラフは、最小二乗回帰による指数関数的増殖に対するデータの適合であり、比増殖率（μ）の計算に使用した。対照試料を含む、完全な代謝物質及び細胞増殖プロファイルを図１６に示す。ｄ）ＨＡＣＬを含む（＋）又は含まない（－）関連する生産株及び示されたＣ１基質と示された時間インキュベートした場合の消費株の増殖（ｐＦＡＬＤ：パラホルムアルデヒド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＦＡＬＤ：ホルムアルデヒド、ＦＡ：ギ酸ナトリウム）図１６～図１８も参照のこと。全てのデータは、２連のテクニカルレプリケートについて示され、棒グラフは平均値に描画されている。ｅ）パネルｄの条件に対応する消費株の増殖を示すプレート画像。 図８は、ＦＯＲＣＥ経路がＣ１基質での増殖を可能にする能力を評価するための二株系を示した図である。ａ）ＦＯＲＣＥ経路は、非天然のＣ１基質を、炭素源及びエネルギー源として機能する天然の複数炭素基質に変換することにより、合成メチロトロフィ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｙ）を可能にすることができる。ｂ）二株系の概念図。グリコレート（glycolate）を消費できない生産（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）株（黄色の輪郭線）は、３つのＣ１基質のいずれかからグリコレート（glycolate）を生成するように設計された：メタノール（赤色）、（パラ）ホルムアルデヒド（青色）、又はギ酸及びホルムアルデヒド（緑色）。グリコレート（glycolate）を消費可能な２番目の消費（ｃｏｎｓｕｍｅｒ）株を培養液に加え、増殖を評価するための検出可能なシグナルとして機能させた。ｃ）唯一の炭素源として（パラ）ホルムアルデヒドを使用した二株系におけるグリコレート（glycolate）濃度（青色）及び細胞増殖（橙色）の時間経過。ＬｍＡＣＲ、ＡｌｄＡ、及びＢｓｍＨＡＣＬを発現するＡＣ４４０（３×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）に５ｍＭ（質量当量）のパラホルムアルデヒドを添加した。全てのデータ点は、２連のレプリケートに対して示されている。グリコレート（glycolate）濃度の線グラフは平均値に描画されている。細胞増殖の線グラフは、最小二乗回帰による指数関数的増殖に対するデータの適合であり、比増殖率（μ）の計算に使用した。対照試料を含む、完全な代謝物質及び細胞増殖プロファイルを図１６に示す。ｄ）ＨＡＣＬを含む（＋）又は含まない（－）関連する生産株及び示されたＣ１基質と示された時間インキュベートした場合の消費株の増殖（ｐＦＡＬＤ：パラホルムアルデヒド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＦＡＬＤ：ホルムアルデヒド、ＦＡ：ギ酸ナトリウム）図１６～図１８も参照のこと。全てのデータは、２連のテクニカルレプリケートについて示され、棒グラフは平均値に描画されている。ｅ）パネルｄの条件に対応する消費株の増殖を示すプレート画像。 図９は、生物学的Ｃ１利用のための正規（ａ）アーキテクチャ及び直交合成（ｂ）アーキテクチャを示した図である。ａ）代謝の「ボウタイ」アーキテクチャでは、炭素基質が中心的な代謝物質に統合され、そこから発酵経路及び生合成経路を介して多くの産物が生成される。代謝工学は通常、ボウタイの３つの構成要素のいずれか１つ又は全てを操作することにより、このフレームワーク内で動作する。ｂ）直交ＦＯＲＣＥ経路は、産物の合成及び増殖のための基質／代謝物質の提供の両方のプラットフォームとして機能する。これは、中央代謝を通じて全ての炭素を供給し、そこから産物及びバイオマスの両方が得られる従来のアプローチに代わるフレームワークである。 図１０は、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡの脱水及びα還元に基づく代替ＦＯＲＣＥ経路を示した図である。この経路は、β酸化反転（β還元）に似ている３９。この経路は、不飽和産物を生成する可能性のある経路でもある。ＨＡＣＬ：２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ、ＨＡＣＤ：２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡ脱水酵素、ＴＥＲ：トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ、ＡＣＲ：アシル－ＣｏＡレダクターゼ。 図１１は、ＦＯＲＣＥ経路を介したグリコレート（glycolate）又はアセテート（acetate）へのホルムアルデヒド（上）及びメタノール（下）変換に対するＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比の影響を示した図である。 図１２は、ＦＯＲＣＥ経路を介したグリコレート（glycolate）又はアセテート（acetate）へのホルムアルデヒド（上）及びメタノール（下）変換に対するＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比の影響を示した図である。糖酸を生成するためのアシル－ＣｏＡの加水分解による終結は、反復回数が少ない場合の経路の駆動力を増加させるが、反復回数が増加するにつれて駆動力は収束する。 図１３は、ギ酸活性化経路で改変された大腸菌によるギ酸からのグリコレート（glycolate）の生成を示した図である。休止細胞実験を、ＣａＡｂｆＴ及びＢｓｍＨＡＣＬを発現する株（青色の棒グラフ）と、ＢｓｍＨＡＣＬを欠く対応する対照（橙色の棒グラフ）を使用して行った。培養物（２．５ ＯＤ６００＝２．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）を、炭素源として１０ｍＭホルメート（formate）（＋１ｍＭホルムアルデヒド）を使用して２００ｒｐｍで振とうする２５ｍＬフラスコ内で３０℃で２４時間インキュベートした（１ｍＭホルムアルデヒドあり及びホルメート（formate）なしによる対照培養物も表示）。全てのデータ点は、ｎ＝６のレプリケートに対して示されている。棒グラフは平均値に描画されている。 図１４は、メチロトロフィを可能にする選択経路の実装による、様々なＣ１基質からのバイオマス電子及び炭素収率の予測を示した図である。略語：Ｆｏｒｍａｌｄ－ホルムアルデヒド、ＦＯＲＣＥ－Ｇｌｙｃｅｒａｌｄ－グリセルアルデヒド生成を可能にする反応を伴うＦＯＲＣＥ経路、ＲｕＭＰ－リブロース一リン酸経路、ＦＯＲＣＥ－Ａｃ－アセテート（acetate）生成を可能にする反応を伴うＦＯＲＣＥ経路、ＳＡＣＡ－合成アセチル－ＣｏＡ経路、ＦＯＲＣＥ－Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ－グリコレート（glycolate）生成を可能にする反応を伴うＦＯＲＣＥ経路。太字のシナリオは、図８に示す予測フラックスマップに対応している。 図１５は、パラホルムアルデヒド可溶化率及びパラホルムアルデヒドによる休止細胞生物変換を示した図である。ａ）粒子サイズの異なる市販のパラホルムアルデヒド（ｐＦＡＬＤ）の可溶化率。可溶化速度は、２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２５ｍＬフラスコ中の１０ｍＬのＭ９培地で測定される。ｂ）４０μＭのクメート（ｃｕｍａｔｅ）及び１００μＭのＩＰＴＧで誘導された、ＢｓｍＨＡＣＬ、ＬｍＡＣＲ、及びＡｌｄＡを発現する株の休止細胞生物変換。３ｍｇの小粒化パラホルムアルデヒドを、２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２５ｍＬフラスコ中の２０ｍＬのＭ９培地（２．５ｍＭホルムアルデヒド当量）に添加する。これらの条件下では、ホルムアルデヒドはミリモル以下の濃度でしか蓄積しない。 図１５は、パラホルムアルデヒド可溶化率及びパラホルムアルデヒドによる休止細胞生物変換を示した図である。ａ）粒子サイズの異なる市販のパラホルムアルデヒド（ｐＦＡＬＤ）の可溶化率。可溶化速度は、２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２５ｍＬフラスコ中の１０ｍＬのＭ９培地で測定される。ｂ）４０μＭのクメート（ｃｕｍａｔｅ）及び１００μＭのＩＰＴＧで誘導された、ＢｓｍＨＡＣＬ、ＬｍＡＣＲ、及びＡｌｄＡを発現する株の休止細胞生物変換。３ｍｇの小粒化パラホルムアルデヒドを、２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２５ｍＬフラスコ中の２０ｍＬのＭ９培地（２．５ｍＭホルムアルデヒド当量）に添加する。これらの条件下では、ホルムアルデヒドはミリモル以下の濃度でしか蓄積しない。 図１６は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５ｍＭパラホルムアルデヒドを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１６は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５ｍＭパラホルムアルデヒドを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１６は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５ｍＭパラホルムアルデヒドを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１６は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５ｍＭパラホルムアルデヒドを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１７は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５００ｍＭメタノールを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１７は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５００ｍＭメタノールを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１７は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５００ｍＭメタノールを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１７は、グリコレート（glycolate）、ホルメート（formate）、及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイル、並びに５００ｍＭメタノールを使用した二株系におけるセンサー株の細胞増殖を示した図である。ａ）生産株がＨＡＣＬを発現しなかった時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。ｃ）生産株がＨＡＣＬを発現する経時変化。ｄ）パネルｃに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１８は、１ｍＭホルムアルデヒド及び１０ｍＭホルメート（formate）を使用した二株系におけるグリコレート（glycolate）及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイルを示した図である。ａ）生産株がＢｓｍＨＡＣＬを発現する時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。 図１８は、１ｍＭホルムアルデヒド及び１０ｍＭホルメート（formate）を使用した二株系におけるグリコレート（glycolate）及びホルムアルデヒドの濃度の時間経過プロファイルを示した図である。ａ）生産株がＢｓｍＨＡＣＬを発現する時間経過。ｂ）パネルａに示す時間経過の代表的な実験からのプレート。２．５ｇ／Ｌグリコレート（glycolate）を含む最小培地プレートに、様々な時点で５０μＬの培養物（５×１０－３希釈物）を播種した。全てのデータは、２連のレプリケート（ｎ＝２）について示されている。線グラフは平均値に描画されている。
本開示をより詳細に説明する前に、本開示は、記載された特定の実施形態に限定されず、当然、変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。
値の範囲が提示される場合、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその指定された範囲内の任意の他の指定値又は介在値は、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限定に従うことを条件として、本開示にも包含される。記載された範囲が限定の一方又は両方を含む場合、含まれる限定のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用され全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法及び材料も、本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで説明する。
本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、あたかも個々の刊行物又は特許が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用され、前記刊行物が引用されることに関連した方法及び／又は材料を開示及び説明する目的で参照により本明細書に援用される。刊行物の引用は、出願日より前の開示のためのものであり、本開示が先行開示のおかげでそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提示された刊行日は実際の刊行日とは異なる場合があるため、個別の確認を要する場合がある。
本開示を理解すれば当業者には明らかであるように、本明細書で説明及び図示した個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲又は精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離する又は組み合わせることが可能な個別の構成要素及び特徴を有する。列挙された方法はいずれも、列挙されたイベントの順序で、又は論理的に可能な他の順序で実行され得る。
本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当業者の範囲内である化学、及び生物学などにおける技術を使用する。
以下の実施例は、当業者に、本明細書で開示及び特許請求される方法の実施及びプローブの使用の完全な開示及び説明を提供するために提示される。数値（例えば、量や温度など）については正確を期すよう努めているが、多少の誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部、温度は℃、圧力は大気圧又は大気圧に近い値である。標準温度及び標準圧力は、２０℃及び１気圧として定義される。
本開示の実施形態を詳細に説明する前に、別段の指示がない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応材料、又は製造プロセスなどに限定されず、よってそれらは変化し得る。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。本開示では、論理的に可能な場合、異なる順序で工程を実行することも可能である。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
本明細書で定義されるように、「組換え宿主微生物」、「遺伝子改変宿主微生物」、「改変宿主微生物」、及び「遺伝子修飾宿主微生物」という語句は、交換可能に使用することができ、（ａ）１又は複数の外因性ポリヌクレオチドを発現する、（ｂ）１又は複数の内因性及び／又は１又は複数の外因性ポリヌクレオチド、例えば、ベクターに含まれるもの又は内因性遺伝子の発現に変化を有するものなどを過剰発現する、又は（ｃ）内因性遺伝子をノックアウト又はダウンレギュレートするように遺伝子改変された宿主微生物を指す。さらに、特定の遺伝子がゲノムから物理的に除去されるか（例えば、ノックアウト）、活性が低下、変化、又は増強されるように改変される場合がある。
「改変する」、「遺伝子改変する」、又は「遺伝子修飾する」という用語は、微生物に検出可能な変化をもたらす微生物の任意の操作を指し、この操作には、異種（外因性）ポリヌクレオチドを介して非天然の代謝機能を導入することか、ポリヌクレオチドの欠失、変異、又はノックアウトを介して天然の機能を除去することが含まれるが、これらに限定されない。「代謝的に改変された」という用語は、通常、所望の代謝物質の産生のための、生合成遺伝子（ＯＲＦ）、オペロンに関連する遺伝子、及びそのようなポリヌクレオチドの制御要素の合理的な経路設計及び構築を含む。「代謝的に改変された」はさらに、遺伝子工学を使用した転写、翻訳、タンパク質安定性、及びタンパク質機能の調節及び最適化による代謝フラックスの最適化、並びに目的の経路につながる中間体と競合する競合代謝経路の減少、破壊、又はノックアウトを含む適切な培養条件を含み得る。
「代謝改変微生物」及び「修飾された微生物」という語句は、本明細書では交換可能に使用され、特定の対象宿主細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は可能性のある子孫を指す。変異又は環境の影響のいずれかにより、特定の修飾が後続の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、そうであっても本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
本明細書で使用される「変異」という用語は、（すなわち、野生型核酸又はポリペプチド配列に対して）変化した核酸又はポリペプチドをもたらす核酸及び／又はポリペプチドの任意の修飾を示す。変異には、例えば、ポリヌクレオチド（又はコードされたポリペプチド）における単一又は複数の残基の点変異、置換、欠失、又は挿入が含まれ、これらには遺伝子のタンパク質コード領域内で生じる変化、並びにタンパク質コード配列の外側の領域における変化、限定されるものではないが調節配列又はプロモーター配列などが含まれる。遺伝子変化は、あらゆる種類の変異であり得る。例えば、前記変異は、遺伝子の一部又は全部の点（突然）変異、フレームシフト（突然）変異、挿入、又は欠失を構成してもよい。特定の実施形態では、遺伝子改変された微生物のゲノムの一部を、１又は複数の異種（外因性）ポリヌクレオチドで置換してもよい。いくつかの実施形態では、前記変異は自然発生的である。他の実施形態では、前記変異は人為的選択圧の結果である。さらに他の実施形態では、微生物ゲノムにおける変異は、遺伝子工学の結果である。
遺伝子配列、ＯＲＦ配列、又はポリヌクレオチド配列に関して「発現」又は「発現された」という用語は、遺伝子、ＯＲＦ、又はポリヌクレオチドの転写、及び必要に応じて、得られたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明らかなように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写及び翻訳から生じる。宿主微生物における所望の産物の発現レベルは、宿主に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は選択された配列によってコードされる所望の産物の量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲ又はノーザンハイブリダイゼーションによって定量化可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９を参照）。選択した配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法で（例えば、ＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることによって、又はタンパク質を認識して結合して反応する抗体を使用して、ウェスタンブロッティング又はラジオイムノアッセイなど、そのような活性とは独立したアッセイを採用することによって）、定量できる。
ポリヌクレオチド（及びその中にコードされるポリペプチド）に関して本明細書で使用される用語「内因性」は、ポリヌクレオチド及びポリペプチドが由来する生物において発現される（すなわち、それらは生物にとって先天的である）ことを示す。一方、「異種」及び「外因性」という用語は交換可能に使用され、ポリヌクレオチド（及びその中にコードされるポリペプチド）に関連して本明細書で定義されるように、それら（すなわち、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列）が起源を有する又は由来する生物以外の生物で発現されるポリヌクレオチド及びポリペプチドを示す。
「原料」という用語は、微生物又は発酵プロセスに供給される原材料又は原材料の混合物として定義され、そこから他の産物を作ることができる。例えば、本発明で説明するように、メタン炭素源又はメタノール炭素源又はホルムアルデヒド炭素源は、単独で又は組み合わせて、発酵プロセスにおいてバイオ燃料又はバイオベースの化学物質を生成する微生物の供給原料である。しかしながら、本発明の原料（例えば、メタン基質）に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び当業者に公知であり、培養物の増殖及び複数炭素化合物の生成に必要な酵素経路の促進に適した他の成分を含む。
「基質」という用語は、酵素の作用によって別の化合物に変換される、又は変換されることを意味する、任意の物質又は化合物を指す。この用語は、単一の化合物だけでなく、溶液、混合物、及び少なくとも１つの基質を含む他の物質、又はその誘導体などの化合物の組み合わせも含む。さらに、「基質」という用語は、出発物質（例えば、メタン）としての使用に適した炭素源を提供する化合物だけでなく、本明細書に記載の代謝改変微生物に関連する経路で使用される中間産物及び最終産物の代謝物質も包含する。
本明細書で使用される「天然の複数炭素基質（native multi-carbon substrate）」という用語は、微生物の増殖を可能にする増殖基質又は代謝物質として機能する複数炭素化合物を指す。
「発酵」又は「発酵プロセス」という用語は、宿主微生物が原料及び栄養素などの原材料を含む培養培地で培養され、前記微生物が原料などの原材料を産物に変換するプロセスとして定義される。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では「核酸」という用語と交換可能に使用され、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はそれらの類似体を含む２以上のモノマーで構成される有機ポリマーを指し、任意の長さの一本鎖又は二本鎖のセンス又はアンチセンスデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及び必要に応じて、ｓｉＲＮＡを含む任意の長さの一本鎖又は二本鎖のセンス又はアンチセンスリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。「ヌクレオチド」という用語は、プリン又はピリミジン塩基及びリン酸基に結合したリボース又はデオキシリボース糖からなり、核酸の基本構造単位であるいくつかの化合物のいずれかを指す。「ヌクレオシド」という用語は、デオキシリボース又はリボースと結合したプリン又はピリミジン塩基からなり、特に核酸に見られる化合物（グアノシン又はアデノシンとして）を指す。「ヌクレオチド類似体」又は「ヌクレオシド類似体」という用語は、それぞれ、１又は複数の個々の原子が異なる原子又は異なる官能基で置換されているヌクレオチド又はヌクレオシドを指す。したがって、ポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＯＲＦ、それらの類似体及び断片を含む、任意の長さの核酸を含む。
本明細書で定義されるように、「オープンリーディングフレーム」（以下、「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を表す一連の２以上のコドン、及び（ｉｉｉ）終止コドン（ＯＲＦは５’から３’方向に読み取られる又は翻訳される）からなる中断されてないリーディングフレームを含む核酸又は核酸配列（天然、非天然、又は合成のいずれか）を意味する。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは「遺伝子」を含み、本明細書に記載の核酸分子は「ベクター」又は「プラスミド」を含むことが理解される。したがって、「遺伝子」という用語は、１若しくは複数のタンパク質又は酵素の全部又は一部を含み、例えば遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る、アミノ酸の特定の配列をコードするポリヌクレオチドを指す。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）、及び３’－ＵＴＲを含む非翻訳領域、並びにコード配列を含み得る。
「プロモーター」という用語は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御可能な核酸配列を指す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、本来の遺伝子に完全に由来するか、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成され、又は合成核酸セグメントを含むことさえあり得る。当業者は、異なるプロモーターが、異なる組織又は細胞型において、又は発生の異なる段階において、又は異なる環境若しくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることを理解する。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、通例「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があることが認識されている。
「動作可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響を受けるように、単一の核酸断片上で核酸配列が結合することを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現をもたらすことが可能である場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と動作可能に連結されている。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向で調節配列に動作可能に連結することができる。
「コドン最適化」という用語は、様々な宿主の形質転換のための核酸分子（又はＯＲＦ）の遺伝子又はコード領域に言及する場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するように核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンを変更することを指す。
「オペロン」という用語は、共通のプロモーターから単一の転写単位として転写される２以上の遺伝子を指す。特定の実施形態では、オペロンを含む遺伝子、ポリヌクレオチド、又はＯＲＦは近接遺伝子である。オペロン全体の転写は、共通のプロモーターを修飾することによって修飾（すなわち、増加、減少、又は排除）できることが理解される。あるいは、オペロン中の任意の遺伝子、ポリヌクレオチド、若しくはＯＲＦ、又はそれらの任意の組み合わせを修飾して、コードされたポリペプチドの機能又は活性を変更することができる。修飾は、コードされたポリペプチドの活性又は機能の増加又は減少をもたらし得る。さらに、修飾は、コードされたポリペプチドに新たな活性を与え得る。
「ベクター」は、生物、細胞、又は細胞成分の間で核酸を増殖及び／又は移動させることができる任意の手段である。ベクターには、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、及びＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が含まれ、これらは「エピソーム」であり、すなわち、自律的に複製するか、宿主微生物の染色体に組み込むことができる。ベクターは、天然ではエピソームではない、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内のＤＮＡ及びＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリジン結合ＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡ又はＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどであってもよく、アグロバクテリウム又は細菌などの上記のポリヌクレオチド構築物の１又は複数を含む生物であってもよい。
「ホモログ」という用語は、第１の科又は種の元の酵素、ポリペプチド、遺伝子、又はポリヌクレオチド（又はそれらをコードするＯＲＦ）に関して使用される場合、第２の科又は種の特徴的な酵素、遺伝子、又はポリヌクレオチドであって、機能的、構造的、又はゲノム分析によって、前記第２の科又は種の酵素、遺伝子、又はポリヌクレオチドであると決定され、第１の科又は種の元の酵素又は遺伝子に対応するものを指す。ほとんどの場合、「相同体」は、機能的、構造的、又はゲノム上の類似性を有する。酵素、遺伝子、又はポリヌクレオチドの相同体を、遺伝子プローブ及びＰＣＲを使用して容易にクローニングできる技術が公知である。「相同体」としてのクローン配列の同一性は、機能アッセイ及び／又は遺伝子のゲノムマッピングを使用して確認できる。
ポリペプチド（又はタンパク質又は酵素）は、ポリペプチドをコードする核酸配列が第２のポリペプチドをコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、第２のポリペプチドに対して「相同性」を有するか又は「相同」である。あるいは、ポリペプチドは、２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、第２のポリペプチドに対して相同性を有する。したがって、「相同タンパク質」又は「相同ポリペプチド」という用語は、２つのポリペプチドが類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。本発明の特定の実施形態では、表１に示される１又は複数のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドに相同なポリヌクレオチド及びポリペプチドは、配列分析及び比較のために当技術分野で公知の方法を使用して容易に同定することができる。
本明細書で使用される「ＣｏＡ」という用語は、コエンザイムＡを指す。
本発明の相同なポリヌクレオチド又はポリペプチド配列はまた、クエリヌクレオチド又はポリペプチド配列を公知の配列のデータベースと比較するＢＬＡＳＴ分析（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）又は同様のバイオインフォマティクスツールによって決定又は同定され得る。例えば、ＢＬＡＳＴを使用して検索分析を行って、以前に公開された配列との配列の同一性又は類似性を判断することができ、配列がまだ公開されていない場合は、ＤＮＡ又はタンパク質配列の機能に関連する洞察を得ることができる。
本発明は、Ｃ１基質での増殖を可能にする経路をそれらに付与するように改変された系及び微生物を提供する（前記改変された／合成経路がなければ、前記微生物はＣ１基質上で増殖することができない）。いくつかの実施形態では、前記系は、Ｃ１基質と、Ｃ１基質上で増殖可能な修飾された生物とを含む。本発明は、Ｃ１基質の細胞へ変換する（すなわち、Ｃ１基質上での増殖）系、生物、及び方法を提供する。実施例及び図７～図９、図１４、及び図１６～図１８（及びこれらの図に関連する資料）で実証されるように、Ｃ１基質上での増殖が実証される。
様々な実施形態において、本発明は、前記生物のエネルギー源及び炭素源の両方として機能する単炭素（Ｃ１）化合物を提供する。様々な還元レベルの単一炭素分子が相互変換されて、炭素骨格を伸長するために使用される単一炭素単位であるホルミル－ＣｏＡが生成される。ギ酸アシル転移酵素の使用に基づくＣ１原料の生物変換のための系及び方法は、国際公開第２０１７／２１０３８１号に記載されており、これらの教示について参照により援用される。対照的に、開示された系は、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ（ＨＡＣＬ）によって触媒される反応において、ホルミル－ＣｏＡをＣ１ビルディングブロック又は伸長単位として使用する。このアプローチは、設計（全体的な反応工程が少ない）及び実際面（酸素許容量が増加）の両方においてより簡単である。
いくつかの実施形態では、単炭素（Ｃ１）分子が単独で供給される炭素源である。これらの状況では、１炭素アシル－ＣｏＡ、ホルミル－ＣｏＡが生成される。いくつかの実施形態では、ホルメート（formate）は、適切なアセチル－ＣｏＡ合成酵素によって直接的に、又は適切なギ酸キナーゼ（formate kinase）及びリン酸アセチル－転移酵素によって中間体のホルミル－リン酸を介して、ホルミル－ＣｏＡに変換することができる。ホルムアルデヒドは、適切なアシル－ＣｏＡレダクターゼによってホルミル－ＣｏＡに変換することもできる。
上記の反応の組み合わせを使用して、他の単一炭素分子からホルミル－ＣｏＡを生成することができる。例えば、メタンを利用する実装には、メタンモノオキシゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、及びアシル－ＣｏＡレダクターゼの発現が含まれる。記載された反応及び付随する酵素のさらに多くの組み合わせを使用して、単一炭素単位の混合物、例えば、記載されている全ての反応によるメタン及び二酸化炭素の組み合わせを使用する実装を可能にすることができる。少なくとも、この機能は、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現によってホルムアルデヒドから、又は適切なアセチル－ＣｏＡ合成酵素若しくは組み合わせたギ酸キナーゼ（formate kinase）及びリン酸アセチル転移酵素によってホルメート（formate）から達成することができる。
したがって、従属栄養生物が増殖のために単一炭素（Ｃ１）基質（例えば、メタン、メタノール、二酸化炭素、ホルメート（formate）、ホルムアルデヒド）を利用可能とする方法が、本明細書に開示され、この方法は、単一炭素基質をホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドに変換する第１の代謝酵素のセット、及び代謝酵素が所望の炭素長のアルデヒド又はアルドース中間体を生成するのに適した条件下でＣ１基質を前記系に供給する、アルドース又はアルデヒド（生成されたホルムアルデヒドを含む）をホルミル－ＣｏＡ分子で伸長する第２の代謝酵素のセット、並びに、任意選択的に（optionally）、前記アルデヒド又はアルドース中間体を所望の複数炭素化学物質に変換するための第３の代謝酵素のセットを含む細胞系を提供する工程を含む。
開示された系及び方法における第１の工程は、一炭素基質（例えば、メタン、メタノール、二酸化炭素、ホルメート（formate）、ホルムアルデヒド）のホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドへの変換である。この工程は、本明細書ではＣ１活性化と称される。
通常、メタン（ＣＨ４）からホルムアルデヒド（Ｈ２Ｃ＝Ｏ）及びホルミル－ＣｏＡへの変換には、少なくとも以下の３つの工程が必要である：（１）メタン（ＣＨ４）基質は、最初にメタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ：ＥＣ １．１４．１３．２５）を介してメタノール（ＣＨ３ＯＨ）に酸化される、（２）その後メタノール（ＣＨ３ＯＨ）は、メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ：Ｅ．Ｃ． １．１．１．２４４、１．１．２．７）を介してホルムアルデヒド（Ｈ２Ｃ＝Ｏ）に酸化される、及び（３）ホルムアルデヒド（Ｈ２Ｃ＝Ｏ）の一部は、アシル－ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ）を介してホルミル－ＣｏＡに酸化される。例示的なアシル－ＣｏＡレダクターゼ又はアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼには、脂肪アシル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．８４）、スクシニル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．７６）、アセチル－ＣｏＡレダクターゼ、ブチリル－ＣｏＡレダクターゼ、プロピオニル－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．２．１．１０）が含まれる。
通常、二酸化炭素（ＣＯ２）からホルミル－ＣｏＡへの変換では、最初にＣＯ２基質がギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase）（Ｅ．Ｃ． １．２．１．２）を介してギ酸（ＨＣＯＯ－）に還元される必要がある。生成されたギ酸は、３つの経路のいずれかによってホルミル－ＣｏＡに変換できる。いくつかの実施形態では、前記ホルメート（formate）は、アシル－ＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ：Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）を介してホルミル－ＣｏＡに変換される。いくつかの実施形態では、前記ホルメート（formate）は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦａｌｄＤＨ：Ｅ．Ｃ．１．２．１．４６）によってホルムアルデヒド（Ｈ２Ｃ＝Ｏ）に変換され、その後、アシル－ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ：Ｅ．Ｃ． Ｅ．Ｃ． １．２．１．－、例えば、１．２．１．１０、１．２．１．７６、１．２．１．８４）を介してホルミル－ＣｏＡに酸化される。いくつかの実施形態では、前記ホルメート（formate）は、ギ酸キナーゼ（formate kinase）（ＦＯＫ：Ｅ．Ｃ．２．７．２．６）を介してホルミル－リン酸に変換され、次いでホスホトランスアシラーゼ（ＰＴＡ：ＥＣ ２．３．１．８）を介してホルミル－ＣｏＡに変換される。
本明細書に開示されるように、ホルミル－ＣｏＡは、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ（ＨＡＣＬ）又はオキサリル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＯＸＣ：Ｅ．Ｃ．４．１．１．８）によって触媒される反応において、Ｃ１ビルディングブロック又は伸長単位として使用され得る。これらの酵素は、ホルミル－ＣｏＡを、Ｃ１化合物のホルムアルデヒドを含む、幅広い鎖長及び機能を有する様々なカルボニル含有アクセプターと連結できる。したがって、本明細書では、ＨＡＣＬ触媒反応の産物である２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを、ホルミル－ＣｏＡによってさらに伸長可能なアルデヒドに変換する反応経路を開示する。
いくつかの実施形態では、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡは、アシル－ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ：Ｅ．Ｃ．１．２．１．－、例えば、１．２．１．１０、１．２．１．７６、１．２．１．８４）によって２－ヒドロキシアルデヒドに還元される。ＨＡＣＬによるホルミル－ＣｏＡとの２－ヒドロキシアルデヒドのさらなるライゲーションにより、ポリヒドロキシアシル－ＣｏＡ及びさらなるポリヒドロキシアルデヒド（一般にアルドースとして公知）が得られる。ポリヒドロキシアルデヒドは、原則として、本明細書で「アルドース伸長」と称されるＨＡＣＬ触媒反応の基質として働くことができる。
適切な１，２－ジオールオキシドレダクターゼ（ＤＯＲ：Ｅ．Ｃ． １．１．１．７７）又はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ：Ｅ．Ｃ． １．１．１．７１）によって、２－ヒドロキシアルデヒドをさらに還元して１，２－ジオールを得ることができる。いくつかの実施形態では、ＤＯＲは大腸菌ＦｕｃＯである。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＦｕｃＯは、この酵素の教示のために参照により援用されるＰｅｒｅｉｒａ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇ． ３４， ８０－８７ （２０１６）に記載されている。バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ＲｈａＯは、この酵素の教示のために参照により援用されるＰａｔｅｌ， Ｅ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５９， ６７８－６８４ （２００８）に記載されている。クロストリジウム・スフェノイデス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｈｅｎｏｉｄｅｓ）ＤＯＲは、この酵素の教示のために参照により援用されるＴｒａｎ－Ｄｉｎ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １４２， ８７－９２ （１９８５）に記載されている。メタノール資化性菌（Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｕｓ ｅｂｕｒｎｅｕｓ）ＤＯＲは、この酵素の教示のために参照により援用されるＫａｗａｇｉｓｈｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ４４， ９４９－９５０ （１９８０）に記載されている。通性嫌気性細菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）ＤＯＲは、この酵素の教示のために参照により援用されるＷｅｉｍｅｒ， Ｐ．Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４７， ２６３－２６７ （１９８４）に記載されている。
１，２－ジオールの脱水は、ジオール脱水酵素（ＤＤＲ：Ｅ．Ｃ． ４．２．１．２８）の活性によって触媒され、アルデヒドを生成する。本明細書で「アルデヒド伸長」と称される、ホルミル－ＣｏＡによるアルデヒドのさらなる伸長は、脂肪酸生合成又は逆β－酸化経路と同様に、アルキル鎖の伸長をもたらす。
いくつかの実施形態では、上記の経路の組み合わせは、いくつかの分子についてはアルドース伸長によって伸長が起こり、他の分子についてはアルデヒド伸長によって伸長が起こるように同時に実施することができる。両方の経路は、同じ系に同時に存在し得る。
いくつかの実施形態では、上記の反応の中間体は、微生物の増殖のための代謝物質として機能する。他の実施形態では、上記反応の中間体は、微生物の増殖基質への前駆体として働くか、又は前駆体に変換される。これらの産物の例は、図２で強調表示されており、ケト酸、ヒドロキシ酸、アルデヒド、ジオール、及びポリオールが挙げられる。
いくつかの実施形態において、記載された経路は、微生物宿主の文脈内で提示される。いくつかの実施形態では、微生物宿主を発酵系で培養して、複数炭素分子を生成する。他の実施形態では、微生物系を使用して酵素を生成し、次いで酵素を無細胞系で使用するために微生物から抽出する。他の実施形態では、前記酵素は別々に生成され、前記系に個別に添加される。
いくつかの実施形態では、微生物系は、複数の改変微生物宿主から構成され、Ｃ１利用、バイオマス生成、及び産物合成の機能は複数の生物に分割されていて、前記生物は、共培養として知られる発酵システムで培養され、共培養の全体的な結果は、バイオマス及び／又は化学産物へのＣ１基質の変換である。
生物系の経路は通常、１又は複数の酵素をコードする遺伝子を含む１又は複数の発現ベクターで微生物を形質転換することによって作られるが、前記遺伝子は、組換え工学、相同組換え、遺伝子編集、及び同様の技術によって染色体に追加することもできる。必要なタンパク質が内因性である場合、いくつかの例の場合のように、そのままで充分な場合もあるが、通常は機能性を高め、活性酵素レベルを制御するために過剰発現させる。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子の１若しくは複数又は全てが、誘導性プロモーターの制御下にある。
必要であれば、酵素をゲノムに、又は発現ベクターを介して添加することができる。好ましくは、複数の酵素が１つのベクターで発現されるか、又はコード領域間に必要なシグナルを追加することによって、複数の酵素を１つのオペロンに組み合わせることができる。さらなる改善は、例えば、プラスミド又は他のベクターを介して細胞に余分なコピーを追加することによって、酵素の１又は複数、さらには全てを過剰発現させることによって得ることができる。最初の実験では、便宜上３以上のＯＲＦをホストする発現プラスミドを使用する場合があるが、安定性の理由からオペロン又は個々の遺伝子をゲノムに挿入することが好ましい場合がある。
例えば、アセテート（acetate）、ホルメート（formate）、エタノール、及びラクテート（lactate）を生成するための経路などの競合する経路を減少又は抑制することにより、収率のさらなる改善を得ることができ、これらの経路を減少又はノックアウトする方法は、当技術分野で既に周知である。例えば、それぞれ、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，５６９，３８０号、第７，２６２，０４６号、第８，９６２，２７２号、第８，７９５，９９１号、第８，１２９，１５７号、及び第８，６９１，５５２号を参照。他の多くも当分野で功を奏している。
改変経路を含む適切な菌株の構築に続いて、開発された菌株の培養を実行して、意図した目標である単一炭素化合物からの産物の生成での経路の有効性を評価できる。生物は、適切な増殖培地で培養することができ、メタンからＣＯ２まで、単独球は複数炭素分子と組み合わせて、単一炭素基質上での産物形成について評価することができる。生物によって生成される産物の量は、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定でき、増殖率、生産性、力価、収率、又は炭素効率などの性能の指標を決定できる。
経路の酵素同士及び宿主系との相互作用をさらに評価することで、経路の性能を最適化し、有害な影響を最小限に抑えることができる。前記経路は、生物の本来進化した調節メカニズムではなく、合成制御下にあるため、前記経路の発現は通常、細胞増殖や生成を遅らせる可能性のある問題を回避し、目的の化合物の生成を最適化するために手動で調整される。
さらに、相対的な酵素活性の不均衡は、経路全体の全体的な炭素フラックスを制限する可能性があり、最適ではない生成速度と経路中間体の蓄積につながり、経路酵素を阻害したり、細胞毒性を示したりする場合がある。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はＧＣによる細胞培養の分析は、構築された株によって生成される代謝中間体を明らかにすることができる。この情報は、潜在的な経路の問題を示している可能性がある。
経路のインビボでの発現に代わるものとして、経路の無細胞インビトロ版を構築することができる。各反応工程に関連する酵素を精製することにより、反応混合物で必要な酵素を組み合わせて、全体的な経路を組み立てることができる。関連する補因子及び基質を追加することで、宿主とは無関係に経路の性能を評価できる。
いくつかの実施形態では、二酸化炭素、ホルメート（formate）、ホルムアルデヒド、メタノール、メタン、及び一酸化炭素などの単一炭素分子が、少なくとも１つのカルボキシル基を含む産物の生成に単独で使用される。この実施形態では、ホルムアルデヒド及びホルミル－ＣｏＡの両方が、前述のように単一炭素分子から生成される。
遺伝子合成及びＤＮＡクローニング、並びにベクター及びプラスミド構築のための通常の方法は、当技術分野で周知であり、多くの刊行物に記載されている。より具体的には、消化及びライゲーションに基づくクローニング、並びにインビトロ及びインビボ組換え法などの技術を使用して、基質から産物への変換を適切なベクターに触媒するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み立てることができる。これらの方法には、制限消化クローニング、配列及びライゲーションに依存しないクローニング（ＳＬＩＣ）、ゴールデン・ゲート・クローニング、及びギブソン・アセンブリなどが含まれる。これらの方法の一部は、ハイスループット・アプリケーション向けに自動化及び小型化できる。
宿主微生物において改変代謝経路を発現するための遺伝子カセットは、当技術分野で公知である。カセットは、１又は複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる。ＯＲＦは、導入された経路の酵素、オペロン内の下流ＯＲＦの転写を指示するプロモーター、個々のＯＲＦによってコードされるｍＲＮＡの翻訳を指示するリボソーム結合部位、及び転写ターミネーター配列をコードする。発現カセットの様々な構成要素のモジュール性により、１又は複数の位置で異なる構成要素を置換することにより、当業者はこれらの配置の組み合わせ順列を作成できる。当業者は、１又は複数のＯＲＦの方向性を逆にして、これらの代替配向のいずれかが産物の収率を改善するかどうかを決定することもできる。
いくつかの実施形態では、プラスミドを発現するための宿主微生物はメタノトローフ（ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈ）であり、代謝経路発現カセットを含むプラスミドベクターは、接合によってこれらの生物に動員される。
微生物宿主において代謝経路遺伝子を発現させる別の方法では、生合成経路遺伝子を染色体に直接挿入することができる。染色体修飾の方法には、非標的化及び標的化欠失及び挿入の両方が含まれる。
いくつかの実施形態では、開示された系及び方法は、発酵ブロスから所望の産物を回収及び精製することも含む。使用する方法は、産物の物理化学的特性、並びに発酵培地及び細胞の性質及び組成によって決定される。例えば、米国特許第８，１０１，８０８号は、連続フラッシュ蒸発及び相分離処理を用いて発酵ブロスからＣ３ーＣ６アルコールを回収する方法を記載している。いくつかの実施形態において、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションによって発酵培地から除去され得る。いくつかの実施形態では、前記複数炭素化合物は、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、又はパーベーパレーション（浸透気化）などの方法を使用して発酵培地から単離される。
脂肪アルコールなどの長鎖アルコールの場合、米国特許第８，２６８，５９９号は、二相分離によって発酵の水相からこれらの成分を分離する方法を記載しており、それによって生成化合物と発酵ブロスとの不混和性により、有機相を収集して除去することができる。この分離は、宿主微生物細胞に対する産物の毒性効果を低減することもできる。米国特許出願公開第２００７／０２５１１４１号は、尿素を添加し、飽和及び不飽和の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を別々に回収可能な相分離を生じさせることによって、液体懸濁液から脂肪酸メチルエステルを回収する方法を記載している。膜分離法は、バイオディーゼルなどの脂肪酸エステル産物の精製にも適用できる。
特定の実施形態において、本発明のメタン基質は、天然ガス源から提供又は取得され、天然ガスは「ウェット（湿潤）」天然ガス又は「ドライ（乾燥）」天然ガスである。天然ガスは、他の一般的に関連する炭化水素のほとんどが除去された、ほとんど純粋なメタンである場合、「ドライ」天然ガスと称される。他の炭化水素が存在する場合、天然ガスは「ウェット」と称される。ウェット天然ガスは、典型的には、約７０％～９０％のメタン、約０％～２０％のエタン、プロパン、及びブタン（合計）、約０％～８％の二酸化炭素（ＣＯ２）、約０％～５％の窒素（Ｎ２）、約０％～５％の硫化水素（Ｈ２Ｓ）、並びに微量の酸素、ヘリウム、アルゴン、ネオン、及びキセノンで構成される。特定の他の実施形態では、本発明のメタン基質は、メタン放出物又はメタンオフガスから提供又は取得される。メタン放出物又はメタンオフガスは、固形廃棄物の埋め立て地での嫌気性分解、反芻動物の腸内発酵、消化槽及び廃水処理作業での有機固形物の分解、化石燃料の回収、輸送、処理でのメタン漏出などのシステムを含む、様々な自然及び人間の影響を受けたプロセスによって生成される。
本発明の多数の実施形態を説明してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことが可能であることが理解されるべきである。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
実施例１：
本実施例では、宿主生物の中央代謝プロセスに直交し（Ｐａｎｄｉｔ， ＡＶ．， ｅｔ ａｌ Ｒ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８：１－１１ （２０１７））、新たに見出されたＨＡＣＬによるＣ１伸長単位としてのホルミル－ＣｏＡの応用に基づく標準的なＣ１代謝に代わるものを調べる。中央代謝プロセスが産物の合成と増殖との間の主要な分岐点である代謝の「ボウタイ」アーキテクチャ（図９Ａ）ではなく、直交アーキテクチャは、宿主の中心的かつ産物の合成経路から独立して産物の合成を可能にする（図１Ａ）。このタイプの代謝アーキテクチャは、多様な産物合成に必要な炭素骨格をＣ１基質から直接生成する能力に依存している。本実施例は、ホルミル－ＣｏＡ伸長（ＦＯＲＣＥ）経路に基づいて、この直交アーキテクチャを可能にする生化学的経路の概念化及び設計を報告し、それらの実現可能性及び性能の分析を提供し、プロトタイプシステムでのそれらの機能を実証する。ＦＯＲＣＥ経路は、微生物宿主生物に固有の増殖基質の生成を介して、バイオ製品合成及びＣ１栄養の必要性（C1-trophy）の両方の基礎として機能する。本実施例は、以前はそのような培地で増殖できなかった微生物を増殖可能とする一炭素基質を含む系を提供する。Ｃ１基質上でのこの増殖は新規性があり、一炭素基質を唯一のエネルギー源として利用する系設計によるものである。図７～図９、図１４、及び図１６～図１８（及びこれらの図に関連する資料）に、Ｃ１基質上での増殖の詳細が記載されている。
結果
Ｃ１利用及び産物合成に基づく直交代謝アーキテクチャの設計
本明細書で展開される直交代謝アーキテクチャは、以下の３つの主要な特徴を有する：１）炭素鎖の伸長に適したビルディングブロックへのＣ１基質の活性化、２）サイクルごとに１つの炭素による炭素鎖の反復伸長、及び３）目的の産物の蓄積をもたらす経路の終結。以前の本発明者らの知見（Ｃｈｏｕ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １５：９００－９０６ （２０１９））に基づいて、ホルミル－ＣｏＡの使用に基づいて考案及び実装された設計を開発した。
代謝におけるホルミル－ＣｏＡの役割は、複数炭素化合物の分解において最もよく確立されており、Ｃ１分子からのホルミル－ＣｏＡの生成に関する報告はわずかである。しかしながら、アシル－ＣｏＡは、カルボキシレート（carboxylate）及びアルデヒドの形態間の便利な中間体であり、酸化Ｃ１基質及び還元Ｃ１基質の両方からホルミル－ＣｏＡの生成を可能にする（図１Ｂ：１炭素活性化パネル）。ホルムアルデヒドから、アシル－ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ）１６活性を介してホルミル－ＣｏＡを生成することができ、メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）によるホルムアルデヒドへのメタノール酸化は、数多くの研究の対象となっている１８－２０。ホルミル－ＣｏＡは、ＣｏＡ転移酵素２１又は無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）活性大腸菌アセチル－ＣｏＡ合成酵素（ＥｃＡＣＳ）６などのＣｏＡリガーゼによってホルメート（formate）から生成され得る。後者はＡＭＰ形成（２ＡＴＰ相当を消費）であるが、ギ酸キナーゼ（formate kinase）（ＦＯＫ）及びホスホトランスアシラーゼ（ＰＴＡ）を介した中間ホルミル－リン酸を介したＡＤＰ形成経路のエビデンスが存在する２２。ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦａｌｄＤＨ）によるホルメート（formate）のホルムアルデヒドへの還元を介した、ＡＴＰに依存しないホルメート（formate）のホルミル－ＣｏＡへの変換も可能２３であるが、熱力学的には困難である（図１Ｂ）。さらに、二酸化炭素（ＣＯ２）はギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase）（又は二酸化炭素レダクターゼ）２４，２５の逆活性によってホルメート（formate）に変換でき、メタンモノオキシゲナーゼ２６によってメタンをメタノールに変換できる。これは、上記の反応に結合する場合、ホルミル－ＣｏＡの形成になり得る。
Ｃ１伸長による多様な炭素骨格の新たな（ｄｅ ｎｏｖｏ）直交構築には、Ｃ２ーＣ５代謝物質２７から炭素骨格を構築する自然界に見られるものと同様の反復経路が必要であるが、中央代謝の外側に存在している。２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ（ＨＡＣＬ）は広い炭素鎖長特異性を有するため１６、反復経路を確立するための優れた候補である。ＨＡＣＬ触媒反応の産物である２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを、ホルミル－ＣｏＡによってさらに伸長可能なアルデヒドに変換することにより、見込みのある反復を可能にする反応経路を評価した。α－炭素では、脱水が可能であり、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを、充分に確立されたアクリル酸経路２９に類似した２－エノイル－ＣｏＡ２８（図１０）に変換する（図１０）。これらの中間体はβ酸化に関与しているため、２－エノイル－ＣｏＡの生成も便利であり、β酸化反転プラットフォーム３０－３２のために確立された酵素ツールキット及び知識を利用できる可能性がある。ただし、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡの脱水は、３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡの脱水よりもはるかに困難であるため、酸素感受性のラジカル機構が必要である３３。また、β－炭素の存在も必要とするため、経路の実装が中間体の三炭素以上に制限される。
これらの問題により、チオエステルの変換を調べた。ＣｏＡ－チオエステルの還元により、２－ヒドロキシアルデヒドが得られる（図１Ｂ：ホルミル－ＣｏＡ伸長パネル）。これは、特定のアシル－ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ）の非特異的活性により可能である１６。ＨＡＣＬによるホルミル－ＣｏＡとの２－ヒドロキシアルデヒドのライゲーションにより、ポリヒドロキシアシル－ＣｏＡ及びさらなるポリヒドロキシアルデヒド（一般にアルドースとして公知）が得られる。ポリヒドロキシアルデヒドは、原則として、本明細書で「アルドース伸長」（図１Ｂ：ホルミル－ＣｏＡ伸長パネル）と称されるＨＡＣＬ触媒反応の基質として働くことができる。
ジオールオキシドレダクターゼ（ＤＯＲ）活性を介して２－ヒドロキシアルデヒドを還元して１，２－ジオールにすることも可能である。例えば、大腸菌ＦｕｃＯは、１，２－ジオールと２－ヒドロキシアルデヒドとの相互変換を触媒する３４。１，２－ジオールのアルデヒドへの脱水は、ジオール脱水酵素（ＤＤＲ）の活性によって触媒され、効果的にα－還元を達成する。ジオールの脱水にもラジカル機構が必要であるが、Ｂ１２依存性ＤＤＲは耐酸素性があり、多数のタンパク質及び代謝工学研究の対象となっている３５－３７。ホルミル－ＣｏＡによるこのアルデヒドの伸長（アルデヒド伸長と称する）により、脂肪酸生合成３８経路又は逆β酸化３９経路における二炭素伸長に類似した、アルキル鎖の伸長が可能になる。これらの経路（アルドース伸長、α－還元、及びアルデヒド伸長）は、炭素鎖伸長単位としてのホルミル－ＣｏＡの使用を促進するため、ホルミル－ＣｏＡ伸長（ＦＯＲＣＥ）経路と総称する（図１Ｂ：ホルミル－ＣｏＡ伸長パネル）。
中間体として、又はＦＯＲＣＥ経路の中間体の誘導体から様々な産物クラスを生成することができ（図１Ｂ）、その一部は微生物の増殖もサポートする（図９）。例えば、アルドース糖は、２－ヒドロキシアルデヒドのノードの直接の結果である。エチレングリコールなどの主要な工業用化学物質を含むジオールは、１，２－ジオールのノードの結果である。２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡのノードの誘導体には、工業製品のグリコール酸及び乳酸など、チオエステラーゼ触媒反応によって生成される２－ヒドロキシ酸が含まれる。他の産物の前駆体として機能するカルボン酸、アルコール、及びアシル－ＣｏＡを含む、多数の化学クラスをアルデヒドのノード４０から派生させることができる。
Ｃ１利用のためのＦＯＲＣＥ経路の熱力学的解析
経路反応の標準的なギブズ自由エネルギー（図１Ｂ）は、潜在的な困難な反応を容易に明らかにするが、反応が互いに影響を与える能力を考慮する経路熱力学の全体論的分析が必要である。このために、「最大最小駆動力（Ｍａｘ－Ｍｉｎ Ｄｒｉｖｉｎｇ Ｆｏｒｃｅ （ＭＤＦ））」アプローチを適用した４１。
ＦＯＲＣＥ経路のＭＤＦを評価して、Ｃ１基質からＣ２代謝物質のグリコレート（glycolate）及びアセテート（acetate）を生成した。物質移行の制限により二酸化炭素（ＣＯ２）及びメタンの利用が大幅に制限される可能性があり、この分析の範囲外であるため、可溶性Ｃ１基質のみを評価した。代表的なＣ２産物であるグリコレート（glycolate）及びアセテート（acetate）は経路産物及び増殖基質の両方であり、グリコレート（glycolate）は最短の経路を必要とし、アセテート（acetate）はアルデヒド伸長反応の全シーケンスを必要とする。図２Ａに示すように、各基質について、アセテート（acetate）よりもグリコレート（glycolate）生成への大きな駆動力がある。これは、熱力学的に有利なグリコリル－ＣｏＡの加水分解によるものであるが、アセテート（acetate）の生成にはグリコリル－ＣｏＡの熱力学的に困難な還元が必要である。代謝物質濃度の標準限界を使用すると４１、ホルムアルデヒドはＮＡＤ＋依存性メタノール酸化又はホルミル－ＣｏＡ還元をホルムアルデヒドに必要としないため、最大のＭＤＦを可能にする。しかしながら、メタノール酸化の熱力学的困難にもかかわらず、グリコレート（glycolate）及びアセテート（acetate）の純生成のための所望の方向性への充分な駆動力がある。ホルメート（formate）利用の駆動力は最も低い。ここで、ＡＴＰ加水分解はホルメート（formate）の活性化を助ける。２ＡＴＰ当量の加水分解は、アセテート（acetate）の純生成に充分な駆動力を提供するが、１ＡＴＰ当量の利用はグリコレート（glycolate）生成に充分な駆動力しか提供しない。予想どおり、ＡＴＰ非依存性のルートは、これらの条件下では実現可能ではない。
上記の分析では、代謝物質濃度の標準的な制約（１μＭ～１０ｍＭ４１）を想定しているが、Ｃ１基質の毒性などの物理的制限に基づいて現実的な基質濃度を適用しようとした（図２Ａ）。一部の生物は１０ｍＭ４２程度のホルムアルデヒド濃度で生存できるが、ホルムアルデヒドの上限はより合理的な０．１ｍＭに調整したところ、ＭＤＦが減少した。１００ｍＭ４３程度の濃度で使用したメタノールの上限を増加させると、ＭＤＦが増大した。興味深いことに、これらの濃度では、メタノール利用の駆動力はホルムアルデヒドの駆動力よりも大きくなる。同様に、大腸菌は１００ｍＭ９，４４程度のホルメート（formate）濃度の存在下で増殖する能力を有する。ホルメート（formate）濃度の上限を上げても、１又は２ＡＴＰ消費シナリオではＭＤＦに影響はなかったが、０ＡＴＰルートのＭＤＦには大きな影響があり、グリコレート（glycolate）の合成が可能になった。
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比も、経路の熱力学に対する主要な制約であった。好気性条件下での大腸菌の増殖を反映して、最初は０．１４１の制約を使用したが、生理的ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋は変動し、嫌気性条件下４５－４７で１に近い値又は１を超える値に達した。生理学的範囲（０．１～１）では、経路駆動力は、基質としてのホルムアルデヒド及びメタノールに対して正のままであった（図１１）。予想どおり、低い比率が好適であったのは、経路が酸化還元生成（メタノールからアセテート（acetate）／グリコール酸（glycolate）及びホルムアルデヒドからグリコレート（glycolate））であった場合であり、高い比率が好適であったのは、経路が酸化還元消費（ホルメート（formate）からアセテート（acetate）／グリコレート（glycolate）へ）又は酸化還元均衡（ホルムアルデヒドからグリコレート（glycolate）へ－おそらく、還元反応が熱力学的に難しいためである）であった場合である。ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比は、ホルメート（formate）利用経路の原動力にとって重要である（図２Ｂ）。ここで、ギ酸濃度を１００ｍＭに増加させることと組み合わせて生理学的範囲の上限にあるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比により、ＡＴＰ加水分解がなくても、グリコレート（glycolate）又はアセテート（acetate）の生成に対するポジティブな駆動力が可能になる。
さらに、中間の酸化還元状態により、ホルムアルデヒドを例示的な基質として使用して反復をサポートするＦＯＲＣＥ経路の能力を評価した。アルドース及びアルデヒドの両方の伸長経路の熱力学は、四炭素までの反復をサポートする（図２Ｃ）。四炭素になると、アルドース伸長モードは好適ではなくなり、これは、連続するアシル－ＣｏＡ還元反応の累積効果によるものと思われる。アルデヒド伸長モードは、おそらくＤＯＲ及びＤＤＲによって触媒される熱力学的に好ましい反応のために、同じアシル－ＣｏＡ還元を必要とするにもかかわらず、好適なままである。異なるＣ１活性化及び終結経路は、反復回数が少ない場合、伸長サイクル全体のＭＤＦに影響を与える。反復回数が増えるにつれて、伸長サイクル反応の熱力学が支配的になる（図１２）。
インビトロ経路検証
ＦＯＲＣＥ経路の重要な前提条件は、ホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドの生成である。これらの反応の機能を検証するために、異なるＣ１基質からのホルミル－ＣｏＡ及びＨＡＣＬ縮合産物のグリコリル－ＣｏＡの形成をモニターするための精製酵素系を開発した（図３）。
ホルミル－ＣｏＡはＡＣＲによってホルムアルデヒドから生成可能であるため、ホルミル－ＣｏＡ及びグリコリル－ＣｏＡの両方の形成について、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＣＲ（ＬｍＡＣＲ）及びロドスピリラレス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）菌ＵＲＨＤ００１７ ＨＡＣＬ（ＲｕＨＡＣＬ）１６をホルムアルデヒドを唯一のＣ１基質として使用した反応で観察した。ホルミル－ＣｏＡは、ホルメート（formate）の活性化によって酸化されたＣ１基質から派生させることもできる。オキサロバクター・ホルミゲネシス（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ（ＯｆＦｒｃ））由来のホルミル－ＣｏＡ転移酵素及びスクシニル－ＣｏＡをＣｏＡドナーとして使用すると、ホルミル－ＣｏＡへのホルメート（formate）活性化が観察され、ホルムアルデヒドの添加により、グリコリル－ＣｏＡが形成された。ホルメート（formate）を唯一の基質として使用すると、ホルムアルデヒドを添加した場合よりもグリコリル－ＣｏＡの生成が少ないにもかかわらず、ＬｍＡＣＲを使用したホルミル－ＣｏＡ還元によってホルムアルデヒドがインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成された。まとめると、これらの結果は、この酵素系では、酵素の活性又はＮＡＤ（Ｈ）の適切な形態の必要性による制約のいずれかにより、ＡＣＲ反応によって制限が課されることを示唆している。後者の仮説を支持して、酸化方向（すなわち、ホルムアルデヒドからホルミル－ＣｏＡへ）では、ＣｏＡチオエステルの加水分解後に観察されたグリコレート（glycolate）の量は、反応に加えられた１ｍＭのＮＡＤＨとほぼ同等であった。反対方向では、同等量未満のグリコレート（glycolate）が観察され、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の減少に伴って反応の熱力学が好適でなくなることと一致している（図１Ｂ、図２Ｂ）。
コア経路反応を検証した後、無細胞代謝工学４８を使用して、産物合成のためのＦＯＲＣＥ経路のプロトタイプを作成した。α還元性ＦＯＲＣＥ経路を含む各酵素を発現する大腸菌の抽出物を連続的に組み合わせ、段階的に経路機能を実証した（図４）。ＨＡＣＬ生成２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡのチオエステル切断を介した２－ヒドロキシカルボキシレート（例えば、グリコレート（glycolate））の直接生成以外に、他のＣ２産物並びにアルドース又はアルデヒド伸長経路は、この２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡの還元を必要とする（例えば、ホルムアルデヒド及びホルミル－ＣｏＡライゲーションのためのグリコリル－ＣｏＡ）（図１Ｂ：ホルミル－ＣｏＡ伸長パネル）。ＬｍＡＣＲがグリコールアルデヒド１６に作用可能であることを以前に見出したため、ホルミル－ＣｏＡへのホルムアルデヒド酸化及びグリコールアルデヒドへのグリコリル－ＣｏＡ還元の両方を触媒するために使用した（図４Ａ）。ＬｍＡＣＲ単独ではホルムアルデヒドからホルメート（formate）への変換のみとなったが、ＲｕＨＡＣＬを含めるとグリコレート（glycolate）が生成された（図４Ｂ）。グリコールアルデヒドは検出されなかった。これはおそらく、細胞抽出系に内因性のオキシドレダクターゼが存在し、グリコレート（glycolate）への酸化（例えば、ＡｌｄＡ、ＡｌｄＢ、ＰｕｕＣ、ＰａｔＤ）又は程度は低いものの、エチレングリコールへの還元（例えば、ＦｕｃＯ、ＹｑｈＤ、ＡｄｈＰ、ＥｕｔＧ、及びその他４９）を触媒した。
次の還元産物であるエチレングリコールの合成（図４Ａ）は、１，２－ジオールオキシドレダクターゼである大腸菌ＦｕｃＯを過剰発現する大腸菌の細胞抽出物を添加することによって有意に増加した（２倍増加、１．３７±０．１ｍＭ～２．７３±０．０３ｍＭ）（図４Ｂ）。クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ＤＤＲを発現する大腸菌細胞抽出物をコエンザイムＢ１２と共にさらに添加すると、エタノールが検出された（１時間で１．９０±０．０３ｍＭ、図４Ｂ）。これはおそらく、内因性オキシドレダクターゼによるアセトアルデヒド（エチレングリコール脱水によって形成された）の減少と、それに伴う対応するエチレングリコールの減少によるものである。後半の時点で、内因性オキシドレダクターゼ活性によるエタノール及びアセトアルデヒドの酸化による可能性が高いアセテート（acetate）の増加が観察された。
ＦＯＲＣＥ経路のインビボでの実装
設計したプラットフォームの重要な機能、並びに追加の産物の合成及び休止大腸菌培養物と増殖大腸菌培養物との両方を使用した様々なＣ１基質の利用の実証を試みた（図５及び図６）。ＦＯＲＣＥ経路設計の重要な特徴は反復性であり、アルドース又はアルデヒド伸長によって達成できる（図１Ｂ：ホルミル－ＣｏＡ伸長パネル、図２Ｃ）。インビボでの反復アルドース伸長を実証するために、ホルムアルデヒドからの三炭素産物であるグリセレート（glycerate）の合成を目標にした（図５Ａ）。Ｃ１異化及びグリコレート消費ノックアウト（ＡＣ４４０：ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ΔｆｒｍＡΔｆｄｈＦΔｆｄｎＧΔｆｄｏＧΔｇｌｃＤ）を有する、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ、ＬｍＡＣＲ、及びＥｃＡｌｄＡ１６を過剰発現する、開発済みの菌株から開始した。グリコールアルデヒドの蓄積及びホルミル－ＣｏＡとの縮合を促進するために、発現ベクターからＥｃＡｌｄＡを除去した。ホルムアルデヒドの消費は大幅に減少したが、グリコールアルデヒド及びグリセレート（glycerate）の蓄積が観察され（図５Ｂ）、反復的なアルドース伸長経路が示された。これらの化合物の生成を増やすために、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ΔａｌｄＡ ΔａｌｄＢ ΔｐａｔＤ ΔｐｕｕＣ、Δａｌｄｈと総称する）を除去し、ＥｃＡｌｄＡが過剰発現していない場合、グリコレート（glycolate）を減らし、グリコールアルデヒドを増やした。しかしながら、これらのノックアウトはグリセレートの蓄積に影響を与えず、おそらくＲｕＨＡＣＬによって触媒されるグリコールアルデヒド及びホルミル－ＣｏＡ間の縮合反応の制限を示していた。また、大腸菌ｆｕｃＯ５０を過剰発現させることにより、次の還元産物であるエチレングリコールへの経路を拡張した。これにより、細胞外培地でのエチレングリコールの蓄積が増加し、Δａｌｄｈバックグラウンドが生成をさらに改善した（図５Ｂ）。観察された産物がホルムアルデヒドに由来するものであり、残留複数炭素基質又はバイオマス成分に由来しないことを確認するために、１３Ｃ標識ホルムアルデヒドを基質として使用した。グリコール酸、エチレングリコール、及びグリセリン酸は、産物のＴＭＳ誘導体の特徴的な［Ｍ－１５］＋イオンに基づいて、完全に１３Ｃ標識されていることが判明した（図５Ｃ）。
上記で確立されたホルムアルデヒド利用経路をメタノールに拡張するには、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ、ＬｍＡＣＲ、及びＥｃＡｌｄＡと組み合わせて、メタノールをホルムアルデヒドに変換するために、バチルス・メタノリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）ＭＧＡ３（ＢｍＭＤＨ２ＭＧＡ３）１８からよく研究されているＭＤＨバリアントを発現させた。毒性のために休止細胞の使用が必要なホルムアルデヒドとは異なり、メタノールは増殖中の大腸菌培養に直接添加することもできる。改変メタノール利用菌株を栄養素複合体及び５００ｍＭメタノールの存在下で培養すると、ＲｕＨＡＣＬを発現する菌株でのみグリコレート（glycolate）の形成が観察された（図６Ｂ）。この菌株によるメタノールからグリコレートへの変換は非効率的であったが、ホルメート（formate）がかなり蓄積された。
性能を向上させるために、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎを、本明細書ではＢｓｍＨＡＣＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ０Ａ３Ｃ０ＴＸ３０）と称されるビーチサンドメタゲノム（ｂｅａｃｈ ｓａｎｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）に由来する新たに特定されたＨＡＣＬに置換した。ＢｓｍＨＡＣＬはグリコレート（glycolate）の蓄積を約３倍増加させた（図６Ｃ）。グリコール酸の生成が改善されたにもかかわらず、ホルメート（formate）の蓄積は高いままであった。この問題に対処するために、終結酵素ＥｃＡｌｄＡを、ＯｆＦｒｃ５１よりも優れた特性を有することが以前に判明したクロストリジウム・アミノブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（ＣａＡｂｆＴ）のＣｏＡ転移酵素に置換した。ＣａＡｂｆＴは、グリコリル－ＣｏＡからグリコレートを放出し、さらなる縮合のために反応性ホルメート（formate）をホルミル－ＣｏＡとする。ＣａＡｂｆＴが発現されると、グリコレート（glycolate）の蓄積が約３３％増加し、ホルメート（formate）の蓄積は約３６％減少した。最終的に、ＣａＡｂｆＴがグリコール酸の放出を介して経路を終結させるのに役立つため、内因性チオエステラーゼは必要とされず、観察されたホルメート（formate）の部分的原因であると推定された。チオエステラーゼ（ΔｙｃｉＡ ΔｔｅｓＡ ΔｔｅｓＢ ΔｙｂｇＣ ΔｙｄｉＩ ΔｆａｄＭ）が欠損した宿主菌株を使用すると、ホルメート（formate）の蓄積がさらに減少した。グリコレート（glycolate）がメタノールに由来することを検証するために、１３Ｃ標識メタノールを使用し、グリコール酸のＴＭＳ誘導体の［Ｍ－１５］＋イオンが完全に１３Ｃ－メタノールに由来することが観察された（図６Ｄ）。
ホルメート（formate）活性化の有望な経路としてＣａＡｂｆＴを確立したので、ＣａＡｂｆＴを使用して外因的に供給されたホルメート（formate）を組み込むことが可能であるかどうかを評価した。ここでは、ホルムアルデヒドの添加時にホルムアルデヒド及びホルミル－ＣｏＡの相互変換が必要ないため、ＣａＡｂｆＴはＬｍＡＣＲの過剰発現なしでホルメート（formate）を活性化するために発現された。ＢｓｍＨＡＣＬを発現する改変株では、ホルムアルデヒドを単独で供給した場合と比較して、ホルメート（formate）を培地に含めた場合にグリコレート（glycolate）の１２倍の増加が観察され（図１３）、最初にホルムアルデヒドとして添加された量よりも多くのグリコレートとして蓄積された総炭素が含まれていた。
合成メチロトロフィのフラックスバランス解析
直接産物合成のためのＦＯＲＣＥ経路が実証されており、そのうちのいくつか（例えば、グリコレート（glycolate）、グリセレート（glycerate）、アセテート（acetate））が増殖基質として機能できる。大腸菌で合成メチロトロフィを可能にするそれらの能力をインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で評価した。大腸菌の開発済みゲノムスケールモデルｉＭＬ１５１５５２を使用して、メチロトロフィを可能にするために報告又は提案された選択経路を含むモデルに反応を追加した。全ての経路を、存在する様々な還元レベルでＣ１分子の相互変換を可能にする反応を用いて評価した。各経路を実施する全反応を表３に示す。
シミュレーションの結果は、以前に提案された全ての経路が、天然（リブロース一リン酸又はＲｕＭＰ、セリン）及び合成（ホルモラーゼ、合成アセチル－ＣｏＡ又はＳＡＣＡ、還元グリシン）８，５３，５４の両方で、大腸菌で何らかの形態のメチロトロフィを可能にすることを示唆しており、そうすることが可能である（図１４）。非天然Ｃ１基質の天然増殖基質であるグリコレート（glycolate）、アセテート（acetate）、及びグリセルアルデヒドへの変換について評価されたＦＯＲＣＥ経路も例外ではなかった。これは、大腸菌又はその他の生物の生理学的基質を表す化合物への直接的ルートとして、プラットフォームの直交性の別の利点を示している。これにより、ＦＯＲＣＥ経路を様々な又は複数の代謝ノードに統合して、それらを改変するのではなく、天然の代謝及び基質利用の調節を充分に利用できる。モデル化された３つのＦＯＲＣＥ経路のフラックス分布を分析すると、さらなる洞察が得られる（図７）。グリコレート（glycolate）の形成に至るＦＯＲＣＥ経路は、大腸菌に存在する炭素効率の低いグリコレート利用経路を利用し、これには、グリオキシレート（glyoxilate)の２つの分子の脱炭酸縮合が必要である（図７Ａ）５５。したがって、グリコールアルデヒド又はアセテートなどのより還元されたＣ２代謝物質の産生は、増殖基質としてグリコール化するのに好ましい。このモデルは、グリシンとの縮合及び逆ピリドキサール－５－リン酸生合成経路を含むグリコールアルデヒド同化の経路を示唆し、最終的にグリセルアルデヒド－３－リン酸を与えるペントースリン酸転位をもたらすため、グリコールアルデヒドの予測された代謝は特に興味深い（図７Ｂ）。このルートは、予測されたフラックス分布に基づいて、グリオキシレートバイパスを介したアセチル－ＣｏＡの同化よりも優先されると見られる。ＨＡＣＬに基づく経路からグリセルアルデヒドを直接生成すると、グリセルアルデヒドがグリセロールに変換され、続いて天然のグリセロール代謝が行われる（図７Ｃ）。その結果、グリセルアルデヒド及びジヒドロキシアセトンなどのＣ３分子に至る経路は、ＡＴＰの純生成のために解糖反応を利用することができ、最終的にバイオマス収率を増やすことができる。ＦＯＲＣＥ経路には、酸化還元バランス、ＡＴＰ要件、必要な反応数などの他の指標に基づく有望な特性もあった（表４）。
合成メチロトロフィを評価するための二株共培養系
代謝に対するＦＯＲＣＥ経路の直交性により、増殖からＣ１変換経路を完全に切り離すことができる。これにより、経路のメチロトローフの可能性を評価するための独自の設計が可能になる（図８Ａ、図９Ｂ）。可能性のある有利な実装の１つでは、複数炭素化合物の生成及び細胞増殖を２つの宿主に分離することによる分業を採用してもよい。これは、経路が、例えばアルドースリン酸又はアセチル－ＣｏＡなどの２つの一般的なＣ１同化経路の産物を介して、中央代謝と直接相互作用している場合には行えない。この概念を使用して、ＦＯＲＣＥ経路がＣ１基質であるホルムアルデヒド、ホルメート（formate）、及びメタノールでの大腸菌の増殖をサポートする能力を評価した。
共培養で機能するように、二株の大腸菌系を設計及び構築した（図８Ｂ）。生産株と称される最初の株は、Ｃ１基質を天然のＣ２増殖基質グリコレートに変換するためのＦＯＲＣＥ経路を発現する構築物を含んでいたが、グリコレートを消費する能力が不足していた。センサー株と称される２番目の株は、グリコレートで増殖する能力を保持し、さらにシグナルとしてｅＧＦＰを構成的に発現したが、グリコレート生成のためのＦＯＲＣＥ経路を発現しなかった。したがって、これらの菌株は、グリコレート最小培地プレートでの選択及び蛍光コロニーの検出の両方によって区別できた。様々な基板の実現可能性を評価するために、３つの異なる生産株を考案した。ホルムアルデヒド利用のために、前記生産株は、ＬｍＡＣＲ、ＢｓｍＨＡＣＬ、及びＥｃＡｌｄＡを発現した。ホルムアルデヒドによるホルメート（formate）の利用の評価のために、ＢｓｍＨＡＣＬをＣａＡｂｆＴで発現させた。メタノールの利用のために、ＢｍＭｄｈＭＧＡ３、ＬｍＡＣＲ、ＢｓｍＨＡＣＬ、及びＣａＡｂｆＴを発現するチオエステラーゼ欠損バックグラウンドを利用した（図８Ｂ）。
ホルムアルデヒドによる増殖条件を可能にするために、パラホルムアルデヒドを使用した。パラホルムアルデヒドは、粒子サイズ及び濃度の選択によって可溶化速度を制御しながら、水性媒体中でホルムアルデヒドに徐々に解重合する（図１５Ａ）。これにより、ホルムアルデヒドをミリモル以下の濃度に保持し、有毒なレベルまでの蓄積を回避し、なおも有意なグリコレートの生成が観察される系が可能になった（図１５Ｂ）。唯一の炭素基質として（パラ）ホルムアルデヒド（５ｍＭに相当）を含む最小培地では、前記生産株がＢｓｍＨＡＣＬを発現しなかった対照系と比較して、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の増加に示されるように前記センサー株の増殖が観察された（図８Ｃ、図１６）。グリコレートは最初の８時間で急速に蓄積し、初期誘導期（遅滞期）後に生じるセンサー株の持続的な指数関数的増殖が見られました。前記センサー株は、３０時間で約６．６回倍加したことが判明した。
メタノールでは、前記生産株がＢｓｍＨＡＣＬを発現した場合にのみ前記センサー株の増殖が観察されたが（図８Ｄ、図１７）、パラホルムアルデヒド利用の場合と比較して、前記センサー株の増殖速度は異なり、時間経過に伴うＣＦＵのほぼ直線的な増加を反映している。観察されたダイナミクスの違いは、一定の供給速度の流加培養５６で観察された現象と同様に、生産株によるメタノールからのグリコレート生成速度によって課せられた制限を反映している可能性がある。メタノールの利用は（パラ）ホルムアルデヒドの利用よりも大幅に遅く、７２時間で約４．６回の倍加であった。
同様の実験を、１ｍＭホルムアルデヒド及び１０ｍＭホルメート（formate）共基質系を使用して実施した。ここでは、ホルムアルデヒドとして追加されたよりも多くの炭素がグリコレート（glycolate）で観察され、ホルメート（formate）の取り込みを示していた（図１８）。センサー株の増殖は、メタノールでの増殖よりも速かったが、５ｍＭ（パラ）ホルムアルデヒドでの倍加ほど多くは生じなかった。２７時間で、約４．９回の倍加が観察された（図８Ｄ）。
検討
代謝の標準的なアーキテクチャでは、基質は生合成ビルディングブロックと、結果として生じる中央代謝物質に由来する目的の産物と共に中央代謝に向かって進む。今日まで、Ｃ１生物変換を設計しようとする試みは、合成経路５－９又は新規酵素設計６を利用するものでさえ、中央炭素代謝に依存してきた。最小限の直交性を示すこれらの設計では、宿主の代謝ネットワークを最適化してＣ１生物変換に適応させる必要があるが、これは困難であることが証明されている。
本研究では、ホルミル－ＣｏＡ伸長（ｆｏｒｍｙｌ－ＣｏＡ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ（ＦＯＲＣＥ））経路の設計、分析、及び実装を提示し、宿主の代謝に直交する方法でＣ１の利用及び生物変換を可能にする。ＦＯＲＣＥ経路は、ホルミル－ＣｏＡとカルボニル含有基質との間の２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ（ＨＡＣＬ）触媒アシロイン縮合によって可能になる同化代謝物質としてのホルミル－ＣｏＡの使用に基づいている。産物の合成は、他のアプローチと比較して中央代謝に対して比較的高い直交性で達成される。本発明者らの熱力学的分析は、例示的な産物として、ホルメート（formate）、ホルムアルデヒド、及びメタノールからグリコレート（glycolate）又はアセテート(acetate）へのＦＯＲＣＥ経路変換の好適な駆動力を示唆した。インビトロ（精製酵素及び細胞抽出物）及びインビボ（休止細胞及び増殖細胞）の両方の実装で、自己充足型の直交経路の可能性を実証する。これらの実装では、ホルムアルデヒド、ホルメート（formate）、又はメタノールを唯一のＣ１基質として使用することで、多様な機能を有する産物（例えば、グリコレート、グリコールアルデヒド、エチレングリコール、エタノール、グリセレート）を増殖及び宿主代謝に依存しない方法で生成できる。生物触媒がＣ１生物変換に使用されている間、増殖及び維持が複数炭素基質で行われる可能性のあるバイオプロセスを予測することができる。多酵素カスケード及び二段階発酵に基づくこの性質のバイオプロセスは、最近のレビューの対象となっている５７，５８。
Ｃ１基質からの産物合成はＦＯＲＣＥ経路の決定的な特徴であるが、また、グリコレート、アセテート、又はグリセルアルデヒドなどの従属栄養生物によって自然に消費される複数炭素化合物の生成を介して、非天然Ｃ１基質（例えば、合成メチロトロフィ）での増殖を可能にする可能性もある。ゲノムスケールモデリング及びフラックスバランス分析により、ＦＯＲＣＥ経路が代替アプローチと同等又はそれ以上であることが明らかになり、設計が導かれた。現行の経路の性能は、Ｃ１基質上での大腸菌の単一株の増殖をサポートできなかったが、経路の直交性により、別の大腸菌株のホルメート（formate）、ホルムアルデヒド、及びメタノールでの増殖に対する経路の制限を分離して評価することができた。メチロトロフィを可能にするＦＯＲＣＥ経路の可能性により、増殖及び産物合成の両方の唯一の炭素源としてＣ１に基づく従来の発酵に類似したバイオプロセスの実装が可能になる。ＦＯＲＣＥ経路は、産物の合成及び増殖に向かうフラックスの分岐点であるため、特に動的代謝制御５９，６０の分野における最近の開発により、フラックス分配を容易に制御できる可能性が非常に高くなる（図１Ｂ）。
さらなるＦＯＲＣＥ経路の開発により、特に経路の反復を介して、合成メチロトロフィ及び多様な産物合成のためのより効率的な設計が可能になるはずである。現行の実証では、生理学的に適切な濃度のホルムアルデヒドで実施した場合、１１８μｍｏｌ／ＯＤ／ｈｒのＣ１利用率が可能になった（図１５Ｂ）。ＨＡＣＬの発現レベル及び動力学的パラメーターを改善することにより、さらなる改善が可能であると評価する。ホルムアルデヒド又はメタノールを使用した様々な実装での副産物としてのホルメート（formate）の観察は、ホルミル－ＣｏＡの生成速度及びＨＡＣＬによるその利用速度の間の不均衡による可能性が高い。また、ホルミル－ＣｏＡ加水分解１６も観察したが、これはおそらく内因性チオエステラーゼによってインビボで悪化する。この制限に対処するための戦略には、ＣｏＡ－トランスフェラーゼＣａＡｂｆＴを使用して本明細書で行われるように、ＣｏＡ－トランスフェラーゼを使用してホルメート（formate）をホルミル－ＣｏＡに再活性化すること、及びＢｓｍＨＡＣＬの識別を介して本明細書に示されるより良い特性を有するＨＡＣＬ酵素の識別又は改変が含まれる。最終的に、この目的のために、内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びチオエステラーゼの欠失などの宿主株の修飾も探索した。
ＨＡＣＬが触媒する縮合及び酵素活性は最近になって記述されたばかりであるため、さらなるゲノムマイニング、バイオプロスペクティング（ｂｉｏｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇ）、酵素工学、及び生化学的特性評価により、バリアントの性能が向上し、最終的に経路のボトルネックが克服されることが期待される。明確に定義された鎖長及び官能基特異性を有するＨＡＣＬバリアントは、互換性のある特定の終結酵素と組み合わせて、他のプラットフォーム経路で実証されているものと同様に、特定の産物の生成を可能にする６１－６３。これらの研究はまた、代謝におけるホルミル－ＣｏＡの役割にさらなる光を当て、本明細書で説明されている合成経路を上回る可能性がある。最近の報告は、当分野の知識の進歩に既に貢献しており１７，６４、さらなる研究が続く可能性が高い。
方法：
熱力学計算
反応の標準ギブズ自由エネルギーは、データベースソース（ＭｅｔａＣｙｃ）６５から、又はｅＱｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ生化学的熱力学計算機を使用して見出された。経路の最小－最大駆動力は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社）を使用して実装された報告済みの方法４１を使用して計算した。
フラックスバランス分析
ＣＯＢＲＡ Ｔｏｏｌｂｏｘ６６ ｆｏｒ ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社）及びＧｕｒｏｂｉソルバー（Ｇｕｒｏｂｉ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ社）を使用して、フラックスバランス分析を行った。様々なメチル化経路を可能にする反応（表３）を大腸菌ゲノムスケールモデルｉＭＬ１５１５５２に追加又は変更した。基質交換反応の制限は、全てのＣ１基質について１０ｍｍｏｌ Ｃ／ｇ－ＤＣＷ／ｈｒに設定した。
試薬
特に明記しない限り、全ての化学物質はフィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ． ＬＬＣ．）及びシグマ アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ）から入手した。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社又はユーロフィンジェノミクス（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）社によって合成された。特に明記しない限り、制限酵素はニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）から入手した。
遺伝的方法
大腸菌に対して天然ではない遺伝子を、コドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．））によって合成した。大腸菌遺伝子は、標準的なプロトコルに従って染色体ＤＮＡから増幅された６７。プラスミドベースの遺伝子発現は、適切な制限酵素で消化されたｐＣＤＦＤｕｅｔ－１又はｐＥＴＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））に目的の遺伝子をクローニングし、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング技術（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．））を使用して達成された。遺伝子ノックアウト及びゲノム修飾は、大腸菌用に開発された ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの系を使用して作成した。ｐＣａｓ及びｐＴａｒｇｅｔＦは、Ｓ． Ｙａｎｇから提供された（それぞれＡｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６２２２５及び６２２２６）。本研究で使用されたプラスミド及び菌株を表２に示す。
精製酵素を用いたコアパスウェイモジュールの評価
プラスミドには、ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ、ＬｍＡＣＲ、及びＯｆＦｒｃをコードする遺伝子が含まれており、ｐＣＤＦｄｕｅｔ－１にクローニングされ、発現のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された。発現株の一晩培養物を１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含むＬＢで増殖させ、これを使用して、２５０ｍＬバッフル付きフラスコに１％で５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを添加した５０ｍＬのＴＢ培地に接種した。培養物は３０℃及び２５０ｒｐｍでオービタルシェーカーで、ＯＤ６００が０．４～０．６に達するまで培養し、その時点で０．１ｍＭのＩＰＴＧ発現が誘導された。次に、接種後２４時間で、遠心分離によって細胞を回収した。細胞ペレットを、９ｇ／Ｌの冷塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で１回洗浄し、必要になるまで－８０℃で保存した。
凍結した細胞ペレットを１０ｍＬの冷溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２０ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、そこに２５０Ｕのベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））ヌクレアーゼを添加した。Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ社の超音波処理装置ＣＰＸ１３０を使用して氷上で超音波処理することにより、混合物をさらに処理し（５秒のパルスオン及び６秒のパルスオフのサイクルで３分間、振幅を３０％に設定）、７，５００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。上清を、溶解緩衝液で事前に平衡化した５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロース樹脂（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．））を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。次に、カラムをまず１０ｍＬの溶解緩衝液で洗浄し、次に２５ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、７０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。目的のＨｉｓタグ付きタンパク質は、２０ｍＬの溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出液を回収し、１０，０００分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）限外ろ過遠心分離装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））に適用し、濃縮物（＜３００μＬ）を脱塩のために４ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）、１０％グリセロール（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。タンパク質濃度は、製造元のプロトコルに従って、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（バイオ・ラッド社（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して計算した。精製されたタンパク質は、必要になるまで－８０℃で２０μＬのアリコートで保存した。
唯一のＣ１基質としてのホルムアルデヒドの利用を試験するために、反応を、５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）（ｐＨ７．４）、５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．１ｍＭリン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、２ｍＭコエンザイムＡ（ＣｏＡＳＨ）、１μＭ ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ、１μＭ ＬｍＡＣＲ、及び１００ｍＭ ＦＡＬＤで構成した。補基質としてのホルメート（formate）及びホルムアルデヒドの利用を試験するために、反応を、５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）（ｐＨ７．４）、５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．１ｍＭリン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、１ｍＭスクシニル－ＣｏＡ、１μＭ ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ、２μＭ ＯｆＦｒｃ、１００ｍＭギ酸ナトリウム、及び１００ｍＭ ホルムアルデヒドで構成した。唯一のＣ１基質としてのホルメート（formate）の利用を試験するために、反応を、５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）（ｐＨ７．４）、５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．１ｍＭリン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、２ｍＭスクシニル－ＣｏＡ、１μＭ ＲｕＨＡＣＬＧ３９０Ｎ、２μＭ ＯｆＦｒｃ、１μＭ ＬｍＡＣＲ、及び１００ｍＭギ酸ナトリウムで構成した。対照として、反応を、５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）（ｐＨ７．４）、５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．１ｍＭリン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、２ｍＭスクシニル－ＣｏＡ、２ｍＭコエンザイムＡ（ＣｏＡＳＨ）、２μＭ ＢＳＡ、１００ｍＭギ酸ナトリウム、及び１００ｍＭホルムアルデヒドで構成した。反応量は２００μＬで、ロティサリーシェーカー上で室温で３０分間反応を行った。
アシル－ＣｏＡを含む試料（２００μＬ）を最初に５μＬの１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で処理して、チオエステルを加水分解し、カルボン酸を生成した。次いで、酸抽出の効率を改善するために、１％硫酸で酸性化した硫酸アンモニウム溶液を添加した。得られた試料を９０秒間激しくボルテックスすることにより、４．０ｍＬの酢酸エチルに抽出した。有機相を分離し、窒素流下で蒸発乾固した。残留物を５０μＬのピリジン及び５０μＬのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドに溶解し、６０℃で１５分間インキュベートした。誘導体化した試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７７Ｂ ＧＣ／ＭＳＤ単四重極、Ｉｎｔｕｖｏ ９０００ ＧＣシステムを、統合ＧＥＲＳＴＥＬ多機能オートサンプラー試料準備ロボット及びＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ－５ｍｓキャピラリーカラム（内径：０．２５ｍｍ、膜厚：０．２５μＭ、長さ：３０ｍ）と共に用いてＧＣ－ＭＳで分析した。ガスクロマトグラフィーでは、ヘリウムをキャリアガスとして、１．５ｍＬ／分の流量で以下の温度プロファイルを使用して、１：１のスプリット比で１μＬの試料を注入した：開始時９０℃で３分間、毎分１５℃で１７０℃まで上昇、毎分２０℃で３００℃まで昇温し、８分間維持する。注入器及びと検出器の温度は、それぞれ２５０℃及び３５０℃であった。Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ ＧＣ／ＭＳ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｂ．０７．０６．２７０４を使用してデータを取得し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｂ．０８．００を使用して分析した。
ＬＣ－ＭＳでアシルＣｏＡを分析するために、２００μＬの反応試料に８μＬのギ酸を加えて反応を停止し、２００μＬのメタノールで２回プライミングし、１００μＬの１ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ３．０）で平衡化した１ｍＬのＨｙｐｅｒＳｅｐ Ｃ１８カートリッジ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．））で脱塩した。カラムを２００μＬの１ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ３．０）で１回洗浄し、アシル－ＣｏＡを２００μＬのメタノールで溶出した。ＬＣ－ＭＳ分析は、以前の説明に基づいて実行した７。Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４０ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ－ＭＳシステムには、ポジティブイオン化モードに設定されたＪｅｔ Ｓｔｒｅａｍエレクトロスプレーイオン化ソース及び１００ｍｍ×４．６ｍｍのＫｉｎｅｔｅｘ ２．６μｍ Ｐｏｌａｒ Ｃ１８ １００Åカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．））を装備した。ＬＣ条件は、４０℃に設定したカラムオーブン、注入量５μＬ、並びに移動相として５０ｍＭギ酸アンモニウム及びメタノールであった。化合物の分離は、以下の勾配法を使用して、流速４００μＬ／分で行った：０％メタノールで０分、０％メタノールで１分、２．５％メタノールで３分、２３％メタノールで９分、８０％メタノールで１４分、８０％メタノールで１６分、０％メタノールで１７分。ＭＳ条件は、キャピラリー電圧３．５ｋＶ、ノズル電圧５００Ｖ、フラグメンター電圧１５０Ｖで行い、噴霧（２５ｐｓｉｇ）、乾燥（５Ｌ／分、２２５℃）、シースガス（１０Ｌ／分、４００℃）に窒素を使用した。１００～１０００ｍ／ｚのスキャン範囲を使用した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ ＬＣ／ＭＳ ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｂ．０５．０１を使用してデータを取得し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｂ．０５．００（アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ））を使用して分析した。
経路検証のための無細胞代謝工学
酵素発現及び細胞抽出物の調製は、以前に記載されているように行った１６。無細胞反応には、５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）（ｐＨ７．４）、４ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．１ｍＭリン酸トリフェニル（ＴＰＰ）、２．５ｍＭコエンザイムＡ（ＣｏＡＳＨ）、５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、５０ｍＭホルムアルデヒド、及び０．１ｍＭコエンザイムＢ１２が含まれていた。個々の細胞抽出物のローディングは約４．４ｇ／Ｌタンパク質（反応容量の１／８）であり、各反応に添加されたタンパク質の量は、ＢＬ２１（ＤＥ３）抽出物で約２６ｇ／Ｌタンパク質（反応量の３／４）に正規化した。反応物を室温で指示された時間インキュベートし、その時点で、反応を停止させるために、１％硫酸で酸性化した飽和硫酸アンモニウム溶液の反応量の１／４を加えた。試料を２０８１７×ｇで１５分間遠心分離した。上清を、屈折率検出器とＨＰＸ－８７Ｈ有機酸カラム（バイオ・ラッド社（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．））を搭載したＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＳＩＬ ２０システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．）を用いて、ピーク分離を最適化する操作条件（流速０．３ｍＬ／分、３０ｍＭ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、移動相、カラム温度４２℃）でＨＰＬＣ分析した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ｖ５．９６を使用してデータを取得して分析した。
休止細胞の生物変換
休止細胞を使用した生物変換は、わずかな変更を加えて以前に記載されているように１６実行した。使用した基礎塩培地は、Ｍ９（６．７８ｇ／Ｌリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１ｇ／Ｌ塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、１００μＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、及び１５μＭチアミン塩酸塩）であり、さらにＮｅｉｄｈａｒｄｔ６８の微量栄養素溶液を補充した。各菌株のＬＢ一晩培養物を使用して、上記培地の５０ｍＬを含み、さらに、２０ｇ／Ｌグリセロール、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、及び適切な抗生物質（５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン）を補充した２５０ｍＬフラスコに接種（１％）した。フラスコ培養物を、ＮＢＳ Ｉ２４ベンチトップインキュベーターシェーカー（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）において３０℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。２．５時間後、０．１ｍＭイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及び０．０４ｍＭクメート（０．２ｍＭ ＩＰＴＧ及び０．１ｍＭクメート（ｃｕｍｕｌａｔｅ）をホルムアルデヒド及びホルメート（formate）を用いた実験に使用した）の添加により遺伝子発現を誘導した。
上記の培養物からの細胞を遠心分離（５０００×ｇ、２２℃、５分）によって回収し、炭素源を一切含まない上記のＭ９培地で２回洗浄した。最終的な細胞ペレットを、適切な炭素源を含むＭ９に再懸濁した（１０ｍＭホルムアルデヒドでＯＤ６００約１０、又は１ｍＭホルムアルデヒド及び１０ｍＭホルメート（formate）でＯＤ６００約５）。５ｍＬの細胞懸濁液を２５ｍＬの三角フラスコ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．））に加え、フォームプラグで栓をした。フラスコを、ＮＢＳ Ｉ２４ベンチトップインキュベーターシェーカー（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）内で３０℃及び２００ｒｐｍでインキュベートした。ホルムアルデヒドが唯一の炭素源である１．５時間後に、追加の１０ｍＭホルムアルデヒドを添加した。上記のように、ＨＰＬＣ分析のために２４時間後に試料を採取した。基質として１３Ｃ標識ホルムアルデヒドを使用した場合、上記のように抽出及び誘導体化した後、試料をＧＣ－ＭＳで分析した。
発酵実験
使用した増殖培地は、Ｍ９（６．７８ｇ／Ｌリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１ｇ／Ｌ塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、１００μＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、及び１５μＭチアミン塩酸塩）であり、さらに５００ｍＭメタノール、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、及びＮｅｉｄｈａｒｄｔ６８の微量栄養素溶液を補充した。各菌株のＬＢ一晩培養物を使用して、上記培地の５ｍＬを含み、さらに、適切な抗生物質（５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン）を補充した５０ｍＬ密閉円錐チューブに接種（１％）した。約３時間後、０．０４ｍＭイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及び０．０４ｍＭクメートを添加して遺伝子発現を誘導した。チューブを、ＮＢＳ Ｉ２４ベンチトップインキュベーターシェーカー（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）内で３０℃及び２００ｒｐｍでインキュベートした。ＯＤ６００測定及びＨＰＬＣ分析のために、接種後２４時間、４８時間、７２時間、及び９６時間ごとに試料（１００μＬ）を採取した。基質として１３Ｃ標識メタノールを使用した場合、上記のように抽出及び誘導体化した後、試料をＧＣ－ＭＳで分析した。
Ｃ１基質上で増殖させるための二株の大腸菌系
二株実験は、Ｍ９培地１６を使用して前述のように培養及び誘導された菌株を使用して実施した。誘導された細胞を、Ｍ９培地で３×１０９ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍＬ（ＯＤ６００約５に相当）の初期濃度に再懸濁した。２０ｍＬの懸濁液を３ｍｇのパラホルムアルデヒド（５ｍＭに相当）を含む２５ｍＬフラスコに添加するか、又は１０ｍＬの懸濁液を２５ｍＬフラスコに添加し、５００ｍＭメタノール又は１ｍＭホルムアルデヒド及び１０ｍＭギ酸ナトリウムを加えた。グリコレートを消費可能な２番目の大腸菌株ＡＣ７６３を初期濃度５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（ＯＤ６００約０．００５に相当）となるように添加した。ＡＣ７６３はさらに、２つの菌株の識別を支援するために、構成的に発現するｅＧＦＰの染色体コピーを保持していた。培養物に追加する前に、ＡＣ７６３を２５ｍＬ三角フラスコで（単一コロニー接種から）、２００ｒｐｍ、３０℃で２４時間、５ｇ／Ｌグリコレート及び２ｇ／Ｌトリプトンを添加した５ｍＬの上記Ｍ９最少培地で事前に増殖させた。次いで、細胞を遠心分離し（５０００×ｇ、２２℃、５分）、５ｇ／Ｌグリコレートを補充した培地で２回洗浄し、光学密度約０．０５まで再懸濁した。２００ｒｐｍ、３０℃（２５ｍＬ三角フラスコに５ｍＬ）で２４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離（５０００×ｇ、２２℃）し、炭素源を一切含まない培地で２回洗浄し、適切な量を二株系に加えた。両方の菌株を含むフラスコを、２００ｒｐｍ及び３０℃でさらにインキュベートした。ＨＰＬＣ及び細胞増殖分析のために、様々な時点で試料を採取した。
細胞増殖の測定値として、培養液１ｍＬあたりのコロニー形成単位を利用した。適切な容量の培養物を、炭素源を一切含まない上記の最小培地で希釈し、５０μＬの様々な希釈液を、２．５ｇ／Ｌグリコレートを含む最小培地プレートにプレーティングした。３７℃でのプレートインキュベーションの後、コロニーを手動でカウントし、青色光トランスイルミネーター（Ｖｅｒｎｉｅｒ社、米国オレゴン州ビーバートン）を使用してｅＧＦＰ発現株ＡＣ７６３に照射して視覚化した。
データ可用性に関する声明：本研究の結果を裏付ける全てのデータ並びに以下の公開データベースが本明細書に含まれる：ＭｅｔａＣｙｃ （ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇ／）； ｅＱｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／）；ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）。本研究に関与する酵素のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号を表２に示す。全てのＵｎｉＰｒｏｔ配列は、表２に記載されているように、その全体が参照により援用される。
コード可用性に関する声明：本研究で分析を実行するために使用されたスクリプトは、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｈｃ７／ＦＯＲＣＥ＿ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔにある。








表４：代表的なＣ２（アセチル－ＣｏＡ）及びＣ３（ピルベート（pyruvate））代謝物質へのメチロトロフィ（メタノール由来）を可能にする可能性のある、選択されたＣ１利用経路の特性の比較。
計算に使用された本研究からの経路は、ジオール脱水酵素から生成されたアセトアルデヒドを介したアセチル－ＣｏＡへ、及びグリセレートを介したピルベートへの経路であった。正の値は純生成を示し、負の値は純消費を示す。計算では、ＡＴＰからＡＭＰへの加水分解が、ＡＴＰからＡＤＰへの加水分解の２つの当量であると仮定している。メチロトローフ経路の炭素収率は、Ｃ２又はＣ３代謝物質中のメタノールのモル数に基づいているため、ＣＯ２も同化される場合（即ち、セリン経路）では１００％を超える。
別段の定義がない限り、本明細書で使用され全ての技術用語及び科学用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物及びそれらが引用される資料は、参照により具体的に援用される。
当業者は、本明細書に記載された発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、通常のものにすぎない実験を使用して認識するか、又は確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (73)

  1. 増殖及び産物合成のために一炭素（Ｃ１）基質を利用可能な非天然微生物系であって、
    前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする第１の核酸のセット、並びに
    ホルミル－ＣｏＡ及びホルムアルデヒドを、増殖を可能にする天然の（native）複数炭素基質又は代謝物質に変換する酵素をコードする第２の核酸のセット、
    を含む、非天然微生物系。
  2. 前記系が一炭素基質を含み、任意選択的に（optionally）、前記Ｃ１基質がメタンを含む、請求項１に記載の系。
  3. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記メタンをメタノールに変換可能なメタンモノオキシゲナーゼ、前記メタノールをホルムアルデヒドに変換可能なメタノールデヒドロゲナーゼ、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換可能なアシル－ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項２に記載の系。
  4. 前記Ｃ１基質が二酸化炭素を含む、請求項１に記載の系。
  5. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記二酸化炭素をホルメート（formate）に変換可能なギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase）を含む、請求項４に記載の系。
  6. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をホルミル－ＣｏＡに変換可能な酵素をさらに含む、請求項５に記載の系。
  7. 前記第１のセットの代謝酵素が、ホルメート（formate）をホルムアルデヒドに変換可能なホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換可能なアシル－ＣｏＡレダクターゼをさらに含む、請求項５に記載の系。
  8. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をリン酸ホルミルに変換可能なギ酸キナーゼ（formate kinase）、及び前記リン酸ホルミルをホルミル－ＣｏＡに変換可能なホスホトランスアシラーゼをさらに含む、請求項５に記載の系。
  9. 前記Ｃ１基質がホルメート（formate)を含む、請求項１に記載の系。
  10. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記ホルメート（formate)をホルミル－ＣｏＡに変換可能な酵素を含む、請求項９に記載の系。
  11. 前記第１のセットの代謝酵素が、ホルメート（formate)をホルムアルデヒドに変換可能なホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換可能なアシル－ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項９に記載の系。
  12. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記ホルメート（formate)をリン酸ホルミルに変換可能なギ酸キナーゼ（formate kinase）、及び前記リン酸ホルミルをホルミル－ＣｏＡに変換可能なホスホトランスアシラーゼをさらに含む、請求項９に記載の系。
  13. 前記Ｃ１基質が一酸化炭素を含む、請求項１に記載の系。
  14. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記一酸化炭素を二酸化炭素に変換可能な一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、及び前記二酸化炭素をホルメート（formate)に変換可能なギ酸デヒドロゲナーゼを含む、請求項１３に記載の系。
  15. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をホルミル－ＣｏＡに変換可能な酵素をさらに含む、請求項１４に記載の系。
  16. 前記第１のセットの代謝酵素が、ホルメート（formate）をホルムアルデヒドに変換可能なホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換可能なアシル－ＣｏＡレダクターゼをさらに含む、請求項１４に記載の系。
  17. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をリン酸ホルミルに変換可能なギ酸キナーゼ（formate kinase）、及び前記リン酸ホルミルをホルミル－ＣｏＡに変換可能なホスホトランスアシラーゼをさらに含む、請求項１４に記載の系。
  18. 前記Ｃ１基質がメタノールを含む、請求項１に記載の系。
  19. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記メタノールをホルムアルデヒドに変換可能なメタノールデヒドロゲナーゼ、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換可能なアシル－ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項１８に記載の系。
  20. 前記Ｃ１基質がホルムアルデヒドを含む、請求項１に記載の系。
  21. 前記第１のセットの代謝酵素が、前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換可能なアシル－ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項２０に記載の系。
  22. 前記第２のセットの代謝酵素が、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ（ＨＡＣＬ）を含む、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の系。
  23. 前記第２のセットの代謝酵素が、アシル－ＣｏＡレダクターゼをさらに含む、請求項２２に記載の系。
  24. 前記第２のセットの代謝酵素が、１，２－ジオールオキシドレダクターゼをさらに含む、請求項２３に記載の系。
  25. 前記第２のセットの代謝酵素が、ジオール脱水酵素（diol dehydratase）をさらに含む、請求項２４に記載の系。
  26. 目的の分子を生成する酵素をコードする第３の核酸のセットをさらに含む、請求項１～請求項２５のいずれか一項に記載の系。
  27. 全ての核酸を包含する１つの微生物宿主を含む、請求項１～請求項２６のいずれか一項に記載の系。
  28. 異なるセットの核酸を有する複数の微生物宿主株を含む、請求項１～請求項２７のいずれか一項に記載の系。
  29. 請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の微生物系を培養する方法であって、
    適切な条件下で前記微生物系をＣ１原料と共にインキュベートすることを含み、
    ここで、前記Ｃ１原料は増殖に利用される、前記方法。
  30. 前記微生物培養系から目的の産物を単離することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する代謝酵素をコードする第１の核酸のセット、及び
    伸長単位として前記ホルミル－ＣｏＡを使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長する代謝酵素をコードする第２の核酸のセット、
    を含む、代謝改変微生物（metabolically engineered organism）。
  32. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体が、前記微生物の増殖のための代謝物質として機能する、請求項３１に記載の代謝改変微生物。
  33. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体が、１又は複数の化学産物の前駆体として機能する、請求項３１又は請求項３２に記載の代謝改変微生物。
  34. 前記第１の核酸のセット及び第２の核酸のセットによってコードされる前記代謝酵素が、前記微生物において組換え発現又は過剰発現される、請求項３１～請求項３３のいずれか一項に記載の代謝改変微生物。
  35. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路と競合する代謝経路に関与する代謝酵素をコードする１又は複数の遺伝子が、前記微生物においてノックアウトされている、請求項３１～請求項３４のいずれか一項に記載の代謝改変微生物。
  36. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体を化学産物に変換する代謝酵素をコードする第３の核酸のセットをさらに含む、請求項３１～請求項３５のいずれか一項に記載の代謝改変微生物。
  37. 一炭素基質を用いて微生物を培養する方法であって、
    前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換するための代謝酵素をコードする第１の核酸のセット、及び前記ホルミル－ＣｏＡを伸長単位として使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長するための代謝酵素をコードする第２の核酸のセットを前記微生物に与えること、並びに
    前記一炭素基質を含む増殖培地で前記微生物を培養すること、
    を含み、
    前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体が、前記微生物の増殖基質又は増殖基質の前駆体として機能する、前記方法。
  38. 前記増殖基質が、アルドース糖、ジオール、２－ヒドロキシ酸、グリコール酸、グリセルアルデヒド、乳酸、及びアセチル－ＣｏＡのうちの１又は複数を含む、請求項３７記載の方法。
  39. 一炭素基質からの化学産物合成方法であって、
    前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換するための代謝酵素をコードする第１の核酸のセット、及び前記ホルミル－ＣｏＡを伸長単位として使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長するための代謝酵素をコードする第２の核酸のセットを微生物に与えること、並びに
    前記微生物に前記一炭素基質を供給し、前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体が化学産物の前駆体として機能すること、
    を含む、前記方法。
  40. 前記化学産物が、２－ヒドロキシ酸、アルドース、ジオール、ポリオール、カルボン酸化合物、乳酸、及びアルコールから選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記化学産物が複数炭素化学物質である、請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
  42. 前記微生物の発酵ブロスから前記化学産物を精製することをさらに含む、請求項３９～請求項４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記微生物に、前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の中間体を前記化学産物に変換するための代謝酵素をコードする第３の核酸のセットを与えることをさらに含む、請求項３９～請求項４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記微生物に前記第１の核酸のセット及び前記第２の核酸のセットを与えることが、前記代謝酵素のうちの１つ又は複数をコードする１又は複数の遺伝子を含む１又は複数の発現ベクターで前記微生物を形質転換することを含む、請求項３７～請求項４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記微生物に、前記第１の核酸のセット及び前記第２の核酸のセットを与えることが、組換え工学、相同組換え、及び遺伝子編集のうちの１つによって、前記代謝酵素のうちの１つ又は複数をコードする遺伝子を添加することを含む、請求項３７～請求項４３のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換するための前記代謝酵素のうちの１つ又は複数、及び／又は前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して前記一炭素基質を伸長するための１又は複数の前記代謝酵素を過剰発現させることをさらに含む、請求項３７～請求項４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記微生物における前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路と競合する代謝経路を、前記競合する代謝経路に関与する代謝酵素をコードする前記微生物における１又は複数の遺伝子をノックアウトすることによって抑制することをさらに含む、請求項３７～請求項４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する第１の代謝酵素のセット、及び
    伸長単位として前記ホルミル－ＣｏＡを使用するホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して炭素骨格を伸長する第２の代謝酵素のセット、
    を含む、無細胞系。
  49. 前記第１の代謝酵素のセット及び前記第２の代謝酵素のセットが、前記第１の代謝酵素のセット及び第２の代謝酵素のセットを発現する１又は複数の微生物の抽出物に由来する、請求項４８に記載の無細胞系。
  50. 前記無細胞系が、前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路の１又は複数の中間体を化学産物に変換する第３の代謝酵素のセットをさらに含む、請求項４８又は請求項４９に記載の無細胞系。
  51. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路が、アルドース伸長経路及びアルデヒド伸長経路のうちの少なくとも１つを含む、請求項３１～請求項５０のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  52. 前記一炭素基質が、メタン、メタノール、二酸化炭素、ホルメート（formate）、一酸化炭素、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項３１～請求項５１のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  53. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記一炭素基質をホルムアルデヒドに変換する１又は複数の酵素、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換するアシル－ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項３１～請求項５２のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  54. 前記一炭素基質がメタンである、請求項３１～請求項５３のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  55. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記メタンをメタノールに酸化するメタンモノオキシゲナーゼを含む、請求項５４に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  56. 前記一炭素基質がメタノールである、請求項３１～請求項５３のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  57. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記メタノールをホルムアルデヒドに酸化するメタノールデヒドロゲナーゼ、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換するアシル－ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項５５又は請求項５６に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  58. 前記一炭素基質が二酸化炭素である、請求項３１～請求項５３のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  59. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記二酸化炭素をホルメート（formate）に変換するギ酸デヒドロゲナーゼを含む、請求項５８に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  60. 前記一炭素基質が一酸化炭素である、請求項３１～請求項５３のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  61. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記一酸化炭素を二酸化炭素に変換する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、及び前記二酸化炭素をホルメート（formate）に変換するギ酸デヒドロゲナーゼを含む、請求項６０に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  62. 前記一炭素基質がホルメート（formate）である、請求項３１～請求項５２のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  63. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をホルミル－ＣｏＡに変換する１又は複数の酵素を含む、請求項５９、請求項６１、又は請求項６２に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  64. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をホルムアルデヒドに変換するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び前記ホルムアルデヒドをホルミル－ＣｏＡに変換するアシル－ＣｏＡレダクターゼを含む、請求項５９、請求項６１、又は請求項６２のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  65. 前記一炭素基質をホルミルＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をリン酸ホルミルに変換するギ酸キナーゼ（formate kinase）、及び前記リン酸ホルミルをホルミル－ＣｏＡに変換するホスホトランスアシラーゼを含む、請求項５９、請求項６１、又は請求項６２のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  66. 前記一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する前記代謝酵素が、前記ホルメート（formate）をホルミル－ＣｏＡに変換するアシル－ＣｏＡ合成酵素を含む、請求項５９、請求項６１、又は請求項６２のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  67. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して前記炭素骨格を伸長する前記代謝酵素が、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ（ＨＡＣＬ）又はオキサリル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＯＸＣ）を含み、
    ここで、前記ＨＡＣＬ又は前記ＯＸＣは、ホルミル－ＣｏＡ及びアルデヒドから２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを生成する、
    請求項３１～請求項６６のいずれか一項に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  68. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して前記炭素骨格を伸長する前記代謝酵素が、前記２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを２－ヒドロキシアルデヒドに還元するアシル－ＣｏＡレダクターゼをさらに含む、請求項６７に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  69. 前記ＨＡＣＬ又は前記ＯＸＣが、前記ホルミル－ＣｏＡによる２－ヒドロキシアルデヒドの前記一炭素伸長を触媒する、請求項６８に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  70. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して前記炭素骨格を伸長する前記代謝酵素が、前記２－ヒドロキシアルデヒドを１，２－ジオールに還元する１，２－ジオールオキシドレダクターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項６８に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  71. 前記ホルミル－ＣｏＡ伸長経路を介して前記炭素骨格を伸長する前記代謝酵素が、前記１，２－ジオールをアルデヒドに脱水するジオール脱水酵素（dehydratase）をさらに含む、請求項７０に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  72. 前記ＨＡＣＬ又はＯＸＣが、前記ホルミル－ＣｏＡによるアルデヒドの前記一炭素伸長を触媒する、請求項７１に記載の代謝改変微生物、方法、又は無細胞系。
  73. 一炭素基質をホルミル－ＣｏＡに変換する１又は複数の第１の代謝酵素をコードする核酸と、前記ホルミルＣｏＡからグリコレート（glycolate）を生成する１又は複数の第２の代謝酵素をコードする核酸と、を含む第１の微生物、ここで、前記第１の微生物は前記グリコレートを消費して増殖することができない；並びに
    前記第１の代謝酵素をコードする核酸と前記第２の代謝酵素をコードする核酸とを欠く第２の微生物、ここで、前記第２の微生物は前記グリコレートを消費して増殖することができ、かつ、前記一炭素基質を含む培地で前記第１の微生物及び前記第２の微生物を共培養すると前記第２の微生物の増殖が生じる；
    を含む、二株微生物系（two-strain microorganism system）。
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