CN103998600A - 通过反向脂肪酸氧化的官能化羧酸和醇 - Google Patents

Abstract

本发明提供以反向合成代谢方向进行β氧化循环的细菌，连同开始反向循环的许多新型引物，制备此类引物的途径以及从而产生的大量产物。还公开了通过在反向途径中使用此类引物用于制备所需产物的方法。

Description

通过反向脂肪酸氧化的官能化羧酸和醇

在先相关申请

本申请要求2011年9月7日提交的美国序列号61/531/911的优先权。本发明仅针对美国目的要求2011年2月7日提交的61/440,192的优先权，其通过引用整体并入。

联邦资助研究声明

本发明是在由国家科学基金颁发的CBET-1134541和CBET-1134541以及CBET-1067565拨款下借助政府资助进行的。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及可以制备各种化学品用于工业用途的工程微生物。特别地，反向驱动脂肪酸氧化途径，将脂肪酸转化成原料和具有较少碳的专用化学品。

发明背景

我们已经表明β-氧化循环的工程化逆转可用于产生具有不同长度和官能度的侧链的直链脂族羧酸和正醇(61/440,192和PCT/US12/24051，2012年2月7日提交并且两者均通过引用整体并入本文)。在所有情况下，合成的分子为在ω末端处具有甲基的伯正醇或羧酸。本发明继续在反向β-氧化应用中进行研究并允许产物的进一步多样化。

为了概述在先基础的突破工作，用于驱动反向β-氧化循环的方法涉及以下三步：1)在不存在其天然诱导底物(即不存在脂肪酸)和存在非-脂肪酸碳源(如存在葡萄糖)的情况下功能性表达β氧化循环酶；2)在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环(与其天然分解代谢/降解方向相反)；和3)表达作用于β氧化循环的合适的中间体的终止酶以制备所需产物。

更详细地，重组工程为：

1)在不存在其天然诱导底物(即不存在脂肪酸)和存在非-脂肪酸碳源(如存在葡萄糖)的情况下表达β-氧化循环:为了表达β-氧化循环，首先i)突变fadR和atoC(c)使得在不存在脂肪酸的情况下表达编码β氧化酶的基因；ii)arcA敲除(ΔarcA)使得在厌氧/微需氧的条件下编码β氧化循环酶/蛋白的基因能够表达(在燃料和化学品的生产中使用微需氧/厌氧条件但是导致β氧化基因被ArcA抑制)；和iii)用cAMP非依赖性突变体(crp*)替换天然的环状AMP受体蛋白(crp)使得在存在分解代谢产物抑制性碳源诸如葡萄糖(葡萄糖为在发酵过程中最广泛使用的碳源且抑制β氧化基因)的情况下表达编码β氧化循环酶/蛋白的基因。

2)以反向/生物合成方向驱动β氧化循环(与其天然分解代谢/降解方向相反)。除了功能性表达β-氧化循环，本途径的反向运行通过驱动朝向β氧化循环的乙酰-CoA及其前体并防止别处A-coA使用来驱动。具体地说，iv)使用微需氧/厌氧条件使通过TCA循环进行的乙酰-CoA的代谢最小化并制备可用来在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰-CoA；v)pta(或ackA或两者)、poxB、adhE、yqhD和eutE敲除减少由乙酰-CoA合成乙酸盐(Δpta或ΔackA和poxB)和乙醇(ΔadhE、ΔyqhD和ΔeutE)并因此制备可用来在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰-CoA；vi)硫解酶的过度表达，在β氧化循环的逆转中的第一步，使得乙酰-CoA引导至本途径并因此以相反方向运行；vii)ldhA、mgsA和frdA敲除分别减少由丙酮酸盐和磷酸烯醇丙酮酸盐合成乳酸盐(ΔldhA和ΔmgsA)和琥珀酸盐(ΔfrdA)，从而制备用于合成乙酰-CoA的更多的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸盐且因此制备可用来在反向/生物合成方向中驱动β氧化循环的乙酰-CoA；viii)丙酮酸盐的过度表达：黄素氧还蛋白氧化还原酶(ydbK)和酰基-CoA脱氢酶(ydiO和ydiQRST)使得丙酮酸盐氧化(丙酮酸盐→乙酰-CoA+CO₂+Fd_red)和反式-Δ²-烯酰-CoA还原(反式-Δ²-烯酰-CoA+Fd_red→酰基-CoA)偶联并因此以相反方向驱动β氧化。

3)CoA硫酯中间体至所需终产物的转化。描述将反应中间体从反向β-氧化循环抽出并产生所需终产物的若干终止酶：

i)针对羧酸(即短的、中等和长链单羧酸，β-酮酸，β-羟基酸，反式-Δ2-脂肪酸)的CoA硫酯水解酶/硫酯酶或酰基-CoA：乙酰-CoA转移酶或磷酸转酰基酶和羧酸激酶，

ii)针对醇(即短的、中等和长链正醇，β-酮醇，1,3-二醇，反式-Δ²-醇)的醇形成CoA硫酯还原酶，

iii)醛形成CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶，其一起形成醇(即短的、中等和长链正醇，β-酮醇，1,3-二醇，反式-Δ²-醇)。

iv)醛形成CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶(其一起形成不同链长的烷烃或末端烯烃)，以及

v)烯烃形成酶(其一起形成脂族内部烯烃或末端烯烃或三烯或链烯醇)。

根据所需终产物视需要可以过度表达一种或多种这些终止酶。

4.产物链长的调节。硫酯中间体的链长确定终产物的长度并通过使用具有所需链长特异性的适当的终止酶来控制。另外，可以通过减少或增加具有所需链长特异性的硫解酶的活性抑制或促进链的伸长。可以一起或单独使用这两种方法。例如：

i)敲除fadA、fadI和paaJ以避免链延伸超出循环的l-至-2转弯(取决于使用乙酰-CoA或丙酰-CoA作为引物/起始分子，产生4-&6-碳中间体和产物或5-&7-碳中间体和产物)和短链硫解酶yqeF或atoB或短链醇脱氢酶诸如fucO或yqhD的过度表达；

ii)fadB、fadI和paaJ的过度表达以促进长链硫解酶tesA、tesB、fadM、ybgC或yciA或长链醇脱氢酶诸如ucpA、ybbO、yiaY、betA、ybdH或eutG的链伸长和过度表达。

本文使用的术语“适当的”是指对特定链长的给定中间体具有所需特异性的酶(即酰基-CoA、烯酰-CoA、羟酰-CoA和酮脂酰-CoA)。请注意硫酯中间体的链长可以通过操作硫解酶来控制(如以上所述)，且因此只有所需链长的硫酯对终止酶为可获得的。

我们现在已经改进了以上工作以获得较好的平台，这也允许初始化学品包括比仅仅乙酰-coA或丙酰co-A更多的引物，以及在步骤3处使用适当的终止酶以在此产生更多的其它的化学品。

发明概述

初始的反向β氧化使用乙酰-CoA(对于偶数长度产物)和丙酰-CoA(对于奇数链长产物)作为引物和然后导致合成羧酸和醇作为产物的相应的终止途径发挥作用。

相比之下，本发明使用如14种引物中的一者，它们中没有一个为乙酰-CoA或丙酰-CoA(尽管乙酰-CoA确实与引物缩合以至其添加两个碳原子，充当延伸子单元)。与不同的终止途径组合，这些导致二醇、二羧酸、羟基酸、羧基醇、胺、氨基酸、羟基化胺、二胺、酰胺、羧基酰胺、羟基化酰胺、二酰胺、异羟肟酸及其β-取代的衍生物的合成。

在一个实施方案中，本发明为基因工程细菌，其包括：

a.过度表达的硫解酶；

b.过度表达的3-羟酰-CoA脱氢酶；

c.过度表达的烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-CoA脱水酶；

d.过度表达的酰基-CoA脱氢酶或反式-烯酰-CoA还原酶；

e.过度表达的终止酶，其选自由以下酶组成的组：

i.硫酯酶或酰基-CoA:乙酰-CoA转移酶或磷酸转酰基酶和羧酸激酶，或

ii.醇形成辅酶-A硫酯还原酶，或

iii.醛形成CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶，或

iv.醛形成CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶，或

v.烯烃形成酶，或

vi.醛形成CoA硫酯还原酶和转氨酶；以及

f.发酵酶的减少表达，导致乳酸盐、乙酸盐、乙醇和琥珀酸盐的生产降低；

其中所述细菌具有在合成代谢方向进行的反向β氧化途径。

在终止酶中，醇形成辅酶-A(CoA)硫酯还原酶包括但不限于adhE2。

醛形成CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶包括但不限于：对于醛形成CoA硫酯还原酶为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)acrM，不动杆菌属某种菌株M-13(Acinetobactersp.Strain M-13)acr1，梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)sucD，大肠杆菌(E.coli)ybbO、ucpA、mhpF和eutE，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)ald，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)eutE和对于醇脱氢酶为大肠杆菌fucO、betA、eutG、yiaY；

醛形成CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶包括但不限于醛形成CoA硫酯还原酶与以上相同，对于醛脱羰基酶为来自细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC7942的PCC7942_orf1593和来自海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MIT9313的PMT9312_0532；

烯烃形成酶包括但不限于来自野生黄单孢菌(Xanthomonas campestris)的oleA、oleB、oleC和oleD；以及

醛形成CoA硫酯还原酶和转氨酶包括但不限于醛形成CoA硫酯还原酶与以上相同和对于转氨酶为来自大肠杆菌和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的gabT、来自小家鼠(Mus musculus)和小型猪(Sus scrofa)的abat以及来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的SGR_1829。

在另一实施方案中，本发明为工程细菌，其包含反向β氧化循环，所述微生物包含：

a.用于合成CoA硫酯的途径，所述CoA硫酯可以用作反向β-氧化循环的引物单元；

b.在β-氧化逆转中能够合成中间体的过度表达的酶，其包括i)硫解酶，ii)3-羟酰-CoA脱氢酶，iii)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-CoA脱水酶，和iv)酰基-CoA脱氢酶或反式-烯酰-CoA还原酶；

c.将反向β氧化循环中间体转化成所需产物的一种或多种过度表达的终止酶。

优选地，在所述生物体中的天然发酵途径已经减少并且从而产生较少的乙酸盐、乳酸盐、乙醇和琥珀酸盐。

本发明的另一实施方案为工程埃希氏杆菌属细胞，其包含：

a.ΔadhE、(Δpta或ΔackA或ΔackApta)、ΔpoxB、ΔldhA和ΔfrdA，

b.加上i)硫解酶；ii)3-羟酰-CoA脱氢酶；iii)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-CoA脱水酶；和iv)酰基-CoA脱氢酶或反式-烯酰-CoA还原酶中的一种的过度表达；其中酶i-iv)一起产生反向β氧化合成代谢循环；以及

c.表达载体，其提供将反向β氧化循环中间体转化成所需产物的过度表达的终止酶。

如本文所用，基因/蛋白/酶的过度表达可以通过本领域已知的方法例如通过使用可控制的表达载体或通过染色体中基因的过度表达或其它方法来实现。

其它实施方案为制备所需产物的方法，其包括将如本文所述的基因工程细菌在肉汤培养物中生长，通过使用反向β氧化途径延伸负荷乙酰-coA的引物以产生比所述引物长至少两个碳的产物并分离所述产物，其中所述引物选自列于表3A-B中的引物。引物和产物两者均可选自列于表3A-B中的引物和产物，并且优选地引物、产物和细菌基因型均选自列于表3A-B中的引物、产物和细菌基因型。

“引物”意指负荷有或变成负荷有CoA的引发剂或起始分子，然后在反向β氧化循环中与另一乙酰-coA缩合，因此制备延长两个碳原子的引物。此类分子包括：i)草酰-CoA、丙二酰-CoA、琥珀酰-CoA，ii)羟基乙酰-CoA、3-羟基丙酰基-CoA、4-羟基丁酰基-CoA，iii)2-氨基乙酰-CoA、3-氨基丙酰基-CoA、4-氨基丁酰基-CoA，和iv)异丁酰-CoA、3-甲基-丁酰基-CoA、2-羟基丙酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、2-氨基丙酰基-CoA。可以将此类引物提供给细胞或因此提供前体，或可以对细胞进行改造以产生与图3-5所示相同的物质。

“反向β氧化循环”或“RBOx循环”意指以反向或合成代谢方向驱动正常的分解代谢脂肪酸氧化循环因此每循环制备延长两个碳原子的中间体。正常的β氧化循环反应如图15中所示进行且一般包括i)脱氢以制备双键，ii)水合以将双键转化成-OH，iii)脱氢以将-OH转化成羰基，以及iv)损失如乙酰-coA的两个碳。反向β氧化循环反而包括i)如乙酰-coA的两个碳至引物的缩合，ii)羰基至-OH的氢化，iii)失水以形成双键，以及iv)氢化以除去双键。参见如图8。

“终止酶”在本文中意指催化将反向β氧化中间体从RBOx循环中除去的反应的酶,因此“终止”循环的运行。终止酶包括但不限于i)硫酯酶或酰基-CoA：乙酰-CoA转移酶或磷酸转酰基酶和羧酸激酶(其形成羧酸)或ii)醇形成辅酶-A硫酯还原酶(其制备醇)或iii)醛形成CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶(其一起形成醇)或iv)醛形成CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶(其一起形成烷烃或末端烯烃)或v)烯烃形成酶(诸如OleA、OleB、OleC、OleD，其一起形成内部的烯烃或末端烯烃或三烯或链烯醇)。

本文提供示例性的基因/蛋白/菌种。然而，基因、蛋白和酶的命名变化很大，因此本文中可以取代催化相同反应的任何蛋白。此外，尽管本文提供示例性的蛋白序列登录号，每个连接于相应的DNA序列和相关的序列。此外，通过同源搜索和如本文所示确定的必要的活动可以容易地鉴定相关的序列。

大肠杆菌基因和蛋白名称(其中它们已经被指定)可以通过ecoliwiki.net/确定以及酶可以通过brenda-enzymes.info/进行搜索。可获得许多类似的数据库，举例来说，包括PROSITE、EC2PDB、ExplorEnz、PRIAM、KEGG Ligand、IUBMB Enzyme Nomenclature、IntEnz、MEDLINE和MetaCyc。

按照惯例，基因以斜体书写而相应的蛋白以规则的字体书写。如，ackA为编码AckA或乙酸激酶A的基因。

如本文所用，+是指过度表达的酶活性，意指至少150%的野生型活性，且优选为200%、500%、1000%或更多。过度表达的活性可以通过上调内源性基因、去除抑制物、加入编码具有高Km的酶的基因或优选地通过在可控制的启动子下加入基因来实现。

符号Δ（delta）意指活性为不可检测的或不显著的。基因活性可以通过使用终止突变、缺失、移码突变等变得不可检测。

参考本文“活性”意指参考蛋白或编码该蛋白的基因的酶活性。

降低的活性意指与在该基因座的野生型相比酶活性水平减少至少75%。

本发明一般涉及通过引入羧基和/或醇基由反向β氧化产生的产物的α和ω(omega)碳的官能化。这继而将产生ω-羟基化羧酸、ω-羧化正醇、二羧酸、二醇和以下α-羟基化衍生物:α-羟基化和ω-羧化正醇、α-羟基化二羧酸和l,2,n-三醇。

在所有情况下，可以获得不同链长的产物：即根据循环圈数的数目，在不同长度的α和ω末端之间具有内部/间隔链的产物并根据对于其合成用作前体的β-氧化中间体，含有不同的官能度的产物。后者包括β碳中的羟基或酮基和α,β不饱和性。

在本发明中使用两种一般方法以将α和ω碳官能化：

i)使用具有官能化ω碳连同能够对ω-官能化的硫酯中间体起作用的β-氧化和终止酶的适当的组的引物或起始子以及

i)官能化β-氧化循环的工程化逆转的中间体或产物的α/ω碳。在β-氧化循环的工程化逆转的中间体已经通过适当的终止酶转化成羧酸和正醇之前或之后可以发生后者。应表达在必需的α/ω-官能化途径中起作用的酶连同必需的β-氧化和终止酶。

一组潜在的引物和产物(连同示例性的基因型)提供为表3A-B以及其它可能性提供在表4A-E中。

附图简述

图1.能够使用ω-羧化(A)、ω-羟基化(B)和ω-胺化(C)引物或起始分子的天然的和工程化硫解酶。然后所得ω-羧化、ω-羟基化和ω-胺化酮-酰基-CoA在β-氧化逆转中经历还原和脱水步骤并支持ω-羟基化、ω-羧化和ω-胺化正醇和羧酸的合成。(1)表明能够使用草酰-CoA、丙二酰-CoA和琥珀酰-CoA作为引物或起始分子的天然的或工程化硫解酶。以下3-氧代己二酰-CoA硫解酶[EC:2.3.1.16/EC:2.3.1.174]为此类酶的实例并在芳香族化合物的降解期间催化3-氧代己二酰-CoA至琥珀酰-CoA和乙酰-CoA的可逆转化：大肠杆菌PaaJ(Mascaraque等人,2010,PNAS107:14390-14395;Nogales等人,2007,Microbiology153:357-365)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)菌株B13CatF(Gobel等人,2002,J.Bacteriol.184:216-223)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)PcaF和CatF(Eulberg等人,1998,J.Bacteriol.180:1072-1081)和链霉菌属(Streptomyces sp.)2065PcaF(Iwagami等人,2000,Appl.Environ.Microbiol.66:1499-1508)。(2)表明能够使用羟基乙酰-CoA、3-羟基丙酰基-CoA和4-羟基丁酰基-CoA作为引物或起始分子的天然的或工程化硫解酶(3)表明能够使用2-氨基乙酰-CoA、3-氨基丙酰基-CoA和4-氨基丁酰基—CoA作为引物或起始分子的天然的或工程化硫解酶。除了在以上(1)中列出的那些酶，示出将酰基-CoA分子与乙酰-CoA缩合的若干天然的β-酮硫解酶[EC:2.3.1.9]可以潜在的催化以上反应(1、2或3)，诸如大肠杆菌AtoB(Sato等人,2007,J.Biosci.Bioeng.103:38-44)、YqeF和FadA(Dellomonaco等人,2011,Nature476,355-359)、Ralstonia eutropha PhaA(Sato等人,2007,J.Biosci.Bioeng.103:38-44)和BktB(Slater等人,1998,J Bacteriol.180:1979-1987)以及丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ThlA和ThlB(Winzer等人,2000,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2:531-541)。另外，已经示出BktB将乙酰-CoA和丙酰-CoA进行缩合以及另外已用于将一些官能化(ω-羟基化)的CoA分子与乙酰-CoA(W02010101651)进行缩合。

图2.能够使用非-末端/仲碳官能化的化合物诸如分支的、羟基化或胺化官能化分子作为引物或起始分子的天然的和工程化硫解酶。然后所得官能化酮-酰基-CoA在β-氧化逆转中经历还原和脱水步骤并支持非-末端/仲碳官能化正醇和羧酸的合成。(1)表明能够使用非-末端/仲碳化合物诸如异丁酰-CoA、3-甲基-丁酰基-CoA、2-羟基丙酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA和2-氨基丙酰基-CoA作为引物或起始分子的天然的或工程化硫解酶。在图1中所列的硫解酶为进行这些缩合反应的所有可能的候选物。

图3.ω-羧化酰基-CoA草酰-CoA、丙二酰-CoA和琥珀酰-CoA的合成，然后其可以在在反向β-氧化循环中充当引物。数字表明催化指定转化的酶。(1)碳利用和糖分解途径；(2)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶[EC:4.1.1.31]或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶[EC:4.1.1.49]或丙酮酸羧化酶[EC:6.4.1.1]；(3)苹果酸脱氢酶[EC:1.1.1.37]；(4)乙酰-CoA：乙醛酸C-乙酰基转移酶(硫酯-水解，羧甲基-形成)/L-苹果酸乙醛酸裂解酶(CoA-乙酰化)[EC:2.3.3.9]；(5)乙醛酸：氧化还原酶/乙醛酸氧化酶(乙醛酸+氧+H2O=过氧化氢+草酸+H+)[EC:1.2.3.5]；(6)富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)草酰乙酸乙酰水解酶，oahA(草酰乙酸+H2O—>草酸+乙酸+H+)[EC:3.7.1.1]；(7a)乙醛酸：NADP+氧化还原酶(CoA-草酰化(CoA-oxalylating))(乙醛酸+CoA+NADP+<=>草酰-CoA+NADPH+H+)[EC:1.2.1.17]；(7b)草酸含铜菌(Cupriavidusoxalaticus)琥珀酰-CoA:草酸CoA-转移酶(草酸+琥珀酰-CoA—>草酰-CoA+琥珀酸盐)[EC:2.8.3.2]；(7c)大肠杆菌或产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)甲酰-CoA转移酶，frc(甲酰-CoA+草酸—>甲酸+草酰-CoA)[EC:2.8.3.16];(7d)草酰-CoA合成酶(草酸+ATP+辅酶A=草酰-CoA+二磷酸+AMP)[EC:6.2.1.8]；(8)富马酸酶[EC:4.2.1.2]；(9)FADH2-/NADH/泛醌/甲基萘醌-依赖的富马酸还原酶[EC:1.3.99.1/EC:1.3.1.6/EC:1.3.5.4]；(10)琥珀酰-CoA合成酶/连接酶(ATP+琥珀酸+CoA<=>ADP+正磷酸+琥珀酰-CoA)[EC:6.2.1.5]，琥珀酰-CoA:乙酰乙酸CoA-转移酶(琥珀酰-CoA+乙酰乙酸<=>琥珀酸+乙酰乙酰-CoA)[EC:2.8.3.5]；(11)丙酮酸盐脱氢酶复合体[EC:1.2.4.1]，丙酮酸甲酸裂解酶[EC:2.3.1.54]，丙酮酸：黄素氧还蛋白/：铁氧还蛋白氧化还原酶.[EC:1.2.7.1]；(12a)乙酰-CoA:二氧化碳连接酶(ATP+乙酰-CoA+HCO3-<=>ADP+正磷酸+丙二酰-CoA)[EC:6.4.1.2]；(12b)丙二酰-CoA:丙酮酸羧基转移酶(丙二酰-CoA+丙酮酸盐<=>乙酰-CoA+草酰乙酸)[EC:2.1.3.1];(13)苹果酸酶[EC:1.1.1.40/EC:1.1.1.38]和苹果酸脱氢酶((S)-苹果酸+NAD+/NADP+<=>草酰乙酸+NADH/NADPH+H+)[EC:1.1.1.37/EC:1.1.1.82]。由草酰-CoA、丙二酰-CoA和琥珀酰-CoA与乙酰-CoA的缩合产生的ω-羧化酮-酰基-CoA在b-氧化逆转中经历还原和脱水步骤产生ω-羧化中间体，这继而支持ω-羧化正醇和羧酸的合成。

图4.由羟基乙酰-CoA和4-羟基丁酰基-CoA引物合成ω-羟基化酰基-CoA。数字表明催化指定转化的酶。(1)酶催化碳-利用和糖分解途径；(2)D-甘油酸-3-磷酸磷酸水解酶(3-磷-D-甘油酸+H2O<=>D-甘油酸+正磷酸)[EC:3.1.3.38]；(3)甘油-3-磷酸脱氢酶[EC:1.1.1.8/1.1.1.94]和甘油-3-磷酸酶[EC:3.1.3.21](具有甘油-3-磷酸中间体的两步)；(4)甘油:NAD+/NADP+氧化还原酶(甘油+NAD+/NADP+<=>D-甘油醛+NADH/NADPH+H+)[EC:1.1.1.21/EC:1.1.1.72]；(5)D-甘油醛:NAD+氧化还原酶(D-甘油醛+NAD++H2O<=>D-甘油酸+NADH+H+)[EC:1.2.1.3]或甘油醛铁氧还蛋白氧化还原酶(D-甘油醛+H2O+氧化的铁氧还蛋白<=>D-甘油酸+H++还原的铁氧还蛋白)[EC:1.2.7.5]；(6)D-甘油酸:NAD+/NADP+2-氧化还原酶(D-甘油酸+NAD+/NADP+<=>羟基丙酮酸盐+NADH/NADPH+H+)[EC:1.1.1.29/EC:1.1.1.81]；(7)丙酮酸盐脱氢酶复合体，PDHC(羟基丙酮酸盐+NAD++CoA—>羟基乙酰-CoA+NADH+CO2):来自豌豆叶绿体的PDHC显示出羟基丙酮酸上的活性(Camp和Randal,1985,Plant Physiol.77:571-577)；(8)羟基丙酮酸羧基裂解酶(羟基丙酮酸<=>乙醇醛+CO2)[EC:4.1.1.40];(9)乙醇醛:NAD+氧化还原酶(乙醇醛+NAD++H2O<=>乙醇酸+NADH+H+)[EC:1.2.1.21];(10)工程化乙醛酸:NADP+氧化还原酶，琥珀酰-CoA:草酸CoA-转移酶，甲酰-CoA转移酶或草酰-CoA合成酶以将乙醇酸用作底物(乙醇酸+ATP+CoA—>羟基乙酰-CoA+ADP)；(11)常见的糖分解步骤；(12)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶[EC:4.1.1.31]或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶[EC:4.1.1.49]或丙酮酸羧化酶[EC:6.4.1.1]；(13)苹果酸脱氢酶[EC:1.1.1.37]；(14)乙酰-CoA：乙醛酸C-乙酰转移酶(硫酯-水解，羧甲基-形成)/L-苹果酸乙醛酸-裂解酶(CoA-乙酰化)[EC:2.3.3.9]；(15)乙醛酸还原酶:ghrB(大肠杆菌(Escherichia coli)K-12substr.MG1655)；乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸盐还原酶：ghrA(大肠杆菌K-12substr.MG1655)(乙醛酸+NADPH—>乙醇酸+NADP)[EC:1.1.1.79]；(16)苹果酸:NAD/NADP脱氢酶[EC:1.1.1.37/EC:1.1.1.299]；(17)FADH2-/NADH/泛醌/甲基萘醌-依赖的富马酸还原酶[EC:1.3.99.1/EC:1.3.1.6/EC:1.3.1.5/EC:1.3.1.4]；(18)琥珀酰-CoA合成酶/连接酶(ATP+琥珀酸+CoA<=>ADP+正磷酸+琥珀酰-CoA)[EC:6.2.1.5]，琥珀酰-CoA:乙酰乙酸CoA-转移酶(琥珀酰-CoA+乙酰乙酸<=>琥珀酸+乙酰乙酰-CoA)[EC:2.8.3.5];(19)琥珀酸-半醛:NADP+氧化还原酶(琥珀酰-CoA+NADPH+H+<=>琥珀酸半醛+NADP++CoA)[EC:1.2.1.76]；(20)4-羟基丁酸酯:NAD+氧化还原酶(4-羟基丁酸+NAD+<=>琥珀酸半醛+NADH+H+)[EC:1.1.1.61]或琥珀酸半醛还原酶(NADPH)(4-羟基丁酸+NADP+<=>琥珀酸半醛+H++NADPH)[EC:1.1.1.-]；(21)4-羟基丁酸：CoA连接酶(AMP-形成)(4-羟基丁酸+ATP+CoA<=>4-羟基丁酰基-CoA+AMP+二磷酸)[EC:6.2.1.-]或乙酰-CoA:4-羟基丁酸酯CoA转移酶(4-羟基丁酸+乙酰-CoA<=>4-羟基丁酰基-CoA+乙酸)[EC:2.8.3.-]。由羟基乙酰-CoA和4-羟基丁酰基-CoA与乙酰-CoA缩合产生的ω-羟基化酮-酰基-CoA在b-氧化逆转中经历还原和脱水步骤以产生ω-羟基化中间体，这继而支持ω-羟基化正醇和羧酸的合成。

图5.由3-羟基丙酰基-CoA引物合成ω-羟基化酰基-CoA。数字表明催化指定转化的酶。(1)酶催化碳-利用和糖分解途径；(2)D-乳酸盐脱氢酶[EC:1.1.1.28]；(3)乳酰-CoA:丙酸CoA-转移酶(乳酰-CoA+丙酸<=>(S)-乳酸+丙酰-CoA)[EC:2.8.3.1]或丙酸CoA-转移酶(乳酰-CoA+乙酸<=>(S)-乳酸+乙酰-CoA)[EC:2.8.3.1]；(4)乳酰-CoA水裂解酶(乳酰-CoA<=>丙烯酰-CoA+H2O)[EC:4.2.1.54]；(5)3-羟基丙酰基-CoA水裂解酶(3-羟基丙酰基-CoA<=>丙烯酰-CoA+H2O)[EC:4.2.1.116]；(6)甘油脱水酶(甘油—>3-羟基丙醛+H2O)[EC:4.2.1.30]；(7)γ-谷酰基-γ-氨基丁醛脱氢酶(3-羟基丙醛+NAD++H2O—>3-羟基丙酸+2H+)[EC:1.2.1.-];(8)3-羟基丙酸:Co A连接酶(AMP-形成)(3-羟基丙酰基-CoA+二磷酸+AMP<=>3-羟基丙酸+CoA+ATP)[EC:6.2.1.36]；(9)丙酮酸盐脱氢酶复合体[EC:1.2.4.1]，丙酮酸甲酸裂解酶[EC:2.3.1.54]，丙酮酸:黄素氧还蛋白/:铁氧还蛋白氧化还原酶[EC:1.2.7.1]；(10a)乙酰-CoA:二氧化碳连接酶(ATP+乙酰-CoA+HCO3-<=>ADP+正磷酸+丙二酰-CoA)[EC:6.4.1.2]；(10b)丙二酰-CoA:丙酮酸羧基转移酶(丙二酰-CoA+丙酮酸<=>乙酰-CoA+草酰乙酸)[EC:2.1.3.1]；(11)苹果酸酶[EC:1.1.1.40/EC:1.1.1.38]和苹果酸脱氢酶((S)-苹果酸+NAD+/NADP+<=>草酰乙酸+NADH/NADPH+H+)[EC:1.1.1.37/EC:1.1.1.82]；(12)丙二酰CoA还原酶(丙二酸半醛形成)(CoA-丙二酰化)(丙二酸半醛+辅酶A+NADP+=丙二酰-CoA+NADPH+H+)[EC:1.2.1.75]；(13)3-羟基丙酸:NADP+氧化还原酶(3-羟基丙酸+NAD+/NADP+<=>3-氧代丙酸+NADH/NADPH+H+)[EC:1.1.1.59/EC:1.1.1.298];(14)(3)甘油-磷酸脱氢酶[EC:1.1.1.8/1.1.1.94]和甘油-3-磷酸酶[EC:3.1.3.21](具有甘油-3-磷酸中间体的两步)。由3-羟基丙酰基-CoA与乙酰-CoA的缩合产生的5-羟基3-氧代-戊酰基-CoA在b-氧化逆转中经历还原和脱水步骤以产生奇数链ω-羟基化中间体，这继而支持奇数链ω-羟基化正醇和羧酸的合成。

图6.由使用ω氧化(A)和α氧化(B和C)途径的β-氧化逆转获得的羧酸和醇的α-和ω-官能化。数字表明催化指定转化的酶。(1)脂肪酸，还原的红素氧还蛋白：氧氧化还原酶(ω-羟基化)(脂肪酸+氧+还原的红素氧还蛋白<=>ω-羟基脂肪酸+氧化的红素氧还蛋白+H2O)[EC:1.14.15.3]或ω-羟化酶/烷烃，还原的-红素氧还蛋白：氧1-氧化还原酶(烷烃+还原的红素氧还蛋白+氧<=>氧化的红素氧还蛋白+伯醇+H2O)[EC:1.14.15.3];(2)伯_醇:NAD+氧化还原酶(伯醇+NAD+/NADP+/O2/受体<=>醛+NADH/NADPH/H2O2/还原的受体+H+)[EC:1.1.1.1/EC:1.1.1.71/EC:1.1.3.13/EC:1.1.99.20]；(3)醛:(吡咯并喹啉-醌)氧化还原酶(醛+受体/NAD+/NADP++H2O=羧酸+还原的受体/NADH/NADPH)[EC:1.2.99.3/6/7/EC:1.2.1.3//EC:1.2.1.5]；(4)脂肪酸，还原的-黄素蛋白:氧氧化还原酶(RH-羟基化或-环氧化)(还原的黄素蛋白+脂肪酸+氧<=>α-羟基脂肪酸+氧化的黄素蛋白+H2O)[EC:1.14.14.1]。

图7.由β-氧化逆转获得的酰基-CoA中间体和羧酸的胺-官能化。“R”基团表示由b-氧化逆转获得的其它碳长和官能团。数字表明催化指定转化的酶。(1)硫酯酶[EC:3.1.2.-]诸如大肠杆菌TesA、TesB、YciA、FadM、YdiI、YbgC、PaaI和YbdB；(2)CoA-依赖的醛脱氢酶[EC:1.2.1.-]诸如来自醋酸钙不动杆菌的脂肪酰基-CoA还原酶(Reiser和Somerville,1997,J.Bacteriol.179:2969-2975)，和不动杆菌属属(Acinetobacter sp.)菌株M-l(Ishige等人,2002,Appl.Environ,Microbiol.68:1192-251195)，和来自梭状芽孢杆菌的sucD基因(Sohling和Gottschalk,1996,J.Bacteriol.178:871-880)；(3)羧酸还原酶(CAR)/醛脱氢酶[EC:1.2.99.6/7]或醛氧化还原酶[EC:1.2.7.5]诸如来自诺卡式菌属(Nocardia sp.)NRRL5646的CAR(Venkitasubramanian等人,2008,Enzyme Microb.Technol.42:130-137)；和(4)转氨酶[EC:2.6.1-]诸如来自大肠杆菌的γ-氨基丁酸转氨酶(Bartsch等人,1990,J.Bacteriol.172:7035-7042)、小家鼠(Cooper,1985,Methods Enzymol.113,80-82)、荧光假单胞菌(Scott和Jacoby,1959,J.Biol.Chem.234,932-936)和灰色链霉菌(Yonaha等人,1985,Eur.J.Biochem.146:101-106)或来自诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(Heydari等人,2004,Appl.Environ.Microbiol.70,937-942)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(Hashimoto等人,1989,Agric.Biol.Chem.53,1175-1176)和反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)(Ruldeekulthamrong等人,2008,BMB Rep.790-795)的生物体的赖氨酸-6-脱氢酶[EC:1.4.1.18].

图8.反向β氧化循环：将具有4-C羧酸的β-氧化循环的一圈官能化逆转作为代用品用于产物合成。核心途径酶以虚线圈出，具有由每个循环中间体产生羧酸形成的硫酯酶终止途径。多圈循环牵涉末端酰基-CoA分子(来自一圈逆转的丁酰-CoA)与乙酰-CoA的缩合，产生2个碳的伸长。

图9.对于β-氧化逆转的各个组分的体内组装的重排宿主代谢。(a)在野生型大肠杆菌MG1655和具有对照载体pTHA和pZSBlank以及具有硫解酶(AtoB)过度表达的JC01的工程菌株JC01(MG1655ΔldhAΔpoxBΔptaΔadhEΔfrdA)中甘油的消耗和产物的合成。(b)在JC01，即JC01(pTHatoB pZSBlank)中在硫解酶过度表达时产生的4-C羧酸的分布。基因过度表达由质粒名称显而易见(即pTHatoB表达的atoB)。

图10.硫解酶过度表达和终止途径操作的影响(a)在JC01中当硫解酶(AtoB)过度表达与硫酯酶过度表达组合后的4-C羧酸和丙酮产生(b)在JC01中容纳具有天然的3-羟酰-CoA脱氢酶(FadB)或硫酯酶染色体缺失的pTHatoB和pZSBlank的4-C羧酸和丙酮产生。基因过度表达由质粒名称显而易见(即pZStesA表达的tesA)。“Δ基因”表示基因缺失。

图11.一圈β-氧化逆转的硫解酶、3-羟基乙酰-CoA脱氢酶和烯酰-CoA水合酶组分的体内组装。(a)在具有AtoB和FadB表达结合硫酯酶过度表达的JC01中的4-C羧酸和乙酸盐产生。(b)在容纳pTHatoB.fadB和pZSBlank的宿主菌株中天然的硫酯酶染色体缺失对4-C羧酸和丙酮产生的影响。基因过度表达由质粒名称显而易见(即pZStesA表达的tesA)。“Δ基因”表示基因缺失。

图12.在全部一圈β-氧化逆转的体内组装期间，候选的酰基-CoA脱氢酶/反式-烯酰-CoA还原酶的功能评估。在宿主菌株中具有AtoB和FadB过度表达结合天然的酰基-CoA脱氢酶(fadE，ydiO)染色体删除缺失或酰基-CoA脱氢酶/反式-烯酰-CoA还原酶(egTER)表达的(S)-3-羟基丁酸和丁酸产生。基因过度表达由质粒名称显而易见(即pTHatoB.fadB.egTER表达的atoB、fadB和egTER)。“Δ基因”表示基因删除缺失。

图13.具有功能的全部一圈β-氧化逆转的终止途径操作。(a)在JC01中在硫解酶(AtoB)、3-羟基乙酰-CoA脱氢酶(FadB)、烯酰-CoA水合酶(FadB)和反式-烯酰-CoA还原酶(egTER)表达(即pTHatoB.fadB.egTER)经由可控制的构建体结合硫酯酶过度表达后甘油消耗、丁酸和乙酸产生，(b)在容纳具有天然的硫酯酶染色体删除缺失的pTHatoB.fadB.egTER和pZSBlank的JC01中甘油消耗和丁酸产生。基因过度表达由质粒名称显而易见(即pTHatoB.fadB.egTER表达的atoB、fadB和egTER)。“Δ基因”表示基因缺失。.

图14.在β-氧化循环的功能性逆转期间运行多个循环圈数用于合成较长链产物。在用于全部一圈逆转(pTHatoB pZSfadB.egTER)和包含长链特定硫解酶FadA(pTHatoBpZSfadBA.egTER)的功能性单元表达之后通过JC01的细胞外脂肪酸产生的分布。C6，己(hexanoic)(己(caproic))酸；C8，辛(octanoic)(辛(caprylic))酸；C10，癸(decanoic)(癸(capric))酸；C12，十二烷(月桂)酸。基因过度表达由质粒名称显而易见(即pZSfadBA.egTER表达的fadB、fadA和egTER)。

图15.用于脂肪酸分解代谢的β-氧化循环。

图16A-C.使用在本发明中概述的不同引物和终止途径构建用于工程化β-氧化逆转的代表性表达载体。过度表达的基因由载体名称显而易见(即.fadB.fadE表达的atoB、fadB和fadE基因)以及每个基因的细节可见于代表性的表和整个说明书中。

发明详述

在本发明中使用两种一般方法以官能化α和ω碳：

i)使用具有官能化的ω碳的引物或起始子，或

ii)官能化β-氧化循环的工程化逆转的中间体或产物的α/ω碳。在β-氧化循环的工程化逆转的中间体通过适当的终止酶已经转化成羧酸和正醇之前或之后可以发生后者。

下面详述了这两种方法。

在β-氧化循环的工程化逆转中使用ω羟基化和ω羧化引物/起始分子：在β-氧化循环的工程化逆转中使用的“正常的/标准的”起始子/引物为乙酰-CoA，这导致偶数链正醇和羧酸(61/440,192)的合成。通过硫解酶也可将丙酰-CoA用作起始子单元/引物从而能够合成奇数链羧酸和正醇(Id.)。

经常在上述起始子/引物分子两者的ω末端(ω(omega)或ω为离脂肪酸的羧基最远的碳)发现甲基。然后通过β-氧化逆转使用具有ω羟基化或ω羧化碳(即官能化的ω末端)的起始子/引物分子将导致羧酸和醇的合成，所述β-氧化逆转将含有官能化的ω末端：如，ω-羟基化的羧酸、ω-羧化的正醇、二羧酸和二醇。

使用ω-羟基化和ω-羧化起始子/引物分子需要：i)将其用作底物以引发β-氧化循环的逆转的天然的或工程化硫解酶(图1)，和ii)这些引物的代谢合成/产生(图2-4)。

在一个方面，本发明包括具有两个单独的硫解酶：对于所需的引物/起始分子具有高亲和力的短链硫解酶/酰基转移酶(具有所需性质或工程化AtoB/YqeF天然酶)(图1)和具有广泛链长特异性的硫解酶(如β-氧化复合体FadBA和FadJI)(61/440,192)。

在一些情况下，将需要把YqeF/AtoB工程化以获得比乙酰-CoA优先的羟基乙酰-CoA、羟基丙酰基-CoA、羟基琥珀酰-CoA、草酰-CoA、丙二酰-CoA或琥珀酰-CoA作为引物/起始分子的突变体。

这些硫解酶中的一些已经在自然界中为可获得的；例如大肠杆菌PaaJ(Mascaraque等人,2010,PNAS107:14390-14395;Nogales等人,2007,Microbiology153:357-365)、假单胞菌属菌株B13CatF(Gobel等人,2002,J.Bac.184:216-223)、混浊红球菌PcaF和CatF(Eulberg等人,1998,J.Bacteriol.180:1072-1081)和链霉菌属，PcaF(Iwagami等人,2000,Appl.Environ.Microbiol.66:1499-1508)为3-氧代己二酰-CoA硫解酶，其在芳香族化合物的降解期间催化3-氧代己二酰-CoA至琥珀酰-CoA和乙酰-CoA的可逆转化并因此可以将琥珀酰-CoA用作引物/起始分子。

将支持上述ω-羧化和ω-羟基化引物/起始分子的合成的代谢途径示于图2-4并简要的描述于下文：

ω羧化引物—草酰-CoA、丙二酰-CoA或琥珀酰-CoA：将丙二酰-CoA用作起始子/引物分子将支持奇数链二羧酸和ω-羧化正醇的合成。将草酰-CoA和琥珀酰-CoA用作引物/起始分子将支持偶数链二羧酸和ω-羧化正醇的合成。

图3示出获得草酰-CoA、丙二酰-CoA或琥珀酰-CoA的工程化途径。本策略将使用在与乙酰-CoA的缩合反应中能够将草酰-CoA、丙二酰-CoA或琥珀酰-CoA用作引物/起始分子的工程化硫解酶(图1A)。将使用工程化AtoB或YqeF以起始循环，然后FadBA和YdiO-YdiQRST将在所有循环圈数的其它步骤中起作用。

ω羟基化引物—羟基乙酰-CoA、羟基丙酰基-CoA和羟基琥珀酰-CoA：将羟基乙酰-CoA和羟基琥珀酰-CoA用作起始子/引物分子将导致偶数链l,n-二醇和ω-羟基化羧酸的合成。图3示出工程化途径以获得这些ω-羟基化酰基-CoA。将羟基丙酰基-CoA用作起始子/引物分子将导致奇数链l,n-二醇和ω-羟基化羧酸的合成。

图4示出工程化途径以获得羟基丙酰基-CoA。本发明的部分的两个关键方面为：i)天然的或工程化酰基-CoA连接酶以由羟基乙酸/乙醇酸产生羟基乙酰-CoA，以及ii)优先地将羟基丙酮酸转化成羟基乙酰-CoA(而不是将丙酮酸转化成乙酰-CoA)的天然的或工程化丙酮酸脱氢酶。

就硫解酶反应而言，将使用在与乙酰-CoA的缩合反应中能够将羟基乙酰-CoA、羟基丙酰基-CoA和羟基琥珀酰-CoA用作引物/起始分子的工程化硫解酶(图1B)。例如，将使用工程化AtoB或YqeF以起始循环然后FadBA和YdiO-YdiQRST将在所有循环圈数的其它步骤中起作用。

使用ω-氧化途径的ω碳的官能化：烷烃和长链脂肪酸通过工业上重要的酵母菌和细菌使用ω-氧化途径(用于中链脂肪酸的较小途径)进行代谢。在ω碳处的甲基首先被氧化成羟基，然后成氧代基团，最后成羧基。然后衍生自ω-氧化的长链二羧酸酯进入β-氧化循环用于进一步降解。使用下述分子中的一者作为引物/起始子将这些酶用于本发明以官能化在β-氧化逆转中产生的羧酸和正醇的ω碳：乙酰-CoA、羟基乙酰-CoA、羟基丙酰基-CoA、羟基琥珀酰-CoA、草酰-CoA、丙二酰-CoA或琥珀酰-CoA。官能化牵涉在ω碳中引入羟基、醛或羧基。

ω氧化作为关键的途径：将ω甲基氧化成醇(1步，产生羟基末端)或羧酸(由羟基至氧代至羧基的2步，产生羧化末端)。ω氧化酶将作用于由硫酯酶和醛形成酰基-CoA还原酶以及醇脱氢酶分别作用于β-氧化逆转的不同的中间体产生的羧酸或醇的ω碳。

在本发明的部分使用的三个酶促步骤概述于下文并示于图5A：

1.羟基化(ω-羟基化)：

●脂肪酸+2NADPH+O2—>ω-羟基脂肪酸+2NADP+H2O

○长链脂肪酸ω-羟化酶：CYP704B1(阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)col)

●月硅酸+NADPH/NADH+O2—>ω-羟基月硅酸+NADP/NAD+H2O

○月硅酸单加氧酶(菊芋(Helianthus tuberosus))NADPH-依赖型

○月硅酸单加氧酶：IMT-2(矮牵牛(Petunia x hybrida))NADPH-依赖型

○月桂酸脱羟基酶:CYP76J1(矮牵牛)NADPH-依赖型

○月硅酸ω-羟化酶(豌豆(Pisum sativum))：NADH-依赖型

●脂肪酸+2NADPH+氧<=>链内羟基脂肪酸+2NADP++H2O

P450羟化酶的许多其它实施例提供于：Pinot F,Beisson F.(2011).Cytochrome P450metabolizing fatty acids in plants:characterization and physiological roles.FEBS J,278(2),195-205.

2.醇氧化

●ω-羟基脂肪酸+O2—>ω-氧代脂肪酸+H2O2

○ω-羟基脂肪酸氧化酶：AtFA03(阿拉伯芥col)

○ω-羟基脂肪酸氧化酶：fao2(阴沟假丝酵母(Candida cloacae))

○ω-羟基脂肪酸氧化酶：fao1(阴沟假丝酵母)

3.酮氧化

●ω-氧代脂肪酸+NAD—>二羧酸+NADH

能够进行本酶促步骤的代表性的醛氧化还原酶提供于以下参考文献：Hommel R和Kleber HP1984.FEMS Microbiol.Lett.22,139-142;Shinagawa E,Toyama H,Matsushita K,Tuitemwong P,Theeragool G,Adachi O.2006.Biosci.Biotechnol.Biochem.70:850-857;Groen B,Frank J,Duine JA.1984.Biochem.J.223:921-924;Zamt G,T,AndreesenJR.2001J.Bacteriol.183:1954-1960。

使用α-氧化途径的α碳的官能化:α氧化(α-氧化)为一种过程，其中某些脂肪酸通过从羧基末端去除单独碳进行分解。由于3-甲基脂肪酸不能通过β-氧化循环降解，末端羧基首先通过α-氧化去除。

在α-氧化途径中涉及的酶促步骤已经在别处进行了报道(Jansen和Wanders:Biochimica et Biophysica Acta1763(2006)1403-1412，还可参见en.wikipedia.org/wiki/Αlpha_oxidation)。已经对植烷酸的α-氧化进行了详细地调查。途径牵涉首先植烷酸至植烷酰-CoA的活化，然后由植烷酰-CoA羟化酶(PhyH/Pahx)的植烷酰-CoA的2-羟基化以形成2-羟基植烷酰-CoA。

来自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)(MXAN_0191)和橙色标桩菌(Stigmatellaaurantiaca)(STIAU_3334)的脂肪酸α羟化酶(Ring MW,Schwar G,Bode HB.2009.ChemBioChem10:2003-20)表示用于在由β-氧化循环的逆转产生的产物上进行α羟基化的候选酶

发明理论

近年来由于对能够由再生材料产生先进(长链)燃料和化学品的新技术发展的增长的需求，能够使碳链伸长的生物系统的开发和工程化已经获得了重要的关注^1-4。尽管使用脂肪酸生物合成途径已经吸引了大部分的注意力^5-7，最近β-氧化循环的工程化逆转作为用于合成不同碳长和官能度的醇和羧酸的代谢平台示出极大的希望⁸。与脂肪酸生物合成途径相比，本途径用辅酶A(CoA)中间体操作并直接使用乙酰-CoA用于酰基-CoA链伸长，特征在于能够以最多的碳和能源效率进行产物合成⁸。

我们先前对在大肠杆菌中构建β-氧化循环的功能性逆转的工作专注于自上而下/系统级策略，所述策略涉及若干总体调控子的操作⁸。使得FadR无功能的突变结合AtoSC双组分调节系统在细胞质响应调控子AtoC中的突变使得在β-氧化循环中所有酶在不存在其天然底物(脂肪酸)的情况下组成型表达⁸。由于编码β-氧化循环酶的若干操纵子也通过环-AMP(cAMP)受体蛋白(CRP)-cAMP复合体来激活并且因此通过存在替代碳源进行抑制，我们用赋予去阻遏表型的cAMP非依赖性突变体(crp*)替换天然的crp基因。最后，由于在燃料和化学品的产生中使用的厌氧/微需氧条件将导致ArcA-介导的编码β-氧化循环的大多数操纵子的抑制，所以缺失arcA基因⁸。

然后这些系统级的操作结合一小组局部干扰(天然发酵途径的消除和选定的终止途径的表达)以实现所需产物的合成。由于工程化途径的各个组分的不明确的性质，所以本系统级方法尽管有效，但是具有某些局限性。这继而限制了有效地操作此类各个组分至微调特定产物合成的能力并防止工程化途径至其它宿主生物体的转移(即在其它宿主中将需要“等价的”全局调节子以实施β-氧化循环的功能性逆转)。

为了克服这些局限，此处采取的方法集中于合成生物学策略，其中靶途径由定义明确的和独立的功能性单元构建，所述功能性单元可以以不同的组合装配以实现众多种产物的合成。本自下而上法意味着有效的设计通过预定义的组分或结构单元(即组成该途径的每个功能性单元/酶)的组装产生⁹。因此，β-氧化循环的功能性逆转的重建可以在不含工程化全局调节子的情况下实现并且因此产生可以容易地转移至其它宿主/生物体的“干净的”平台。

以上方法的实施需要i)途径的各个组分的体内动力学特征，和ii)功能性途径的体内组装和特征。为此，将针对各个功能性单元包含核心途径的硫解酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、烯酰-CoA水合酶/3-羟酰-CoA脱水酶和酰基-CoA脱氢酶/反式-烯酰-CoA还原酶元件的合适的酶(图8)通过体内动力学特征纯化并测试。我们初始把我们的努力集中于将β-氧化循环的一圈逆转作为基本平台但是选定的酶也可以充当多圈循环逆转的功能性组分。

尽管这四种主要组分涵盖β-氧化循环的全部逆转，但是产物合成还需要终止途径至模块化框架的整合。为了构建将每个核心单元的功能性评估提供为途径，选定并利用能够将每个CoA途径中间体转化成其各自的羧酸对应物的硫酯酶作为终止途径。本方法能够使用羧酸作为代用品用于产物合成(如在β-氧化循环的功能性一圈逆转期间产生的4-C羧酸)。

一旦得到鉴定和表征，进行核心途径的每个功能性单元的组装和体内特征。由于其用于工业生物燃料和生化产量¹⁰以及作为用于合成生物学应用的底盘的有利特性9，我们选定大肠杆菌作为初始的底盘用于途径组装。此外，为了显示功能性组分的非依赖原料的性质(即仅需要由给定的碳源产生乙酰-CoA)，选定甘油作为碳源。最后，将大肠杆菌的新陈代谢通过局部干扰和每个单独组分的模块化组装进行重编程和调整用于合成4-C和较长链产物。本重建途径通过工程化引发(使用不同的引物)和终止(使用不同的终止途径)步骤现可用于合成宽范围的产物，如本发明所述。

反向β氧化

β-氧化循环的功能性逆转在每循环的运行中产生酰基-CoA中间体的两碳的伸长。本代谢过程需要用于核心途径功能的4个关键组分的整合：i)催化乙酰-CoA与酰基-CoA的缩合产生酮酰基-CoA的硫解酶；ii)将酮酰基-CoA还原至羟酰-CoA的羟基乙酰-CoA脱氢酶；iii)由羟基乙酰-CoA产生反式烯酰-CoA的烯酰-CoA水合酶/3-羟酰-CoA脱水酶；和iv)将反式-烯酰-CoA还原至比初始的酰基-CoA长两个碳的酰基-CoA的酰基-CoA脱氢酶/反式-烯酰-CoA还原酶(图8)。

以其最简单的形式，经一圈逆转，这些反应产生初始的乙酰-CoA分子至丁酰基-CoA的伸长。除了上述组分之外，产物合成还需要能够将每个CoA途径中间体转化成所需产物的终止途径的整合。在此报道的工作中，我们使用硫酯酶以将CoA硫酯中间体转化成其各自的羧酸对应物(图8)。在下文中依次解决每个组分。

硫解酶

在脂肪酸的β-氧化中涉及的四种大肠杆菌硫解酶¹¹(atoB、yqeF、,fadA、fadI)可潜在地催化乙酰-CoA与不同链长的酰基-CoA的缩合。其中，已经对AtoB和FadA研究最多。AtoB短链酰基-CoA分子显示出较高特异性¹²,¹³，而FadA为对酰基-CoA底物具有广泛链长特异性的FadBA多酶复合体的部分¹⁴。

考虑到其充分研究的性质，AtoB和FadA被选定为最可行的硫解酶候选物且进一步进行体内特征以确保其在功能性β-氧化逆转的框架中的相容性。在纯化和动力学特征后，AtoB示出能有效地催化具有3.55×10³M^-1s^-1的kcat/KM的两个乙酰-CoA分子的缩合，示出其作为短链特定硫解酶组分用于起始一圈β-氧化逆转(表1)，并且因此引发多个圈数的循环的潜力。在另一方面，尽管在动力学特征期间具有FadA的底物饱和为不可能的，但是针对乙酰-CoA分子的缩合，估算的(参见方法)7.47M^-1s^-1的k_cat/K_M示出FadA对于本初始的缩合反应并不为可行的候选物(表1)。

重要的指出然而当认为具有较长链长中间体多个圈数的β-氧化循环的功能性逆转时，针对较长链酰基-CoA底物的广泛链长特异性的FadA14在通过AtoB初始引发循环之后可以传达促进具有单一酶的多个循环圈数的能力。还指出事实：AtoB和FadA两者似乎在分解代谢方向更有效(即将乙酰乙酰-CoA转化成2个乙酰-CoA分子)(表1)。这可适当地构成在组分的体内组装期间而无适当的驱动力的问题，诸如底物和产物的代谢物库的热力学驱动力¹⁵以确保有利于生物合成反应。

3-羟酰-CoA脱氢酶

三种大肠杆菌酶可以潜在地编码3-羟酰-CoA脱氢酶活性：两种羟酰-CoA脱氢酶(fadB和fadJ)，其参与脂肪酸的β-氧化¹¹，和参与苯基乙酸的降解的3-羟基己二酰-CoA脱氢酶(paaH)¹⁶。尽管参与降解途径，这三种酶催化可逆反应并且因此被认为为可行的候选物。

在潜在的候选物中，FadB（FadBA多酶复合体的第二成员）研究的最多且已经示出拥有具有广泛链长特异性的羟酰-CoA脱氢酶和烯酰-CoA水合酶活性¹⁷,¹⁸。考虑到这些活性均对于β-氧化循环的功能性逆转为必需的并且多个循环圈数将需要酶能够作用于不同碳长的中间体，FadB的这些关键特性使其成为用于体内特征的有前景的候选物。如表1中可见，纯化之后，FadB显示出有效的3-羟酰-CoA脱氢酶活性用于具有6.65×10⁴M^-1 _s ^-1的k_cat/K_M的乙酰乙酰-CoA的依赖NADH的还原，提供其包括为组分的整合组的成员的初始证据。

烯酰-COA水合酶.

在β-氧化反应中参与的烯酰-CoA水合酶家族的三个成员应能够用作3-羟基丁酰基-CoA脱水酶：参与脂肪酸的β-氧化的好氧(fadB)和厌氧(fadJ)烯酰-CoA水合酶¹¹，以及参与苯基乙酸降解的2,3-脱氢己二酰-CoA水合酶(paaF)¹⁶。尽管这些酶在降解途径中的主要作用，其催化的反应的可逆性质表明其对于羟酰-CoA的脱水的潜力。

先前选择FadB作为β-氧化循环的一圈逆转的3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶组分，本蛋白表示对烯酰-CoA水合酶(在一圈逆转的上下文中为3-羟基丁酰基-CoA脱水酶)的自然选择，如报道为编码羟酰-CoA脱氢酶和烯酰-CoA水合酶活性两者¹⁷,¹⁸。选择该酶也将提供使整合框架的必需组分的数目最小化的优势。

与3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶活性一样，评估了纯化的FadB针对3-羟基丁酰基-CoA脱水酶活性的动力学性质(表1)，并且为FadB能够在模块化框架中充当烯酰-CoA水合酶组分提供了丰富的证据。虽然底物饱和被证明为困难的，但是FadB确实显示出具有估算的(参见方法)3.19×10³M^-1s^-1的k_cat/K_M的必需的活性用于巴豆酰基-CoA的水合，证实了其在β-氧化循环的功能性逆转的体内组装期间充当关键组分的潜力。

酰基-COA脱氢酶/反式-烯酰-COA还原酶.

将两种β-氧化酶选择为可以潜在地催化循环的逆转的最后一步的酶：参与脂肪酸的好氧分解代谢的酰基-CoA脱氢酶(fadE)¹¹和在厌氧条件下提出为脂肪酸的β-氧化部分的预测的酰基-CoA脱氢酶(ydiO)¹⁹。

尽管有证据表明在某些条件下YdiO8和FadE20在巴豆酰基-CoA至丁酰基-CoA的还原中起作用，但是这些酶的复杂性使得其体内特征和体内组装/功能具有困难。YdiO与巴豆甜菜碱基-CoA还原酶CaiA共有高的同源性⁸，所述酶为催化巴豆甜菜碱基-CoA至γ-丁酰甜菜碱基-CoA还原的酶²¹，所述还原反应类似于在β-氧化循环的一圈逆转中巴豆酰基-CoA至丁酰基-CoA的还原。而且，编码需要电子至CaiA转移的黄素蛋白和铁氧还蛋白的fixABCX操纵子²²,²³与由ydiQRST操纵子编码的那些示出高的序列相似性⁸。

这表明正如CaiA、YdiO需要辅助性黄素蛋白和铁氧还蛋白用于在烯酰-CoA至酰基-CoA的还原期间进行电子的转移，使得其模块化组装和体内功能复杂化。对于使用这些酶的另一告诫为涉及铁氧还蛋白，所述蛋白在电子转移期间被氧化。还原的铁氧还蛋白将必须用其它反应再生以能够使电子转移并且因此β-氧化循环的全部功能性逆转的连续周转。为此目的，可以利用预测的丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶(ydbK)²⁴以将丙酮酸异化与铁氧还蛋白还原偶联，因此能够使连续的铁氧还蛋-辅助电子转移至烯酰-CoA还原步骤。

尽管酰基-CoA脱氢酶FadE不能催化铁氧还蛋白介导的还原，但是以其生理学方向(即脂肪酸的分解代谢)运行的酶通过黄素蛋白偶联至电子转移链且在β-氧化循环的分解代谢运行中被认为表示唯一不可逆的步骤¹¹。从标准的热力学意义上讲，使用FadE至电子转移链的直接偶联使得β-氧化循环的总体一圈功能性逆转变得不利⁸。尽管类似于YdiO的电子转移系统可以与FadE相容，使得反应在热力学上更加有利的，但是这增加与以上所述的针对YdiO的复杂性类似水平的复杂性。

考虑到上述YdiO和FadE的复杂性，在它们体内纯化和表征期间我们面临重要的挑战。在纯化后，用酶未测量到可检测的活性，尽管我们能够在表达它们的细胞的粗提物中测量它们的活性(表1)。这些结果可以反映对适当功能的辅助性酶的需求并对其在模块化框架中用作关键组分构成了潜在的挑战。

为了解决这些问题，我们使用来自光合鞭毛虫纤细眼虫(Euglena gracilis)(egTER)的反式-2-烯酰-CoA还原酶，示出经由依赖NAD(P)H的机制将在C4和C6烯酰-CoA中间体中的双键还原以产生酰基-CoA²⁵。本方法消除用于适当功能的辅助性和偶联酶的需求。

有趣的是，egTER为纤细眼虫的线粒体中厌氧代谢过程的关键酶，所述酶导致经由脂肪酸的非依赖丙二酰-CoA合成(后者等价于β-氧化循环的功能性逆转)来合成蜡酯²⁶。本线粒体的过程合成链长⁸-¹⁸的产物，表明egTER能够催化不同链长的烯酰-CoA分子的还原²⁶,²⁷。考虑到egTER作为类似于β-氧化循环的逆转及其广泛链长特异性的核心过程的功能性单元的生理学作用，将该酶包括在我们的设计中拥有很大的希望。egTER的纯化和体内特征进一步显示该酶作为还原含有NADH作为辅因子的巴豆酰基-CoA以1.16×10⁴M^-1s^-1的k_cat/K_M有效地进行的有效性(表1)。

终止:硫酯酶

以上所述的四个步骤的组合需要形成β-氧化循环的逆转的功能性单元。然而，来自该过程的产物合成需要使用能够将核心途径的CoA中间体转化成所需产物的终止途径。尽管具有不同官能度的众多种产物可以由循环中间体通过选择和整合不同终止途径合成⁸，使用硫酯酶提供针对功能性一圈逆转的体内特征可论证的最简单的终止途径且也能够评估每个功能性单元作为相继构建的途径。硫酯酶，部分较大亚家族的作用于酯键的水解酶，催化硫酯键的水解裂解。在β-氧化循环的功能性逆转的上下文中，硫酯酶切割CoA中间体的硫酯键以将其转化成它们的羧酸组分。

由于大肠杆菌硫酯酶不同的底物特异性，选择由tesA28、tesB29、yciA30、fadM31、ydiI32和ybgC32编码的大肠杆菌硫酯酶用于进一步表征并与体内组装的框架整合。通过表达这些不同硫酯酶的菌株的粗细胞提取物的比活测量的体内特征示出YciA在循环的4-C CoA中间体上具有最高活性(表2)。然而，每个测试的硫酯酶对具有较长链中间体癸酰-CoA示出增加的活性(表2)。

尽管针对相关的4碳CoA中间体的高活性的YciA为有前景的，但是在本表征中显示的一个可能问题为YciA似乎也对乙酰-CoA具有重要的活性(表2)，在此情况下这可能在循环起始(硫解酶)和终止途径之间产生竞争。这通过YciA的全部动力学特征来确认，因为乙酰-CoA的K_M(42.7μM)显著地低于AtoB的乙酰-CoA的KM(892μM)(表1)。此外，本分析显示YciA对所有潜在的CoA中间体在β-氧化循环的一圈逆转期间显示出重要的催化功效(表1)，表明在模块的整合组装期间其能够充当来自任何CoA中间体的终止途径。然而，考虑到YciA对乙酰-CoA的低K_M和高催化功效，该酶的过度表达在β-氧化循环的功能性逆转的体内组装期间也能够限制至核心途径的通量，因此需要测试所有选定的硫酯酶组分以确定最佳的官能度。

功能性单元的组装

尽管选定组分的体内特征提供了这些酶能够进行β-氧化循环的功能性逆转所需的反应的证据，仅仅这些单独单元的体内组装结合选定的硫酯酶作为终止途径可提供途径官能度的评估(即4-C羧酸的合成)(图8)。这种类型的合成/自下而上的方法也确保可以对每个预定义的组分或结构单元(即组成该途径的每个功能性单元/酶)进行单独整合使在核心途径的一圈逆转中的作用和官能度进行真实的评估。

然而，在可以实现之前，必需将宿主生物体的新陈代谢(如针对我们目的的大肠杆菌)进行重编程以确保核心和终止途径的各个组分的表达产生所需的生化产物。考虑到甘油作为感兴趣的碳源，这需要将大肠杆菌新陈代谢从天然发酵产物中转移(图9a)并确保产生乙酰-CoA以充当核心途径的引发分子(图8)。

为此，构建了含有缺失编码负责至乙醇(adhE)、乙酸(pta和poxB)、乳酸(ldhA)和琥珀酸(frdA)的发酵途径的酶的基因的菌株。由于这些关键基因的缺失，在工程化宿主中(MG1655ΔldhAΔpoxBΔptaΔadhEΔfrdA=JC01)甘油新陈代谢从乳酸、乙酸和乙醇的混合物转移至丙酮酸和乙酸的混合物(图9a)。本产物概况表明将工程化宿主/底盘内的新陈代谢充分地调整用于从核心途径合成所需的4-C羧酸，如丙酮酸和乙酸两者的产量反映乙酰-CoA库的构建(图8)。因此，本宿主内表达对短链酰基-CoA化合物具有高度特异性的硫解酶(即AtoB)应当为乙酰-CoA提供其它出口，充当核心途径的初始引发步骤并使β-氧化循环的功能性逆转所需的各个组分能够进行体内评估。

如所预期的，在JC01中atoB的单独过度表达导致产生4-C羧酸(图9a)，证实了在这些条件下AtoB可以用来引发循环以及表明存在天然表达的硫酯酶充当终止途径用于循环的初始体内评估。

然而，有些出乎意料的为由于atoB的4-C羧酸产物的分布。3-氧代丁酸，乙酰乙酰-CoA的硫醇裂解的羧酸产物，仅以少量存在，而大部分4-C羧酸产物呈3-羟基丁酸的形式，3-羟基丁酰基-CoA的硫酯酶裂解产物(图9b)。本结果可能表明在这些条件下天然表达的硫酯酶对乙酰乙酰-CoA具有非常低的特异性和/或积聚的乙酰乙酰-CoA通过天然的3-酮丁酰基-CoA脱氢酶的作用提示其还原成3-羟基丁酰基-CoA(图8)。

为了研究这些可能性并进一步提供选定的终止途径酶的评估，构建了菌株，其中将atoB过度表达与硫酯酶的过度表达(tesA、tesB、yciA、fadM、ydiI、ybgC)结合或将其从宿主菌株的染色体缺失。尽管未确定针对3-氧代丁酸产物的关键硫酯酶的明确指示，如无显著增加地单一过度表达或明确消除3-氧代丁酸的单一缺失(图10)，观察到若干显著的方面。首先，尽管ybgC的表达不会获得3-氧代丁酸的增加，但是在该菌株中观察到了丙酮产物(图10a)。丙酮，高度挥发性短链甲基酮，可以在适当的条件下由3-氧代丁酸的自发脱羧形成³³。第二，且可能为最显著的，事实为过度表达的yciA导致核心途径的所有4-C羧酸产物的消除并在乙酸产量中产生几乎3倍增加(图10a)。

虽然YciA的体内分析结果指定本硫酯酶可以作用于由β-氧化循环的一圈逆转中观察到的大多数途径中间体(表1)，但是乙酸的大量增加加强体外特征的结论：当在显著水平过度表达时，较低的K_M和较大的催化功效(表1)使得YciA与AtoB有利地竞争乙酰-CoA。此外，AtoB的可逆性质(表1)和缺乏单独表达的3-酮丁酰基-CoA脱氢酶以作用于乙酰乙酰-CoA(图8)也可以在yciA过度表达时构成增加的乙酸产量。这也表明就各个组分的表达而言，产物形成的总体控制可能位于与终止途径相对的核心途径。

后者方案反映出以下事实：在atoB表达后观察到显著量的3-羟基丁酸(图9b)，甚至在缺乏3-酮丁酰基-CoA脱氢酶的非依赖表达下。本结果还提供在β-氧化循环的逆转期间进一步评估天然的FadB充当3-酮丁酰基-CoA脱氢酶的方法。为此目的，将fadB基因从宿主菌株中缺失并在atoB过度表达后(即JC01ΔfadB pTHatoB pZSBlank)测试4-C羧酸产量。

如图10b中观察到，当与JC01pTHatoB pZSBlank相比较时，缺失fadB导致3-羟基丁酸产量减少约1.5倍，反映出天然表达的fadB在乙酰乙酰-CoA转化成3-羟基丁酰基-CoA中的重要作用。然而，缺失fadB并未完全消除3-羟基丁酸产物，表明其它酶可能在本转化中起作用。如先前提及的，可能的候选物包括厌氧的羟酰-CoA脱氢酶(fadJ)和3-羟基己二酰-CoA脱氢酶(paaH)，当对纯化的酶进行测试时(数据未示出)，后者对乙酰乙酰-CoA的还原示出适度的比活。而这些结果为进一步评估能够催化本反应的酶提供了有趣的领域，在atoB过度表达后的体外特征和FadB的作用反映出该酶充当β-氧化循环的逆转的关键功能性单元的潜力。

为了进一步评估FadB并将3-羟酰-CoA脱氢酶和烯酰-CoA水合酶组分整合至模块化框架，将针对atoB和fadB表达的可控制的构建体(即pTHatoB.fadB)的进行装配并体内测试4-C羧酸产量。进一步证实了该酶充当β-氧化循环的逆转的关键组分的能力，在JC01中atoB和fadB的组合的过度表达导致3-羟基丁酸产量的3倍增加(与仅表达atoB相比)，2.5g/L的3-羟基丁酸产生0.29g/g的收率(图11)。

有趣的是，尽管存在以下事实：FadB的体内特征(表1)表明在β-氧化循环的逆转期间该酶可以充当3-酮丁酰基-CoA脱氢酶和3-羟基丁酰基-CoA脱水酶，但是在其与atoB表达后仅观察到3-羟基丁酸产量的增加，不含可检测的巴豆酸酯，观察到巴豆酰基-CoA的硫醇裂解产物(图8)。这可能为在这些条件下天然的硫酯酶活性的特异性的结果而非FadB进行脱水反应的体内能力的反映，因为少量的丁酸，需要巴豆酰基-CoA的还原和随后硫酯酶的裂解(图8)，也在本菌株中观察到(图11a)。

这进一步通过atoB和fadB与选定的硫酯酶单独过度表达(图11a)的组合表达或缺失(图11b)来评估。虽然在选定的硫酯酶过度表达后未观察到3-羟基丁酸的增加，但是ydiI结合atoB和fadB的过度表达导致产生少量的巴豆酸酯(约0.2g/L,图11a)，表明该酶能够用作终止途径用于巴豆酸酯生产且进一步确认FadB能够催化循环的第一还原和随后的脱水反应。另外注意为以下事实：尽管YciA对3-羟基丁酰基-CoA和巴豆酰基-CoA的高比活和催化功效(表1)，yciA与atoB和fadB的组合的过度表达产生增加的乙酸产量，同时完全消除4-C羧酸途径产物(图11a)，反映yciA仅与atoB过度表达后的结果(图10a)。

这些结果再次构成将对控制产物形成的主要水平放置在由核心途径表示的单独步骤的重要性并用导致特定产物形成的高度特异性终止途径来补充该结构(诸如在ydiI表达和巴豆酸酯形成的情况下)。用于多个途径中间体(表1)以及核心途径和终止途径内酶之间对中间体的竞争的选定的硫酯酶(具体地为YciA)的混杂性在关键酶的表达水平之间产生复杂的平衡。

对于4-C羧酸产物的目的，利用天然的宿主终止途径作为一种补充核心途径的单独功能性单元的操作方法作为针对合成不同产物的总体控制策略似乎更好。

就大肠杆菌中形成3-羟基丁酸而言，选择缺失与atoB和fadB表达结合的硫酯酶表明虽然天然表达的tesB和yciA可能在其产生中起作用，如由产量水平的轻微减少所证实(图11b)，但是不存在来自选定的硫酯酶的单一的天然终止途径仅仅负责3-羟基丁酸产生。

核心途径发挥控制产物形成的其它证据从当atoB和fadB单独表达时(甚至与选定的硫酯酶而不是上述yciA结合，图11a)存在丁酸的情况下观察到。类似于仅仅具有硫解酶表达的3-羟基丁酸的产生，在atoB和fadB表达后丁酸的产生将需要能够催化核心途径反应的酶的天然表达,具体地说存在对于巴豆酰基-CoA至丁酰基-CoA的还原必需的丁酰基-CoA脱氢酶(图8)。

尝试阐明在该转化中涉及的天然酶，包括酰基-CoA脱氢酶(fadE)和预测的酰基-CoA脱氢酶(ydiO)，将基因缺失的候选物单独地加入至JC01并结合atoB和fadB的表达进行测试(图12)。虽然无单一的缺失导致丁酸产物的完全消除，但是ydiO的缺失导致丁酸浓度约30%的减少，表明该预测的酰基-CoA脱氢酶的可能的作用(图12)。

为了对这些酶充当β-氧化循环的功能性逆转的关键组分的可能作用和能力获得进一步了解，开发了能够使fadE或ydiO结合硫解酶(AtoB)、3-羟酰-CoA脱氢酶(FadB)和烯酰-CoA水合酶组分(FadB)的组合的过度表达的构建体(即pTHatoB.fadB.fadE和pTHatoB.fadB.ydiO)。更重要的要指出就ydiO表达的情况而言，还构建含有对适当的酶/途径功能(参见以上)必需的预测的辅助性酶的载体(即pZSydbK.ydiQRST)并在存在1mM硫胺素焦磷酸(TPP)的情况下用上述构建体进行测试，示出增加YdbK活性²⁴。如图12，虽然ydiO的表达，甚至与辅助性酶共表达对仅有atoB和fadB的表达在丁酸产量上未示出增加，fadE与核心途径的第一两种酶的表达在丁酸水平上产生～60%的增加，示出在β-氧化循环的逆转期间该酶贡献的能力。虽然这些结果表明YdiO和FadE的作用，由这些菌株产生的低水平的丁酸和高水平的3-羟基丁酸反映出涉及使用这些酶系统的复杂性(如需求其它辅助性酶和偶联伙伴诸如YdbK和YdiQRST)(参见以上)。

如前所述，对于该步骤的替代组分为使用来自纤细眼虫(egTER)的反式-2-烯酰-CoA还原酶，所述酶不但对巴豆酰基-CoA的还原示出有利的动力学特征(表1)，而且来自生物体，所述生物体已经示出具有核心途径基本上等价于β-氧化循环的功能性逆转的代谢过程(蜡的合成)²⁶。该酶的一个优势为egTER不需要适当功能的辅助性酶或偶联反应因为NAD(P)H在反应中被用作电子供体²⁵。

当与多种碳源使用时，虽然缺乏对辅助性酶的需求可有助于该酶的功效，但是就甘油而言，将NADH用作还原等价物的事实也赋予了产生还原化合物的优势，所述化合物可以由循环的中间体实现。甘油的还原性质指出形成一分子的丙酮酸产生来自葡萄糖的两倍数目的还原等价物(2NADH)³⁴，表示每个循环的“圈数”所需的还原等价物的精确数目(即由酮酰基-CoA至酰基-CoA中间体的两个还原反应，图8)。与使用YdiO相比，由于针对这些酶的电子供体的性质，所以在丙酮酸异化期间其需要还原的铁氧还蛋白的再生，egTER利用NADH的事实产生将该酶结合丙酮酸异化使用通过丙酮酸甲酸裂解酶以避免其它还原等价物积聚的能力。

与其它候选的丁酰基-CoA脱氢酶相比考虑到egTER的这些独特的优势，我们研究编码在模块化框架中必需的所有组分用于β-氧化循环的一圈逆转的atoB、fadB和egTER的组合表达的影响。如图12，与fadE或ydiO的表达完全相反，egTER连同atoB和fadB的表达产生显著的丁酸水平(3.43g/L产生0.35g/g的收率)。此外，此菌株未产生3-羟基丁酸(图12)，示出egTER针对该还原反应的功效以及进一步证实了核心途径组分在β-氧化循环的一圈逆转期间指定产物形成的能力。

通过对宿主菌株中全部一圈逆转结合单独硫酯酶过度表达必需的关键组分的表达提供了对该第二点的其它确认。尽管针对丁酰基-CoA的适度比活(表2)，但是在过度表达任一硫酯酶后，未观察到丁酸产量的显著增加(图13a)。然而，虽然yciA表达导致乙酸产量的显著增加，但是其表达未完全消除4-C羧酸产物因为其具有atoB或仅atoB/fadB表达(图13a)。这可能反映出至丁酰基-CoA合成的强驱动力，egTER指出的表达(即控制总体产物形成的核心途径表达)，结合针对丁酰基-CoA YciA的高催化功效和比活示出可与其它4-CCoA中间体比较的(表1)，因此使YciA活性对乙酰-CoA的影响最小化。另外注意的事实为先前未示出对4-C羧酸产物的影响的ybgC的表达在本实例中导致丁酸浓度的显著降低。

虽然β-氧化循环的功能性逆转的各个组分的模块化表达似乎对硫酯酶终止途径产生的产物发挥大多数控制，但是在JC01中具有atoB、fadB和egTER表达的天然硫酯酶的随后缺失为天然的终止途径至丁酸的特性提供了宝贵的了解。尽管具有部分β-氧化循环组分表达的硫酯酶缺失的模糊性质，对于全部一圈循环逆转，YciA似乎为丁酸产生最关键的硫酯酶因为yciA的缺失导致丁酸浓度和收率几乎减少5倍(图13b)。

与其它4-C CoA中间体相比，当将丁酰基-CoA用作底物时，这些结果与针对YciA观察到的高催化功效相一致(表1)以及事实为无其它测试的硫酯酶对丁酰基-CoA具有与YciA相近的比活水平(表2)。尽管事实为YciA似乎对丁酸产生为关键的并且也对一圈逆转的所有途径中间体显示出高活性(表1)，但是当其与单独的核心途径酶结合表达时由于本硫酯酶对宽范围底物的混杂的性质YciA过度表达事实上导致4-C羧酸产物形成的降低30。

总之，将具有4-C羧酸循环的各个组分的体内组装作为代用品用于产物合成显示出什么样的功能性单对途径的有效运行为必需的。这能够针对β-氧化循环的一圈逆转的核心组分构建完全合成的和可转移系统。这些就绪后，可以评估确定需要扩展核心途径用于多个圈数的关键需求和组分，因此扩展可以通过β-氧化循环的功能性逆转合成的产物的范围。

较长链产物

运行β-氧化循环的逆转的多个圈数需要由一圈循环产生的酰基-CoA与其它乙酰-CoA分子缩合以在每个循环圈数中使酰基-CoA延长2个碳(如图8中丁酰基-CoA与乙酰-CoA的缩合)8。因此，多个循环圈数的起始和延伸需要使用针对较长链酰基-CoA分子特异的硫解酶结合能够作用于增加碳数目的中间体的其它核心途径酶。虽然用于β-氧化循环的一圈逆转来自纤细眼虫的大肠杆菌FadB和egTER的选择和官能度显示出这些酶的可逆性质和性能，但是其选择的另一优势为它们已经示出参与涉及不同链长的中间体的代谢过程并且因此应具有作用于宽范围碳长中间体的能力(参见以上)。

因此，当前模块能够使β-氧化循环功能性逆转，控制运行循环的多个圈数的能力的关键步骤在于选定用于缩合酰基-CoA中间体的硫解酶。虽然由于其对短链酰基-CoA分子的高度特异性选择AtoB用于一圈逆转¹²,¹³，但是该特性可能限制其参与增加碳长中间体的循环的连续圈数的运行能力。

在另一方面，FadA对酰基-CoA底物显示出广泛链长特异性¹⁴，使得该酶成为支持多个循环圈数的理想候选物并能够产生长链产物。然而，低功效的具有乙酰-CoA作为底物的FadA(表1)可能需要存在对短链酰基-CoA分子具有高度特异性的另一硫解酶(诸如AtoB)以进行初始的缩合反应(即引发循环)。

利用这些组分，通过载体编码的AtoB、FadBA操纵子和egTER的模块化构建开发了运行β-氧化循环的功能性逆转的多个圈数的平台。当整合至宿主菌株JC01时，本设计能够通过硫酯酶终止途径的天然表达进行多达C12(十二烷酸)的细胞外较长链脂肪酸的合成(图14)。

fadA的表达对于本目的为重要的，因为在不存在FadA的情况下相同整合的组分产生显著地小于总计较长链脂肪酸(C≥6)且未检测到大于C6的产物(图14)。此外，当将FadA排除在模块化组分之外时，观察到5倍量的丁酸，表明对于AtoB难于有效地运行多个循环圈数(以及在丁酸下FadA超出终止的能力)。

虽然本模块化框架在β-氧化循环的功能性逆转期间显示出对于运行多个循环圈数所必需的组分，但是较长链脂肪酸的总体低水平显示出对于将来调查研究核心途径组分的总体整合以及鉴定和合并能够产生具有不同的碳长和官能度的众多种产物的高度特定终止途径的机会。

结论

基于单独功能性单元的体外动力学特征及其体内组装使用合成的/自下而上的方法构建β-氧化循环的工程化逆转。由于β-氧化循环的一圈功能性逆转，本策略能够合成多种4-C羧酸，因为单独的硫解酶(AtoB)、3-羟酰-CoA脱氢酶(FadB)、烯酰-CoA水合酶(FadB)和酰基-CoA脱氢酶/反式-烯酰-CoA还原酶(egTER)组分对用天然的硫酯酶终止途径形成的产物发挥大多数控制。通过整合能够作用于较长链中间体的硫解酶(FadA)，也显示了起始多个循环圈数导致较长链产物的产生。

用于合成4-C和高级化合物的模块化框架克服了先前使用的系统级/自上而下方法的一些局限(由于途径的各个组分的不清楚的性质)，提供了可转移至其它宿主/生物体的“干净的”平台。在本研究中鉴定的独立的和宿主-非依赖功能性单元提供了由β-氧化循环的逆转的关键中间体可获得的众多种化合物的有效产生必需的核心代谢平台。选择的终止途径的进一步鉴定和整合应提供必需的官能度以扩展组分的组合。

与进一步最优化的结合应能够将本途径整合进其它工业宿主使得能够完全利用β-氧化循环的逆转的有利性质用于合成众多种即到生物燃料和生物化学品。

应记得虽然选择丁酸和其它简单的脂肪酸来例示功能性反向途径，这些仅被认为为示例性的并且许多产物可以用本发明制备，诸如列于表3A-B中的产物。

材料&方法

对于所有的基因修饰，将野生型K12大肠杆菌菌株MG165535用作宿主。在MG1655及其衍生物中通过P1噬菌体转导引入基因敲除³⁶,³⁷。将来自National BioResource Project(NIG,Japan)³⁸的单个基因敲除突变体用作特定突变的供体。所有的突变通过聚合酶链式反应来确认并且在普通宿主中的多个基因的破坏如先前所述实现³⁶。在本研究中使用的所有所得菌株列于补充表S1。

基因过度表达通过在低拷贝(pZS³⁶)或高拷贝基载体(pTrcHis2A,缩写为pTHA；Invitrogen,Carlsbad,CA)利用In-Fusion PCR克隆技术(Clontech Laboratories,Inc.,MountainView,CA)实现。由供应商所述(Thermo Scientific,Waltham,MA)在标准条件下使用列于补充表S2中的引物用Phusion DNA聚合酶经由来自大肠杆菌基因组DNA的感兴趣的ORF的PCR产生克隆插入。来自纤细眼虫(egTER)的反式-2-烯酰-CoA还原酶基因的扩增如以上进行不同的是使用由GenScript(Piscataway,NJ)合成的质粒容纳的最优密码子egTER。当适当时，经由引物合成加入RBS。由大肠杆菌培养物(Qiagen,Valencia,CA)纯化载体骨架并用列于补充表S2的限制酶根据制造商所述(New England Biolabs,Ipswich,MA)进行消化以能够克隆。将所得In-Fusion产物用于转化大肠杆菌Stellar细胞(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)并通过PCR、限制消化和DNA测序确认阳性克隆。

所有的分子生物学技术用标准的方法³⁷,³⁹或通过制造商方案进行。将菌株保存在-80℃的32.5%的甘油储液中。使用含有1.5%琼脂的LB培养基制备平板并包括以下浓度的适当的抗生素：氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)。

由Neidhardt等人设计的基本培养基⁴⁰，用100mM MOPS和Na2HPO4替代K2HPO4，补充有20g/L甘油、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、100μM FeSO4、5mM泛酸钙、1.48mM Na2HPO4、5mM(NH4)2SO4和30mM NH4Cl用于所有发酵(除非另外指明)。当适当时包括抗生素(100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素)和诱导剂(0.1μM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷和100ng/mL无水四环素)。所有化学品获得自Fisher Scientific Co.(Pittsburg,PA)和Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO)。

发酵在充满20mL以上培养基并用填充瓶颈的泡沫塞密封的25mL Pyrex Erlenmeyer摇瓶(窄嘴/重型轮缘,Coming Inc.,Coming,NY)中进行。将所需菌株的单个克隆在具有适当抗生素的LB培养基中培养过夜(14-16小时)并用作所有发酵的接种物(1%)。在接种之后，将摇瓶在NBS C24台式恒温振荡器(New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,NJ)中在37℃和200rpm下进行培养直至达到约0.3-0.5的光密度，此时加入IPTG和无水四环素。然后诱导后(除非另外指明)将摇瓶在相同条件下培养48小时。

将光密度在550nm下在Thermo Spectronic Genesys20(Thermo Scientific,Waltham,MA)中进行测量并用于估算细胞质量(1O.D.550=0.34g干重/L)41。短链(C≤4)代谢物的鉴定通过如先前所述8的核磁共振(NMR)进行而较长链脂肪酸经由气相色谱-质谱法(GC-MS)鉴定。脂肪酸的鉴定在装备有5975C惰性XL质量选择检测器(Agilent Technologies,SantaClara,CA)和Rxi-5Sil柱(0.25mm内径，0.10μm膜厚度，30m长；Restek,Bellefonte,PA)的Agilent7890A GC系统(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上进行，以下为方法：35℃的初始温度保持1分钟，6℃/min至200℃，30℃/min至270℃，保持1分钟。提取和衍生化方法如以下所述。将氦(2.6mL/min,Matheson Tri-Gas,Longmont,CO)用作载气。将注射器和检测器保持在280℃下。将2μL样品使用40:1分流比注射。

在培养物上清液中的甘油和代谢产物的定量通过高效液相色谱(HPLC)和气相色谱-火焰电离检测(GC-FID)进行。使用装备有HPX-87H有机酸柱(Bio-Rad,Hercules,CA)的Shimadzu Prominence SIL20系统(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.,Columbia,MD)以最优化峰分离的操作条件(0.3ml/min流速，30mM H2SO4流动相，柱温42℃)经由离子排斥HPLC确定甘油、乙醇和有机酸的浓度⁴²。

脂肪酸(C4-C12)和脂肪酸甲基酯(Cl4-C18)的其它定量在装备有火焰离子化检测器(GC-FID)和HP-INNOWax毛细管柱(0.32mm内径，0.50μm膜厚，30m长；AgilentTechnologies,Inc.,Santa Clara,CA)的Varian CP-3800气相色谱(Varian Associates,Inc.,PaloAlto,CA)中进行，以下为方法：50℃保持3分钟，10℃/min至250℃，和250℃保持10分钟。将氦(1.8mL/min,Matheson Tri-Gas,Longmont,CO)用作载气。将注射器和检测器分别保持在220℃和275℃。将1μl样品以不分流注射模式进行注射。

对于鉴定脂肪酸，将2mL的上清等份试样转移至5mL玻璃小瓶中(Fisher ScientificCo.,Pittsburg,PA)。将样品补充有1.2μL作为内标的1-壬醇并用2mL己烷提取。将小瓶拧紧并涡旋30s，并在Glas-Col旋转器(Glas-Col,Terre Haute,IN)中以60rpm混合2小时。然后将样品再次涡旋30s并在4℃下以8000rpm离心1分钟。将顶部有机层的700μL等分试样转移至2mL具有PTFE/硅酮螺帽的硅酸硼玻璃小瓶(Fisher Scientific Co.,Pittsburg,PA)中并与50μL吡啶和50μL BSTFA(N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺)混合。使用AccuBlock Digital Dry Bath(LabNet,Woodbridge,NJ)将样品在70℃下培养30分钟并经由GC-MS将甲硅烷基化样品进行分析。

对于脂肪酸和脂肪酸甲基酯的定量，将2mL的上清等份试样转移至5mL玻璃小瓶中(Fisher Scientific Co.,Pittsburg,PA)。将样品用硫酸(补充有2mg三癸酸作为内标)酸化，并用2mL己烷：三氯甲烷(4:1,v/v)的混合物进行提取。如以上所述进行涡旋、旋转和离心。对于短和中链脂肪酸(C4-C12)的定量，将1mL的有机层等分至2mL具有PTFE/硅酮螺帽的硅酸硼玻璃小瓶中(Fisher Scientific Co.,Pittsburg,PA)并经由GC-FID分析。

对于长链脂肪酸(Cl4-C18)的定量，将1mL的有机层转移至2mL玻璃小瓶中(FisherScientific Co.,Pittsburg,PA)。将样品氮蒸发至几乎干燥，再溶于1mL甲醇：三氯甲烷：硫酸(30:3:1,v/v/v)的混合物中并使用AccuBlock干式加热器(LabNet,Woodbridge,NJ)在90℃下于密封的小瓶中培养60分钟。将水(1mL)加入至每管中，并用2mL己烷:三氯甲烷(4:1,v/v)提取脂肪酸甲基酯(FAME)。在提取之后，将1mL有机层等分至2mL具有PTFE/硅酮螺帽的硅酸硼玻璃小瓶中(Fisher Scientific Co.,Pittsburg,PA)并经由GC-FID分析。

使用硬脂酸(C18:0)、棕榈酸(C16：0)、肉豆蔻酸(C14:0)、月桂酸(C12:0)、癸酸(C10:0)、辛酸(C8:0)、己酸(C6:0)和丁酸(C4:0)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)校正气相色谱。将己烷(高分辨气相色谱)和三氯甲烷(试剂级)用作提取溶剂(Fisher Scientific Co.,Pittsburg,PA)。将1-壬醇、吡啶(HPLC级)和BSTFA(合成级)用于甲硅烷基化反应(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)。用于酯化反应的甲醇和浓缩的硫酸为试剂级(Fisher Scientific Co.,Pittsburg,PA)。

当开始时，产物产量(mmol/mmol甘油或g/g甘油)表示在发酵长度期间(48小时除非另外指明)消耗每单位量的甘油合成的产物的量。

对于酶特征，将来自MG1655基因组DNA的大肠杆菌fadA和fadB基因克隆至pUCBB-ntH6载体⁴³以获得可由Thxombin切割的具有n-末端6His-标签的组成型表达的基因。用引物fadANdeI5p:fadAmidrev(第一半)和fadAmidfor:fadANotI3p(第二半)(补充表S3)以两半扩增fadA。

用fadBNdeI5p:fadBmid1rev(第一部分)、fadBmid1for:fadBmid2rev(第二部分)和fadBmid2for:fadBNotI3p(第三部分)(补充表S3)以三部分扩增fadB。将fadA和fadB PCR产物部分通过重叠延伸PCR进行组合以获得全部基因，随后将其用NdeI和NotI限制酶消化并连接至先前用NdeI和NotI的消化pUCBB-ntH6以获得pUCBB-ntH6-FadA和pUCBB-ntH6-FadB。

将来自丙酮丁醇梭菌ATCC824(caHBD)的hbd基因克隆至pUCBB-pBAD⁴³以获得具有c-末端His6-标签的阿拉伯糖可诱导的caHBD基因。使用caHBDBglii5p和caHBDxhoI3p引物(补充表S3)由丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组PCR扩增caHBD。然后将所得PCR产物用BglII和XhoI消化并连接至先前用BglII和XhoI消化的pUCBB-pBAD以获得pUCBB-pBAD-caHBD。

对于AtoB和硫酯酶特征测定，使用来自ASKA收藏的pCA24N-基因(-gfp)质粒44。为了表达纤细眼虫TER用于动力学特征，使用In-Fusion方案(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)将egTER基因克隆至pTrcHis2A然后由含有具有引物对F1pTH6hisEgter和R1pTH6hisEgter(补充表S3)的质粒的上述最优密码子egTER进行PCR扩增。

在37℃下将在250mL三角瓶(Wheaton Industries,Inc.,Millville,NJ)中用于酶促测定的培养物在100mL LB培养基中于OD600约0.6下用1mM IPTG(pCA24N,pTrcHis2A)或1mM阿拉伯糖诱导大肠杆菌BL21(DE3)的细胞(pUCBB-pBAD)生长过夜或组成型表达(pUCBB-ntH6)。在Synergy HT板读数仪(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,VT)上于25℃下(用于在300nm或更高下监测反应)或针对在263nm下的反应在Biomate5分光光度计(Thermo Scientific,Waltham,MA)中监测反应。

按照规定的方案使用细菌蛋白提取试剂(B-PER)(Thermo Scientific,Waltham,MA)将细胞裂解以便获得含有活性酶的上清液。在先前创建的方法45之后使用以上提及的相同的生长条件纯化FadE和YdiO。

将细胞沉淀重悬于40mL50mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)中并通过破坏EmulsiFlex-C5匀浆器(Avestin,Ottawa,ON)破碎。然后将破坏的细胞在Optima L-80XP超速离心机(Beckman-Coulter,Schaumburg,IL)中在4℃下以120,000x g旋转90分钟以产生用于测定的上清液。

对于比活测定(以μmol底物/mg蛋白/min报道)，利用这些上清级分并且使用Bradford试剂(Thermo Scientific,Waltham,MA)使用BSA作为蛋白标准确立蛋白浓度。对于每个反应确立线性并且减去背景非-酶促速率以确立活性。

对于动力学特征，将AtoB、FadA、FadB、caHBD、egTER的his-标签蛋白使用Talon金属亲和树脂(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)通过重力纯化从B-PER上清液级分中纯化。简而言之，在室温下将上清液与大约2mL的用缓冲液A(50mM Tris pH7.9,5mM MgCl2,100mM NaCl,5mM咪唑)预洗涤两次的Talon树脂(1mL树脂/0.3mg上清蛋白)在LabQuake旋转器(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上混合1小时。然后将树脂在700xg下旋转5分钟以去除未结合的蛋白，用20x(40mL)缓冲液A洗涤，在20x(40mL)缓冲液B(具有20mM咪唑的缓冲液A)重悬并负载至重力柱。然后将缓冲液B排出并将蛋白用20mL缓冲液C(具有250mM咪唑的缓冲液A)洗脱。然后将洗脱的级分浓缩并用于动力学特征。通过测量在260nm下的吸光度和针对每个酶由ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam/)预测的消光系数确立酶浓度。

对于动力学特征，酶的适当量由核实接近预测的K_M值的线性范围确立。然后，测量一系列底物的速率以便确立k_cat和K_M。就针对巴豆酸酶反应的FadB和在“正向”硫解酶反应中与HBD偶联的FadA而言，不能确立底物饱和，因此，针对反应的kcat/KM通过将速度对比[底物]的线性斜率除以在本测定中使用的酶量来确定。对于可以饱和的反应，速度对比[底物]由EnzKIN Matlab模型(http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/26653)拟合以确立V_max和_KM。

正向硫解酶测定(即生物合成方向)和β-羟基丁酰基-CoA脱氢酶测定在25℃下存在1.5mM DTT,4.5mM MgCl2,100mM Tris HCl pH7.5和0.2mM NADH的总共200μL的体积的情况下进行⁴⁶。

β-羟基丁酰基-CoA脱氢酶活性通过在340nm下NADH的氧化来监测，同时正向中硫解酶活性在340nm下以偶联测定测量，其中存在10U过量的caHBD以还原由硫解酶活性产生的乙酰乙酰-CoA。

反向硫解酶活性在25℃下存在0.5mM DTT,4.5mM MgCl2,100mM Tris HCl pH7.5和2mM CoA的总共200μL的体积的情况下进行测定⁴⁷。活性通过在303nm下使用14mM-1cm-1的消光系数经乙酰乙酰-CoA的损耗来监测。巴豆酸酶活性通过在263nm(=6.7mM-1cm-1)下以下巴豆酰基-CoA在存在100mM Tris HCL pH7.5的200μL总体积的情况下的损耗进行监测⁴⁸。

对于egTER，巴豆酰基-CoA还原酶活性随后通过在25℃下在存在100mM Tris HCLpH7.5和0.2mM NADH的200μL总体积的情况下NADH吸光度的损耗来监测⁴⁶。

对于FadE和YdiO，丁酰基-CoA脱氢酶活性利用二茂铁离子进行测量⁴⁹。反应在50mM磷酸钾pH7.2，0.4mM MgSO4,200μM六氟磷酸盐二茂铁和200μM丁酰基-CoA中进行并在300nm下监测还原的二茂铁离子的形成(=4.3mM-1cm-1)。

硫酯酶活性通过在412nm下以下TNB的产生来监测(=4.3mM^-1cm^-1)³⁰。反应在25℃下在存在100mM Tris pH7.5,200mM KCl,25mM DTNB和200μM的‘-CoA’底物的200μL的体积的情况下进行。

用于酶测定的所有底物和化学品获得自Fisher Scientific Co.(Pittsburg,PA)和Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO)。

以下为表格：

在此引用的所有参考文献为了所有目的通过引用整体并入本文。为了读者便利将某些参考文献再次列于下文，并且其它的参考文献可见于图的图例中。

Dellomonaco C等人,Engineered reversal of theβ-oxidation cycle for the synthesis of fuels andchemicals.Nature.476(7360):355-9(2011)

Jansen和Wanders:Biochimica et Biophysica Acta1763(2006)1403-1412).

Pinot F,Beisson F.(2011).Cytochrome P450metabolizing fatty acids in plants:characterization andphysiological roles.FEBS J,278(2),195-205.

Mascaraque等人，2010,PNAS107:14390-14395

Nogales等人,2007,Microbiology153:357-365),

Gobel等人,2002,J.Bac.184:216-223

Eulberg等人,1998,J.Bacteriol.180:1072-1081

Iwagami等人,2000,Appl.Environ.Microbiol.66:1499-1508

美国序列号61/440,192，2011年2月7日提交

美国序列号61/531/911，2011年9月7日提交

PCT/US12/24051,2012年2月7日提交

WO2010101651

1.Rude,M.A和Schirmer,A.(2009)New microbial fuels:a biotech perspective,Curr.Opin.Microbiol.12,274-281.

2.Connor,M.R和Liao,J.C.(2009)Microbial production of advanced transportation fuels innon-natural hosts,Curr.Opin.Biotechnol.20,307-315.

3.Lee,J.W.,Na,D.,Park,J.M.,Lee,J.,Choi,S和Lee,S.Y.(2012)Systems metabolic engineeringof microorganisms for natural and non-natural chemicals,Nat.Chem.Biol.8,536-546.

4.Peralta-Yahya,P.P.,Zhang,F.,del Cardayre,S.B和Keasling,J.D.(2012)Microbial engineeringfor the production of advanced biofuels,Nature488,320-328.

5.Steen,E.J.,Kang,Y.S.,Bokinsky,G.,Hu,Z.H.,Schirmer,A.,McClure,A.,del Cardayre,S.B和Keasling,J.D.(2010)Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass,Nature463,559-U182.

6.Handke,P.,Lynch,S.A和Gill,R.T.(2011)Application and engineering of fatty acid biosynthesisin Escherichia coli for advanced fuels and chemicals,Metab.Eng.13,28-37.

7.Lennen,R.M.,Braden,D.J.,West,R.M.,Dumesic,J.A和Pfleger,B.F.(2010)A Process forMicrobial Hydrocarbon Synthesis:Overproduction of Fatty Acids in Escherichia coli and CatalyticConversion to Alkanes,Biotechnol.Bioeng.106,193-202.

8.Dellomonaco,C.,Clomburg,J.M.,Miller,E.N和Gonzalez,R.(2011)Engineered reversal of theβ-oxidation cycle for the synthesis of fuels and chemicals,Nature476,355-359.

9.Keasling,J.D.(2008)Synthetic biology for synthetic chemistry,ACS Chem.Biol.3,64-76.

10.Clomburg,J.M和Gonzalez,R.(2010)Biofuel production in Escherichia coli:the role ofmetabolic engineering and synthetic biology,Appl.Microbiol Biotechnol.86,419-434.

11.Clark,D.P和Cronan,J.E.(有效起始日期2005年10月)Two-Carbon Compounds and FattyAcids as Carbon Sources,In EcoSal-Escherichia coli and Salmonella:cellular and molecular biology(Neidhardt,F.,Curtiss,R.I.,Ingraha,J.,Lin,E.,Low,K.,Magasanik,B.,Reznikoff,W.,Riley,N.,Schaechter,M和Umbarger,H编辑)第2版,ASM Press,Washington,DC.

12.Feigenbaum,J和Schulz,H.(1975)Thiolases of Escherichia coli:Purification and Chain-LengthSpecificties,J.Bacteriol.122,407-411.

13.Jenkins,L.S和Nunn,W.D.(1987)Genetic and Molecular Characterization of the GenesInvolved in Short-Chain Fatty-Acid Degradation in Escherichia coli:The Ato System,J.Bacteriol169,42-52.

14.Yang,S.Y.,Yang,X.Y.H.,Healy-Louie,G.,Schulz,H和Elzinga,M.(1990)NucleotideSequence of the fadA Gene:Primary Structure of the3-ketoacyl-Coenzyme A Thiolase from Escherichiacoli and the Structural Organization of the fadBA Operon,J.Biol.Chem.265,10424-10429.

15.Nielsen,J.,Villadsen,J和Liden,G.(2003)Bioreaction Engineering Principles,KluwerAdademic/Plenum Publishers,New York.

16.Teufel,R.,Mascaraque,V.,Ismail,W.,Voss,M.,Perera,J.,Eisenreich,W.,Haehnel,W和Fuchs,G.(2010)Bacterial phenylalanine and phenylacetate catabolic pathway revealed,Proc.Natl.Acad.ScLU.S.A.107,14390-14395.

17.Binstock,J.F和Schulz,H.(1981)Fatty acid oxidation complex from Escherichia coli,MethodsEnzymol.71,403-411.

18.He,X.Y和Yang,S.Y.(1997)Glutamate-119of the large alpha-subunit is the catalytic base in thehydration of2-trans-enoyl-coenzyme A catalyzed by the multienzyme complex of fatty acid oxidationfrom Escherichia coli,Biochemistry36,11044-11049.

19.Campbell,J.W.,Morgan-Kiss,R.M和Cronan,J.E.(2003)A new Escherichia coli metaboliccompetency:growth on fatty acids by a novel anaerobicβ-oxidation pathway,MoL Microbiol47，793-805.

20.Gulevich,A.Y.,Skorokhodova,A.Y.,Sukhozhenko,A.V.,Shakulov,R.S.,and Debabov,V.G.(2012)Metabolic engineering of Escherichia coli for1-butanol biosynthesis through the inverted aerobicfatty acidβ-oxidation pathway,Biotechnol.Lett.34，463-469.

21.Eichler,K.,Bourgis,F.,Buchet,A.,Kleber,H.P和Mandrandberthelot,M.A(1994)MolecularCharacterization of the Cai Operon Necessary for Carnitine Metabolism in Escherichia coli,MoLMicrobiol.13,775-786.

22.Walt,A和Kahn,M.L.(2002)The fixA and fixB genes are necessary for anaerobic carnitinereduction in Escherichia coli,J.Bacteriol.184,4044-4047.

23.Eichler,K.,Buchet,A.,Bourgis,F.,Kleber,H.P和Mandrandberthelot,M.A.(1995)The fixEscherichia coli region contains4genes related to camitinie metabolism,J.Basic Microbiol.35,217-227.

24.Akhtar,M.K和Jones,P.R.(2009)Construction of a synthetic YdbK-dependent pyruvate:H-2pathway in Escherichia coli BL21(DE3),Metab.Eng.11,139-147.

25.Hoffmeister,M.,Piotrowski,M.,Nowitzki,U和Martin,W.(2005)Mitochondrialtrans-2-enoyl-CoA reductase of wax ester fermentation from Euglena gracilis defines a new family ofenzymes involved in lipid synthesis,J.Biol.Chem.280,4329-4338.

26.Inui,H.,Miyatake,K.,Nakano,Y和Kitaoka,S.(1984)Fatty Acid Synthesis in Mitochondria ofEuglena gracilis,Eur.J.Biochem.142,121-126.

27.Inui,H.,Miyatake,K.,Nakano,Y和Kitaoka,S.(1983)Production and Composition of WaxEsters by Fermentation of Euglena gracilis,Agric.Biol.Chem.47,2669-2671.

28.Cho,H.S和Cronan,J.E.(1993)Escherichia coli thioesterase I,molecular cloning andsequencing of the structural gene and identification as a periplasmic enzyme,J.Biol.Chem.268,9238-9245.

29.Nie,L.,Ren,Y.,Janakiraman,A.,Smith,S.,and Schulz,H.(2008)A novel paradigm of fatty acidβ-oxidation exemplified by the thioesterase-dependent partial degradation of conjugated linoleic acid thatfully supports growth of Escherichia coli,Biochemistry47,9618-9626.

30.Zhuang,Z.H.,Song,F.,Zhao,H.,Li,L.,Cao,J.,Eisenstein,E.,Herzberg,O和Dunaway-Mariano,D.(2008)Divergence of function in the hot dog fold enzyme superfamily:Thebacterial thioesterase YciA,Biochemistry47,2789-2796.

31.Feng,Y和Cronan,J.E.(2009)A New Member of the Escherichia coli fad Regulon:Transcriptional Regulation of fadM(ybaW),J.Bacteriol.191,6320-6328.

32.Kuznetsova,E.,Proudfoot,M.,Sanders,S.A.,Reinking,J.,Savchenko,A.,Arrowsmith,C.H.,Edwards,A.M.,and Yakunin,A.F.(2005)Enzyme genomics:Application of general enzymatic screens todiscover new enzymes,FEMS Microbiol.Rev.29,263-279.

33.Vlessis,A.A.,Bartos,D和Trunkey,D.(1990)Importance of spontaneous alpha-ketoaciddecarboxylation in experiments involving peroxide,Biochem.Biophys.Res.Comm.170,1281-1287.

34.Yazdani,S.S和Gonzalez,R.(2007)Anaerobic fermentation of glycerol:a path to economicviability for the biofuels industry,Curr.Opin.Biotechnol.18,213-219.

35.Kang,Y.S.,Durfee,T.,Glasner,J.D.,Qiu,Y.,Frisch,D.,Winterberg,K.M和Blattner,F.R.(2004)Systematic mutagenesis of the Escherichia coli genome,J.Bacteriol.186,8548-8548.

36.Yazdani,S.S和Gonzalez,R.(2008)Engineering Escherichia coli for the efficient conversion ofglycerol to ethanol and co-products,Metab.Eng.10,340-351.

37.Miller,J.H.(1972)Experiments in molecular genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.

38.Baba,T.,Ara,T.,Hasegawa,M.,Takai,Y.,Okumura,Y.,Baba,M.,Datsenko,K.A.,Tomita,M.,Wanner,B.L和Mori,H.(2006)Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection,Mol Syst.Biol.2,11.

39.Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T和Russell,D.W.(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.

40.Neidhardt,F.C.,Bloch,P.L和Smith,D.F.(1974)Culture Medium for Enterobacteria,J.Bacteriol119,736-747.

41.Dharmadi,Y.,Murarka,A和Gonzalez,R.(2006)Anaerobic fermentation of glycerol byEscherichia coli:A new platform for metabolic engineering,Biotechnol.Bioeng.94,821-829.

42.Dharmadi,Y和Gonzalez,R.(2005)A better global resolution function and a novel iterativestochastic search method for optimization of high-performance liquid chromatographic separation,JChromatogr.,A1070,89-101.

43.Vick,J.E.,Johnson,E.T.,Choudhary,S.,Bloch,S.E.,Lopez-Gallego,F.,Srivastava,P.,Tikh,I.B.,Wawrzyn,G.T和Schmidt-Dannert,C.(2011)Optimized compatible set of BioBrick(TM)vectors formetabolic pathway engineering,Appl.Microbiol.Biotechnol.92,1275-1286.

44.Kitagawa,M.,Ara,T.,Arifuzzaman,M.,Ioka-Nakamichi,T.,Inamoto,E.,Toyonaga H.,和Mori,H.(2005)Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library(A complete Set of E.coli K-12ORF archive):Unique resources for biological research,DNA Res.12,291-299.

45.Obrien,W.J和Frerman,F.E.(1977)Evidence for a Complex of3β-Oxidation Enzymes inEscherichia coli:Induction and Localization,J.Bacteriol.132,532-540.

46.Bond-Watts,B.B.,Bellerose,R.J和Chang,M.C.Y.(2011)Enzyme mechanism as a kineticcontrol element for designing synthetic biofuel pathways,Nat.Chem.Biol.7,222-227.

47.Wiesenbom,D.P.,Rudolph,F.B和Papoutsakis,E.T.(1988)Thiolase from Clostridiumacetobutylicum ATCC-824and its Role in the Synthesis of Acids and Solvents,Appl.Environ.Microbiol.54,2717-2722.

48.Hartmanis,M.G.N.,和Gatenbeck,S.(1984)Intermediary Metabolism in Clostridiumacetobutylicum:Levels of Enzymes Involved in the Formation of Acetate and Butyrate,Appl.Environ.Microbiol.47，1277-1283.

49.Lehman,T.C.,Hale,D.E.,Bhala,A和Thorpe,C.(1990)An Acyl-Coenzyme A DehydrogenaseAssay Utilizing the Feericenium Ion,Anal.Biochem.186，280-284.

Claims (18)

1.一种基因工程细菌，所述基因工程细菌包括：

a.过度表达的硫解酶；

b.过度表达的3-羟酰-CoA脱氢酶；

c.过度表达的烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-CoA脱水酶；

d.过度表达的酰基-CoA脱氢酶或反式-烯酰-CoA还原酶；

e.过度表达的终止酶，其选自以下酶组成的组：

i.硫酯酶或酰基-CoA：乙酰-CoA转移酶或磷酸转酰基酶和羧酸激酶，或

ii.醇形成辅酶-A硫酯还原酶，或

iii.醛形成CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶，或

iv.醛形成CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶，或

v.烯烃形成酶；

vi.醛形成CoA硫酯还原酶和转氨酶；和

f.发酵酶的减少表达，导致乳酸盐、乙酸盐、乙醇和琥珀酸盐的生产降低；其中所述细菌具有在生物合成方向进行的反向β氧化途径。

2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述过度表达的硫解酶由atoB、yqeF、fadA或fadl编码。

3.根据权利要求1所述的细菌，其中所述过度表达的硫解酶由atoB、bktB、catF、fadA、paaJ、pcaF、phaA、thlA、thlB或yqeF编码。

4.根据权利要求1所述的细菌，其中所述过度表达的3-羟酰-CoA脱氢酶由fadB、fadJ或paaH编码。

5.根据权利要求1所述的细菌，其中所述过度表达的烯酰-CoA水合酶由fadB、fadJ或paaF编码。

6.根据权利要求1所述的细菌，其中所述过度表达的酰基-CoA脱氢酶或反式-烯酰-CoA还原酶由egTER、ydiO或fadE编码。

7.根据权利要求1所述的细菌，其中所述过度表达的硫酯酶由tesA、tesB、yciA、fadM、ydiI、ybgC、大肠杆菌paaI、ybdB；泊库岛食烷菌tesB、阿拉伯芥ACH2；小家鼠acot8或酿酒酵母PTE1编码。

8.根据权利要求1所述的细菌，其中所述减少表达的发酵酶为ΔadhE、(Δpta或ΔackA或ΔackApta)、ΔpoxB、ΔldhA和ΔfrdA。

9.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌选自示于表3A-B的基因型。

10.一种工程细菌，所述工程细菌包括反向β氧化循环，所述微生物包括：

a.用于合成CoA硫酯的途径，所述CoA硫酯可用作反向β-氧化循环的引物单元；

b.在β-氧化逆转中能够合成中间体的过度表达的酶，所述酶包括i)硫解酶，ii)3-羟酰-CoA脱氢酶，iii)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-CoA脱水酶，和iv)酰基-CoA脱氢酶或反式-烯酰-CoA还原酶；

c.将反向β氧化循环中间体转化成所需产物的一种或更多种终止酶。

11.根据权利要求10所述的细菌，其中在所述生物体中的天然发酵途径已经缩减并且从而产生较少的乙酸盐、乳酸盐、乙醇和琥珀酸盐。

12.一种工程埃希氏杆菌属细胞，其包括：

a.ΔadhE、(Δpta或ΔackA或ΔackApta)、ΔpoxB、ΔldhA和ΔfrdA，

b.加上一种或更多种i)硫解酶；ii)3-羟酰-CoA脱氢酶；iii)烯酰-CoA水合酶或3-羟酰-CoA脱水酶；和iv)酰基-CoA脱氢酶或反式-烯酰-CoA还原酶的过度表达；其中酶i-iv)一起产生反向β氧化合成代谢循环；以及

c.将反向β氧化循环中间体转化成所需产物的一种或更多种过度表达的终止酶。

13.根据权利要求12所述的细菌，其中所述终止酶选自以下酶组成的组：

i.硫酯酶或酰基-CoA：乙酰-CoA转移酶或磷酸转酰基酶和羧酸激酶，或

ii.醇形成辅酶-A硫酯还原酶，或

iii.醛形成CoA硫酯还原酶和醇脱氢酶，或

iv.醛形成CoA硫酯还原酶和醛脱羰基酶，或

v.烯烃形成酶，或

vi.醛形成CoA硫酯还原酶和转氨酶。

14.根据权利要求12所述的细菌，其中所述终止酶为硫酯酶。

15.一种制备所需产物的方法，所述方法包括将根据权利要求1-14中任一项所述的基因工程细菌生长在肉汤培养物中，通过使用反向β氧化途径延伸负荷乙酰-coA的引物以产生比所述引物长至少两个碳原子的产物，并分离所述产物，其中所述引物选自列于表3A-B的引物。

16.一种制备所需产物的方法，所述包括将根据权利要求1-14中任一项所述的基因工程细菌生长在肉汤培养物中，通过使用反向β氧化途径延伸引物以产生比所述引物长至少两个碳原子的产物，并分离所述产物，其中所述引物选自列于表3A-B的引物且所述产物选自列于表3A-B和4A-E的产物。

17.一种制备所需产物的方法，所述方法包括将基因工程细菌生长在肉汤培养物中，通过使用反向β氧化途径延伸引物以产生比所述引物长至少两个碳原子的产物，并分离所述产物，其中所述引物和细菌基因型选自列于表3A-B的引物并且所述其中产物选自列于表3A-B和4A-E的产物。

18.一种制备所需产物的方法，所述方法包括将根据权利要求1-14中任一项所述的基因工程细菌生长在肉汤培养物中，通过使用反向β氧化途径延伸负荷乙酰-coA的引物以产生比所述引物长至少两个碳原子的产物，并分离所述产物，其中所述产物选自列于表3A-B和4A-E的产物。