CN107429271B - 从一碳化合物生物合成产物 - Google Patents

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Abstract

描述了一种包含用于将一碳底物转化至化学产物的设计的平台的工程化微生物。所述设计的平台体现了一种新的代谢结构，所述代谢结构将碳固定、中心代谢和产物合成整合到一个单一的途径中。2‑羟酰‑CoA裂解酶(α‑氧化途径中的酶)能够催化甲酰‑CoA和具有不同链长的醛之间的C‑C键形成，允许将所述醛的碳骨架伸长一碳单元的关键发现使其成为可能。这些新型微生物提供了从单碳原料，如二氧化碳、一氧化碳、甲酸盐、甲醛、甲醇或甲烷生产化学品的机会。

Description

从一碳化合物生物合成产物
在先相关申请
本申请要求2014年10月29日提交的题目为“用于从1-碳化合物生物合成的合成途径”，美国序列号62/069,850的优先权，其为了所有目的通过引用整体并入本文。
联邦资助研究声明
不适用。
发明领域
本发明涉及可以制备各种化学品用于工业用途的工程化微生物。特别地，直接从单碳化合物生物生产多碳化合物无需中心代谢。
发明背景
过去，许多我们的能源和化学品来源于化石碳资源，如石油和煤炭。然而，对气候变化、政治不稳定以及石油资源消耗和成本的担忧最近引发了对建立基于生物的工业的兴趣，并且正在采取一些战略以实现燃料和化学品的可持续生产。最有希望的方法之一是使用微生物将生物质转化成所需的产物。然而，这些原料的使用受到获取资源的困难、其高昂的价格和有限的可用性的阻碍。包含CO2、CO、甲酸盐、甲醇和甲烷的一碳化合物最近已经成为替代可再生原料。将这些底物转化至燃料和化学品不仅在工艺经济学方面提供了有吸引力的替代方案，而且也将进一步有助于降低温室气体(如CO2和甲烷)的水平。
微生物催化剂已经被设计和工程化，以使用不同的原料，如糖、甘油、二氧化碳、一氧化碳、甲酸盐、甲醇和甲烷合成感兴趣的产物。对于一碳原料的情况，通过如图1所示组织的并且包含用于碳固定、中心代谢和产物合成的专门途径的代谢途径的一般网络使得这样的转化成为可能。这种类型的代谢结构已经被用于迄今为止所进行的所有代谢工程研究中，以开发用于工业应用的微生物。
本公开描述了用于一碳底物的生物转化的替代平台，所述替代平台由单一工程化代谢途径组成，所述代谢途径允许使用“自下而上”集成设计从一碳化合物直接合成化学产物。所述工程化途径定义了一种将碳固定、中心代谢和产物合成整合到单个途径中(图2)的新的代谢结构。所述途径使用单碳延伸单元，绕过生产常见代谢中间体的需要，并且允许以单碳增量迭代地伸长碳骨架。
这与首先需要在伸长之前将单碳化合物固定至代谢中间体(图1)，并且通常一次将碳骨架伸长两个或更多个碳的现有的方法形成对比。这个合成平台被“自下而上”工程化，并且提供了优于现有的“自上而下”方法的潜在优势，所述现有的方法遭受到工程化的困难以及由于在碳链伸长和产物形成之前，使用同化途径以首先产生代谢中间体而产生的低效率。
发明概述
来自“自下而上”的工程生物学最近已经获得了发展。特别地，合成生物学领域已经特别关注使用这种“自下而上”的方法，最终目标是设计具有可调控制和明确响应的系统。合成开发的途径可以具有优于天然途径的优势，例如通过允许对途径酶表达的外源性控制。这有可能使途径性能与生物体的复杂的且知之甚少的调节机制相分离。当被设计以避免使用中心代谢途径(如产生乙酰-CoA的那些途径)时，可以通过合成途径实现进一步分离，从而允许途径性能独立于生物体的中心代谢，所述生物体的中心代谢也受到调节以及和其他途径的相互作用的影响。因此，自下而上的设计方法可以允许创建独立于宿主系统的途径。在这里描述了能够将C1分子转化至更长链产物的途径的自下而上的设计。
描述了将单碳化合物的固定固定在产物的合成中的合成途径的开发。所述途径允许从单碳化合物直接合成产物，避免了产生细胞典型的中间体和使用中心代谢途径的需要(如现有方法所要求的)。这个合成途径受到分解代谢的α-氧化途径(脂肪酸的一个碳缩短)的启发，并且基于我们实验室中近期关键的发现，即酶羟基-酰基-CoA裂解酶(HACL，α-氧化途径的一部分)是可逆的并且能够催化甲酰-CoA和醛之间的C-C键形成。C-C键形成机理以前没有在文献中报道，并且允许通过一碳单元进行碳链伸长。
所述途径实现了四个主要的功能:
第一：单碳化合物被转化至可以并入碳骨架的活性“延伸子”形式。这通过将一碳单元酶促转化成活化的CoA衍生物来完成，并且存在可用于这个的各种酶。
第二：所述途径允许这些单碳延伸子迭代地伸长碳骨架至所需长度。来自α氧化途径的酶(羟基-酰基-CoA裂解酶或HACLs)被用于催化关键缩合/C-C键形成反应，其在本文中被驱动以沿相反的方向运行。然后一系列脱水和还原反应将分子转化至适合于伸长的连续循环的形式。
第三：此外，如果最初的引发醛具有多于一个碳，则需要再生途经以再生起始醛分子。然而，如果起始醛是甲醛，或者单轮循环是足够的，那么可以省略这个功能。
第四：存在从伸长的碳骨架合成所需产物的方法。各种终止酶可以将中间体从循环中抽出，并且如果需要，中间体可以被进一步酶促修饰。
本文中描述的途径从分解代谢的α-氧化途径(脂肪酸的一个碳缩短)中吸取灵感，并且基于我们实验室中最近的关键的发现，即酶2-羟基-酰基-CoA裂解酶(HACL，氧化途径的一部分)是可逆的并且能够催化甲酰-CoA和醛之间的C-C键形成。
本发明中公开的合成途径用作从价值较低且更丰富的单碳化合物，而不是易于耗尽的化石源(如石油)产生有价值的化学产物的平台。例如，甲烷可以转化成液体替代燃料用于目前的运输基础设施。二氧化碳可以被隔离并且被转化成有用的产物。因此，本文中的方法、材料和系统允许从甲烷至二氧化碳的不同还原水平的单碳分子被直接同化到伸长碳骨架中。
在本文中公开的合成途径中，单碳分子首先被活化成甲酰-CoA，所述甲酰-CoA可以通过酶2-羟酰-CoA裂解酶直接与醛连接。所得的2-羟酰CoA比起始醛长一个碳，并且经历一系列反应以将其还原成醛，从而允许碳骨架的进一步伸长。上述反应的中间体可以用终止酶从循环中被转移，以产生有价值的化学产物，如(但不限于)不同链长和官能度的羧酸、醇或烷。
方法涉及使用将单碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛、甲酸盐、一氧化碳或二氧化碳)转化成化学产物的工业生物体(如大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母(S.cerevisiae)或荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)或毕赤酵母(Pichia pastoris))进行传统的培养。这些生物体被认为是现代生物技术的主力，并且易于基因工程化以及扩大以用于工业生产水平。
然而，在另一个实施方案中，可以提供设计的合成途径中的任何中间体作为起始化合物，并且不需要从头制备整个分子，从而将一经转化为醛的起始分子延伸一个碳，并且使用终止组件抽出循环中的任何中间体。在中间体是丰富的或者是来自另一方法的废产物，并且因此非常便宜时，这样的实施方案可能是有用的。与此组合，再生组件可以被省略，如果起始醛是甲醛，则单轮循环是足够的。
考虑到起始分子和最终所需产物，如果合适，仅使用一部分设计的合成途径也是可能的。因此，如本文中描述的，如果仅加入单碳将足够，可以仅使用HACL蛋白。作为另一个替代方案，设计的合成途径中的一种或更多种下游酶与HACL组合使用。然而，在大多数情况下，大多数多功能性来自包含所有4个组件。
生物系统中的组件通常通过用编码一种或更多种蛋白质的表达载体转化微生物来制备，但是也可以通过重组、同源重组和类似技术将基因加入到染色体中。如果需要的蛋白质是内源性的，比如在某些情况下，其原本可能足够，但是为了更好的功能以及活性酶水平的控制，蛋白质经常被过度表达。
当与权利要求或说明书中的术语“包括”一起使用时，单词“一个”的使用表示一个或多于一个，除非上下文另有规定。
如果没有指出测量方法，术语“约”表示规定的值加上或减去测量的误差幅度或加上或减去10％。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确地指出仅仅是指替代方案，或者如果替代方案是相互排斥的。
术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”(及其变体)是开放式连系动词，并且在权利要求中使用时允许加入其他元素。
如本文中使用的，“微生物(microorganism)”、“微生物(microbe)”、“菌株”等表达方式可以互换使用，并且所有这样的名称包括其后代。还应当理解，由于有意的或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不是精确地相同。具有与在原始被转化的细胞中筛选的相同功能或生物活性的突变后代被包含。在明确名称的情况下，从上下文中是清楚的。
本文中提及的蛋白质可以被理解为包含关于编码这样的蛋白质的基因。因此，所要求的“通透酶”蛋白可以包含编码该通透酶的相关基因。然而，本文中优选的是通过按照ecoliwiki或HUGO的标准名称来指定蛋白质，因为酶和基因名称差别很大，尤其在原核领域。
一旦获得示例性蛋白质，可以通过BLAST搜索来鉴定许多附加的类似活性的实施例蛋白质。进一步地，每个蛋白质记录与一个基因记录相关联，使得易于设计过度表达载体。许多所需的酶已经存在于载体中，并且通常可以从细胞储存器或者从克隆它们的研究人员处获得。但是，如果需要，可以使用RT-PCR技术基于可用的序列信息来制备新的克隆。因此，获得所有所需的过量表达的酶应当是很容易的。
找到用于本发明的合适的酶/蛋白质的另一种方法是考虑具有相同EC编号的其它酶，因为这些编号是基于特定的酶进行的反应来分配的。因此，例如从AddGene或从描述该酶的工作的作者获得酶，并测试如本文中描述的功能。
理解遗传密码的固有简并性允许本领域普通技术人员设计编码相同氨基酸序列的多个核苷酸。NCBITM提供密码子使用数据库用于优化各种物种中用于蛋白质表达的DNA序列。利用这样的数据库，使用将表达所述基因的物种的密码子偏好，基因或cDNA可以被“优化”用于在大肠杆菌(E.coli)、酵母(yeast)、藻类或其他物种中表达。
为了方便起见，在大肠杆菌(E.coli)中进行了最初的克隆实验，因为大多数所需的基因已经存在于适合细菌表达的质粒上，但是将基因加入细菌中几乎是普遍适用的。重组方法是在20世纪70年代发明的，并且现在是如此常见，甚至学龄儿童使用细菌进行基因工程实验。这样的物种包含例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、固氮菌属(Azotobacter)、木霉属(Trichoderma)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微球菌属(Micrococcus)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、变形杆菌属(Proteus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcus)、副球菌属(Paracoccus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)和甲基球菌属(Methylococcus)，或任何完全测序的细菌物种。事实上，数百种细菌基因组已经被完全测序，并且这种信息大大简化了编码所需的基因的载体的产生，以及重组工程协议的设计。这样的物种列表参见http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_bacterial_genomes。
此外，酵母是用于微生物制造的常见物种，并且许多物种可以被成功转化。事实上，α氧化途径存在于酵母和α-氧化酶羟基-酰基-CoA裂解酶(HACL)中，所述HACL是本发明关键部分并且在酵母酵母菌属(Saccharomyces)中成功表达。其他物种包含但不限于，仅举几个例子，念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、Arxula adeninivorans、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)(安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、毕赤酵母(Pichiapastoris)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
基因修饰许多种类的藻类也是可能的，包含例如螺旋藻属(Spirulina)、曲霉属(Apergillus)、衣藻属(Chlamydomonas)、海带(Laminaria japonica)、裙带菜(Undariapinnatifida)、紫菜属(Porphyra)、麒麟菜属(Eucheuma)、卡帕藻属(Kappaphycus)、江蓠属(Gracilaria)、礁膜属(Monostroma)、浒苔属(Enteromorpha)、节旋藻属(Arthrospira)、小球藻属(Chlorella)、杜氏藻属(Dunaliella)、束丝藻属(Aphanizomenon)、等鞭金藻属(Isochrysis)、巴夫藻属(Pavlova)、褐指藻属(Phaeodactylum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、红球藻属(Haematococcus)、角毛藻属(Chaetoceros)、微拟球藻属(Nannochloropsis)、骨条藻属(Skeletonema)、海链藻属(Thalassiosira)、和海带(Laminaria japonica)等。事实上，微藻类巴夫金藻(Pavlova lutheri)已经被用作有经济价值的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的来源，并且隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)是目前用于生产许多婴儿配方食品中使用的DHA的异养藻种类。
此外，许多数据库包含载体信息和/或载体储存库，并且可以被用于选择适合于所选宿主物种的载体。参见例如，AddGene.org，其提供储存库和可搜索的数据库，让载体容易地被发现并且从同行处获得。也可参见质粒信息数据库(PlasmID)和具有超过191,000种质粒的DNASU。一批大肠杆菌(E.coli)的克隆载体也被保存在国家遗传研究所作为生物研究界的资源。此外，载体(包含其中特别的ORFS)通常可从同行获得。
可以根据需要将酶加入基因组或经由表达载体。优选地，多种酶在一个载体中表达，或者多种酶可以通过在编码区之间加入所需的信号被组合成一个操纵子。通过过度表达一种或更多种，或者甚至所有的酶，例如通过经由质粒或其它载体将额外的拷贝加入到细胞中，可以获得进一步改善。为了方便起见，初步实验可以采用承载3个或更多个ORFs的表达质粒，但由于稳定性原因，可能优选的是将操纵子或单个基因插入到基因组中。
通过减少竞争途径，如用于制备例如乙酸盐、甲酸盐、乙醇和乳酸盐的那些途径，可以获得产量的进一步提高，并且如何减少或敲除这些途径是本领域众所周知的。参见例如William Marsh Rice University的Ka-Yiu San和George Bennett的专利组合(US7569380、US7262046、US8962272、US8795991)以及这些发明人的专利(US8129157和US8691552)(其为了所有目的通过引用整体并入本文)。许多其他人也在这个领域工作。
在计算“％同一性”时，查询序列的未对齐的末端部分不包含在计算中。同一性是在参考序列的整个长度上计算，因此与查询序列的短的局部比对不相关(例如，％同一性＝查询序列中的对齐残基数/参考序列的长度)。如Tatusova TA&Madden TL(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-250中描述的，比对是使用BLAST同源性比对进行并且可通过NCBI网站获取。除过滤器被关闭外，使用默认参数。
如本文中使用的，“可操作地关联”或“可操作地连接”是指功能性偶联的核酸或氨基酸序列。
“重组”涉及、衍生自或含有基因工程化材料。换句话说，一种生物体的遗传学以某种方式被有意地操纵。
“降低的活性”或“灭活”或“低表达”在本文中被定义为，与适当的对照物种(例如，相同宿主物种中的野生型基因)相比，蛋白质活性降低至少75％。优选地，可以获得活性降低至少80、85、90、95％，并且在最优选的实施方案中，活性被消除(100％)。蛋白质可以用抑制剂，通过突变，或通过抑制表达或翻译，通过敲除，通过加入终止密码子，通过移码突变等被灭活。
“无效”或“敲除”的意思是突变产生不可检测的活性蛋白。通过敲除或去除全部基因序列的一部分，可以将基因完全(100％)削减。通过移码突变、早期终止密码子、关键残基的点突变、缺失或插入等完全阻止活性蛋白的转录和/或翻译，也可完全灭活(100％)基因产物。本文中所有无效突变体均由Δ表示。
“过度表达”或“过度表达的”在本文中被定义为，与适当的对照物种或者完全缺乏活性的物种中的任何表达相比，至少150％的蛋白质活性。优选地，活性增加100-500％。过度表达可以通过使蛋白质突变以产生更具活性的形式或抵抗抑制的形式，通过去除抑制剂或加入活化剂等来实现。过度表达也可以通过去除阻抑物、将多个基因拷贝加入细胞或者上调内源性基因等来实现。所有过度表达的基因或蛋白质均以“+”表示。
在某些物种中，通过改变调节序列或去除阻抑物，基因工程化内源性蛋白质以被过度表达是可能的。然而，由于它的简易并且易于施加外部控制，基因通过包含于在细胞中存在成百上千拷贝的可选质粒上而过度表达可能是优选的，尽管长期稳定性原因考虑，对基因组的永久性修饰可能是优选的。
附图说明
图1基于改变天然代谢的现存结构的现有的“自上而下”的代谢工程化方法。
图2设计的途径的总体结构。具有新的代谢结构的“自下而上”整合的设计。将C固定、中心代谢和产物合成(如图1所示)合并成能够直接使用单碳分子用于长链(≥C2)产物的合成的单一途径。也参见图10以获得更多细节。
图3用于将一碳化合物转化至可用于伸长的活化形式的延伸子产生组件。参考表1A以获得更多细节。
图4A-B用于将碳骨架一个碳迭代伸长的可能的伸长组件。参考表1B以获得更多细节。
图5一些实施包含再生组件用于允许醛的再生以引发进一步伸长，从而允许合成途径的多次循环以及多于一个碳被加入生长链。更多细节参考表1C。
图6终止组件：衍生自途径组件的酰基-CoA中间体的潜在产物。更多细节参考表1D。
图7直链脂肪酸的α氧化。
图8通过TPP依赖性酶的偶姻缩合反应的机理。为了比较，甲酰-CoA被包含作为供体分子，以使R1是S-CoA基团。受体分子是任何醛。通过这个机理连接这两种分子导致2-羟酰-CoA的形成。
图9人HACL1(SEQ ID NOs 1-4)的四种同种型。
图10A-B对于路径的一些已提出的实施的概述。数字对应于表2中列出的反应。
图11用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的含有编码来自单核细胞增生利斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)的N-末端HIS-标签酰化醛还原酶Lmo1179的基因的载体构建体。
图12显示来自大肠杆菌(E.coli)的单核细胞增生利斯特氏菌(Lysteriamonocytogenes)酰化醛还原酶Lmo1179的表达和纯化的SDS-PAGE。
图13单核细胞增生利斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)酰化醛还原酶Lmo1179在340nm处吸光度(对应于NADH的产生)的时程测定。
图14在固相萃取后，单核细胞增生利斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)酰化醛还原酶Lmo1179反应测定混合物的-CoA含量的ESI-TOF MS数据。
图15A-B用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)(15A)和大肠杆菌(E.coli)(15B)中的含有编码来自智人(Homo sapiens)的氨基-末端6X HIS-标签羟基-酰基-CoA裂解酶HACL1的基因的表达载体构建体。
图16显示来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的羟基-酰基-CoA裂解酶HACL1的纯化的SDS-PAGE。泳道1对应于蛋白标准品。泳道2是酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞提取物。泳道3对应于纯化的HACL1。
图17用己烷提取后，HACLl降解反应混合物中十五醛含量的GC-FID色谱图。顶部：十五醛标准物；中部：取样的HACLl测定；底部：无酶对照。在含有HACL1的样品中，观察到十五烷醛峰，而在其中省略酶的样品中没有峰。
图18在酰基-CoA的水解和衍生化后，HACL1合成反应混合物的GC-FID色谱图。从上到下：无酶对照；HACLl样品；2-羟基十六酰基-CoA标准物；2-羟基己酸标准物。将HACL1与十五醛和甲酰-CoA温育，并且能够将分子连接到2-羟基十六酰基-CoA上，如标准物对应的峰所表明的。图18和图19证明了酶可以按照合成代谢途径的要求反向运行。
图19与乙醛和甲酰-CoA温育的HACL1合成反应样品的HPLC色谱图。实线：HACL1样品；短划线：无酶对照。乙醛和甲酰-CoA的连接的预期产物是乳酰-CoA，所述乳酰-CoA预期将被水解成它的酸形式的乳酸。乳酸的峰(26min)在含有纯化的HACL1的样品中被观察到，并且在不含有酶的样品中未被观察到。
图20与甲醛和甲酰-CoA温育的HACL1合成反应样品的HPLC色谱图。实线：无酶对照；短划线：HACL1样品；点线：乙醇酸标准物。甲醛和甲酰-CoA的连接的预期产物是羟乙酰基-CoA，所述羟乙酰基-CoA预期将被水解成它的酸形式，即乙醇酸。在含有纯化的HACL1的样品中观察到与乙醇酸标准物匹配的峰(25.2min)，并且在不含有酶的样品中未观察到。
图21A-B与乙醛和甲酰-CoA温育的HACL1测定样品的NMR光谱。(21A)HACL1样品。(21B)无酶对照。与乳酸盐相应的峰在含有HACL1的样品中被鉴定。
图22编码来自(A)产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)和(B)大肠杆菌(E.coli)的草酰-CoA脱羧酶的载体构建体。
图23编码来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的苯甲醛裂解酶的载体构建体。
图24用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的含有编码来自丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的LcdABC的基因的载体构建体。LcdABC是2-羟酰-CoA脱水酶的实施例(图10和表2中的酶3)
图25用于确定egTER酶动力学的Eadie-Hofstee图。egTER是反式烯酰-CoA还原酶的实施例(图10和表2中的酶4)。
图26对应于MhpF测定中的NADH的消耗在340nm处的吸光度的时程。
图27对应于FucO测定中的NADH的消耗在340nm处的吸光度的时程。
图28伸长组件的反式-2-烯酰-CoA还原酶步骤和酰基-CoA还原酶步骤的体外组装的HPLC色谱图。对应于丁醛(丁醛标准物为粗体)的峰存在于含有齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)TER和大肠杆菌(E.coli)MhpF的样品中(实细线)，但不存在于仅含有齿垢密螺旋体(Treponema denticola)TER的对照中(短划线)。
图29用于确定FadB酶动力学的Eadie-Hofstee图。
图30用于确定AtoB酶动力学的Eadie-Hofstee图。
图31对应于硫酸酯酶：yciA、fadM、ydbB和paaI的测定中的TNB的产生在412nm处的吸光度的时程。
图32组合再生和终止组件的测定的HPLC色谱图。
图33由通过HACL1催化，然后通过终止至产物的一个单元伸长组成的途径的体外实施的HPLC色谱图。在这种情况下，HACL1催化甲醛和甲酰-CoA的连接以产生羟乙酰基-CoA。包含在反应混合物中的大肠杆菌(E.coli)YciA将羟乙酰基-CoA转化至乙醇酸。
图34通过基因组规模模型评估，比较支持大肠杆菌(E.coli)在不同单碳原料上生长的工程化途径的能力。
表1A-D四个组件中每一个的酶列表。这些只是可以使用的几种酶，但提供了一个代表性的列表。
具体实施方式
在本文中，我们的重点将是已知的在直链脂肪酸上起作用的α氧化途径的哺乳动物版本。参见图7。在这个途径中，脂肪酸首先在α位置羟基化，并且所得的2-羟基脂肪酸被活化至酰基-CoA衍生物。关键酶2-羟酰-CoA裂解酶(“HACL”)将2-羟酰-CoA切割成甲酰-CoA和比起始脂肪酸短一个碳的醛。这形成了第二部分假设的基础—HACL可以催化逆反应，使用甲酰-CoA作为延伸子将脂肪醛伸长一个碳。
正如β-氧化途径中的硫解酶反应显示是可逆的(参见例如US20130316413、US20140273110，其为了所有目的通过引用整体并入本文)，可以预料的是α-氧化的HACL反应可以被逆转。从热力学和机械学的角度来看，这个假设似乎是合理的。我们的初步实验被预期基于反应的吉布斯自由能来确认这个，并且我们的随后的结果表明我们是正确的。新的合成合成代谢途径的总体设计在图2中示出并且附加的细节在图10中。
编码来自智人(Homo sapiens)HACL1的2-羟酰-CoA裂解酶的基因(图9)被克隆到大肠杆菌(E.coli)中。智人(Homo sapiens)HACL1克隆到酵母表达载体pYES2中也已经被完成(参见图15A-B)，并且已经在酵母中进行了表达实验。使用过度表达的HACL酶，我们能够反向驱动反应(参见EQ 1)，从而提供可供使用伸长组件。参见图18/19。
Figure BDA0001335509420000101
尽管在本文中我们使用人HACL基因(参见UniProt Q9UJ83)，但这是为了方便起见，并且可以使用任何哺乳动物HACL基因，倘若其催化相同的反应。HACL基因是EC编号4.1(迄今未完全表征)，并且其他可能满足要求的蛋白质包含大猩猩(XP_004033733.1＝577/578(99％)同一性)；黑猩猩(NP_001267049.1＝574/578(99％))；牦牛(XP_005910609.1＝515/581(89％))；狗(XP_013961990.1＝514/581(88％))；猫(XP_003992184.1＝520/581(90％)，小鼠(NP_064359.2＝508/581(87％))等。此外，非哺乳动物物种也可以满足要求，因为同源物已知存在于青蛙(GenBank NP_001017332)和斑马鱼(GenBank NP_998250)中。源自拟南芥(Arabidopsis)的重组蛋白甚至可商购获得(MyBioSource)。
当然，在正常情况下，HACL反应将按生理学正向运行，使得2-羟酰-CoA分子缩短一个碳(分解代谢方向)。然而，通过足够的水平过度表达并且通过增加底物水平或通过去除产物，可以强制其按反向伸长方向(参见EQ 1)运行，从而以相反的方向推动反应。我们能够通过提供额外的底物使其按反向合成代谢或延伸方向运行。此外，将反应温度从37℃降低至室温，并且将反应的pH从7.4降低至5.4。
总的来说，四种组件包括提出的发明，并且这些大体上被依次描述。
延伸子产生组件：在图3中被阐明以及在表1A中被概述的延伸子产生组件旨在将单碳分子活化成其中可以被用于连接的形式。在已提出的使用2-羟酰-CoA裂解酶(“HACL”)作为延伸子酶的方案中，这个活化形式是分子甲酰-CoA。用于将甲酸盐转化至甲酰-CoA的方法将在这里被详细描述。
甲酸盐作为单碳利用的好的起始点，因为它可以由CO2酶促地或电催化地还原，并且由更多还原的分子(如甲烷、甲醇或甲醛)氧化。存在至少3种用于甲酸盐活化至甲酰-CoA的潜在的途径：
1)第一种途径使用一种酶、一种酰基-CoA合成酶(ACS)直接产生硫酯。在这个过程中，一个ATP水解成AMP，有效地消耗两个ATP当量。一种形成具有甲酸盐活性的酰基-CoA合成酶的这样的AMP已经在生物体嗜气热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)中被发现。由开放阅读框(ORF)PAE2867编码的ACS显示了从甲酸盐至丁酸盐的非常宽的范围的底物特异性。
2)可替代的途径使用两种酶，但是利用一个ATP当量生成ADP。能够催化这些反应的酶最先在柱孢梭菌(Clostridium cylindrosporum)中被鉴定。这个生物体含有两种甲酸激酶，所述甲酸激酶催化由甲酸盐和ATP形成甲酰-磷酸盐，以及能够由甲酰-磷酸盐合成甲酰-CoA的磷酸甲酰转移酶。从那时起，其他酶已经被发现具有甲酸盐活性，如来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的乙酸激酶。这些酶确保了甲酰-CoA的产生的研究。
3)附加的替代方案允许使用酰化醛脱氢酶将甲醛直接转化至甲酰-CoA。这种酶的变体已经在具有甲醛活性的实验证据的物种(如肠贾第虫(Giardia intestinalis)、假单胞菌株CF600(Pseudomonas sp.CF600)以及不动杆菌株HBS-2(Acinetobacter sp.HBS-2)中被发现。这些酶催化甲醛至甲酰-CoA的转化并产生一个分子的NADH。与单碳代谢的甲基营养型途径非常相似，这个酶允许在相同氧化态下单碳分子的更加有效的利用，或者相比甲醛(包含甲醇和甲烷)被更大程度地还原。
伸长组件：图4A-B中所示的以及表1B中概述的伸长组件允许碳骨架的迭代伸长。使用HACL(一种示例性一碳碳-碳键形成酶)将醛与甲酰-CoA连接以产生比起始的醛长一个碳的2-羟酰-CoA。
为了允许附加的伸长的循环，2-羟酰-CoA必须被转化回醛形式。在一个实施图4A中，从2-羟酰-CoA至反式-2-烯酰-CoA的下一个步骤是将分子脱水。具有这种活性的酶，即乳酰-CoA脱水酶，已经被发现由丙酸梭菌的基因lcdABC编码。这种酶被发现催化2-羟基底物(如2-羟基丙酰-CoA，也被称为乳酰-CoA)和2-羟基丁酰基-CoA分别至丙-2-烯酰-CoA(丙烯酰-CoA)和对丁-2-烯酰-CoA(巴豆酰基-CoA)的转化。
在下一个步骤中，所得的反式-烯酰-CoA被转化至饱和酰基-CoA。许多酶已经被鉴定具有这种所需的活性。按照前述实施例，丙烯酰-CoA已经显示通过由类红球细菌(Rhodobacter sphaeroides)acuI编码的丙烯酰-CoA还原酶被还原至丙酰-CoA。
具有宽的链特异性的其他反式-2-烯酰-CoA还原酶已经被用于工程化途径，如反向β-氧化途径，该途径类似于将3-羟酰-CoA还原至饱和酰基-CoA之前，将3-羟酰-CoA脱水至反式-2-烯酰-CoA的这个途径。在本申请中，来自小眼虫(Euglena gracilis)的反式-2-烯酰-CoA还原酶已经被成功地使用。越来越多的证据也表明，编码被用于脂肪酸生物合成途径中的烯酰-ACP还原酶的大肠杆菌(E.coli)内源基因fabI也在烯酰-CoA底物上具有活性(Vick et al.,2014)。
醛可以直接从酰基-CoA产生。肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)eutE编码能够催化丙酰-CoA至丙醛的转化的酰基-CoA还原酶。(Zhu et al.,2011)同样地，来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)基因ald的酰基-CoA还原酶已经示出在其转化至丁醛中在丁酰-CoA上具有活性。这个步骤完成循环，允许碳链进行伸长的另一轮循环。
在伸长组件的替代实施中，经由还原和脱水的替换布置至上述的那些，2-羟酰-CoA可以被转化至其相应的醛(图4B)。裂解酶首先通过酰基-CoA还原酶被还原至2-羟醛，其实施例在上文提供。然后，2-羟醛通过1,2-二醇氧化还原酶被进一步还原至1,2-二醇。大肠杆菌(E.coli)fucO已经被证实编码一种这样的1,2-二醇氧化还原酶。最后，1,2-二醇可以被二醇脱水酶转化至醛。克雷伯氏杆菌(Klebsiella ocytoca)pddABC已经被证实编码能够将C2-C4 1,2-二醇脱水至它们的相应的醛的酶。这种醛可以被用于碳骨架的进一步伸长。
再生组件：允许引发醛的再生的途径在本文中被描述并且在图5中被阐明。这将允许产物的再生，而不需要细胞资源的转移以产生起始醛。
烯酰-CoA水合酶(如大肠杆菌(E.coli)内源FadB)催化从反式-2-烯酰-CoA开始至3-羟酰-CoA的转化。FadB还被证实具有3-羟酰-CoA脱氢酶活性，所述FadB催化3-羟酰-CoA至3-酮酰基-CoA的转化。然后，硫解酶(如大肠杆菌(E.coli)酶FadA或AtoB)可以从3-酮酰基-CoA切割出乙酰-CoA，留下酰基-CoA。例如乙酰-CoA可以被上述的肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)EutE，还原为乙醛，并且被用于引发进一步伸长循环，而酰基-CoA可以被转化至产物。
终止组件：存在许多可能的方法从上述反应的中间体产生产物，，通过所述方法，可以通过用一种或更多种酶反应将中间体从途径中抽出而产生产物。终止途径受到我们在反向β氧化上的工作的高度启发，我们的在反向β氧化上的工作已经提供了大量可以用于本文中的终止酶和途径。因此，读者参考了US20130316413、US20140273110等，以及关于附加的终止酶的相关出版物，包含其选择以控制链长，以及在循环中的哪个点去除中间体。
从途径得到的酰基-CoAs可以被转化至产物，如通过表达硫酯酶转化的脂肪酸、通过表达酰基-CoA还原酶和醛还原酶转化的醇，或者通过表达酰基-CoA还原酶和醛脱羧酶转化的烷。参见图6。
表1A-D呈现了对应于提出的途径设计的酶的概述，并且图10A-B提供了上述提出的形式中的整体途径的代表。从书面文字看，途径从甲酸盐开始，使用一个ATP当量用于每一个一个碳伸长，或用于易于与替代方案比较，使用两个ATP的当量用于两个碳伸长。
然而，重要的是要注意，途径从甲醛开始，不需要用于伸长的ATP当量，所述甲醛可以从更多种被还原的化合物容易地被氧化。这种ATP效率甚至比得上更有效的替代方案，例如还原剂乙酰-CoA或核酮糖单磷酸途径(RuMP)途径与反向β-氧化途径的组合，其分别消耗来自CO2的约一个ATP当量或者不消耗来自甲醛的ATP，用于两个碳伸长。
在构建含有工程化途径的合适的菌株之后，可以进行开发菌株的培养以评估途径的预期目标的效率，以及从单碳化合物产生产物的效率。可以在从甲烷至CO2和H2的各种单碳底物上评估生物体在自养或兼养条件下，包含附加的碳来源的生长。由生物体产生的产物可以通过HPLC或GC被测量，并且性能指标，如生长速度、生产率、滴定度、产率、碳效率，可以被确定。
进一步地，异源表达的途径酶之间以及与宿主系统的相互作用的评估可以优化途径性能并且最小化有害作用。因为途径在合成控制下，而不是在生物体的天然进化调控机制下，途径的表达必须被手动调整以避免潜在的阻碍细胞生长或生产的问题，并且优化所需化合物的产生。
此外，相对酶活性的不平衡可能限制整个途径的总体碳通量，导致次优生产率以及途径中间体的积累，所述中间体可以抑制途径酶或者是细胞毒素的。通过HPLC或GC分析细胞培养物可以揭示由构建的菌株产生的代谢中间体。这个信息可以表明潜在的途径问题。
作为途径的体内表达的替代方案，可以构建无细胞的体外版本的途径。通过纯化用于每个反应步骤的相关酶，可以通过组合必需的酶来组装整体途径。通过加入相关的辅因子和单碳化合物，可以评估途径独立于宿主的性能。作为另一个替代方案，完整的湿的或干的细胞可以被用作生物反应器。然而，活的、生长的培养系统是优选的。
提出的工作的主要焦点是开发一种直接从单碳化合物合成产物的途径。然而，一个附加的感兴趣的领域涉及使用与α-氧化相关的酶用于产生α-功能化产物。特别地，脂肪酸2-羟化酶允许从脂肪酸产生α-羟基酸，所述α-羟基酸可以被进一步转化至α-羟基醛、醇、酮或酯，或进一步转化成α-酮化合物。这样的α-功能化产物已经被发现是特别有用的生物活性分子，并且已经发现在化妆品以及药物递送中的应用。如上所述，这些转化所需的酶可以在大肠杆菌(E.coli)、酵母或藻类中被表达，并且在体外被测试。当和产物合成平台(如β-氧化反向途径)一起使用时，可以实现α-功能化产物的微生物生产。
以下实验的描述提供了附加的细节，所述细节中的任何一个与任何其他的组合可以有取得专利权的倾向。说明书的整体将被视为提供可以与其他细节互换使用的各种细节，因为如果列出可以运行反向α氧化途径的基因/载体/酶/宿主的每个可能的组合，它将是非常长的长度。
材料&方法
感兴趣的酶可以从载体被表达，如使用DE3表达系统的pCDFDuet-1(MERCK,Germany)。基因可以根据宿主生物体的密码子使用频率进行密码子优化，并且通过商业供应商或自行合成。然而，成千上万的表达载体和宿主是可用的，这是一种方便。
使用被设计用于适当的载体切割位点的15-22个碱基对同源引物，基因可以通过PCR被扩增。对于不需要用于纯化的6X-组氨酸标签融合的酶，pCDFDuet-1可以用NcoI和EcoRI被线性化。被Ni-NTA柱纯化的酶将使用pCDFDuet-1中的6X-HIS标签。在这种情况下，载体仅可以使用EcoRI被线性化。
PCR产物可以使用例如In-Fusion HD EcoDry克隆系统被插入载体中，并且所述载体通过热激被转化至感受态大肠杆菌(E.coli)细胞。转化株可以在含有适当抗生素的固体培养基上被筛选。质粒DNA可以使用任何合适的方法被分离，所述方法包含QIAprep SpinMiniprep试剂盒(QIAGEN,Limburg)，并且构建体通过PCR和测序确认。确认的构建体可以通过例如电穿孔被转化至宿主菌株(如大肠杆菌(E.coli))用于表达，但是具有合适的表达载体和宿主物种的可能的密码子优化的其他宿主物种可以被使用。
从构建的菌株表达所需酶可以在液体培养基(例如摇瓶、生物反应器、恒化器、发酵罐等)中进行。当培养基OD550达到大约0.5-0.8时，通常通过加入合适的诱导剂诱导基因表达。诱导的细胞可以生长约4-8小时，此时细胞可以被沉淀并且被保存在-20℃。所需蛋白质的表达可以通过在SDS-PAGE上运行细胞沉淀样品来确认。
仅仅通过化学、酶、热或机械方式破坏细胞，可以在粗细胞裂解物中直接测定表达的酶。然而，根据酶的表达水平和活性，可能需要纯化，从而能够测量超过背景水平的酶活性。纯化的酶也可以允许途径的体外组装，从而允许其受控的特性。
N-或C-末端HIS-标签蛋白可以通过使用例如按照制造商的协议的Ni-NTA Spin试剂盒(Qiagen,Venlo,Limburg)或者可以使用其它方法被纯化。选择HIS-标签系统仅仅出于方便起见，，并且其他标签可以用于纯化用途。进一步地，如果最终组装途径中的蛋白质用于体内用途，则不需要被标记。然而，对于本文中进行的酶表征工作，标记是方便的。
用于酶测定的反应条件可以随待测试的酶的类型而变化很大。然而，通常来说，酶测定遵循类似的一般协议。将纯化的酶或粗裂解物加入合适的反应缓冲液中。反应缓冲液通常含有盐、必需的酶辅因子，并且处于适当的pH。缓冲液组分通常根据酶或反应类型而变化。通过加入底物引发反应，并且监测与底物的消耗或产物的产生有关的反应的一些方面。
选择适当的监测方法取决于待测量的化合物。分光光度测定是方便的，因为其允许通过测量在一定波长处的化合物的浓度依赖性吸光度来实时确定酶活性。不幸的是，在反应中并不总是存在在方便的波长处具有可测量的吸光度的化合物。在这些情况下，化学分析的其他方法对于确定所涉及的化合物的浓度可能是必需的。
气相色谱(GC)便于挥发性物质的定量，其中的脂肪酸和醛具有特殊的相关性。向反应混合物中加入内标，所述内标通常是一种或更多种不参与反应的相似类型的分子，并且用有机溶剂(如己烷)提取反应混合物。例如，脂肪酸样品可以在氮气流下被干燥，并且使用比例1:1的BSTFA和吡啶，将脂肪酸样品转化成其三甲基甲硅烷基衍生物。温育30分钟后，样品被再次干燥并且在己烷中被重悬以施加至GC。醛样品不需要被衍生化。样品可以运行在例如配有火焰离子化检测器和HP-5毛细管柱(AGILENT Tech.,Santa Clara,CA)的Varian CP-3800气相色谱仪(VARIAN ASSOCIATES,Palo Alto,CA)上。
一旦途径已经在体外被充分研究，就有更大的信心可以在体内构建该途径。用于体内途径操作的菌株构建应该允许途径的酶的明确的受控表达。如前所述，大肠杆菌(E.coli)或酵母将是用于体内途径的选择宿主，但是其他宿主可以被使用。例如，Duet系统通过在大肠杆菌中的IPTG的诱导，允许同时表达多达8种蛋白质，并且初步实验将使用这个宿主。
途径酶也可以被插入宿主染色体中，从而允许维持途径，而不需要抗生素以确保质粒的持久的维持。理论上，由于染色体表达不需要单独的复制起点(这对质粒表达是常有的事)，也存在无限数量的可以被置于染色体上的基因。
如Datsenko和Wanner所述，用于染色体整合的DNA构建体通常包含用于去除的具有侧翼FRT位点的抗生素抗性标记，充分表征的启动子、核糖体结合位点、感兴趣的基因和转录终止子。整体产物是一个具有50个位于构建体左右两端的，与染色体上目标位点同源的碱基对的线性DNA片段。
然而，Flp-FRT重组方法仅仅是一种用于将基因加入染色体的系统，并且其他系统是可用的，如RecBCD途径、RecF途径、RecA重组酶、非同源末端连接(NHEJ)、Cre-Lox重组、TYR重组酶和整合酶、SER游离酶/转化酶、SER整合酶、PhiC31整合酶等。大肠杆菌(E.coli)中的染色体修饰也可以通过重组方法实现，如Datsenko和Wanner最初所述。
在重组方法中，例如，按照标准技术制备用于电穿孔的细胞，并且用含有与所需修饰位点靶向同源的侧翼的50个碱基对的线性DNA转化细胞。对于DNA构建体的无缝整合，可以使用含有阳性和阴性选择标记的盒，如cat和sacB的组合，来采用两步方法。在第一轮重组中，对于所需修饰位点具有靶向同源性的cat-sacB盒被引入细胞。cat基因提供对氯霉素的抗性，允许在含有氯霉素的固体培养基上选择阳性重组体。可以对阳性分离物进行第二轮重组，引入与cat-sacB盒的去除相对应的位点具有靶向同源性的所需的DNA构建体。sacB基因编码提供对蔗糖敏感性的酶。因此，在含有蔗糖的培养基上的生长允许选择cat-sacB构建体被去除的重组体。可以从通过PCR和测序被确认的分离物来制备P1噬菌体裂解物。裂解物可以被用于将修饰转导至所需的菌株，如前所述。
表达设计的途径的工程化菌株可以在以下或类似条件下被培养。从单克隆开始的过夜培养基可以被用于接种到含有适当培养基的烧瓶。培养物生长一段时间，并且分析培养基。培养条件将高度依赖于实际途径的特化以及需要测试的是什么。例如，可以通过使用甲酸盐或甲醛作为MOPS基本培养基中的底物，如Neidhardt所述，补充适当的抗生素和诱导剂，来测试途径用于自养生长的能力。可以通过加入单碳化合物和葡萄糖或甘油来表征兼养生长。
发酵后培养基的分析提供了对工程化途径的性能的洞察。可以通过GC分析较长链脂肪酸产物的定量。其他代谢产物，如短链有机酸和底物，如葡萄糖或甘油，可以通过HPLC被分析。一旦途径完全起作用，培养物可以在恒化器中生长，在需要的情况下提供连续的不间断的产物的产生。
各种各样的组学技术，如微阵列或2D-PAGE可以分别提供关于基因表达或蛋白质表达的信息。基因组规模模型允许可能导致改善宿主菌株的性能的的附加的修饰的鉴定。例如，删除竞争的途径可能增加用于产物生产的整个工程化途径的碳通量。
标准分子生物学技术被用于基因克隆、质粒分离和大肠杆菌(E.coli)转化。使用引物从大肠杆菌(E.coli)MG1655基因组DNA扩增大肠杆菌(E.coli)内源基因，从而在被插入至载体骨架中用于重组的基因的每一端上附加15bp的同源片段。来自其他生物体的基因被密码子优化并且通过GeneArt(LIFE TECH.,CA或GENSCRIPT,NJ)被合成。质粒通过合适的限制酶被线性化，并且使用In-Fusion HD Eco-Dry克隆系统(CLONTECH Lab.,CA)与基因插入片段被重组。随后混合物被转化成恒星感受态细胞(CLONTECH Lab)。
分离生长在补充有适当抗生素的固体培养基(LB+琼脂)上的转化株，并且通过PCR筛选基因插入片段。从验证的转化株中分离质粒，并且通过DNA测序(LONE STAR LABS,TX)进一步确认基因插入片段的序列。在每种情况中，质粒(也被称为载体)含有至少一个启动子、每个基因的核糖体结合位点、感兴趣的基因、至少一个终止子、复制起点和抗生素抗性标记。示例性质粒示于图11、15和22-24。
通过n-羟基琥珀酰亚胺方法(Blecher,1981)制备2-羟基十六酰基-CoA。总之，通过在二环己基碳二亚胺存在下使n-羟基琥珀酰亚胺与酸反应来制备2-羟基十六烷酸的n-羟基琥珀酰亚胺酯。产物被过滤并且通过从甲醇重结晶被纯化，以产生纯的2-羟基十六烷酸的n-羟基琥珀酰亚胺酯。所述酯与CoA-SH在巯基乙酸存在下反应，以产生2-羟基十六酰基-CoA。2-羟基十六酰基-CoA通过使用高氯酸被纯化沉淀，过滤，并且用高氯酸、乙醚和丙酮洗涤滤液。
如先前所述(Parasaran&Tarbell,1964)，通过首先形成甲酸乙基碳酸酐来制备甲酰-CoA。简略地，将甲酸(0.4mmol)和氯甲酸乙酯(0.4mmol)在4mL无水乙醚中混合，并且冷却至-20℃。向混合物中加入0.4mmol三乙胺，并且反应被允许在-20℃下进行30分钟。反应混合物通过玻璃棉被过滤，以产生含有甲基乙基碳酸酐的乙醚溶液。为了获得甲酰-CoA，将7μmol CoASH溶解在5mL 3:2的水：四氢呋喃中，向其中加入10mg碳酸氢钠。甲酸乙基碳酸酐溶液以剧烈搅拌被滴加到CoASH溶液中，然后在氮气流下，蒸发有机相。将混合物在4℃下保持2小时，然后在氮气下，蒸发任何剩余的二乙醚。使用C18柱的固相萃取被用于从反应混合物中纯化甲酰-CoA。将甲酰-CoA在甲醇中从C18柱洗脱，并且储存在2:1的甲醇：醋酸铵(pH5.5)中。
如上所述，构建含有编码来自单核细胞增多性李斯特氏菌(Lysteriamonocytogene)的6X HIS-标签Lmo1197的密码子优化的基因的质粒。所得的构建体(图11)，被转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中用于表达。将所得的菌株在含有50μg/mL壮观霉素的50mL TB培养基的250mL烧瓶中培养。当培养物达到OD550大约0.6时，通过加入0.1mMIPTG诱导表达，并且在室温下过夜培养后通过离心收获细胞。
将所得的细胞沉淀物重悬于细菌蛋白提取试剂(B-PER)(THERMO SCI.,MA)中至OD550大约40，向其中加入大约5000U的溶菌酶和大约250U的全能核酸酶(SIGMA-ALDRICHCo.,MO)。将细胞混合物在室温下放置直到完全澄清以产生细胞提取物。加入1M咪唑储备溶液以提供细胞提取物中的10mM咪唑的最终浓度。
使用TALON金属亲和树脂(CLONTECH Lab.)从细胞提取物中纯化HIS-标记的Lmo1199蛋白。简而言之，使用2.5mL含有50mM磷酸钠、300mM NaCl和10mM咪唑的pH 7.5的的缓冲液(NPI-10)平衡250μL树脂床两次。将细胞提取物加入树脂中，并且将混合物在冰上轻轻震荡20分钟。然后将树脂用2.5mL缓冲液NPI-20(与NPI-10相同，但是有20mM咪唑)洗涤两次，每次洗涤在冰上轻轻震荡15分钟。然后将树脂转移到重力柱中，并且用1.25mL NPI-20洗涤一次。最后，使用1.25mL缓冲液NPI-250(与缓冲液NPI-10相同，但是有250mM咪唑)洗脱所需的蛋白质，并将洗脱液在500μL级分中收集。Lmo1179的样品纯化在图12中示出。
如上所述，构建含有编码人HIS-标签HACL1的密码子优化的基因的质粒。所得的构建体(图15)被转化到酿酒酵母(S.cerevisiae)InvSCl(Life Tech.)中。将所得的菌株在50mL含有2％葡萄糖的SC-URA培养基中在30℃下培养24小时。将细胞沉淀并且将所需量的细胞用于接种含有0.2％半乳糖、1mM MgCl2和0.1mM硫胺素的250mL培养物体积的SC-URA培养基至0.4OD600。在30℃下振荡培养20小时后，将细胞沉淀并保存。
当需要时，将细胞沉淀在含有50mM磷酸钾(pH 7.4)、0.1mM硫胺素焦磷酸、1mMMgCl2、0.5mM AEBSF、10mM咪唑和250单位全能核酸酶的缓冲液中重悬至OD600大约100。向细胞悬浮液中加入大约等体积的425-600μm玻璃珠。细胞在3000rpm下涡旋30秒，随后在冰上30秒的四个循环中破裂。通过离心沉淀玻璃珠和细胞碎片，并且收集含有细胞提取物的上清液。使用如上所述的Talon金属亲和树脂(仅修改树脂床体积并且将所有后续洗液减半)，从细胞提取物中纯化HIS-标记的HACL1。洗脱液在两个500μL级分中被收集。HACL1的样品纯化在图16中示出。
将大肠杆菌(E.coli)fadA和fadB基因从MG1655基因组DNA克隆至pUCBB-ntH6载体以产生具有可被凝血酶切割的氨基-末端HIS-标签的组成型表达基因。对于AtoB和硫酯酶特征测定，使用来自ASKA收藏的pCA24N-基因(-gfp)质粒(Kitagawa et al,2005)。为了表达小眼虫(E.gracilis)TER用于动力学特征，使用In-Fusion协议(Clontech LAB.)将egTER基因克隆至pTrcHis2A然后由含有质粒的上述最优密码子egTER进行PCR扩增。
在37℃下将在250mL三角瓶(WHEATON IND.,NJ)中用于酶促测定的培养物在100mLLB培养基中于OD600约0.6下用1mM IPTG(pCA24N,pTrcHis2A)或1mM阿拉伯糖(pUCBB-pBAD)诱导大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)的细胞生长过夜或组成型表达(pUCBB-ntH6)。在SynergyHT板读数仪(BIOTEK INSTR.,VT)上于25℃下(用于在300nm或更高下监测反应)或针对在263nm下的反应在Biomate 5分光光度计(THERMO SCI.)中监测反应。
按照规定的方案使用细菌蛋白提取试剂(B-PER)(Thermo Sci.)将细胞裂解以便获得含有活性酶的上清液。在先前创建的方法之后使用以上提及的相同的生长条件纯化FadE和YdiO。将细胞沉淀重悬于40mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中并通过破坏EmulsiFlex-C5匀浆器(AVESTIN,ON)破碎。然后将破坏的细胞在Optima L-80XP超速离心机(BECKMAN-COULTER,IL)中在4℃下以120,000x g旋转90分钟以产生用于测定的上清液。
对于比活度测定(以μmol底物/mg蛋白/min报道)，利用这些上清级分并且使用Bradford试剂(Thermo Sci.)使用BSA作为蛋白标准确立蛋白浓度，并且减去背景非-酶促速率以确立活性。将AtoB、FadA和egTER的HIS-标签蛋白使用Talon金属亲和树脂(CLONTECHLAB.)通过重力纯化从B-PER上清液级分中纯化。
简而言之，在室温下将上清液与大约2mL的用缓冲液A(50mM Tris pH 7.9,5mMMgCl2,100mM NaCl,5mM咪唑)预洗涤两次的Talon树脂(1mL树脂/0.3mg上清蛋白)在LabQuake旋转器(FISHER SCI.,PA)上混合1小时。然后将树脂在700x g下旋转5分钟以去除未组合的蛋白，用20X(40mL)缓冲液A洗涤，在20X(40mL)缓冲液B(具有20mM咪唑的缓冲液A)重悬并负载至重力柱。然后将缓冲液B排出并将蛋白用20mL缓冲液C(具有250mM咪唑的缓冲液A)洗脱。然后将洗脱的级分浓缩并用于动力学特征。通过测量在260nm下的吸光度和针对每个酶由ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam/)预测的消光系数确立酶浓度。
对于粗提取物测定，细胞(JST07-atoBCT5-fadBCT5,JST07-atoBCT5-fadBCT5/pCDF-yciA)在37℃下和200rpm下，在含有25mL LB培养基的125mL锥形瓶中生长。在OD5500.3-0.5时加入0.2mM的Cumate和0.1mM的IPTG，分别用于cumate启动子(CT5)调控的fadB、atoB和T7启动子调控的yciA的过度表达，然后在相同的条件下继续培养4小时，然后在5000X g下离心10分钟后收获。用9g/L NaCl溶液洗涤收获的细胞一次，并且在-80℃下储存为细胞沉淀直至使用。将冷冻的细胞重悬于补充有1mM二硫苏糖醇(DTT)的Tris-HCl(50mM,pH 7.5)缓冲液中，用于通过使用玻璃珠(0.1mm直径)进行的细胞破坏。
体外途径表征
如上所述，克隆和表达编码工程化途径的酶的基因。评估纯化的酶的催化提出的反应(如表2和图10A-B所概述的)的能力。工程化途径由至少一种延伸子产生组件组成，所述延伸子产生组件导致甲酰-CoA的产生；伸长组件，所述伸长组件允许碳骨架的迭代伸长；以及终止组件，所述终止组件允许从其他组件的中间体产生产物。还描述了再生组件，但是是可选的，并且如果循环仅运行一次，则可以省略再生组件。在这里，我们描述了体外测试组成使用甲醛以产生饱和脂肪酸的实施的步骤。
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Figure BDA0001335509420000201
延伸产生组件：如上所述，在大肠杆菌(E.coli)中克隆(图11)、表达和纯化(图12)单核细胞增多性李斯特菌Lmo1179。评估纯化的酶将甲醛转化成延伸子单元甲酰-CoA的能力。酶测定在23mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、1mM CoASH、0.5mM NAD+、20mM2-巯基乙醇和50mM甲醛中进行。通过测量在340nm处的吸光度(对应于NADH的产生)来监测反应。通过使用C18柱的固相萃取(SPE)从反应混合物中提取CoA化合物，并通过ESI-TOF MS确定提取的CoAs的质量。在反应混合物中包含Lmo1179导致甲醛至甲酰-CoA的转化，如NADH共同产生所示(图13)。质谱分析确认通过Lmo1179产生甲酰-CoA。在用酶温育的样品中鉴定出在甲酰-CoA(796)的预期的质量处的峰，如图14所示。在无酶对照(图14)中不存在峰，表明Lmo1179产生甲酰-CoA。
伸长组件：伸长组件由醛和甲酰-CoA的连接组成，然后是将产生的2-羟酰-CoA转化回比起始醛长一个碳的醛的步骤。
为了催化连接步骤，如上所述，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中克隆(图15A-B)、表达和纯化(图16)人HACL1。通过评估将2-羟基十六酰基-CoA切割成十五烷醛和甲酰-CoA的能力，测试纯化的HACL1的内源分解代谢活性。酶测定在50mM pH 7.5的tris-HCl、0.8mMMgCl2、0.02mM TPP、6.6μm BSA和0.3mM 2-羟基十六酰基-CoA中进行。将测定混合物在37℃温育1小时，然后通过用己烷提取和通过用GC-FID分析评估十五烷醛的存在。如图17所示，在含有HACL1的样品中产生十五烷醛，但在不含有HACL1的对照样品不产生，表明蛋白质以活性形式表达和纯化。
还确定了纯化的HACL1在合成代谢方向(与生理方向相反)运行的能力。测试醛和甲酰-CoA在包括60mM磷酸钾(pH 5.4)、2.5mM MgCl2、0.1mM TPP、6.6μM BSA、5mM醛、20％DMSO、大约1mM新鲜制备的甲酰-CoA和大约0.5mg/mL纯化的HACL1的连接。允许反应在室温下发生16小时，然后通过调节pH>12.0将酰基-CoAs水解成其相应的酸。对于预期短链碳产物的情况，例如由乙醛产生的乳酸盐，通过HPLC分析样品。在较长产物的情况下，例如由十五醛产生的2-羟基十六烷酸，将样品用HCl酸化并且用乙醚提取。将提取后的乙醚在氮气流下蒸发至干燥，并且通过加入1:1的BSTFA：吡啶衍生化。在70℃下温育30分钟后，通过GC-FID分析这些样品。
当纯化的酶被供给十五醛和甲酰-CoA时，如图18所示，正如假设的，HACL1被证实催化这些分子与2-羟基十六酰基-CoA连接。在酰基-CoA水解后，含有酶的样品的色谱图显示出与2-羟基十六酰基-CoA加标标准相似的峰，其在不含有酶的样品中未出现。
进一步测试纯化的HACL1在较短醛上的活性，如乙醛或甲醛与甲酰-CoA的连接，以分别产生乳酰-CoA或羟乙酰基-CoA。在将酰基-CoAs水解至其酸形式后，通过HPLC分析这些样品。在含有HACL1的样品中鉴定由乙醛和甲酰-CoA伸长的乳酸盐的存在，但在无酶对照中不存在，如图19所示。
观察到从甲醛和甲酰-CoA到乙醇酸的类似的结果，如图20所示。通过NMR确认相关样品中乳酸盐的存在，如图21A-B所示。这表明HACL1能够催化具有链长至少从C1-C15的醛与甲酰-CoA的连接，使得其适合于工程化迭代途径。
然后将2-羟酰-CoA脱水至相应的反式-2-烯酰-CoA。2-羟酰-CoA脱水酶被鉴定为来自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的LcdABC。LcdABC被Hofmeister和Buckel表征具有对应于1.21±0.08μmol/min/mg蛋白质(Hofmeister&Buckel,1992)的比活度用于将2-羟基丁酰基-CoA脱水为巴豆酰基-CoA。如上所述，克隆编码LcdABC的基因(图24)。
然后通过反式-2-烯酰-CoA还原酶将反式-2-烯酰-CoA还原至饱和酰基-CoA。如上所述，鉴定和克隆来自小眼虫(Euglena gracilis)的变体EgTER。EgTER表达和纯化后，通过在25℃下在200μL的最终体积中，在100mM Tris HCL(pH 7.5)和0.2mM NADH的存在下监测NADH吸光度的损耗，进行体外测定。这表明酶能够催化巴豆酰基-CoA转化至丁酰-CoA，具有对应于1.21±0.08μmol/min/mg蛋白质的比活度(图25)。
饱和酰基-CoA最终通过酰基-CoA还原酶转化至相应的醛。测试了大肠杆菌(E.coli)内源酰基-CoA还原酶MhpF将丁酰-CoA转化为丁醛的能力(图26)。大肠杆菌(E.coli)MhpF由ASKA采集菌株(Kitagawa et al.2005)表达。将菌株在具有100mM Tris(pH8.0)、10μg/L葡萄糖、50μM FeSO4、5μM NaH2SeO3和5μM(NH4)6Mo7O24的10mL LB中厌氧生长。细胞生长至OD550 0.4，此时通过加入0.1mM IPTG诱导蛋白质表达。
生长3小时后，将细胞沉淀，并且将沉淀重悬于100mM MOPS(pH 7.5)中至40OD。将1mL的细胞悬浮液加入0.75g玻璃珠中，并且使用细胞破裂仪(Scientific Industries,Bohemia,NY,USA)将细胞破裂3分钟。通过离心沉淀细胞碎片和玻璃珠，并且将包括细胞提取物的上清液用于测定。
测定混合物由100mM MOPS(pH 7.5)、6mM DTT、5mM MgSO4、0.3mM(NH4)2Fe(SO4)2、0.3mM NADH和0.2mM丁酰-CoA组成。通过在340nm处的吸光度的损耗(对应于NADH的消耗)来监测反应，如图24所示。MhPF能够以0.009±0.003μmol/mrn/mg蛋白质的比活度催化转化(图26)。
测定大肠杆菌(E.coli)FucO进行类似的反应(将丁醛还原至丁醇)的能力。如上所述，由ASKA采集菌株表达和纯化FucO。在含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.3mM NADH和10mM丁醛的缓冲液中测定纯化的FucO。通过在340nm处的吸光度的损耗(对应于NADH的消耗)来监测反应，如图27所示。FucO能够催化丁醛还原至丁醇，具有5.08±0.08μmol/min/mg蛋白质的比活度。
伸长组件的一部分在体外组装以证明组合途径步骤的功能。将反式-2-烯酰-CoA还原酶和酰基-CoA还原酶步骤组合，以评估巴豆酰基-CoA到丁醛的总体转化。在37℃下，在含有1mM DTT的50mM Tris缓冲液(pH 7.5)中进行实验。与MhpF的反应含有0.15g/L TdTer、0.1g/L的MhpF、7.5mM NADH和1.7mM巴豆酰基-CoA。与Lmo1179的反应含有0.15g/L TdTer、0.9g/L Lmo1179、7.5mM NADH和1.7mM巴豆酰基-CoA。通过用HPLC测量丁醛的产生来监测测定。当在上述条件下测定时，来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的反式-2-烯酰-CoA还原酶和大肠杆菌(E.coli)酶MhpF的组合被证明从巴豆酰基-CoA产生丁醛至0.55mM的最终浓度(图28)。
再生组件：从伸长组件的烯酰-CoA开始，烯酰-CoA水合酶将烯酰-CoA转化至相应的3-羟酰-CoA。然后通过3-羟酰-CoA脱氢酶将3-羟酰-CoA转化至3-酮酰基-CoA。3-酮酰基-CoA硫解酶将3-酮酰基-CoA切割成乙酰-CoA和两个碳缩短的酰基-CoA。在这个实施中，通过上述酰基-CoA还原酶之一将乙酰-CoA转化成醛，并且被用于在另一轮循环中引发伸长循环。剩余的酰基-CoA通过硫酯酶被转化为羧酸产物，或者以另外的方式由终止组件处理。
大肠杆菌(E.coli)内源FadB已经示出具有烯酰-CoA水合酶和3-羟酰-CoA脱氢酶活性。大肠杆菌(E.coli)FadB在体外以相反的方向被纯化和测定(图29)，尽管其在所需的方向上的生理活性已经被很好地表征(Binstock&Schulz,1981)。在25℃下，在200μL的总体积中存在1.5mM DTT、4.5mM MgCl2、100mM Tris HCL(Ph 7.5)和0.2mM NADH时进行β-羟基丁酰基-CoA脱氢酶测定。通过NADH在340nm处的氧化来监测β-羟基丁酰基-CoA脱氢酶活性。在200μL总体积中存在100mM Tris HCL(pH 7.5)情况下，通过在263nm(ε＝6.7mM-1cm-1)处巴豆酰基-CoA的损耗，监测烯酰-CoA水合酶活性。在这些条件下，烯酰-CoA水合酶比活度被测量为0.051±0.004μmol/min/mg蛋白质，而3-羟酰-CoA脱氢酶活性被测量为0.185±0.001μmol/min/mg蛋白质(图29)。
测定了大肠杆菌(E.coli)内源硫解酶AtoB和FadA在将3-酮丁酰基-CoA切割成乙酰-CoA的两个分子时的活性(图30)。在25℃下，在200μL的总体积中存在0.5mM DTT、4.5mMMgCl2、100mM Tris HCL(pH 7.5)和2mM CoA情况下，确定硫解酶活性。对于AtoB，比活度被测量为0.36±0.05μmol/min/mg蛋白质，并且对于FADA，为0.013±0.002μmol/min/mg蛋白质。
终止组件：大肠杆菌(E.coli)内源硫酯酶FadM、TesA、TesB、YbgC、YciA和YdiI通过在412nm(ε＝4.3mM-1cm-1)处产生TNB进行体外表征。在25℃下，在200μL的体积中存在100mMTris(pH 7.5)、200mM KCl、25mM DTNB和200Μm“-CoA”底物时，进行反应。由于它们的不同的底物链长度特异性，选择用于所需产物的合适的硫酯酶对于途径的最优的功能是重要的。硫酯酶在乙酰-CoA上的体外表征的结果在表2和图31中概述。
在体内组装再生和终止组件，并且在体外测定表达组件酶的细胞的粗提取物以证明模块的功能。具有内源硫酯酶敲除的大肠杆菌MG1655菌株JST07被用作背景，包括再生组件的AtoB和FadB以及包括终止组件的YciA被过度表达。以巴豆酰基-CoA作为底物，这种再生和终止组件的组合将被期望产生作为产物的乙酸酯。反应混合物含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、200mM KCl、1.7mM巴豆酰基-CoA、1mM DTT、3.5mM NAD+、5mM CoA和粗提取物，最终体积为300μL。反应在30℃下进行，并且通过HPLC测量乙酸的产生。用于乙酸分析的测定混合物通过Amicon自旋过滤器(截留分子为10kDa)过滤，并且在HPLC分析之前在4℃下储存。如图32所示，在含有整个再生和终止组件的样品中观察到乙酸盐，但是在其中省略终止组件、YciA的样品中未观察到。这些结果表明组合的再生和终止组件的功能性构建和表达。
在体外实施提出的途径的简单实施用于生产乙醇酸。在这个实施中，通过一个碳单元甲酰-CoA伸长甲醛，并且将所得的2-羟酰-CoA、乙酰-CoA转移到由硫酯酶组成的终止组件中以产生乙醇酸。在体外实施中，将HACL1和大肠杆菌(E.coli)YciA在包括60mM磷酸钾pH 5.4、2.5mM MgCl2、0.1mM TPP、6.6μM BSA、5mM醛和约1mM甲酰-CoA的反应混合物中混合。将混合物在室温下温育30分钟，并且通过HPLC直接分析，显示的乙醇酸通过途径产生(图33)。
路径的计算机模拟
开发并且评估了在作为宿主的大肠杆菌(E.coli)中被实施的途径的数学模型，以评估用于支持各种一碳原料上的产物形成和生物体生长的途径的可行性。大肠杆菌的基因组规模模型(GEM)iJO1366被用作起点(Orth et al.,2011)。这个模型包含1366个基因、2251个反应和1136个独特的代谢物。然而，调整GEM iJO1366以模拟在基本培养基中野生型大肠杆菌(E.coli)的甘油的发酵代谢时，这个模型预测了在模拟条件下不起作用但是人为地能够使氧化还原平衡的若干途径的操作。因此，我们限制了唯一地涉及氨基酸降解、核苷酸降解和氨基酸的输出、亚精胺、5-甲硫基-d-核糖产生、亚铁和硫化氢的反应至零通量(Cintolesi et al.,2014)。然后将包括提出的途径的反应加入到GEM中。
为了简化，两轮伸长循环的净反应被用来产生乙酰-CoA，其反过来允许细胞生长。这个净反应可以写成：
2甲酰-CoA+2NADH+2H+→1乙酰-CoA+1CoASH+2NAD++H2O。
此外，将用于将不同单碳底物转化至甲酰-CoA的反应加入到模型中。对于甲醛，反应形式如下：
1甲醛+1CoASH+1NAD+→1甲酰-CoA+1NADH+1H+。
对于甲酸，反应为：
1HCOOH+1ATP+1CoA→1甲酰-CoA+1ADP+1Pi。
此外，通过CO2还原酶将CO2和氢转化至甲酸(Schuchmann&Muller,2013)书写为：
1CO2+1H2→1HCOOH。
甲醇至甲醛的转化书写为：
1甲醇+1NAD+→1甲醛+1NADH+1H+。
通过甲烷单加氧酶将甲烷转化至甲醇书写为：
1甲烷+1O2+1NADH+1H+→1甲醇+1NAD++H2O。
使用通量平衡分析来评估模型。使用Matlab(THE MATHWORKS,MA)中的COBRA工具箱v2.0(Schellenberger et al.,2011)进行评估。为了比较，一个碳底物的吸收量在碳摩尔基础上被设定相等(任意地，10mmol C/g DCW/hr)。
然后对通过生产乙酰-CoA以支持细胞生长的途径的能力进行模拟。因为大肠杆菌(E.coli)不能在单碳底物上生长，细胞生长作为在大肠杆菌(E.coli)模型中包含途径的结果，表明了功能性途径。实际上，结果表明，含有设计的途径的大肠杆菌(E.coli)能够在从CO2到甲烷的单碳底物上生长(图34)。甲醇似乎允许最高的生长速率，最有可能是由于从甲醇氧化得到的附加的还原当量，这可以被用于产生用于生长的ATP。由于它们的转化至甲酰-CoA的ATP需求并且因为它们的高氧化态，相较于其他底物，在甲酸和CO2上的生长更具挑战性。这是一个原理证明途径能够按照在设计的大肠杆菌(E.coli)代谢以及其他生物体的代谢的情况下运行的证据。
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Figure BDA0001335509420000371
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序列表
<110> 威廉马什莱斯大学
<120> 从一碳化合物生物合成产物
<130> RICE:2015-017-02WO
<150> 62/069,850
<151> 2014-10-29
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 578
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Pro Asp Ser Asn Phe Ala Glu Arg Ser Glu Glu Gln Val Ser Gly
1 5 10 15
Ala Lys Val Ile Ala Gln Ala Leu Lys Thr Gln Asp Val Glu Tyr Ile
20 25 30
Phe Gly Ile Val Gly Ile Pro Val Thr Glu Ile Ala Ile Ala Ala Gln
35 40 45
Gln Leu Gly Ile Lys Tyr Ile Gly Met Arg Asn Glu Gln Ala Ala Cys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ala Ile Gly Tyr Leu Thr Ser Arg Pro Gly Val Cys
65 70 75 80
Leu Val Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile His Ala Leu Gly Gly Met Ala
85 90 95
Asn Ala Asn Met Asn Cys Trp Pro Leu Leu Val Ile Gly Gly Ser Ser
100 105 110
Glu Arg Asn Gln Glu Thr Met Gly Ala Phe Gln Glu Phe Pro Gln Val
115 120 125
Glu Ala Cys Arg Leu Tyr Thr Lys Phe Ser Ala Arg Pro Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Ala Ile Pro Phe Val Ile Glu Lys Ala Val Arg Ser Ser Ile Tyr
145 150 155 160
Gly Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Val Asp Ile Pro Ala Asp Phe Val Asn
165 170 175
Leu Gln Val Asn Val Asn Ser Ile Lys Tyr Met Glu Arg Cys Met Ser
180 185 190
Pro Pro Ile Ser Met Ala Glu Thr Ser Ala Val Cys Thr Ala Ala Ser
195 200 205
Val Ile Arg Asn Ala Lys Gln Pro Leu Leu Ile Ile Gly Lys Gly Ala
210 215 220
Ala Tyr Ala His Ala Glu Glu Ser Ile Lys Lys Leu Val Glu Gln Tyr
225 230 235 240
Lys Leu Pro Phe Leu Pro Thr Pro Met Gly Lys Gly Val Val Pro Asp
245 250 255
Asn His Pro Tyr Cys Val Gly Ala Ala Arg Ser Arg Ala Leu Gln Phe
260 265 270
Ala Asp Val Ile Val Leu Phe Gly Ala Arg Leu Asn Trp Ile Leu His
275 280 285
Phe Gly Leu Pro Pro Arg Tyr Gln Pro Asp Val Lys Phe Ile Gln Val
290 295 300
Asp Ile Cys Ala Glu Glu Leu Gly Asn Asn Val Lys Pro Ala Val Thr
305 310 315 320
Leu Leu Gly Asn Ile His Ala Val Thr Lys Gln Leu Leu Glu Glu Leu
325 330 335
Asp Lys Thr Pro Trp Gln Tyr Pro Pro Glu Ser Lys Trp Trp Lys Thr
340 345 350
Leu Arg Glu Lys Met Lys Ser Asn Glu Ala Ala Ser Lys Glu Leu Ala
355 360 365
Ser Lys Lys Ser Leu Pro Met Asn Tyr Tyr Thr Val Phe Tyr His Val
370 375 380
Gln Glu Gln Leu Pro Arg Asp Cys Phe Val Val Ser Glu Gly Ala Asn
385 390 395 400
Thr Met Asp Ile Gly Arg Thr Val Leu Gln Asn Tyr Leu Pro Arg His
405 410 415
Arg Leu Asp Ala Gly Thr Phe Gly Thr Met Gly Val Gly Leu Gly Phe
420 425 430
Ala Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Lys Asp Arg Ser Pro Gly Gln Trp
435 440 445
Ile Ile Cys Val Glu Gly Asp Ser Ala Phe Gly Phe Ser Gly Met Glu
450 455 460
Val Glu Thr Ile Cys Arg Tyr Asn Leu Pro Ile Ile Leu Leu Val Val
465 470 475 480
Asn Asn Asn Gly Ile Tyr Gln Gly Phe Asp Thr Asp Thr Trp Lys Glu
485 490 495
Met Leu Lys Phe Gln Asp Ala Thr Ala Val Val Pro Pro Met Cys Leu
500 505 510
Leu Pro Asn Ser His Tyr Glu Gln Val Met Thr Ala Phe Gly Gly Lys
515 520 525
Gly Tyr Phe Val Gln Thr Pro Glu Glu Leu Gln Lys Ser Leu Arg Gln
530 535 540
Ser Leu Ala Asp Thr Thr Lys Pro Ser Leu Ile Asn Ile Met Ile Glu
545 550 555 560
Pro Gln Ala Thr Arg Lys Ala Gln Asp Phe His Trp Leu Thr Arg Ser
565 570 575
Asn Met
<210> 2
<211> 551
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Pro Asp Ser Asn Phe Ala Glu Arg Ser Glu Glu Gln Val Ser Gly
1 5 10 15
Ala Lys Val Ile Ala Gln Ala Leu Lys Thr Gln Asp Val Glu Tyr Ile
20 25 30
Phe Gly Ile Val Gly Ile Pro Val Thr Glu Ile Ala Ile Ala Ala Gln
35 40 45
Gln Leu Gly Ile Lys Tyr Ile Gly Met Arg Asn Glu Gln Ala Ala Cys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ala Ile Gly Tyr Leu Thr Ser Arg Pro Leu Leu Val
65 70 75 80
Ile Gly Gly Ser Ser Glu Arg Asn Gln Glu Thr Met Gly Ala Phe Gln
85 90 95
Glu Phe Pro Gln Val Glu Ala Cys Arg Leu Tyr Thr Lys Phe Ser Ala
100 105 110
Arg Pro Ser Ser Ile Glu Ala Ile Pro Phe Val Ile Glu Lys Ala Val
115 120 125
Arg Ser Ser Ile Tyr Gly Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Val Asp Ile Pro
130 135 140
Ala Asp Phe Val Asn Leu Gln Val Asn Val Asn Ser Ile Lys Tyr Met
145 150 155 160
Glu Arg Cys Met Ser Pro Pro Ile Ser Met Ala Glu Thr Ser Ala Val
165 170 175
Cys Thr Ala Ala Ser Val Ile Arg Asn Ala Lys Gln Pro Leu Leu Ile
180 185 190
Ile Gly Lys Gly Ala Ala Tyr Ala His Ala Glu Glu Ser Ile Lys Lys
195 200 205
Leu Val Glu Gln Tyr Lys Leu Pro Phe Leu Pro Thr Pro Met Gly Lys
210 215 220
Gly Val Val Pro Asp Asn His Pro Tyr Cys Val Gly Ala Ala Arg Ser
225 230 235 240
Arg Ala Leu Gln Phe Ala Asp Val Ile Val Leu Phe Gly Ala Arg Leu
245 250 255
Asn Trp Ile Leu His Phe Gly Leu Pro Pro Arg Tyr Gln Pro Asp Val
260 265 270
Lys Phe Ile Gln Val Asp Ile Cys Ala Glu Glu Leu Gly Asn Asn Val
275 280 285
Lys Pro Ala Val Thr Leu Leu Gly Asn Ile His Ala Val Thr Lys Gln
290 295 300
Leu Leu Glu Glu Leu Asp Lys Thr Pro Trp Gln Tyr Pro Pro Glu Ser
305 310 315 320
Lys Trp Trp Lys Thr Leu Arg Glu Lys Met Lys Ser Asn Glu Ala Ala
325 330 335
Ser Lys Glu Leu Ala Ser Lys Lys Ser Leu Pro Met Asn Tyr Tyr Thr
340 345 350
Val Phe Tyr His Val Gln Glu Gln Leu Pro Arg Asp Cys Phe Val Val
355 360 365
Ser Glu Gly Ala Asn Thr Met Asp Ile Gly Arg Thr Val Leu Gln Asn
370 375 380
Tyr Leu Pro Arg His Arg Leu Asp Ala Gly Thr Phe Gly Thr Met Gly
385 390 395 400
Val Gly Leu Gly Phe Ala Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Lys Asp Arg
405 410 415
Ser Pro Gly Gln Trp Ile Ile Cys Val Glu Gly Asp Ser Ala Phe Gly
420 425 430
Phe Ser Gly Met Glu Val Glu Thr Ile Cys Arg Tyr Asn Leu Pro Ile
435 440 445
Ile Leu Leu Val Val Asn Asn Asn Gly Ile Tyr Gln Gly Phe Asp Thr
450 455 460
Asp Thr Trp Lys Glu Met Leu Lys Phe Gln Asp Ala Thr Ala Val Val
465 470 475 480
Pro Pro Met Cys Leu Leu Pro Asn Ser His Tyr Glu Gln Val Met Thr
485 490 495
Ala Phe Gly Gly Lys Gly Tyr Phe Val Gln Thr Pro Glu Glu Leu Gln
500 505 510
Lys Ser Leu Arg Gln Ser Leu Ala Asp Thr Thr Lys Pro Ser Leu Ile
515 520 525
Asn Ile Met Ile Glu Pro Gln Ala Thr Arg Lys Ala Gln Asp Phe His
530 535 540
Trp Leu Thr Arg Ser Asn Met
545 550
<210> 3
<211> 496
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Pro Asp Ser Asn Phe Ala Glu Arg Ser Glu Glu Gln Val Ser Gly
1 5 10 15
Ala Lys Val Ile Ala Gln Ala Leu Lys Thr Gln Asp Val Glu Tyr Ile
20 25 30
Phe Gly Ile Val Gly Ile Pro Val Thr Glu Ile Ala Ile Ala Ala Gln
35 40 45
Gln Leu Gly Ile Lys Tyr Ile Gly Met Arg Asn Glu Gln Ala Ala Cys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ala Ile Gly Tyr Leu Thr Ser Arg Pro Gly Val Cys
65 70 75 80
Leu Val Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile His Ala Leu Gly Gly Met Ala
85 90 95
Asn Ala Asn Met Asn Cys Trp Tyr Met Glu Arg Cys Met Ser Pro Pro
100 105 110
Ile Ser Met Ala Glu Thr Ser Ala Val Cys Thr Ala Ala Ser Val Ile
115 120 125
Arg Asn Ala Lys Gln Pro Leu Leu Ile Ile Gly Lys Gly Ala Ala Tyr
130 135 140
Ala His Ala Glu Glu Ser Ile Lys Lys Leu Val Glu Gln Tyr Lys Leu
145 150 155 160
Pro Phe Leu Pro Thr Pro Met Gly Lys Gly Val Val Pro Asp Asn His
165 170 175
Pro Tyr Cys Val Gly Ala Ala Arg Ser Arg Ala Leu Gln Phe Ala Asp
180 185 190
Val Ile Val Leu Phe Gly Ala Arg Leu Asn Trp Ile Leu His Phe Gly
195 200 205
Leu Pro Pro Arg Tyr Gln Pro Asp Val Lys Phe Ile Gln Val Asp Ile
210 215 220
Cys Ala Glu Glu Leu Gly Asn Asn Val Lys Pro Ala Val Thr Leu Leu
225 230 235 240
Gly Asn Ile His Ala Val Thr Lys Gln Leu Leu Glu Glu Leu Asp Lys
245 250 255
Thr Pro Trp Gln Tyr Pro Pro Glu Ser Lys Trp Trp Lys Thr Leu Arg
260 265 270
Glu Lys Met Lys Ser Asn Glu Ala Ala Ser Lys Glu Leu Ala Ser Lys
275 280 285
Lys Ser Leu Pro Met Asn Tyr Tyr Thr Val Phe Tyr His Val Gln Glu
290 295 300
Gln Leu Pro Arg Asp Cys Phe Val Val Ser Glu Gly Ala Asn Thr Met
305 310 315 320
Asp Ile Gly Arg Thr Val Leu Gln Asn Tyr Leu Pro Arg His Arg Leu
325 330 335
Asp Ala Gly Thr Phe Gly Thr Met Gly Val Gly Leu Gly Phe Ala Ile
340 345 350
Ala Ala Ala Val Val Ala Lys Asp Arg Ser Pro Gly Gln Trp Ile Ile
355 360 365
Cys Val Glu Gly Asp Ser Ala Phe Gly Phe Ser Gly Met Glu Val Glu
370 375 380
Thr Ile Cys Arg Tyr Asn Leu Pro Ile Ile Leu Leu Val Val Asn Asn
385 390 395 400
Asn Gly Ile Tyr Gln Gly Phe Asp Thr Asp Thr Trp Lys Glu Met Leu
405 410 415
Lys Phe Gln Asp Ala Thr Ala Val Val Pro Pro Met Cys Leu Leu Pro
420 425 430
Asn Ser His Tyr Glu Gln Val Met Thr Ala Phe Gly Gly Lys Gly Tyr
435 440 445
Phe Val Gln Thr Pro Glu Glu Leu Gln Lys Ser Leu Arg Gln Ser Leu
450 455 460
Ala Asp Thr Thr Lys Pro Ser Leu Ile Asn Ile Met Ile Glu Pro Gln
465 470 475 480
Ala Thr Arg Lys Ala Gln Asp Phe His Trp Leu Thr Arg Ser Asn Met
485 490 495
<210> 4
<211> 518
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Pro Asp Ser Asn Phe Ala Glu Arg Ser Glu Glu Gln Val Ser Gly
1 5 10 15
Ala Lys Val Ile Ala Gln Ala Leu Lys Thr Gln Asp Val Glu Tyr Ile
20 25 30
Phe Gly Ile Val Gly Ile Pro Val Thr Glu Ile Ala Ile Ala Ala Gln
35 40 45
Gln Leu Gly Ile Lys Tyr Ile Gly Met Arg Asn Glu Gln Ala Ala Cys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ala Ile Gly Tyr Leu Thr Ser Arg Pro Gly Val Cys
65 70 75 80
Leu Val Val Ser Gly Pro Gly Leu Ile His Ala Leu Gly Gly Met Ala
85 90 95
Asn Ala Asn Met Asn Cys Trp Pro Leu Leu Val Ile Gly Gly Ser Ser
100 105 110
Glu Arg Asn Gln Glu Thr Met Gly Ala Phe Gln Glu Phe Pro Gln Ala
115 120 125
Val Arg Ser Ser Ile Tyr Gly Arg Pro Gly Ala Cys Tyr Val Asp Ile
130 135 140
Pro Ala Asp Phe Val Asn Leu Gln Val Asn Val Asn Ser Ile Lys Tyr
145 150 155 160
Met Glu Arg Cys Met Ser Pro Pro Ile Ser Met Ala Glu Thr Ser Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ala Ala Ser Val Ile Arg Asn Ala Lys Gln Pro Leu Leu
180 185 190
Ile Ile Gly Lys Gly Ala Ala Tyr Ala His Ala Glu Glu Ser Ile Lys
195 200 205
Lys Leu Val Glu Gln Tyr Lys Leu Pro Phe Leu Pro Thr Pro Met Gly
210 215 220
Lys Gly Val Val Pro Asp Asn His Pro Tyr Cys Val Gly Ala Ala Arg
225 230 235 240
Ser Arg Ala Leu Gln Phe Ala Asp Val Ile Val Leu Phe Gly Ala Arg
245 250 255
Leu Asn Trp Ile Leu His Phe Gly Leu Pro Pro Arg Tyr Gln Pro Asp
260 265 270
Val Lys Phe Ile Gln Val Asp Ile Cys Ala Glu Glu Leu Gly Asn Asn
275 280 285
Val Lys Pro Ala Val Thr Leu Leu Gly Asn Ile His Ala Val Thr Lys
290 295 300
Gln Glu Leu Ala Ser Lys Lys Ser Leu Pro Met Asn Tyr Tyr Thr Val
305 310 315 320
Phe Tyr His Val Gln Glu Gln Leu Pro Arg Asp Cys Phe Val Val Ser
325 330 335
Glu Gly Ala Asn Thr Met Asp Ile Gly Arg Thr Val Leu Gln Asn Tyr
340 345 350
Leu Pro Arg His Arg Leu Asp Ala Gly Thr Phe Gly Thr Met Gly Val
355 360 365
Gly Leu Gly Phe Ala Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Lys Asp Arg Ser
370 375 380
Pro Gly Gln Trp Ile Ile Cys Val Glu Gly Asp Ser Ala Phe Gly Phe
385 390 395 400
Ser Gly Met Glu Val Glu Thr Ile Cys Arg Tyr Asn Leu Pro Ile Ile
405 410 415
Leu Leu Val Val Asn Asn Asn Gly Ile Tyr Gln Gly Phe Asp Thr Asp
420 425 430
Thr Trp Lys Glu Met Leu Lys Phe Gln Asp Ala Thr Ala Val Val Pro
435 440 445
Pro Met Cys Leu Leu Pro Asn Ser His Tyr Glu Gln Val Met Thr Ala
450 455 460
Phe Gly Gly Lys Gly Tyr Phe Val Gln Thr Pro Glu Glu Leu Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Arg Gln Ser Leu Ala Asp Thr Thr Lys Pro Ser Leu Ile Asn
485 490 495
Ile Met Ile Glu Pro Gln Ala Thr Arg Lys Ala Gln Asp Phe His Trp
500 505 510
Leu Thr Arg Ser Asn Met
515

Claims (24)

1.一种用于从单碳底物生产具有两个或更多个碳原子的产物的方法，所述方法包括催化通过缩合C(n)醛与甲酰-CoA而将C(n)醛延伸一个碳原子成2-羟基-C(n+l)-酰基-CoA的反应的步骤，其中n是碳原子数，其中所述反应使用2-羟酰-CoA裂解酶(HACL)或草酰-CoA脱羧酶进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应在重组微生物中进行，所述重组微生物包括编码2-羟酰-CoA裂解酶(HACL)基因或草酰-CoA脱羧酶基因的表达载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组微生物包括编码2-羟酰-CoA裂解酶(HACL)基因的表达载体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述单碳底物转化成甲酰-CoA的步骤。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法还包括将2-羟基-C(n+l)-酰基-CoA转化成C(n+l)醛的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中2-羟基-C(n+l)-酰基-CoA至C(n+l)醛的转化中的中间体被转化成具有两个或更多个碳原子的产物。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括再生C(n)醛的步骤。
8.根据权利要求6所述的方法，其中：
(a)所述中间体是甲酰-CoA，并且所述产物是羧酸；
(b)所述中间体是甲酰-CoA，并且所述产物是末端醇；
(c)所述中间体是甲酰-CoA，并且所述产物是醛；
(d)所述中间体是醛，并且所述产物是末端醇；
(e)所述中间体是醛，并且所述产物是末端烷；或者
(f)所述中间体是醛，并且所述产物是末端胺。
9.根据权利要求8所述的方法，其中：
i.(a)中的所述中间体至所述产物的转化通过硫酯酶、酰基-CoA:乙酰-CoA转移酶、或者磷酸转酰基酶和羧酸激酶进行；
ii.(b)中的所述中间体至所述产物的转化通过醇形成辅酶-A硫酯还原酶进行；
iii.(c)中的所述中间体至所述产物的转化通过醛形成辅酶-A硫酯还原酶进行；
iv.(d)中的所述中间体至所述产物的转化通过醇脱氢酶进行；
v.(e)中的所述中间体至所述产物的转化通过醛脱羧基酶进行；并且
vi.(f)中的所述中间体至所述产物的转化通过转氨酶进行。
10.根据权利要求8所述的方法，其中通过包括下列步骤的一系列反应再生C(n)醛：
(g)反式-2-烯酰-CoA至3-羟酰-CoA的转化；
(h)3-羟酰-CoA至3-酮酰-CoA的转化；
(i)3-酮酰-CoA至乙酰-CoA和缩短两个碳原子的酰基-CoA的转化；以及
(j)乙酰-CoA至乙醛的转化。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(g)由烯酰-CoA水合酶催化；步骤(h)由3-羟酰-CoA脱氢酶催化；步骤(i)由3-酮酰-CoA硫解酶催化；并且步骤(j)由乙酰-CoA还原酶催化。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述重组微生物包括编码下列酶的DNA分子：
(k)催化反式-2-烯酰-CoA至3-羟酰-CoA的转化的烯酰-CoA水合酶；
(l)催化3-羟酰-CoA至3-酮酰-CoA的转化的3-羟酰-CoA脱氢酶；
(m)催化3-酮酰-CoA至乙酰-CoA和缩短两个碳原子的酰基-CoA的转化的3-酮酰-CoA硫解酶；以及
(n)催化乙酰-CoA至乙醛的转化的乙酰-CoA还原酶。
13.根据权利要求4所述的方法，其中所述单碳底物选自由甲烷、甲醇、甲醛、甲酸盐、一氧化碳、二氧化碳及其组合组成的组。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述单碳底物是二氧化碳，并且通过包括下列步骤的一系列反应，二氧化碳被转化成甲酰-CoA：
(a)二氧化碳至甲酸盐的转化；
(b)甲酸盐至甲酰-磷酸盐的转化；以及
(c)甲酰-磷酸盐至甲酰-CoA的转化。
15.根据权利要求14所述的方法，其中：
i.步骤(a)通过二氧化碳还原酶进行；
ii.步骤(b)通过乙酸激酶或甲酸激酶进行；并且
iii.步骤(c)通过磷酸乙酰转移酶进行；
或者其中所述单碳底物是甲烷，并且通过包括下列步骤的一系列反应，甲烷被转化成甲酰-CoA：
(d)甲烷至甲醇的转化；
(e)甲醇至甲醛的转化；以及
(f)甲醛至甲酰-CoA的转化。
16.根据权利要求15所述的方法，其中：
i.步骤(d)通过甲烷单加氧酶进行；
ii.步骤(e)通过甲醇脱氢酶进行；并且
iii.步骤(f)通过酰化醛脱氢酶进行；
或者其中所述单碳底物是甲醇，并且通过包括下列步骤的一系列反应，甲醇被转化成甲酰-CoA：
(g)甲醇至甲醛的转化；以及
(h)甲醛至甲酰-CoA的转化。
17.根据权利要求16所述的方法，其中：
i.步骤(g)通过甲醇脱氢酶进行；并且
ii.步骤(h)通过酰化醛脱氢酶进行；
或者其中所述单碳底物是甲酸盐，并且甲酸盐被转化成甲酰-CoA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中甲酸盐至甲酰-CoA的转化通过乙酰-CoA合成酶进行；或者其中所述单碳底物是甲醛，并且甲醛被转化成甲酰-CoA。
19.根据权利要求18所述的方法，其中甲醛至甲酰-CoA的转化通过酰化醛脱氢酶进行。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述重组微生物包括：
a)编码催化二氧化碳至甲酸盐的转化的二氧化碳还原酶的DNA分子；编码催化甲酸盐至甲酰-磷酸盐的转化的乙酸激酶或甲酸激酶的DNA分子；以及编码催化甲酰-磷酸盐至甲酰-CoA的转化的磷酸乙酰转移酶的DNA分子；或者
b)编码催化甲烷至甲醇的转化的甲烷单加氧酶的DNA分子；编码甲醇至甲醛的转化的甲醇脱氢酶的DNA分子；以及编码催化甲醛至甲酰-CoA的转化的酰化醛脱氢酶的DNA分子；或者
c)编码催化甲醇至甲醛的转化的甲醇脱氢酶的DNA分子；以及编码催化甲醛至甲酰-CoA的转化的酰化醛脱氢酶的DNA分子；或者
d)编码催化甲酸盐至甲酰-CoA的转化的乙酰-CoA合成酶的DNA分子；或者
其中所述重组微生物包括编码催化甲醛至甲酰-CoA的转化的酰化醛脱氢酶的DNA分子。
21.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，所述方法包括下列步骤：
(i)2-羟基-C(n+l)-酰基-CoA至反式-2-C(n+1)-烯酰-CoA的转化；
(j)反式-2-C(n+l)-烯酰-CoA至C(n+1)-酰基-CoA的转化；以及
(k)C(n+1)-酰基-CoA至C(n+1)-醛的转化。
22.根据权利要求21所述的方法，其中：
i.步骤(i)通过2-羟酰-CoA脱水酶进行；
ii.步骤(j)通过反式-2-烯酰-CoA还原酶进行；并且
iii.步骤(k)通过酰基-CoA还原酶进行；或者所述方法包括下列步骤：
(l)2-羟基-C(n+l)-酰基-CoA至2-羟基-C(n+l)-醛的转化；
(m)2-羟基-C(n+l)-醛至1,2-C(n+l)-二醇的转化；以及
(n)1,2-C(n+l)-二醇至C(n+l)-醛的转化。
23.根据权利要求22所述的方法，其中：
i.步骤(l)通过酰基-CoA还原酶进行；
ii.步骤(m)通过1,2-二醇氧化还原酶或醇脱氢酶进行；并且
iii.步骤(n)通过二醇脱水酶进行。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述重组微生物包括：
a)编码催化2-羟基-C(n+l)-酰基-CoA至反式-2-C(n+1)-烯酰-CoA的转化的2-羟酰-CoA脱水酶的DNA分子；编码催化反式-2-C(n+l)-烯酰-CoA至C(n+1)-酰基-CoA的转化的反式-2-烯酰-CoA还原酶的DNA分子；以及编码催化C(n+1)-酰基-CoA至C(n+1)-醛的转化的酰基-CoA还原酶的DNA分子；或者
b)编码催化2-羟基-C(n+l)-酰基-CoA至2-羟基-C(n+l)-醛的转化的酰基-CoA还原酶的DNA分子；编码催化2-羟基-C(n+l)-醛至1,2-C(n+l)-二醇的转化的1,2-二醇氧化还原酶或醇脱氢酶的DNA分子；以及编码催化1,2-C(n+l)-二醇至C(n+l)-醛的转化的二醇脱水酶的DNA分子。
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