CN116348608A - 基于一碳底物的合成生长 - Google Patents

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Abstract

许多生物技术相关的生物体不能利用廉价且丰富的一碳原料(例如CO2、CO、甲醛、甲醇和甲烷)用于生长，而是优选复杂原料诸如糖。本文公开了使生物体能够经由甲酰基‑CoA延伸途径消耗一碳分子用于生长和维持的系统。利用一碳原料可以替代使用糖作为生物技术应用中培养生物体的主要手段。这有可能具有更大的成本效益，并避免将食物用作原料的争议。甲酰基‑CoA延伸途径的中间体也可以转化为所需的化学产物。

Description

基于一碳底物的合成生长
相关申请的交叉引用
本申请涉及2020年8月26日提交的美国临时专利申请第63/070,464号，要求其优先权，并且为了所有目的通过引用将其并入本文。
背景
一碳(C1)化合物对于化学工业代表了潜在的低成本且丰富的原料(Dürre,P.&Eikmanns,BJ.Curr.Opin.Biotechnol.35:63-72(2015))。由于这些原料的通常是稀的并且分散的特性，生物化学工艺有可能通过在当前化学技术受限的方面实现较低的资本支出(CapEx)和分布式制造而成为用于C1利用的有效技术(Clomburg,JM.,等人Science 355:aag0804(2017))。虽然C1分子可以被生物学有效地利用用于生长，但从C1底物有效地生物生产各种工业化学品仍然是开放的挑战。
包括天然途径(Bar-Even,A.,等人J.Exp.Bot.63:2325-42(2012)；Kalyuzhnaya,MG.,等人Metab.Eng.29:142-152(2015))和合成途径(Bogorad,I.W.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111:15928-33(2014)；Siegel,J.B.等人Proc.Natl.Acad.Sci.112:3704-3709(2015)；Schwander,T.,等人Science 354:900-904(2016)；Lu,X.等人Nat.Commun.10:1378(2019)；Kim,S.等人Nat.Chem.Biol.16:538-545(2020))的、从C1底物向生物产物合成的方法倾向于共有共同的代谢架构(图1A)。处于不同还原水平的C1分子首先被同化，以产生C2中心代谢物和C3中心代谢物。这些C2/C3代谢物是用于产物合成途径的前体，或者通过中心代谢途径被进一步转化以产生所述前体。因此，碳同化、中心代谢和产物合成途径必须被同时工程化，以实现目标化学品的有效产生。然而，从概念上讲，这种架构应该不是用于从C1分子进行化学产生的必要条件。与具有保存碳-碳键优势的多碳底物的利用不同，当从C1分子开始时，所有的碳-碳键都必须从头产生。因此，原理上，应该有可能使用C1“构建模块(building blocks)”从C1分子构建不同的化学产物，而无需首先产生多碳单元的增加的复杂性。
虽然基于C1原料的燃料和化学品生产是有希望的，但重大挑战阻碍了用于C1生物转化的有效生物催化剂的实现。许多生物技术相关的生物体不能利用廉价且丰富的一碳原料(例如CO2、甲烷)用于生长，而是优选复杂原料诸如糖。
概述
如本文所公开的，甲酰基-CoA可以在由2-羟基酰基-CoA裂合酶(HACL)或草酰基-CoA脱羧酶(OXC)催化的反应中用作C1构建模块或延伸单元，允许生物体利用C1原料进行生长，并导致培养所述生物体的更具成本效益的方法。这些途径，在本文称为甲酰基-CoA延伸(FORCE)途径，能够用于产生用于生物催化剂生长或维持的生长底物，并最终用于生化产物合成。在一些实施方案中，所公开的FORCE途径能够与多碳底物，诸如C2、C3、C4、C5、C6底物一起使用。例如，多碳共底物可以包括例如：糖(例如葡萄糖)、甘油、乙酸和脂肪酸。
因此，本文公开了不能天然利用C1底物进行生长但已被工程化成能够这样做的微生物(即异养生物)。对这些被称为甲基营养生物(methylotrophs)、甲酸营养生物(formatotrophs)或自养生物的生物体的工程化包括向细胞系统提供第一组代谢酶以将单碳底物转化为甲酰基-CoA和甲醛，第二组代谢酶以用甲酰基-CoA分子延伸醛糖或醛，在合适的代谢酶产生多碳天然底物或代谢物的条件下向系统供给C1底物，并且任选地提供第三组代谢酶以将底物或代谢物转化为所需的多碳化学品。
本文公开了能够利用一碳(C1)底物进行生长和产物合成的非天然微生物系统。该非天然微生物系统可以包括编码将单碳底物转化为甲酰基-CoA和甲醛的酶的第一组核酸，以及编码将甲酰基-CoA和甲醛转化为能够生长的天然多碳底物或代谢物的酶的第二组核酸。
本文还公开了代谢工程化微生物。该代谢工程化微生物可以包含编码将单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶的第一组核酸，以及编码经由使用甲酰基-CoA作为延伸单元的甲酰基-CoA延伸途径延长碳主链的代谢酶的第二组核酸。
本文还公开了基于单碳底物培养微生物的方法。该方法可以包括向微生物提供编码用于将单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶的第一组核酸，以及编码用于经由使用甲酰基-CoA作为延伸单元的甲酰基-CoA延伸途径延长碳主链的代谢酶的第二组核酸。该方法还可以包括在包含单碳底物的生长培养基中培养微生物。甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体可以用作微生物的生长底物或生长底物的前体。
本文还公开了从单碳底物合成化学产物的方法。该方法可以包括为微生物提供编码将单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶的第一组核酸，以及编码经由使用甲酰基-CoA作为延伸单元的甲酰基-CoA延伸途径延长碳主链的代谢酶的第二组核酸。该方法还可以包括为微生物供给单碳底物。甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体可以是化学产物或可以用作化学产物的前体。
本文还公开了无细胞系统，其包括将单碳底物转化为甲酰基-CoA的第一组代谢酶，以及经由使用甲酰基-CoA作为延伸单元的甲酰基-CoA延伸途延长碳主链的第二组代谢酶。
本文还公开了双菌株微生物系统。该双菌株微生物系统可以包括第一微生物，该第一微生物包含编码一种或更多种将单碳底物转化为甲酰基-CoA的第一代谢酶的核酸，以及编码一种或更多种从甲酰基-CoA产生乙醇酸的第二代谢酶的核酸。第一微生物可以不能够消耗乙醇酸和基于乙醇酸生长。该双菌株微生物系统还可以包括缺乏编码第一和第二代谢酶的核酸的第二微生物。第二微生物能够消耗乙醇酸和基于乙醇酸生长。在包含单碳底物的培养基中共培养第一微生物和第二微生物可以导致第二微生物的生长。
本发明的一种或更多种实施方案的细节在附图和下文的描述中阐述。本发明的其他特征、目标和优势将由说明书和附图，以及由权利要求书而明显。
附图描述
图1.从C1底物合成产物的FORCE途径。a)用于C1利用的合成正交(orthogonal)架构，其基于甲酰基-CoA延伸(formyl-CoA elongation,FORCE)途径。直接由甲酰基-CoA形式的活化C1单元构建碳骨架，从而绕过用于产物合成的代谢的“蝴蝶结”架构。b)通过各种氧化还原反应将一碳底物活化为C1延伸单元甲酰基-CoA(蓝框)。甲酰基-CoA在HACL催化的反应中用于延伸醛，导致2-羟基酰基-CoA的产生。2-羟基酰基-CoA可以被进一步还原为2-羟基醛。2-羟基醛可以被甲酰基-CoA进一步延伸，我们称之为醛糖延伸。可选地，α-还原可以经由还原为1,2-二醇和脱水为非官能化的醛来进行。得到的醛然后可以被进一步延伸。这些用于延伸的集合途径，被称为甲酰基-CoA延伸(FORCE)，在绿框中。这些延伸途径中的各种中间体可以被转化为所需的化学产物(红色)，包括2-羟基酸、醛糖、二醇、多元醇、羧酸和醇。这些产物和中间体中的许多种也可以用作生长的底物(以橙色突出)，诸如乙醇酸、甘油醛和乙酰基-CoA。缩写：MDH：甲醇脱氢酶；ACR：酰基-CoA还原酶；FaldDH：甲醛脱氢酶；ACS：酰基-CoA合成酶；ACT：酰基-CoA转移酶；FOK：甲酸激酶(formate kinase)；PTA：磷酸转酰基酶；HACL：2-羟基酰基-CoA裂合酶；ADH：醇脱氢酶；DDR：二醇脱水酶；TES：硫酯酶；ALDH：醛脱氢酶。对于每种途径的反应，给出了在箭头所示方向上的反应的标准吉布斯自由能。
图2.FORCE途径的热力学分析。通过计算指定转化的最小-最大驱动力(MDF)来评价热力学可行性。a)利用不同的C1底物经由合成途径产生乙醇酸或乙酸的MDF。空心条指的是标准条件(最大底物浓度限制10mM)，而实心条指的是反映每种底物对大肠杆菌的大致毒性的经调整的限制。评价了甲酸利用的三种途径，每种途径对甲酸活化的ATP需求不同。b)诸如NADH/NAD+比率、ATP消耗和甲酸浓度的因素对甲酸向产物转化的MDF的影响。c)迭代FORCE途径的MDF随着产物碳链长度的变化，使用甲醛作为代表性底物，并且其中产物是对应于所示的链长度的醛糖或醛。这些醛糖和醛延伸途径在图2中示出(参见甲酰基-CoA延伸图)。
图3.使用纯化的酶体外评估FORCE途径的核心模块。a)将C1底物甲醛和甲酸(单独和组合地)转化为羟乙酰基-CoA的途径。指示了每一步的酶和辅因子。添加的底物以粗体和下划线示出。b)通过MassHunter Qualitative Analysis B.05.00中的Find By Formula(FBF)功能，对甲酰基-CoA和羟乙酰基-CoA进行的液相色谱-质谱(LC-MS)提取离子色谱(EIC)。数据是两次重复实验的代表；c)体外样品中甲酰基-CoA和羟乙酰基-CoA的相对丰度。通过LC-MS分析，基于EIC峰面积对甲酰基-CoA和羟乙酰基-CoA进行定量。在NaOH水解羟乙酰基-CoA后，样品中产生的C2被进一步定量为乙醇酸。示出技术重复(n＝2)的所有数据，并绘制了平均值的条形图。
图4.FORCE产物合成途径的α-还原变化形式的无细胞原型设计(prototyping)。a)从甲醛产生各种C2产物的原型α-还原途径概述。在该研究中检测到的产物用实轮廓线框出。酶缩写：DDR：产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)二醇脱水酶；终点(1)：内源醛脱氢酶；终点(2)：内源硫酯酶；终点(3)：内源醇脱氢酶；FucO：大肠杆菌(E.coli)1,2-二醇氧化还原酶；LmACR：单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)酰基-CoA还原酶；RuHACL：红螺菌目(Rhodospirillales)细菌URHD0017 HACL。b)在羧酸盐以其酸形式被检测的条件下通过HPLC检测的具有所示的途径酶的无细胞系统的产物和底物的谱(profile)。浓度以碳为基础给出。示出三个技术重复的所有数据点。绘制了平均值的线图，误差线表示标准差。
图5.利用FORCE途径的醛糖延伸和α-还原变化形式进行C1底物甲醛的静息细胞生物转化。a)在该研究中展示使用FORCE途径从甲醛合成不同产物的策略。检测到的产物和副产物用实轮廓线框出。减少副产物合成的敲除策略用红色指示。b)被工程化为利用FORCE途径从甲醛进行产物合成的菌株的24小时静息细胞生物转化后的代谢物谱，其中OD600＝10(5*109CFU/mL)和在0小时和1.5小时两次添加10mM甲醛。在图例中，+表示所示酶的过表达。Δaldh是指醛脱氢酶的敲除：ΔaldAΔaldBΔpatDΔpuuC。终点tes是指内源硫酯酶和自发硫酯水解。在仅表达LmACR和EcAldA而不表达RuHACL的菌株中没有观察到多碳产物。浓度以碳为基础给出，并在羧酸盐以其酸形式被检测的条件下通过HPLC确定。示出两次技术重复的所有数据点。绘制了平均值的条形图。c)与来自未标记的甲醛的产物相比，由使用13C标记的甲醛的实验产生的多碳产物的谱。示出[M-15]+离子。观察到乙醇酸和乙二醇的m/z的+2迁移，并且观察到甘油酸的m/z的+3迁移。
图6.使用甲醇作为C1底物在生长细胞培养物中的FORCE途径实现。a)用于在活跃生长的大肠杆菌培养物中从甲醇产生乙醇酸的宿主和途径设计。减少副产物合成和防止乙醇酸利用的敲除策略用红色指示，并对应于宿主菌株AC440。ΔTE指内源硫酯酶的敲除(ΔyciAΔtesAΔtesBΔybgCΔydiIΔfadM)。终点(1)指内源醛氧化活性。酶缩写：BmMDH2MGA3：甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicu)MGA3 NAD+依赖性甲醇脱氢酶；LmACR：单核细胞增生李斯特菌酰基-CoA还原酶；RuHACLG390N：红螺菌目细菌URHD0017 HACL(G390N)；BsmHACL：沙滩沙宏基因组(Beach sand metagenome)HACL；EcAldA：大肠杆菌乙醛脱氢酶A；CbAbfT：氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)CoA转移酶。b)从甲醇产生乙醇酸和甲酸的时间进程。在具有或没有RuHACLG390N的情况下通过过表达LmACR、EcAldA和BmMdhMGA3实现FORCE途径设计。示出生物重复(对于具有RuHACLG390N的样品，n＝3；对于没有RuHACLG390N的样品，n＝2)的所有数据。绘制了平均值的线图，误差线表示标准差。浓度以碳为基础给出。c)生长大肠杆菌培养物中经由合理工程化的从甲醇产生乙醇酸的改进。给出72小时时间点的以碳为基础的乙醇酸和甲酸的浓度。示出生物重复(对于具有RuHACLG390N的样品，n＝3；对于其他，n＝4)的所有数据。绘制了平均值的条形图。d)由与12C(未标记的)或13C(标记的)甲醇一起孵育的大肠杆菌产生的乙醇酸的2TMS衍生物的[M-15]+离子的谱。
图7.来自利用以下FORCE途径变化形式的基因组规模大肠杆菌生长模型的模拟通量图：a)(甲)醛延伸，b)α-还原，c)醛糖延伸。底物摄取反应以绿色指示。每种FORCE途径变化形式实施的反应以蓝色绘制。FORCE途径终止以橙色指示。异化为CO2输出的碳以红色突出显示。通量以mmol/g DCW/hr给出。为了清楚，仅绘制了主要通量(阈值设置为>μ)。在图b中简化了导致赤藓糖4-磷酸重排为甘油醛3-磷酸的戊糖磷酸途径的反应。
图8.用于评价FORCE途径实现基于C1底物生长的能力的双菌株系统。a)FORCE途径可以通过将非天然C1底物转化为用作碳和能量来源的天然多碳底物来实现合成甲基营养。b)双菌株系统的概念方案。不能消耗乙醇酸的产生者菌株(producer strains)(黄色轮廓线)被工程化为从以下三种C1底物之一产生乙醇酸：甲醇(红色)、(多聚)甲醛(蓝色)、或甲酸和甲醛(绿色)。将能够消耗乙醇酸的第二消耗菌株添加到培养物中，作为评价生长的可检测信号。c)以(多聚)甲醛为唯一碳源的双菌株系统中乙醇酸浓度(蓝色)和细胞生长(橙色)的时间进程。将5mM(质量当量)多聚甲醛添加到表达LmACR、AldA和BsmHACL的AC440(3*109CFU/mL)。示出两次重复的所有数据点。绘制了乙醇酸浓度平均值的线图。细胞生长的线图是通过最小二乘回归将数据拟合为指数生长，其用于计算比生长速率(μ)。完整的代谢物和细胞生长谱，包括对照样品，在图16中示出。d)当与具有(+)或没有(-)HACL的相关产生者菌株和所示的C1底物(pFALD：多聚甲醛；MeOH：甲醇；FALD：甲醛；FA：甲酸钠)一起孵育所示时间时消耗菌株的生长。另外参见图16-图18。示出两次技术重复的所有数据，并绘制了平均值的条形图。e)展示对应于图d中的条件的消耗菌株生长的平板图像。
图9.生物C1利用的经典架构(a)和正交合成架构(b)。a)代谢的“蝴蝶结”架构，其中碳底物被整合成中心代谢物，可以通过发酵和生物合成途径从中心代谢物产生大量产物。代谢工程化通常在这个框架内通过操纵蝴蝶结的三个组成部分中的一个或全部来操作。b)正交FORCE途径用作产物合成和为生长提供底物/代谢物的平台。这是传统方法的替代框架，传统方法通过中心代谢提供所有碳，并且产物和生物质两者都来自于中心代谢。
图10.基于2-羟基酰基-CoA脱水和α-还原的替代FORCE途径。该途径类似于β-氧化逆转(β-还原)39。该途径也是产生不饱和产物的潜在途径。HACL：2-羟基酰基-CoA裂合酶；HACD：2-羟基酰基-CoA脱水酶；TER：反式-2-烯酰基-CoA还原酶；ACR：酰基-CoA还原酶。
图11.NADH/NAD+比率对甲醛(上图)和甲醇(下图)经由FORCE途径向乙醇酸或乙酸转化的影响。
图12.NADH/NAD+比率对甲醛(上图)和甲醇(下图)经由FORCE途径向乙醇酸或乙酸转化的影响。通过水解酰基-CoA产生糖酸来终止使低迭代次数的途径的驱动力增加，但是驱动力随着迭代次数的增加而收敛。
图13.被工程化为具有甲酸活化途径的大肠杆菌从甲酸产生乙醇酸。用表达CaAbfT和BsmHACL的菌株(蓝色条)和缺乏BsmHACL的相应对照(橙色条)进行静息细胞实验。培养物(2.5OD600＝2.5*109CFU/mL)在25mL烧瓶中于30℃以200rpm振荡孵育24小时，使用10mM甲酸(加上1mM甲醛)作为碳源(也示出了包含1mM甲醛且不含甲酸的对照培养物)。示出n＝6次重复的所有数据点。绘制了平均值的条形图。
图14.通过实施选择的能够实现甲基营养的途径，来自各种C1底物的预测的生物质电子和碳产率。缩写：Formald–甲醛，FORCE-Glycerald–具有能够产生甘油醛的反应的FORCE途径，RuMP–核酮糖单磷酸途径，FORCE-Ac–具有能够产生乙酸的反应的FORCE途径，SACA–合成乙酰基-CoA途径，FORCE-乙醇酸–具有能够产生乙醇酸的反应的FORCE途径。粗体的情况对应于图8中所示的预测通量图。
图15.多聚甲醛的溶解速率和使用多聚甲醛的静息细胞的生物转化。a)具有不同粒径的商业可得的多聚甲醛(pFALD)的溶解速率。在30℃以200rpm振荡的25mL烧瓶中的10mL M9培养基中测量溶解速率。b)用40μM cumate和100μM IPTG诱导的表达BsmHACL、LmACR和AldA的菌株的静息细胞生物转化。将3mg粒化多聚甲醛添加到30℃和以200rpm振荡的25mL烧瓶中的20mL M9培养基中(2.5mM甲醛当量)。在这些条件下，甲醛仅以亚毫摩尔浓度积累。
图16.在包含5mM多聚甲醛的双菌株系统中，传感器菌株(sensor strain)的乙醇酸、甲酸和甲醛浓度和细胞生长的时间进程谱。a)产生者菌株不表达HACL的情况下的时间进程。b)来自图a中示出的时间进程的代表性实验的平板。c)产生者菌株表达HACL的情况下的时间进程。d)来自图c中示出的时间进程的代表性实验的平板。在不同时间点将50μL培养物(5×10-3稀释)铺在包含2.5g/L乙醇酸的最小培养基平板上。示出两次重复(n＝2)的所有数据。绘制了平均值的线图。
图17.在包含500mM甲醇的双菌株系统中，传感器菌株的乙醇酸、甲酸和甲醛浓度和细胞生长的时间进程谱。a)产生者菌株不表达HACL的情况下的时间进程。b)来自图a中示出的时间进程的代表性实验的平板。c)产生者菌株表达HACL的情况下的时间进程。d)来自图c中示出的时间进程的代表性实验的平板。在不同时间点将50μL培养物(5×10-3稀释)铺在包含2.5g/L乙醇酸的最小培养基平板上。示出两次重复(n＝2)的所有数据。绘制了平均值的线图。
图18.在包含1mM甲醛和10mM甲酸的双菌株系统中乙醇酸和甲醛浓度的时间进程谱。a)产生者菌株表达BsmHACL的情况下的时间进程。b)来自图a中示出的时间进程的代表性实验的平板。在不同时间点将50μL培养物(5×10-3稀释)铺在包含2.5g/L乙醇酸的最小培养基平板上。示出两次重复(n＝2)的所有数据。绘制了平均值的线图。
详细描述
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必须注意，如本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
如本文定义的，措辞“重组宿主微生物”、“遗传工程化宿主微生物”、“工程化宿主微生物”和“遗传修饰的宿主微生物”可以互换使用，并指已经被遗传修饰成(a)表达一种或更多种外源多核苷酸的宿主微生物，(b)过表达一种或更多种内源多核苷酸和/或一种或更多种外源多核苷酸，诸如载体中包含的多核苷酸，或者在内源基因表达方面具有改变的宿主微生物，或者(c)敲除或下调内源基因的宿主微生物。此外，某些基因可以被物理地从基因组中去除(例如，敲除)，或者它们可以被工程化为具有降低、改变或增强的活性。
术语“工程化”、“遗传工程化”或“遗传修饰”是指对微生物进行的导致微生物的可检测变化的任何操纵，其中所述操纵包括但不限于，经由异源(外源)多核苷酸引入非天然代谢功能，或经由多核苷酸缺失、突变或敲除而去除天然功能。术语“代谢工程化”通常涉及对生物合成基因(ORF)、与操纵子相关的基因和这样的多核苷酸的控制元件的合理途径设计和组装，以用于产生所需的代谢物。“代谢工程化”还可以包括通过使用遗传工程化和适当培养条件(包括降低、破坏或敲除与通向所需途径的中间体竞争的竞争性代谢途径)调节和优化转录、翻译、蛋白稳定性和蛋白功能性来优化代谢通量。
措辞“代谢工程化微生物”和“修饰的微生物”在本文可互换使用，并且不仅指特定的受试宿主细胞，还指这样的细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可以由于突变或环境影响而在随后世代中发生，因此这样的后代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍然被包括在如本文使用的该术语的范围内。
如本文使用的术语“突变”表示导致改变的核酸或多肽(即，相对于野生型核酸或多肽序列)的核酸和/或多肽的任何修饰。突变包括例如多核苷酸(或编码的多肽)中单个或多于一个残基的点突变、取代、缺失或插入，其包括基因的蛋白编码区内出现的改变以及蛋白编码序列以外的区域中的改变，诸如但不限于调控序列或启动子序列。遗传改变可以是任何类型的突变。例如，突变可以构成点突变、移码突变、插入、或者部分或全部基因的缺失。在某些实施方案中，遗传修饰的微生物基因组的一部分可以被一种或更多种异源(外源)多核苷酸替代。在一些实施方案中，突变是天然存在的。在其他实施方案中，突变是人工选择压力的结果。在其他实施方案中，微生物基因组中的突变是遗传工程的结果。
关于基因序列、ORF序列或多核苷酸序列的术语“表达(expression)”或“表达(expressed)”是指基因、ORF或多核苷酸的转录，以及在适当情况下所得mRNA转录物向蛋白的翻译。因此，从上下文中将清楚的是，蛋白的表达来自开放阅读框序列的转录和翻译。宿主微生物中所需产物的表达水平可以基于宿主中存在的相应mRNA的量或由所选序列编码的所需产物的量来确定。例如，从所选序列转录的mRNA可通过PCR或Northern杂交来定量(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)。由选择的序列编码的蛋白可以通过各种方法(例如，通过ELISA，通过测定蛋白的生物活性，或通过采用独立于这样的活性的测定，诸如蛋白印迹或放射免疫测定，使用识别和结合蛋白的抗体)进行定量。
如本文提及多核苷酸(和其中编码的多肽)使用的术语“内源”，表示在它们所起源的生物体中表达的多核苷酸和多肽(即，它们是生物体固有的)。相反，术语“异源”和“外源”可互换使用，并且如本文提及多核苷酸(和其中编码的多肽)所定义的，表示在不是它们(即多核苷酸或多肽序列)所起源或来源的生物体的生物体中表达的多核苷酸和多肽。
术语“原料(feedstock)”被定义为供应给微生物或发酵过程的原材料或原材料混合物，从中可以制备其他产物。例如，如本发明所述，单独或组合的甲烷碳源或甲醇碳源或甲醛碳源，是用于在发酵过程中产生生物燃料或生物基化学品的微生物的原料。然而，除了本发明的原料(例如甲烷底物)之外，发酵培养基还包含本领域技术人员已知的适于培养物生长和促进多碳化合物产生所必需的酶促途径的合适矿物质、盐、辅因子、缓冲剂和其他组分。
术语“底物”是指通过酶的作用被转化或意图转化为另一种化合物的任何物质或化合物。该术语不仅包括单一化合物，还包括化合物的组合，诸如包含至少一种底物或其衍生物的溶液、混合物和其他材料。此外，术语“底物”不仅包括提供适于用作起始材料的碳源的化合物(例如甲烷)，还包括在与本文描述的代谢工程化微生物相关的途径中使用的中间体代谢物和终产物代谢物。
如本文中使用的术语“天然多碳底物”是指用作能够使微生物生长的生长底物或代谢物的多碳化合物。
术语“发酵”或“发酵方法(fermentation process)”被定义为在包含原材料(诸如原料和营养物)的培养基中培养宿主微生物的方法，其中微生物将原材料(诸如原料)转化为产物。
术语“多核苷酸”在本文中可与术语“核酸”互换使用，并且指包含两个或更多个单体(包括核苷酸、核苷或其类似物)的有机聚合物，包括但不限于任何长度的单链或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适当的情况下，任何长度的单链或双链、有义或反义核糖核酸(RNA)，包括siRNA。术语“核苷酸”是指由核糖或脱氧核糖与嘌呤碱基或嘧啶碱基和磷酸基团连接而组成的若干化合物中的任一种，并且它们是核酸的基本结构单元。术语“核苷”是指由嘌呤碱基或嘧啶碱基与脱氧核糖或核糖组合而组成的化合物(如鸟苷或腺苷)，并尤其可见于核酸中。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别指其中一个或更多个个体原子被不同原子或不同官能团替代的核苷酸或核苷。因此，术语多核苷酸包括任何长度的核酸，包括DNA、RNA、ORF、其类似物及片段。
如本文定义的，术语“开放阅读框”(以下称“ORF”)意指包含不间断阅读框的核酸或核酸序列(无论是天然存在的、非天然存在的还是合成的)，该不间断阅读框由(i)起始密码子，(ii)两(2)个或更多个代表氨基酸的密码子的系列，和(iii)终止密码子组成，ORF以5’至3’方向被阅读(或翻译)。
应理解，本文描述的多核苷酸包括“基因”，并且本文描述的核酸分子包括“载体”或“质粒”。因此，术语“基因”是指编码包含一种或更多种蛋白或酶的全部或部分的特定氨基酸序列的多核苷酸，并且可以包含调控(非转录)DNA序列，诸如启动子序列，其决定例如基因表达的条件。基因的转录区可以包含非翻译区，包括内含子、5’-非翻译区(UTR)和3’-UTR，以及编码序列。
术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’。启动子可以以其整体源自天然基因，或包括源自自然界中发现的不同启动子的不同元件，或甚至包括合成的核酸区段。本领域技术人员理解，不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应不同的环境或生理状况的表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况调控序列的确切边界尚未被完全地界定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指在单个核酸片段上核酸序列的缔合以使得一个核酸序列的功能被另一个核酸序列影响。例如，当启动子能够实现编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义方向或反义方向可操作地连接到调控序列。
当提及用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区(或ORF)时，术语“密码子优化”是指改变核酸分子的基因或编码区中的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变由DNA编码的多肽。
术语“操纵子”是指作为单个转录单位由共同启动子转录的两个或更多个基因。在某些实施方案中，包含操纵子的基因、多核苷酸或ORF是连续的基因。应理解，整个操纵子的转录可以通过修饰共同启动子来修饰(即，增加、降低或消除)。可选地，操纵子中的任何基因、多核苷酸或ORF或其任何组合都可以被修饰以改变编码多肽的功能或活性。修饰可以导致编码多肽的活性或功能的增加或降低。此外，修饰可以为编码的多肽赋予新的活性。
“载体(vector)”是核酸可以藉以在生物体、细胞或细胞组分之间传播和/或转移的任何工具。载体包括病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体，诸如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和PLAC(植物人工染色体)等，它们是“附加体(episomes)”，即自主复制或能够整合到宿主微生物的染色体中。载体也可以是性质上为非附加体的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链内包含DNA和RNA两者的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等，或者载体可以是包含一种或更多种上述多核苷酸构建体的生物体，诸如农杆菌或细菌。
如本文关于第一家族或物种的初始酶、多肽、基因或多核苷酸(或编码其的ORF)使用的术语“同源物”是指通过功能、结构或基因组分析被确定为第二家族或物种的酶、基因或多核苷酸的，对应于第一家族或物种的初始酶或基因的第二家族或物种的不同的酶、基因或多核苷酸。最常见的，“同源物”将具有功能、结构或基因组相似性。已知技术可以使用遗传探针和PCR容易地克隆酶、基因或多核苷酸的同源物。克隆序列作为“同源物”的身份可以使用功能测定和/或通过基因的基因组作图来确认。
如果编码多肽的核酸序列与编码第二多肽的核酸序列具有相似的序列，则多肽(或蛋白或酶)与第二多肽具有“同源性”或者是“同源的”。可选地，如果两种蛋白具有“相似”的氨基酸序列，则多肽与第二种多肽具有同源性。因此，术语“同源蛋白”或“同源多肽”被定义为意指两种多肽具有相似的氨基酸序列。在本发明的某些实施方案中，与表1中列出的一种或更多种多核苷酸和/或多肽同源的多核苷酸和多肽可以使用本领域已知的用于序列分析和比较的方法容易地鉴定。
如本文使用的术语“CoA”是指辅酶A。
本发明的同源多核苷酸或多肽序列也可以通过将查询核苷酸或多肽序列与已知序列的数据库进行比较的BLAST分析(Basic Local Alignment Search Tool)或类似的生物信息学工具来确定或鉴定。例如，可以使用BLAST进行检索分析，以确定序列与先前公布的序列的同一性或相似性，并且如果序列尚未被公布，可以给出对DNA或蛋白序列的功能的相关洞察。
本发明提供了被工程化为赋予其能够基于C1底物生长的途径的系统和微生物(在没有所述工程化/合成途径的情况下，所述微生物不能够基于任何C1底物生长)。在一些实施方案中，该系统包括C1底物和能够基于C1底物生长的修饰的生物体。本发明提供了将C1底物转化为细胞(即基于C1底物生长)的系统、生物体和方法。如实施例和图7-图9、图14和图16-图18(以及与这些图相关的材料)所展示的，展示了基于C1底物的生长。
在各种实施方案中，本发明提供了用作生物体的能量和碳两者的来源的单碳(C1)化合物。不同还原水平的单碳分子相互转化产生甲酰基-CoA，甲酰基-CoA是用于延长碳主链的单碳单元。WO 2017/210381中描述了基于使用甲酸酰基转移酶生物转化C1原料的系统和方法，将其通过引用并入用于这些教导。不同的是，本发明公开的系统在由2-羟基酰基-CoA裂合酶(HACL)催化的反应中使用甲酰-CoA作为C1构建模块或延伸单元。这种方法在设计上更简单(更少的总反应步骤)，并且在实践上也更简单(增加的氧耐受性)。
在一些实施方案中，单碳(C1)分子是唯一供应的碳源。在这些情况下，产生一碳酰基-CoA，即甲酰基-CoA。在一些实施方案中，甲酸可以通过合适的乙酰基-CoA合成酶直接转化为甲酰基-CoA，或者通过合适的甲酸激酶和磷酸乙酰转移酶通过中间体甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA。甲醛也可以通过合适的酰基-CoA还原酶转化为甲酰基-CoA。
上述反应的组合可以用于从其他单碳分子产生甲酰基-CoA。例如，利用甲烷的实施方式将包括表达甲烷单加氧酶、甲醇脱氢酶和酰基-CoA还原酶。可以使用所描述的反应和伴随的酶的甚至更多的组合，以允许在所有描述的反应中使用单碳单元的混合物(例如甲烷和二氧化碳的组合)的实施方式。至少，这种功能可以通过表达酰化醛脱氢酶从甲醛来实现，或者通过合适的乙酰基-CoA合成酶或组合的甲酸激酶和磷酸乙酰转移酶从甲酸来实现。
因此，本文公开了使异养生物能够利用单碳(C1)底物(例如，甲烷、甲醇、二氧化碳、甲酸、甲醛)以进行生长的方法，该方法包括以下步骤：提供细胞系统，该细胞系统包含将单碳底物转化为甲酰基-CoA和甲醛的第一组代谢酶，用甲酰基-CoA分子延伸醛糖或醛(包括产生的甲醛)的第二组代谢酶，在适于代谢酶的条件下向该系统供给C1底物以产生所需碳长度的醛或醛糖中间体，以及任选地提供将醛或醛糖中间体转化为所需多碳化学品的第三组代谢酶。
所公开的系统和方法的第一步是将单碳底物(例如甲烷、甲醇、二氧化碳、甲酸、甲醛)转化为甲酰基-CoA和甲醛。该步骤在本文称为C1活化。
通常，将甲烷(CH4)转化为甲醛(H2C＝O)和甲酰基-CoA需要至少以下三个步骤：(1)首先经由甲烷单加氧酶(MMO；EC 1.14.13.25)将甲烷(CH4)底物氧化成甲醇(CH3OH)，(2)然后经由甲醇脱氢酶(MDH；E.C.1.1.1.244,1.1.2.7)将甲醇(CH3OH)氧化成甲醛(H2C＝O)，以及(3)经由酰基-CoA还原酶(ACR)将一些甲醛(H2C＝O)氧化成甲酰基-CoA。示例性酰基-CoA还原酶或酰化醛脱氢酶包括脂肪酰基-CoA还原酶(EC 1.2.1.84)、琥珀酰基-CoA还原酶(EC1.2.1.76)、乙酰基-CoA还原酶、丁酰基-CoA还原酶、丙酰基-CoA还原酶(EC 1.2.1.10)。
通常，将二氧化碳(CO2)转化为甲酰基-CoA首先需要经由甲酸脱氢酶(E.C.1.2.1.2)将CO2底物还原为甲酸(HCOO-)。然后产生的甲酸可以通过三种途径之一转化为甲酰基-CoA。在一些实施方案中，经由酰基-CoA合成酶(ACS；E.C.6.2.1.1)将甲酸转化为甲酰基-CoA。在一些实施方案中，通过甲醛脱氢酶(FaldDH；E.C.1.2.1.46)将甲酸转化为甲醛(H2C＝O)，然后经由酰基-CoA还原酶(ACR；E.C.1.2.1.-，例如1.2.1.10、1.2.1.76、1.2.1.84)将甲醛氧化成甲酰基-CoA。在一些实施方案中，经由甲酸激酶(FOK；E.C.2.7.2.6)将甲酸转化为甲酰基-磷酸，然后经由磷酸转酰基酶(PTA；EC 2.3.1.8)将甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA。
如本文公开的，甲酰基-CoA可以用作由2-羟基酰基-CoA裂合酶(HACL)或草酰基-CoA脱羧酶(OXC；E.C.4.1.1.8)催化的反应中的C1构建模块或延伸单元。这些酶可以将甲酰基-CoA与宽泛链长度和官能化的各种含羰基的受体(包括C1化合物甲醛)连接。因此，本文公开了将HACL催化反应的产物2-羟基酰基-CoA转化为可以被甲酰-CoA进一步延长的醛的反应途径。
在一些实施方案中，2-羟基酰基-CoA通过酰基-CoA还原酶(ARC；E.C.1.2.1.-，例如1.2.1.10、1.2.1.76、1.2.1.84)还原为2-羟基醛。通过HACL进一步连接2-羟基醛与甲酰基-CoA，得到多羟基酰基-CoA和其他多羟基醛，通常称为醛糖。多羟基醛原理上能够用作HACL催化反应的底物，该反应在本文中称为“醛糖延伸”。
通过合适的1,2-二醇氧化还原酶(DOR；E.C.1.1.1.77)或醇脱氢酶(ADH；1.1.1.71)将2-羟基醛进一步还原以得到1,2-二醇是可行的。在一些实施方案中，DOR是大肠杆菌FucO。
大肠杆菌(Escherichia coli)FucO描述于Pereira，B.等人Metab.Eng.34,80–87(2016)中，其通过引用并入用于该酶的教导。多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)RhaO描述于Patel，E.H.等人Res.Microbiol.159,678-684(2008)中，其通过引用并入用于该酶的教导。楔状梭菌(Clostridium sphenoides)DOR描述于Tran-Din，K.等人Arch.Microbiol.142,87-92(1985)中，其通过引用并入用于该酶的教学。Microcyclus eburneus DOR描述于Kawagishi，T.等人Agric.Biol.Chem.44,949-950(1980)中，其通过引用并入用于该酶的教导。浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)DOR描述于Weimer，P.J.Appl.Environ.Microbiol.47,263-267(1984)中，其通过引用并入用于该酶的教导。
通过二醇脱水酶(DDR；E.C.4.2.1.28)的活性可以催化1,2-二醇的脱水得到醛。甲酰基-CoA对醛的进一步延伸，在本文中被称为“醛延伸”，导致烃基链的延伸，类似于脂肪酸生物合成或逆向β-氧化途径。
在一些实施方式中，可以同时实施上述途径的组合，使得对于一些分子，延伸通过醛糖延伸发生，而对于其他分子，延伸通过醛延伸发生。这两个途径可以同时同步地存在于同一系统中。
在一些实施方案中，上述反应的中间体用作微生物生长的代谢物。在其他实施方案中，上述反应的中间体用作微生物的生长底物的前体或转化为微生物的生长底物。在图2中突出了这些产物的实例，并且包括酮酸、羟基酸、醛、二醇和多元醇。
在一些实施方案中，所描述的途径是在微生物宿主的背景中提供的。在一些实施方案中，在发酵系统中培养微生物宿主以产生多碳分子。在其他实施方案中，微生物系统用于产生酶，然后从微生物中提取酶用于在无细胞系统中使用。在其他实施方案中，分别产生酶并单独添加到系统中。
在一些实施方案中，微生物系统包含多于一种工程化微生物宿主，其中C1利用、生物质产生和产物合成的功能被分到多于一种生物体中，这些生物体在称为共培养的发酵系统中培养，并且其中共培养的总体结果是将C1底物转化为生物质和/或化学产物。
生命系统中的途径通常是通过用一种或更多种包含编码一种或更多种酶的基因的表达载体转化微生物来实现的，但是也可以通过重组工程化、同源重组、基因编辑和类似技术将基因添加到染色体中。在如一些实例的情况下，所需的蛋白是内源的，其本身可能就足够了，但通常为了更好的功能和对活性酶的水平的控制而进行过表达。在一些实施方案中，一个或更多个或所有这样的基因受诱导型启动子的控制。
根据需要，可以将酶添加到基因组中或经由表达载体添加。优选地，多于一种酶在一个载体中表达，或者通过在编码区之间添加所需的信号，多于一种酶可以组合成一个操纵子。进一步的改进可以通过过表达一种或更多种，甚至所有的酶，例如经由质粒或其他载体向细胞添加另外的拷贝来实现。为了方便，最初的实验可以采用承载3个或更多ORF的表达质粒，但是出于稳定性原因，可以优选将操纵子或个体基因插入基因组中。
通过降低或抑制竞争途径，诸如用于制备例如乙酸、甲酸、乙醇和乳酸的那些途径，可以进一步提高产率，并且如何降低或敲除这些途径已经是本领域熟知的。参见例如美国专利第7,569,380号、第7,262,046号、第8,962,272号、第8,795,991号、第8,129,157号和第8,691,552号，为了所有目的，每一个都通过引用以其整体并入本文。许多其他人也在这一领域进行了研究。
在构建包含工程化途径的合适菌株之后，可以进行所开发菌株的培养，以评价该途径在其预期目标(从单碳化合物产生产物)上的有效性。生物体可以在合适的生长培养基中培养，并且可以评价基于单独或与多碳分子组合的从甲烷到CO2的单碳底物的产物形成。生物体产生的产物量可以通过超高效液相色谱(UPLC)或气相色谱(GC)来测量，并且可以确定性能指标，诸如生长速率、生产率、滴度、产量或碳效率。
进一步评价途径酶彼此之间以及与宿主系统的相互作用可以允许优化途径性能并最小化有害作用。因为该途径受合成控制，而不是受生物体自身演进的调控机制控制，所以该途径的表达通常被手动调节，以避免减缓细胞生长或生产的潜在问题，并优化所需化合物的产生。
此外，相对酶活性的不平衡可能会限制整个途径的总碳通量，导致次优的生产速率和途径中间体的积累(buildup)，这可能会抑制途径酶或有细胞毒性。通过高效液相色谱(HPLC)或GC分析细胞培养物可以揭示所构建的菌株产生的代谢中间体。该信息可以指出潜在的途径问题。
作为该途径体内表达的替代，可以构建该途径的无细胞体外形式。通过纯化用于每个反应步骤的相关酶，可以通过在反应混合物中组合必要的酶来组装整个途径。随着相关辅因子和底物的添加，可以独立于宿主评估该途径的性能。
在一些实施方案中，仅使用单碳分子，诸如二氧化碳、甲酸、甲醛、甲醇、甲烷和一氧化碳来产生包含至少一个羧基基团的产物。在该实施方案中，甲醛和甲酰基-CoA两者都是从如前所述的单碳分子产生的。
用于基因合成和DNA克隆以及载体和质粒构建的一般方法是本领域熟知的，并且在许多出版物中有所描述。更具体地，诸如基于消化和连接的克隆的技术，以及体外和体内重组方法，可以用于将编码催化底物向产物转化的多肽的DNA片段组装到合适的载体中。这些方法包括限制性消化克隆、序列和连接非依赖性克隆(SLIC)、金门克隆(Golden Gatecloning)、Gibson组装等。这些方法中的一些可以被自动化和小型化，以进行高通量应用。
用于在宿主微生物中表达工程化代谢途径的基因盒是本领域已知的。该盒可以包含一个或更多个编码引入途径的酶的开放阅读框(ORF)，用于指导操纵子内下游ORF转录的启动子，用于指导由个体ORF编码的mRNA翻译的核糖体结合位点，和转录终止子序列。由于表达盒的各种组分的模块化性质，可以通过在一个或更多个位置处取代不同的组件来创建这些布置的组合排列。还可以使一个或更多个ORF的取向逆转，以确定这些替代取向中的任何一个是否提高了产物产率。
在一些实施方案中，用于表达质粒的宿主微生物是甲烷营养菌(methanotroph)，并且包含代谢途径表达盒的质粒载体经由接合被动员到这些生物体中。
在用于在微生物宿主中表达代谢途径基因的替代方法中，可以将生物合成途径基因直接插入染色体中。用于染色体修饰的方法包括非靶向和靶向缺失和插入。
在一些实施方案中，所公开的系统和方法还包括从发酵液中回收和纯化所需产物。待使用的方法取决于产物的物理化学特性以及发酵培养基和细胞的性质和组成。例如，美国专利第8,101,808号描述了使用连续闪蒸和相分离处理从发酵液中回收C3-C6醇的方法。在一些实施方案中，可以通过离心、过滤、倾析从发酵培养基中除去固体。在一些实施方案中，使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、气提、膜蒸发或渗透蒸发的方法从发酵培养基中分离多碳化合物。
对于长链醇，诸如脂肪醇，美国专利第8,268,599号描述了通过双相分离从发酵水相中分离这些组分，由此产物化合物与发酵液的不混溶性允许收集和去除有机相的方法。这种分离还可以降低产物对宿主微生物细胞的毒性作用。美国公布第2007/0251141号描述了通过添加尿素并产生相分离从液体悬浮液中回收脂肪酸甲酯(FAME)的方法，由此饱和和不饱和的FAME可以分别回收。膜分离方法也可以应用于纯化脂肪酸酯产物，诸如生物柴油。
在某些实施方案中，从天然气来源提供或获得本发明的甲烷底物，其中天然气是“湿”天然气或“干”天然气。当天然气几乎是纯甲烷，已经去除了大多数其他通常相关的烃类时，它被称为“干”天然气。当存在其他烃类时，天然气被称为“湿”的。湿天然气通常包含约70％-90％的甲烷、约0-20％的乙烷、丙烷和丁烷(组合总量)、约0-8％的CO2、约0-5％的N2、约0-5％的H2S和痕量的氧、氦、氩、氖和氙。在某些其他实施方案中，从甲烷排放物或甲烷废气中提供或获得本发明的甲烷底物，所述甲烷排放物或甲烷废气由各种自然和人类影响的过程产生，包括固体废物填埋中的厌氧分解、反刍动物中的肠道发酵、消化器和废水处理操作中的有机固体分解，以及化石燃料回收、运输和处理系统中的甲烷泄漏。
已经描述了本发明的多种实施方案。尽管如此，将理解的是，可以做出各种改变而不偏离本发明的精神和范围。因此，其他实施方案在所附权利要求书的范围之内。
实施例
实施例1：
该实施例研究了与宿主生物体中心代谢过程正交、且基于新发现的通过HACL应用甲酰基-CoA作为C1延伸单元的经典C1代谢(Pandit,AV.,等人R.Nat.Commun.8:1–11(2017))的替代方法。与其中中心代谢过程是产物合成和生长之间的主要分支点的代谢的“蝴蝶结”架构(图9A)不同，正交架构允许产物合成独立于宿主中心和产物合成途径(图1A)。这种类型的代谢架构依赖于直接从C1底物产生不同产物合成所必需的碳骨架的能力。该实施例报告了基于甲酰基-CoA延伸(FORCE)途径实现这种正交架构的生化途径的概念化和设计，提供了它们的可行性和性能的分析，并展示了它们在原型系统中的功能。通过产生对微生物宿主生物体天然的生长底物，FORCE途径可以用作生物产物合成和C1营养两者的基础。该实施例提供了包含一碳底物的系统，该底物能够使先前不能够在这样的培养基上生长的微生物生长。这种基于C1底物的生长是新颖的，并且通过利用一碳底物作为仅有能源的系统设计实现。图7-图9、图14和图16-图18(以及与这些图相关的物质)详细描述了基于C1底物的生长。
结果
基于C1利用和产物合成的正交代谢架构的设计
这里开发的正交代谢架构具有三个主要特征：1)将C1底物活化成用于碳链延伸的合适构建模块；2)每个循环碳链迭代延伸一个碳；和3)导致感兴趣的产物积累的途径的终止。基于我们先前的发现(Chou,A.,等人Nat.Chem.Biol.15:900–906(2019))，开发了基于甲酰基-CoA的使用所构思和实现的设计。
甲酰基-CoA在代谢中的作用在多碳化合物的降解中得到了最充分的确立，而从C1分子产生甲酰基-CoA的报道很少。然而，酰基-CoA是羧酸和醛形式之间的方便中间体，能够从氧化和还原的C1底物两者产生酰基-CoA(图1b：一碳活化图)。可以经由酰基-CoA还原酶(ACR)16活性，从甲醛产生甲酰基-CoA，并且通过甲醇脱氢酶(MDH)将甲醇氧化为甲醛是众多研究的主题18-20。可以通过CoA转移酶21或CoA连接酶，诸如混杂活性大肠杆菌乙酰基-CoA合成酶(EcACS)6，从甲酸产生甲酰基-CoA。虽然后者是形成AMP的(消耗2ATP当量)，但存在通过甲酸激酶(FOK)和磷酸转酰基酶(PTA)经由中间体甲酰基-磷酸形成ADP的途径的证据22。尽管热力学上具有挑战性，但经由甲醛脱氢酶(FaldDH)将甲酸还原为甲醛，不依赖ATP将甲酸转化为甲酰基-CoA也是可能的23(图1b)。此外，CO2可以通过甲酸脱氢酶(或二氧化碳还原酶)的逆向活性转化为甲酸24,25，并且通过甲烷单加氧酶将甲烷转化为甲醇26，当与上述反应偶联时，可以导致甲酰基-CoA的形成。
通过C1延伸而正交、从头构建不同的碳骨架需要类似于那些可见于自然界中的从C2-C5代谢物构建碳骨架的，但却存在于中心代谢之外的迭代途径27。因为2-羟基酰基-CoA裂合酶(HACL)具有宽泛的碳链长度特异性16，因此它是用于建立迭代途径的良好候选物。我们评价了通过将HACL催化反应的产物2-羟基酰基-CoA转化为可以被甲酰基-CoA进一步延长的醛来潜在地实现迭代的反应途径。在α-碳处，脱水是可能的，将2-羟基酰基-CoA转化为2-烯酰基-CoA28(图10)，其类似于已确立的丙烯酸途径29。2-烯酰基-CoA产生也是方便的，因为这些中间体参与β-氧化，潜在地允许使用为β-氧化逆转平台建立的酶工具包和知识30-32。然而，2-羟基酰基-CoA的脱水比3-羟基酰基-CoA的脱水更具挑战性，因此需要氧敏感自由基机制33。它还需要β-碳的存在，因此将途径的实现限制为3个碳或更大的中间体。
由于这些问题，我们研究了硫酯的转化。CoA-硫酯的还原得到2-羟基醛(图1b：甲酰基-CoA延伸图)，由于某些酰基-CoA还原酶(ACR)的非特异性活性16，这是可能的。通过HACL将2-羟基醛与甲酰基-CoA连接，得到多羟基酰基-CoA和另外的多羟基醛，通常称为醛糖。多羟基醛原理上可以用作HACL催化反应的底物，我们称之为醛糖延伸(图1b：甲酰基-CoA延伸图)。
经由二醇氧化还原酶(DOR)活性还原2-羟基醛以得到1,2-二醇也是可能的。例如，大肠杆菌FucO催化1,2-二醇与2-羟基醛的相互转化34。通过二醇脱水酶(DDR)的活性可以催化1,2-二醇脱水为醛，有效地完成α-还原。虽然二醇脱水也需要自由基机制，但B12依赖性DDR是氧耐受性的，并且已经成为许多蛋白和代谢工程化研究的主题35-37。这种醛通过甲酰基-CoA的延伸，我们称之为醛延伸，使得烷基链能够延伸，类似于脂肪酸生物合成中的双碳延伸途径38或逆向β-氧化途径39。我们将这些途径(醛糖延伸、α-还原和醛延伸)统称为甲酰基-CoA延伸(FORCE)途径，因为它们促进甲酰基-CoA作为碳链延伸单元的使用(图1b：甲酰基-CoA延伸图)。
各种产物类别可以作为中间体产生或由FORCE途径中间体的衍生物产生(图1b)，其中一些也支持微生物生长(图9)。例如，醛糖是2-羟基醛节点的直接结果。二醇，包括诸如乙二醇的主要工业化学品，是1,2-二醇节点的结果。2-羟基酰基-CoA节点的衍生物包括2-羟基酸，诸如由硫酯酶催化反应产生的工业产品乙醇酸和乳酸。许多化学类别可以源自醛节点40，包括羧酸、醇和可用作其他产物前体的酰基-CoA。
用于C1利用的FORCE途径的热力学分析
途径反应(图1b)的标准吉布斯自由能使得潜在的挑战性反应变得显而易见，但是考虑到反应相互影响的能力，对途径热力学的整体分析是必要的。为此，我们应用了“最大-最小驱动力(Max-min Driving Force,MDF)”方法41。
我们评价了从C1底物产生C2代谢物乙醇酸和乙酸的FORCE途径的MDF。仅评价可溶性C1底物，因为质量传输限制可以显著限制CO2和甲烷利用，并且不在本分析的范围之内。代表性C2产物(乙醇酸和乙酸)既是途径产物又是生长底物，其中乙醇酸需要最短的途径，而乙酸需要醛延伸反应的整个序列。如图2a中示出的，对于每种底物，乙醇酸的产生比乙酸有更大的驱动力。这是由于羟乙酰基-CoA在热力学上有利于水解，而乙酸的产生需要热力学上具有挑战性的羟乙酰基-CoA还原。使用代谢物浓度的标准限值41，甲醛允许最大的MDF，因为它不需要NAD+依赖的甲醇氧化或将甲酰基-CoA还原为甲醛。然而，尽管甲醇氧化有热力学挑战，但在所需的乙醇酸和乙酸的净产生方向上有足够的驱动力。用于甲酸利用的驱动力最低。这里，ATP水解有助于甲酸的活化。2ATP当量的水解为乙酸的净产生提供了刚好足够的驱动力，而1ATP当量的利用仅为乙醇酸的产生提供了足够的驱动力。如所预期的，不依赖ATP的途径在这些条件下是不可行的。
上述分析假设了对代谢物浓度的标准限制(1μM-10mM41)，但我们试图应用基于物理限制(诸如C1底物的毒性)的真实底物浓度(图2a)。尽管一些生物体可以在10mM量级的甲醛浓度存活42，但将甲醛的上限调整到更合理的0.1mM，导致MDF的减少。增加已在100mM量级的浓度使用的甲醇的上限43，导致更大的MDF。令人感兴趣的是，在这些浓度，甲醇利用的驱动力变得大于甲醛的驱动力。类似地，大肠杆菌具有在存在100mM量级的甲酸浓度情况下生长的能力9,44。在1ATP或2ATP消耗的情况下，增加甲酸浓度的界限对MDF没有影响，但对0ATP途径的MDF有重大影响，使合成乙醇酸成为可能。
NADH/NAD+比率也是途径热力学的主要限制。我们最初使用反映了大肠杆菌在有氧条件下生长的0.1的限制41，而生理NADH/NAD+可以变化，在厌氧条件下达到接近或大于1的值45-47。在生理范围(0.1-1)内，甲醛和甲醇作为底物的途径驱动力保持为正(图11)。如所预期的，当途径产生氧化还原(甲醇向乙酸/乙醇酸、和甲醛向乙醇酸)时，低比率是有利的，当途径消耗氧化还原(甲酸向乙酸/乙醇酸)或氧化还原平衡(甲醛向乙酸)时，高比率是有利的——可能是因为还原反应在热力学上更具挑战性。NADH/NAD+比率对于甲酸利用途径的驱动力至关重要(图2b)。这里，将处于生理范围较高一端的NADH/NAD+比率与将甲酸浓度增加到100mM组合，即使没有ATP水解，也能为乙醇酸或乙酸产生提供正驱动力。
由于甲醛的中间氧化还原状态，我们进一步评价了使用甲醛作为示例性底物的FORCE途径支持迭代的能力。醛糖和醛延伸途径两者的热力学都支持至多4个碳的迭代(图2c)。在4个碳之后，醛糖延伸模式变得不利，这可能是由于连续酰基-CoA还原反应的累积效应。尽管需要相同的酰基-CoA还原，醛延伸模式仍然是有利的，这可能是由于DOR和DDR催化的热力学有利的反应。当迭代次数较低时，不同的C1活化和终止途径对整个延伸循环的MDF有影响。随着迭代次数的增加，延伸循环反应的热力学占主导地位(图12)。
体外途径验证
FORCE途径的关键先决条件是甲酰基-CoA和甲醛的产生。为了验证这些反应的功能，我们开发了纯化的酶系统来监测甲酰基-CoA和HACL缩合产物羟乙酰基-CoA由不同C1底物的形成(图3)。
由于甲酰基-CoA可以通过ACR由甲醛产生，我们在使用甲醛作为仅有的C1底物的包含单核细胞增生李斯特菌ACR(LmACR)和红螺菌目细菌URHD0017 HACL(RuHACL)16的反应中观察了甲酰基-CoA和羟乙酰基-CoA两者的形成。甲酰基-CoA也可以通过活化甲酸从氧化的C1底物衍生。使用来自产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)的甲酰基-CoA转移酶(OfFrc)和作为CoA供体的琥珀酰基-CoA，观察到甲酸活化为甲酰基-CoA，并且在添加甲醛的情况下，导致羟乙酰基-CoA的形成。使用甲酸作为唯一底物，使用LmACR通过甲酰基-CoA还原原位产生甲醛，尽管比添加甲醛时产生的羟乙酰基-CoA低。这些结果在一起表明，在该酶系统中，限制是由ACR反应施加的，这是由于酶的活性或由于需要适当形式的NAD(H)。支持后一种假设的是，在氧化方向上(即甲醛向甲酰基-CoA)，在CoA硫酯水解后观察到的乙醇酸的量几乎相当于添加到反应中的1mM NADH。在相反的方向上，观察到少于等量的乙醇酸，这与随着NADH/NAD+的降低反应变得不利的热力学相一致(图1a、图2b)。
验证了核心途径反应，将无细胞代谢工程化48用于产物合成的原型FORCE途径。表达包含α-还原FORCE途径的每种酶的大肠杆菌的提取物被连续组合，以逐步的方式展示途径功能(图4)。除了经由HACL产生的2-羟基酰基-CoA的硫酯裂解直接产生2-羟基羧酸(例如乙醇酸)之外，其他C2产物以及醛糖或醛延伸途径需要还原这种2-羟基酰基-CoA(例如用于甲醛和甲酰基-CoA连接的羟乙酰基-CoA)(图1b：甲酰基-CoA延伸图)。正如我们先前发现的，LmACR能够作用于乙醇醛16，我们用它来催化将甲醛氧化为甲酰基-CoA和将羟乙酰基-CoA还原为乙醇醛两者(图4a)。虽然LmACR单独仅导致甲醛转化为甲酸，但包含RuHACL导致乙醇酸的产生(图4b)。未检测到乙醇醛，这可能是由于细胞提取物系统中存在催化乙醇醛氧化为乙醇酸的内源氧化还原酶(例如AldA、AldB、PuuC、PatD)、或在较小程度上催化乙醇醛还原为乙二醇的内源氧化还原酶(例如FucO、YqhD、AdhP、EutG以及其他49)。
下一个还原产物乙二醇的合成(图4a)通过添加过表达大肠杆菌FucO(1,2-二醇氧化还原酶)的大肠杆菌的细胞提取物显著增加(增加2倍，从1.37±0.1mM增加到2.73±0.03mM)(图4b)。另外添加表达产酸克雷伯菌DDR的大肠杆菌细胞提取物以及辅酶B12，检测到乙醇(在1小时时为1.90±0.03mM：图4b)(可能是由于内源氧化还原酶还原乙醛(乙醛经由乙二醇脱水形成))，以及乙二醇的相应减少。在后面的时间点，观察到乙酸的增加，可能是由于内源氧化还原酶活性导致的乙醇和乙醛氧化。
FORCE途径的体内实现
我们试图展示设计平台的关键特征，以及使用静息大肠杆菌培养物和生长大肠杆菌培养物(图5和图6)两者的另外产物的合成和各种C1底物的利用。FORCE途径设计的关键特征是迭代，这可以通过醛糖或醛延伸来实现(图1b：甲酰基-CoA延伸图，图2c)。为了展示体内迭代醛糖延伸，我们的目标是从甲醛合成三碳产物甘油酸(图5a)。我们从先前开发的具有C1异化和乙醇酸消耗敲除(AC440:MG1655(DE3)ΔfrmAΔfdhFΔfdnGΔfdoGΔglcD)并过表达RuHACLG390N、LmACR和EcAldA的菌株16开始。为了促进乙醇醛的积累和与甲酰基-CoA的缩合，我们从表达载体中去除了EcAldA。虽然甲醛消耗显著降低，但观察到乙醇醛和甘油酸的积累(图5b)，展示了迭代醛糖延伸途径。为了增加这些化合物的产量，我们使编码醛脱氢酶的基因缺失(ΔaldAΔaldBΔpatDΔpuuC，统称为Δaldh)，导致当不过表达EcAldA时，较低的乙醇酸和较高的乙醇醛。然而，这些敲除并不影响甘油酸的积累，这可能指示由RuHACL催化的乙醇醛和甲酰基-CoA之间的缩合反应受到限制。我们还通过过表达大肠杆菌fucO50将该途径扩展到下一个还原产物乙二醇，这导致胞外培养基中乙二醇的积累，其中Δaldh背景进一步提高了产量(图5b)。为了验证观察到的产物源自甲醛而不是来自残留的多碳底物或生物质组分，使用13C标记的甲醛作为底物。基于产物的TMS衍生物的特征性[M-15]+离子，发现乙醇酸、乙二醇和甘油酸完全被13C标记(图5c)。
为了将上述建立的甲醛利用途径扩展到甲醇，我们表达了与RuHACLG390N、LmACR和EcAldA组合的、用于将甲醇转化为甲醛的经充分研究的甲醇芽孢杆菌MGA3的MDH变体(BmMDH2MGA3)18。与其中毒性需要使用静止的细胞的甲醛不同，甲醇还可以直接添加到生长的大肠杆菌培养物中。当工程化甲醇利用菌株在存在复杂营养物和500mM甲醇的情况下生长时，仅在表达RuHACL的菌株中观察到乙醇酸形成(图6b)。然而，该菌株将甲醇转化为乙醇酸的效率低下，并且甲酸大量积累。
为了提高性能，我们将RuHACLG390N替换为新鉴定的来源于沙滩沙宏基因组的HACL，这里称为BsmHACL(UniProt:A0A3C0TX30)。BsmHACL使乙醇酸积累增加约3倍(图6c)。尽管乙醇酸产量提高，甲酸积累仍然是高的。为了解决这个问题，将终止酶EcAldA替换为先前被发现比OfFrc具有更好的特性的来自氨基丁酸梭菌的CoA转移酶(CaAbfT)51。CaAbfT既能用于从羟乙酰基-CoA中释放乙醇酸，又能用于将甲酸重新活化为甲酰基-CoA以进一步缩合。当CaAbfT表达时，乙醇酸积累增加约33％，而甲酸积累减少约36％。最后，由于CaAbfT经由释放乙醇酸被用来终止该途径，预期不需要内源硫酯酶，并且内源硫酯酶被认为是观察到的甲酸的部分原因。使用硫酯酶缺陷的宿主菌株(ΔyciAΔtesAΔtesBΔybgCΔydiIΔfadM)，甲酸积累进一步减少。为了验证乙醇酸源自甲醇，我们使用了13C标记的甲醇，并观察到乙醇酸的TMS衍生物的[M-15]+离子完全源自13C-甲醇(图6d)。
已经确定CaAbfT是用于甲酸活化的有希望的途径，我们评价了CaAbfT是否可以用于整合外源供应的甲酸。这里，CaAbfT被表达以便在没有LmACR过表达的情况下活化甲酸，因为在添加甲醛后不需要甲醛和甲酰基-CoA的相互转化。在表达BsmHACL的工程化菌株中，与当单独供应甲醛时相比，当培养基中包含甲酸时，观察到乙醇酸增加了12倍(图13)，并且作为乙醇酸积累的总碳大于最初作为甲醛添加的量。
合成甲基营养的通量平衡分析
已经展示了用于直接产物合成的FORCE途径，一些产物(例如乙醇酸、甘油酸、乙酸)可以用作生长底物，对它们实现大肠杆菌合成甲基营养的能力进行了计算机(insilico)评价。使用先前开发的基因组规模的大肠杆菌模型iML151552，我们向模型中添加了反应，包括报道或提出的实现甲基营养的选择途径。用能够在存在不同还原水平的情况下实现C1分子相互转化的反应来评价所有途径。实现每个途径的完整反应在表3中示出。
模拟结果表明，先前提出的实现某种形式的大肠杆菌甲基营养的所有途径，天然的(核酮糖单磷酸或RuMP、丝氨酸)和合成的(甲醛酶(formolase)、合成乙酰基-CoA或SACA、还原性甘氨酸)8,53,54，两者都能够做到这一点(图14)。评价的将非天然C1底物转化为天然生长底物(乙醇酸、乙酸和甘油醛)的FORCE途径也不例外。这展示了平台正交性的另一个优点，作为到代表大肠杆菌或任何其他生物体的生理底物的化合物的直接途径，使得FORCE途径能够在不同或多于一个代谢节点整合，以利用天然代谢和底物利用的调节，而不需要对它们进行工程化。对三种模型化的FORCE途径的通量分布的分析提供了进一步的洞察(图7)。导致乙醇酸形成的FORCE途径利用大肠杆菌中存在的碳效率低下的乙醇酸利用途径，该途径需要两个乙醛酸分子进行脱羧缩合(图7a)55。因此，作为生长底物，比产生乙醇酸优选的是产生还原性更高的C2代谢物，诸如乙醇醛或乙酸。预测的乙醇醛代谢特别令人感兴趣，因为该模型提出了用于乙醇醛同化的途径，包括与甘氨酸缩合和逆向吡哆醛-5-磷酸生物合成途径，最终导致戊糖磷酸重排以得到甘油醛-3-磷酸(图7b)。基于预测的通量分布，该途径似乎优于经由乙醛酸旁路的乙酰基-CoA同化。由基于HACL的途径直接产生甘油醛导致甘油醛转化为甘油，随后是天然甘油代谢(图7c)。因此，导致C3分子(诸如甘油醛或二羟基丙酮)的途径可以利用糖酵解反应来净产生ATP，最终实现更高的生物质产量。基于其他指标，诸如氧化还原平衡、ATP需求和所需反应次数，FORCE途径也具有有希望的特征(表4)。
评价合成甲基营养的双菌株共培养体系
FORCE途径与代谢的正交性允许C1转化途径与生长完全解耦。这使得评价途径的甲基营养潜力的独特设计成为可能(图8a；图9b)。一种潜在有利的实施方式可以采用通过将多碳化合物产生和细胞生长分离到两种宿主中来分工，如果该途径直接与中心代谢连接，例如经由醛糖磷酸或乙酰基-CoA(C1同化途径中的两种常见产物)，这将是不可能的。利用这一概念，我们评价了FORCE途径支持大肠杆菌基于C1底物甲醛、甲酸和甲醇生长的能力。
设计和构建了双菌株大肠杆菌系统以使其在共培养物中工作(图8b)。第一菌株，称为产生者菌株，包含表达用于将C1底物转化为天然C2生长底物乙醇酸的FORCE途径的构建体，但缺乏消耗乙醇酸的能力。第二菌株，称为传感器菌株，保留了基于乙醇酸生长的能力，并且另外组成型表达作为信号的eGFP，但是不表达用于乙醇酸产生的FORCE途径。因此，可以通过在乙醇酸最小培养基平板上选择和通过检测荧光菌落两者来区分这些菌株。为了评价不同底物的可行性，设计了三种不同的产生者菌株：对于甲醛利用，产生者菌株表达LmACR、BsmHACL和EcAldA；对于评价通过甲醛对甲酸的利用，BsmHACL与CaAbfT一起表达；并且对于甲醇利用，使用表达BmMdhMGA3、LmACR、BsmHACL和CaAbfT的硫酯酶缺陷背景(图8b)。
为了实现具有甲醛的生长条件，使用了多聚甲醛。多聚甲醛在水性介质中逐渐解聚为甲醛，通过选择粒径和浓度来控制溶解速率(图15a)。这实现了其中甲醛能够保持在亚毫摩尔浓度，避免积累到有毒水平，并且仍观察到显著的乙醇酸产生的系统(图15b)。在含有(多聚)甲醛(相当于5mM)作为唯一碳底物的最小培养基中，观察到传感器菌株的生长，如相对于产生者菌株不表达BsmHACL的对照系统，菌落形成单位(CFU)的增加所指示的(图8c、图16)。乙醇酸在最初的8小时内快速积累，并在最初滞后期之后出现传感器菌株的持续指数生长。发现传感器菌株在30小时内经历了约6.6次倍增。
对于甲醇，仅当产生者菌株表达BsmHACL时才观察到传感器菌株的生长(图8d，图17)，然而与多聚甲醛利用的情况相比，传感器菌株的生长动力学不同，反映了CFU随时间的近似线性增加。所观察到的动力学的差异可能反映了产生者菌株从甲醇产生乙醇酸的速率所施加的限制，类似于在恒定进料速率分批进料培养中观察到的现象56。甲醇的利用比(多聚)甲醛的利用慢得多，导致72小时内约4.6次倍增。
使用1mM甲醛和10mM甲酸共底物系统进行类似的实验。这里，在乙醇酸中观察到比作为甲醛添加的更多的碳，指示甲酸的掺入(图18)。传感器菌株的生长比在甲醇上的生长快，但没有导致在5mM(多聚)甲醛上那么多次倍增。在27小时内，观察到约4.9次倍增(图8d)。
讨论
在代谢的经典架构中，底物以生物合成构建模块被输送到中心代谢中，并且感兴趣的产物衍生自所得的中心代谢物。迄今为止，将C1生物转化工程化的尝试，甚至那些利用合成途径5-9或新的酶设计6的尝试依赖于中心碳代谢。这些设计表现出最小的正交性，需要优化宿主的代谢网络以适应C1生物转化，这已被证明是具有挑战性的。
在本研究中，我们提出了甲酰基-CoA延伸(FORCE)途径的设计、分析和实现，以与宿主代谢正交的方式实现C1的利用和生物转化。FORCE途径基于使用甲酰基-CoA作为合成代谢物，这是通过2-羟基酰基-CoA裂合酶(HACL)催化的甲酰基-CoA和含羰基底物之间的酮醇缩合来实现的。与其他方法相比，产物合成以与中心代谢具有相对较高的正交性实现。我们的热力学分析表明了将甲酸、甲醛和甲醇转化为作为示例性产物的乙醇酸或乙酸的FORCE途径的有利驱动力。我们展示了体外的(纯化的酶和细胞提取物)和体内(静息细胞和生长细胞)实施方式两者中自给、正交的途径的潜力，其中可以使用甲醛、甲酸或甲醇作为唯一C1底物，以不依赖于生长和宿主代谢的方式产生不同功能的产物(例如乙醇酸、乙醇醛、乙二醇、乙醇、甘油酸)。人们可以设想其中生长和维持是用多碳底物进行，而生物催化剂用于C1生物转化的潜在生物方法。基于多酶级联和两阶段发酵的这种性质的生物方法是最近综述的主题57,58。
虽然从C1底物合成产物是FORCE途径的限定特征，但它们也具有经由产生异养生物天然消耗的多碳化合物，诸如乙醇酸、乙酸或甘油醛，使得能够基于非天然C1底物生长(例如合成甲基营养)的潜力。基因组规模建模和通量平衡分析揭示了FORCE途径与替代方法相当或更好，并指导了设计。目前的途径性能无法支持单一菌株大肠杆菌基于C1底物生长，而该途径的正交性质使我们分离和评价单独的大肠杆菌菌株基于甲酸、甲醛和甲醇生长的途径限制。FORCE途径实现甲基营养的潜力允许基于C1作为生长和产物合成两者的唯一碳源来实现更类似于传统发酵的可能生物方法。因为FORCE途径是朝向产物合成和生长的通量的分支点，所以对通量分配的简便控制有很大的潜力(图1b)，特别是随着动态代谢控制领域的最新发展59,60。
另外的FORCE途径开发将能够更有效地设计合成甲基营养和不同的产物合成，特别是经由途径迭代。当以生理相关浓度的甲醛实施时，当前的展示实现了118μmol/OD/h的C1利用速率(图15b)，而我们评估可以通过改进HACL的表达水平和动力学参数来进行进一步改进。贯穿使用甲醛或甲醇的各种实施方式观察到的作为副产物的甲酸，可能是由于甲酰基-CoA的产生速率和HACL对其的利用速率之间的不平衡引起的。我们还观察到甲酰基-CoA水解16，这可能通过内源硫酯酶在体内加剧。解决这一限制的策略包括使用CoA-转移酶将甲酸重新活化为甲酰基-CoA，如这里使用CoA-转移酶CaAbfT所实现的，以及鉴定或工程化具有更好特性的HACL酶，这里经由鉴定BsmHACL示出。最后，为此目的还探索了宿主菌株修饰，诸如内源醛脱氢酶和硫酯酶的缺失。
由于HACL催化的缩合和酶活性只是最近才被描述，我们预期进一步的基因组挖掘、生物勘探、酶工程化和生物化学表征将导致有更好性能的变体，最终克服途径瓶颈。具有明确的链长度和官能团特异性的HACL变体，与相容的特异性终止酶组合，将允许产生特异性产物，类似于已用其他平台途径展示的61-63。这些研究还将进一步阐明甲酰基-CoA在代谢中的作用，这可能比本文描述的合成途径更重要。最近的报告已经促进了本领域知识的发展17,64，并且进一步的研究可能会随之而来。
方法：
热力学计算
反应的标准吉布斯自由能是从数据库源(MetaCyc)65或使用eQuilibrator生化热力学计算器41得到的。使用先前报道的方法41计算途径的最小-最大驱动力，其使用MATLAB(Mathworks)实现。
通量平衡分析
使用带有Gurobi solver(Gurobi Optimization,LLC)的MATLAB(Mathworks)的COBRA Toolbox66进行通量平衡分析。使各种甲基营养途径(表3)成为可能的反应被添加或修饰到大肠杆菌基因组规模模型iML151552中。对于所有C1底物，将底物交换反应的极限设置为10mmol C/g DCW/hr。
试剂
除非另外指定，否则所有化学品均从Fisher Scientific Co.和Sigma-AldrichCo.获得。引物由Integrated DNA Technologies或由Eurofins Genomics合成。除非另外指定，否则限制性内切酶从New England Biolabs获得。
遗传方法
对于大肠杆菌非天然的基因被密码子优化并由GeneArt(Thermo Fisher)合成。大肠杆菌基因根据标准方案从染色体DNA扩增67。通过将所需基因克隆到用适当的限制性内切酶消化的pCDFDuet-1或pETDuet-1(Novagen)中，并通过使用In-Fusion克隆技术(ClontechLaboratories，Inc.)，实现基于质粒的基因表达。使用针对大肠杆菌开发的基于CRISPR-Cas9的系统产生基因敲除和基因组修饰。pCas和pTargetF来自S.Yang的惠赠(分别为Addgene质粒号62225和62226)。本研究中使用的质粒和菌株在表2中列出。
使用纯化的酶评价核心途径模块
包含编码RuHACLG390N、LmACR和OfFrc基因的质粒克隆到pCDFduet-1中，然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用于表达。表达菌株的过夜培养物在含有100mg/L壮观霉素的LB中生长，用于在250mL带挡板烧瓶中以1％接种50ml补充有50mg/L壮观霉素的TB培养基。使培养物在30℃和250r.p.m.在轨道振荡器中生长直到OD600达到0.4-0.6，此时用0.1mM IPTG诱导表达。然后，接种后24h，通过离心收获细胞。将细胞沉淀物用冷的9g/L NaCl溶液洗涤一次，并储存在-80℃直到需要。
将冷冻的细胞沉淀物重悬于10mL冷的裂解缓冲液(50mM NaPi pH7.4、300mMNaCl、20mM咪唑)中，向其中添加250U Benzonase核酸酶。使用Cole-Parmer超声处理器CPX130(3min，周期为5秒脉冲开启和6秒脉冲关闭，并且振幅设定为30％)在冰上通过声处理进一步处理混合物，并在4℃以7,500g离心15min。将上清液施加到包含5ml Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen，Inc.)的色谱柱上，该柱已经用裂解缓冲液预平衡。然后首先用10ml裂解缓冲液洗涤柱，并且然后用25ml洗涤缓冲液(50mM NaPi pH 7.4、300mM NaCl、70mM咪唑)洗涤柱。用20mL洗脱缓冲液(50mM NaPi pH7.4、300mM NaCl、250mM咪唑)洗脱感兴趣的加His标签的蛋白。收集洗脱液并将其施加到10,000分子量截止值的Amicon超滤离心装置(Millipore)，并将浓缩液(<300μL)用4ml 50mM KPi、10％甘油pH 7.4洗涤两次以进行脱盐。根据制造商的方案，使用Bradford蛋白测定(Bio-Rad)计算蛋白浓度。将纯化的蛋白以20μL等分试样保存在-80℃，直到需要。
为了测试甲醛作为唯一C1底物的利用，反应包括50mM KPi pH 7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NAD+、2mM CoASH、1μM RuHACLG390N、1μm LmACR和100mM FALD。为了测试甲酸和甲醛作为共底物的利用，反应包括50mM KPi pH 7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM琥珀酰基-CoA、1μM RuHACLG390N、2μM OfFrc、100mM甲酸钠和100mM甲醛。为了测试甲酸作为唯一C1底物的利用，反应包括50mM KPi pH 7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NADH、2mM琥珀酰基-CoA、1μM RuHACLG390N、2μM OfFrc、1μM LmACR和100mM甲酸钠。作为对照，反应包含50mM KPipH 7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NADH、1mM NAD+、2mM琥珀酰基-CoA、2mM CoASH、2μMBSA、100mM甲酸钠和100mM甲醛。反应体积为200μL，并且反应在室温在rotisserie振荡器上进行30分钟。
首先用5μL 10M NaOH处理包含酰基-CoA的样品(200μL)以水解硫酯并产生羧酸。然后添加用1％硫酸酸化的硫酸铵溶液以提高酸萃取效率。通过剧烈涡旋90s将所得样品萃取到4ml乙酸乙酯中。分离有机相并在氮气流下蒸发至干燥。将残留物溶于50μL吡啶和50μLN,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺中，并在60℃孵育15min。使用Agilent 5977B GC/MSD单四极柱、Intuvo 9000GC系统，集成的GERSTEL多功能自动进样器样品制备机器人和Agilent HP-5ms毛细管柱(内径0.25mm，膜厚度0.25μm，长度30m)通过GC-MS对衍生化样品进行分析。对于气相色谱，以1:1的分离比注入1μl样品，使用氦气作为载气，流量为1.5ml/min，并且温度谱如下：初始90℃，持续3分钟；以每分钟15℃上升至170℃；以每分钟20℃上升至300℃，并保持8分钟。注射器和检测器的温度分别为250℃和350℃。使用AgilentMassHunter GC/MS Acquisition B.07.06.2704采集数据，并使用Agilent MassHunterWorkstation Software B.08.00进行分析。
为了用LC-MS分析酰基-CoA，通过向200μL反应样品中添加8μL甲酸停止反应，并用1mL HyperSep C18柱(Thermo Scientific)脱盐，该柱用200μL甲醇预处理(prime)两次，并用100μL 1mM乙酸铵pH 3.0平衡。用200μL 1mM乙酸铵pH 3.0洗涤柱一次，并以200μL甲醇洗脱酰基-CoA。基于先前描述的内容7进行LC-MS分析。Agilent 6540Q-TOF LC-MS系统配备了设置为正电离模式的喷射流电喷雾电离源和100mm x 4.6mm Kinetex 2.6μm Polar C18
Figure BDA0004198074150000351
柱(Phenomenex)。LC条件为：柱烘箱设定为40℃，注入体积为5μL，并且流动相为50mM甲酸铵和甲醇。以400μL/min的流量，使用以下梯度法实现化合物分离：0min 0％甲醇；1min0％甲醇；3min 2.5％甲醇；9min 23％甲醇；14min 80％甲醇；16min 80％甲醇；17min 0％甲醇。MS条件为：毛细管电压3.5kV，喷嘴电压500V，碎裂电压(fragmentor voltage)150V，并且氮气用于雾化(25psig)、干燥(5L/min，225℃)以及用作鞘气(10L/min，400℃)。使用100-1000m/z的扫描范围。使用Agilent MassHunter LC/MS data Acquisition B.05.01采集数据，并使用MassHunter Qualitative Analysis B.05.00(Agilent)进行分析。
用于途径验证的无细胞代谢工程化
如先前描述的16进行酶表达和细胞提取物制备。无细胞反应包含50mM KPi pH7.4、4mM MgCl2、0.1mM TPP、2.5mM CoASH、5mM NAD+、50mM甲醛和0.1mM辅酶B12。个体细胞提取物载量为约4.4g/L蛋白(反应体积的1/8)，并且添加到每个反应中的蛋白的量用BL21(DE3)提取物归一化为～26g/L蛋白(反应体积的3/4)。将反应物在室温孵育指定时间，此时添加反应体积的1/4的用1％硫酸酸化的饱和硫酸铵溶液以停止反应。将样品以20817×g离心15分钟，并使用配备有折射率检测器和HPX-87H有机酸柱(Bio-Rad)的ShimadzuProminence SIL 20系统(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.)通过HPLC分析上清液，操作条件为优化峰分离(0.3ml/min流量、30mM H2SO4流动相、柱温42℃)。使用ShimadzuLabSolutions v5.96采集和分析数据。
静息细胞生物转化
使用静息细胞的生物转化如先前描述的16稍加修改来进行。使用的基础盐培养基为另外补充有Neidhardt微量营养素溶液68的M9(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/LNH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2和15μM硫胺素-HCl)。使用每个菌株的过夜LB培养物接种(1％)250mL烧瓶，烧瓶中包含50mL进一步补充有20g/L甘油、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和适当的抗生素(50μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL壮观霉素)的上述培养基。将烧瓶培养物在NBS I24台式培养箱振荡器(New Brunswick Scientific Co.)中在30℃和250rpm孵育。2.5小时后，通过添加0.1mM异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和0.04mMcumate(0.2mM IPTG和0.1mM cumate用于甲醛和甲酸的实验)诱导基因表达。
通过离心(5000×g、22℃、5min)收获来自上述培养物的细胞，并用不含任何碳源的上述M9培养基洗涤两次。将最终的细胞沉淀物重悬于含有适当碳源的M9中(～10OD600，含有10mM甲醛；或～5OD600，含有1mM甲醛和10mM甲酸)。将5mL细胞悬浮液添加到25mLErlenmeyer烧瓶(Corning Inc.)中，并用泡沫塞塞住。将烧瓶在NBS I24台式培养箱振荡器(New Brunswick Scientific Co.)中在30℃和200rpm孵育。当甲醛是唯一碳源时，在1.5小时后添加另外10mM甲醛。24小时后采集样品用于如上描述的HPLC分析。当使用13C标记的甲醛作为底物时，在如上描述的提取和衍生化之后，通过GC-MS分析样品。
发酵试验
所使用的生长培养基为另外补充有500mM甲醇、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和Neidhardt微量营养素溶液68的M9(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/LNaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2和15μM硫胺素-HCl)。使用每个菌株的过夜LB培养物接种(1％)50mL闭盖锥形管(Genesee Scientific Co.)，该管包含5mL进一步补充有适当的抗生素(50μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL壮观霉素)的上述培养基。约3小时后，通过添加0.04mM异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和0.04mM cumate诱导基因表达。将管在NBS I24台式培养箱振荡器(New Brunswick Scientific Co.)中在30℃和200rpm孵育。接种后每24、48、72和96小时采集样品(100μL)，用于OD600测量和如上描述的HPLC分析。当使用13C-甲醇作为底物时，在如上描述的提取和衍生化之后，通过GC-MS分析样品。
用于基于C1底物生长的双菌株大肠杆菌系统
使用如先前描述使用M9培养基培养和诱导的菌株进行双菌株实验16。将诱导的细胞重悬于M9培养基中，达到3*109CFU(菌落形成单位)/mL(相当于～5的OD600)的初始浓度。将20mL悬浮液添加到包含3mg多聚甲醛(相当于5mM)的25mL烧瓶中，或将10mL悬浮液添加到含有添加的500mM甲醇、或1mM甲醛和10mM甲酸钠的25mL烧瓶中。将能够消耗乙醇酸的第二大肠杆菌菌株AC763添加到5*106CFU/mL(相当于～0.005的OD600)的初始浓度。AC763另外携带组成型表达的eGFP的染色体拷贝，以帮助区分这两种菌株。在将AC763添加到培养物之前，使AC763在25mL Erlenmeyer烧瓶中(来自单菌落接种)以200rpm和30℃在5mL补充有5g/L乙醇酸和2g/L胰蛋白胨的上述M9最小培养基中预生长24小时。然后离心细胞(5000×g、22℃、5min)，用补充有5g/L乙醇酸的培养基洗涤两次，并将其重悬至～0.05的光密度。在200rpm和30℃(5mL，在25mL Erlenmeyer烧瓶中)孵育24小时后，离心细胞(5000×g、22℃)，用不含任何碳源的培养基洗涤两次，并将适当体积添加到双菌株系统中。包含这两种菌株的烧瓶在200rpm和30℃进一步孵育。在不同时间采集样品用于HPLC和细胞生长分析。
每mL培养物的菌落形成单位被用作细胞生长的量度。在不含任何碳源的上述最小培养基中稀释适当体积的培养物，并将50μL各种稀释液在包含2.5g/L乙醇酸的最小培养基平板上铺板。在37℃平板孵育后，在使用蓝光透照仪(Vernier,Beaverton,OR)照亮表达eGFP的菌株AC763的可视化辅助下，对菌落手动计数。
数据可用性声明支持本研究结果的所有数据都包括在本文以及以下公共数据库中：MetaCyc(metacyc.org/)；eQuilibrator(equilibrator.weizmann.ac.il/)；Uniprot(www.uniprot.org/)。研究中涉及的酶的Uniprot登录号在表2中给出。如表2中列出的所有Uniprot序列通过引用以其整体并入。
代码可用性声明本研究中用于执行分析的脚本可见于github.com/ahc7/FORCE_manuscript。
Figure BDA0004198074150000381
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Figure BDA0004198074150000391
表2：本研究中使用的宿主菌株和质粒。本研究中使用的异源酶的Uniprot登录号在括号中给出。
Figure BDA0004198074150000392
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Figure BDA0004198074150000401
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Figure BDA0004198074150000411
表3：对iML1515进行修饰以实现甲基营养途径。“L”指反应通量的下限，“U”指反应通量的上限，“B”指反应通量的上限和下限两者。
Figure BDA0004198074150000412
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Figure BDA0004198074150000421
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Figure BDA0004198074150000431
表4.比较选定的C1利用途径的特性，这些途径具有实现甲基营养(从甲醇)转化为代表性的C2(乙酰基-CoA)和C3(丙酮酸)代谢物的潜力。本研究中用于计算的途径是：经由二醇脱水酶产生的乙醛转化为乙酰基-CoA，和经由甘油酸转化为丙酮酸。正值指示净产生，而负值指示净消耗。计算假设ATP向AMP的水解相当于两个当量的ATP向ADP水解。甲基营养途径的碳产率基于C2或C3代谢物中甲醇的摩尔数，并因此在CO2也被同化(即丝氨酸途径)的情况中大于100％。
Figure BDA0004198074150000432
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与所公开的本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和它们所引用材料特别地通过引用并入。
本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规的实验确定，本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意图被所附权利要求涵盖。

Claims (73)

1.一种非天然微生物系统，其能够利用一碳(C1)底物用于生长和产物合成，所述非天然微生物系统包括：
编码将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA和甲醛的酶的第一组核酸；以及
编码将甲酰基-CoA和甲醛转化为能够实现生长的天然多碳底物或代谢物的酶的第二组核酸。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统包括一碳底物，任选地，其中所述C1底物包括甲烷。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将甲烷转化为甲醇的甲烷单加氧酶，能够将甲醇转化为甲醛的甲醇脱氢酶，以及能够将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述C1底物包括二氧化碳。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将二氧化碳转化为甲酸的甲酸脱氢酶。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述第一组代谢酶还包括能够将甲酸转化为甲酰基-CoA的酶。
7.根据权利要求5所述的系统，其中所述第一组代谢酶还包括能够将甲酸转化为甲醛的甲醛脱氢酶，以及能够将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
8.根据权利要求5所述的系统，其中所述第一组代谢酶还包括能够将甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶，以及能够将甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸转酰基酶。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述C1底物包括甲酸。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将甲酸转化为甲酰基-CoA的酶。
11.根据权利要求9所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将甲酸转化为甲醛的甲醛脱氢酶，以及能够将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
12.根据权利要求9所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶，以及能够将甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸转酰基酶。
13.根据权利要求1所述的系统，其中所述C1底物包括一氧化碳。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将一氧化碳转化为二氧化碳的一氧化碳脱氢酶，以及能够将二氧化碳转化为甲酸的甲酸脱氢酶。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述第一组代谢酶还包括能够将甲酸转化为甲酰基-CoA的酶。
16.根据权利要求14所述的系统，其中所述第一组代谢酶还包括能够将甲酸转化为甲醛的甲醛脱氢酶，以及能够将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
17.根据权利要求14所述的系统，其中所述第一组代谢酶还包括能够将甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶，以及能够将甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸转酰基酶。
18.根据权利要求1所述的系统，其中所述C1底物包括甲醇。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将甲醇转化为甲醛的甲醇脱氢酶，以及能够将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述C1底物包括甲醛。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述第一组代谢酶包括能够将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的系统，其中所述第二组代谢酶包括2-羟基酰基-CoA裂合酶(HACL)。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述第二组代谢酶还包括酰基-CoA还原酶。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述第二组代谢酶还包括1,2-二醇氧化还原酶。
25.根据权利要求24所述的系统，其中所述第二组代谢酶还包括二醇脱水酶。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的系统，还包括编码产生感兴趣的分子的酶的第三组核酸。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的系统，包括一种含有所有核酸的微生物宿主。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的系统，包括多于一种具有不同组核酸的微生物宿主菌株。
29.一种培养根据权利要求1至28中任一项所述的微生物系统的方法，包括在合适的条件下用C1原料孵育所述微生物系统，其中所述C1原料被用于生长。
30.根据权利要求29所述的方法，还包括从所述微生物培养系统中分离感兴趣的产物。
31.一种代谢工程化微生物，包含：
编码将单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶的第一组核酸；以及
编码经由甲酰基-CoA延伸途径延长碳主链的代谢酶的第二组核酸，所述甲酰基-CoA延伸途径使用所述甲酰基-CoA作为延伸单元。
32.根据权利要求31所述的代谢工程化微生物，其中所述甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体用作用于所述微生物的生长的代谢物。
33.根据权利要求31或32所述的代谢工程化微生物，其中所述甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体用作一种或更多种化学产物的前体。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的代谢工程化微生物，其中由所述第一组核酸和所述第二组核酸编码的所述代谢酶在所述微生物中被重组表达或被过表达。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的代谢工程化微生物，其中一个或更多个编码参与与所述甲酰基-CoA延伸途径竞争的代谢途径的代谢酶的基因在所述微生物中被敲除。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的代谢工程化微生物，还包含编码将所述甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体转化为化学产物的代谢酶的第三组核酸。
37.一种基于单碳底物培养微生物的方法，包括：
为所述微生物提供编码用于将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶的第一组核酸，和编码用于经由使用甲酰基-CoA作为延伸单元的甲酰基-CoA延伸途径来延长碳主链的代谢酶的第二组核酸；以及
在包含所述单碳底物的生长培养基中培养所述微生物，其中所述甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体用作所述微生物的生长底物或生长底物的前体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述生长底物包括醛糖、二醇、2-羟基酸、乙醇酸、甘油醛、乳酸和乙酰基-CoA中的一种或更多种。
39.一种从单碳底物进行化学产物合成的方法，包括：
为微生物提供编码将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶的第一组核酸，和编码经由使用甲酰基-CoA作为延伸单元的甲酰基-CoA延伸途径来延长碳主链的代谢酶的第二组核酸；以及
为所述微生物供给所述单碳底物，其中所述甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体用作化学产物的前体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述化学产物选自2-羟基酸、醛糖、二醇、多元醇、羧酸化合物、乳酸和醇。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述化学产物是多碳化学品。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，还包括从所述微生物的发酵液中纯化化学产物。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，还包括为所述微生物提供编用于将所述甲酰基-CoA延伸途径中的中间体转化为所述化学产物的代谢酶的第三组核酸。
44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其中为所述微生物提供所述第一组核酸和所述第二组核酸包括用一种或更多种表达载体转化所述微生物，所述表达载体包含编码所述代谢酶中的一种或更多种的一个或更多个基因。
45.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其中为所述微生物提供所述第一组核酸和所述第二组核酸包括通过重组体工程化、同源重组和基因编辑中的一种来添加编码所述代谢酶中的一种或更多种的基因。
46.根据权利要求37至45中任一项所述的方法，还包括过表达用于将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的所述代谢酶中的一种或更多种、和/或用于经由所述甲酰基-CoA延伸途径来延长所述单碳底物的所述代谢酶中的一种或更多种。
47.根据权利要求37至46中任一项所述的方法，还包括通过敲除所述微生物中一个或更多个编码参与与所述甲酰基-CoA延伸途径竞争的代谢途径的代谢酶的基因来抑制所述微生物中所述竞争的代谢途径。
48.一种无细胞系统，包括：
将单碳底物转化为甲酰基-CoA的第一组代谢酶；以及
经由甲酰基-CoA延伸途径延长碳主链的第二组代谢酶，所述甲酰基-CoA延伸途径使用所述甲酰基-CoA作为延伸单元。
49.根据权利要求48所述的无细胞系统，其中所述第一组代谢酶和所述第二组代谢酶源自表达所述第一组代谢酶和所述第二组代谢酶的一种或更多种微生物的提取物。
50.根据权利要求48或49所述的无细胞系统，其中所述无细胞系统还包括将所述甲酰基-CoA延伸途径中的一种或更多种中间体转化为化学产物的第三组代谢酶。
51.根据权利要求31至50中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述甲酰基-CoA延伸途径包括醛糖延伸途径和醛延伸途径中的至少一种。
52.根据权利要求31至51中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述单碳底物选自甲烷、甲醇、二氧化碳、甲酸、一氧化碳及其组合。
53.根据权利要求31至52中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将所述单碳底物转化为甲醛的一种或更多种酶，和将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
54.根据权利要求31至53中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述单碳底物是甲烷。
55.根据权利要求54所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将甲烷氧化为甲醇的甲烷单加氧酶。
56.根据权利要求31至53中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述单碳底物是甲醇。
57.根据权利要求55或56中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将甲醇氧化为甲醛的甲醇脱氢酶，和将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
58.根据权利要求31至53中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述单碳底物是二氧化碳。
59.根据权利要求58所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将二氧化碳转化为甲酸的甲酸脱氢酶。
60.根据权利要求31至53中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述单碳底物是一氧化碳。
61.根据权利要求60所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将一氧化碳转化为二氧化碳的一氧化碳脱氢酶，和将二氧化碳转化为甲酸的甲酸脱氢酶。
62.根据权利要求31至52中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述单碳底物是甲酸。
63.根据权利要求59、61或62中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将甲酸转化为甲酰基-CoA的一种或更多种酶。
64.根据权利要求59、61或62中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将甲酸转化为甲醛的甲醛脱氢酶，和将甲醛转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA还原酶。
65.根据权利要求59、61或62中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将甲酸转化为甲酰基-磷酸的甲酸激酶，和将甲酰基-磷酸转化为甲酰基-CoA的磷酸转酰基酶。
66.根据权利要求59、61或62中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中将所述单碳底物转化为甲酰基-CoA的代谢酶包括将甲酸转化为甲酰基-CoA的酰基-CoA合成酶。
67.根据权利要求31至66中任一项所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中经由所述甲酰基-CoA延伸途径延长所述碳主链的代谢酶包括2-羟基酰基-CoA裂合酶(HACL)或草酰基-CoA脱羧酶(OXC)，并且其中所述HACL或所述OXC从甲酰基-CoA和醛产生2-羟基酰基-CoA。
68.根据权利要求67所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中经由所述甲酰基-CoA延伸途径延长所述碳主链的代谢酶还包括将2-羟基酰基-CoA还原为2-羟基醛的酰基-CoA还原酶。
69.根据权利要求68所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述HACL或所述OXC催化甲酰基-CoA对2-羟基醛的一碳延伸。
70.根据权利要求68所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中经由所述甲酰基-CoA延伸途径延长所述碳主链的代谢酶还包括将2-羟基醛还原为1,2-二醇的1,2-二醇氧化还原酶或醇脱氢酶。
71.根据权利要求70所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中经由所述甲酰基-CoA延伸途径延长所述碳主链的代谢酶还包括将1,2-二醇脱水为醛的二醇脱水酶。
72.根据权利要求71所述的代谢工程化微生物、方法或无细胞系统，其中所述HACL或OXC催化甲酰基-CoA对所述醛的一碳延伸。
73.一种双菌株微生物系统，包括：
第一微生物，所述第一微生物包含编码一种或更多种将单碳底物转化为甲酰基-CoA的第一代谢酶的核酸，和编码一种或更多种从甲酰基-CoA产生乙醇酸的第二代谢酶的核酸，其中所述第一微生物不能够消耗乙醇酸和基于乙醇酸生长；以及
第二微生物，所述第二微生物缺乏编码所述第一代谢酶和所述第二代谢酶的核酸，其中所述第二微生物能够消耗乙醇酸和基于乙醇酸生长，并且其中在包含所述单碳底物的培养基中共培养所述第一微生物和所述第二微生物导致所述第二微生物的生长。
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