CN113755543B - 一种淀粉的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了淀粉的生物合成方法,该方法可以实现从二羟丙酮、甲醛、甲酸以及甲醇等简单化合物至淀粉的全人工生物合成,通过与二氧化碳化学还原等方法偶联,甚至可以以二氧化碳作为起始原料实现淀粉的全人工生物合成。天然淀粉合成需要经过卡尔文循环,共需要21‑22步反应,而本发明的方法只需要9‑12步反应,减少近一半的反应步骤,可大大缩短生产周期。此外,本发明的方法可以利用高浓度、高密度的二氧化碳和高能量密度的电能和氢能,更适合工业生产模式,生产周期可从农业种植的数个月缩减到数天。
Description
技术领域
本发明属于生物合成技术领域,具体涉及一种淀粉(包括直链淀粉和支链淀粉)的生物合成方法。
背景技术
全球粮食生产需要消耗38%的土地和70%的淡水资源,随着全球人口的增加,预测到2050年全球粮食需求将提高50-70%,目前的农业种植方式很难满足日益增长的食物需求。淀粉是重要的食物原料,每天提供人体所需约一半的能量。除此之外,淀粉还是重要的生物制造生产化学品的原材料,比如,可用于生产氨基酸、有机酸、生物乙醇等。
农业种植是目前生产淀粉的唯一方式。农作物中淀粉的天然合成途径包括卡尔文循环,共涉及二十几个化学反应和中间代谢产物以及多个细胞器。虽然有报道称实现了淀粉的合成,但其原料,比如1-磷酸葡萄糖、腺苷二磷酸葡萄糖、蔗糖和糊精等,仍然依赖农业种植获得,因此这些已报道的方法不具备替代农业种植生产淀粉的能力。开发能够替代农业种植生产淀粉的方法将具有重要意义。
遨游太空、探索宇宙一直是人类的梦想,但是在太空条件下如何供给食物一直是一个巨大的挑战。航天大国一直致力于开发基于植物种植的食物供给方式,但受到农作物生产淀粉方式的限制,需要数十到数百个立方的空间才能满足一个人的淀粉需求。而开发新的淀粉合成途径将有助于实现在太空条件下的食物供给。
尽管代谢工程和合成生物学的发展使得很多药品和农产品可以通过工业发酵的方式生产,比如青蒿素、阿片、番茄红素、牛奶和肉类等,但是,目前还未能实现淀粉的工业化合成。
二氧化碳是主要的温室气体,同时也是重要的碳素原料。我国每年排放二氧化碳约100亿吨,可作为重要的工业原料被转化利用。国内外已经开发出了高效的化学催化剂,可以利用光、电、氢能将二氧化碳还原生成简单的化合物,比如甲酸、甲醇等,但化学催化剂无法进一步合成复杂的化合物,比如淀粉。
因此,现有技术中存在这样的需求,一方面如何科学地利用一碳化合物从而降低二氧化碳的排放量,另一方面如何实现淀粉的生物学工业化合成。目前,尚且没有能够同时满足这两方面需求的技术和方法。
发明内容
本发明提供了一种合成淀粉的新途径,通过不同化学反应的组合,实现了从一碳化合物合成直链淀粉和/或支链淀粉。
本发明提供一种合成淀粉的方法(I),其包括化合物D即二羟丙酮为原料,在多个酶的催化下,转化为淀粉的步骤;
所述步骤可包括以下步骤:
步骤(1):化合物D,即二羟丙酮为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物F,即D-3-磷酸甘油醛;
步骤(2):步骤(1)得到的化合物F,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物I,即D-葡萄糖-6-磷酸;和
步骤(3):步骤(2)得到的化合物I,在一个或多个酶的催化下,转化为淀粉。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(1)中所使用的酶为经过一步或多步反应催化二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛的酶或酶的组合。例如可以是具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶与具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶的组合。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(2)中所使用的酶为经过一步或多步反应催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-葡萄糖-6-磷酸的酶或酶的组合。例如可以是以下的酶组合:酶组合(I-2-a):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合;或酶组合(I-2-b):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(3)中所使用的酶为经过一步或多步反应催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为直链淀粉或支链淀粉的酶或酶的组合。例如可以是以下的酶组合:
酶组合(I-3-a):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或
酶组合(I-3-b):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶与具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
任选地,组合(I-3-a)或组合(I-3-b)中还包含具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(1)包括以下亚步骤:
步骤(1-1):化合物D在一个或多个酶的催化下转化为化合物E,即磷酸二羟丙酮(该反应记为反应9);和
步骤(1-2):步骤(1-1)得到的化合物E在一个或多个酶的催化下转化为化合物F,即D-3-磷酸甘油醛(该反应记为反应10)。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(1-1)中所使用的酶为具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(1-2)中所使用的酶为具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(2)包括以下亚步骤:
步骤(2-1):化合物F在一个或多个酶的催化下转化为化合物H,即D-果糖-6-磷酸;和
步骤(2-2):步骤(2-1)得到的化合物H在一个或多个酶的催化下转化为化合物I,即D-葡萄糖-6-磷酸(该反应记为反应15)。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(2-1)中所使用的酶为经过一步或多步反应催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸的酶或酶的组合。例如可以是单独的具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶,或者可以是酶组合(I-2-1):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶与具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶的组合。
具体地,步骤(2-1)可以如下进行:化合物F,在具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶的催化下,转化为化合物H(该反应记为反应13或14)。其中反应13和反应14在不同酶的催化进行,例如,可将由6-磷酸果糖醛缩酶(FSA)或转醛缩酶催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸的反应记为反应13,将由6-磷酸果糖醛缩酶磷酸酶(FBAP)催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸的反应记为反应14。
或者,步骤(2-1)也可以如下进行:首先,化合物F,在具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶的催化下,转化为化合物G,即D-果糖-1,6-二磷酸(该反应记为反应11);然后,化合物G,在具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶的催化下,转化为D-果糖-6-磷酸(该反应记为反应12)。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(2-2)中所使用的酶为具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(3)包括以下亚步骤:
步骤(3-1):化合物I在一个或多个酶的催化下转化为化合物J,即α-D-葡萄糖-1-磷酸(该反应记为反应16);
步骤(3-2):步骤(3-1)得到的化合物J在一个或多个酶的催化下转化为化合物1,即直链淀粉;
以及任选的步骤(3-3):步骤(3-2)得到的化合物1在一个或多个酶的催化下转化为化合物2,即支链淀粉(该反应记为反应20)。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(3-1)中所使用的酶为具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(3-2)中所使用的酶为具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶。例如可以是单独的具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶,或者可以是酶组合(I-3-2):具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶与具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合。
具体地,步骤(3-2)可以如下进行:化合物J,在具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的催化下,转化为化合物1,即直链淀粉(该反应记为反应19)。或者,步骤(3-2)也可以如下进行:首先,化合物J,在具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶的催化下,转化为化合物K,即腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖(该反应记为反应17);然后,所得的化合物K,在具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的催化下,转化为直链淀粉(该反应记为反应18)。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(3-3)中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,本发明的方法在步骤(1)之前还包括步骤(0),以甲醛为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物D即二羟丙酮(该反应记为反应8)。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(0)中所使用的酶为具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,本发明的方法在步骤(0)之前还包括步骤(a),甲醇或甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为甲醛。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(a)中,当以甲醇为原料合成甲醛时,所使用的酶为具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶。
根据本发明的方法(I)的实施方案,步骤(a)中,当以甲酸为原料合成甲醛时,所使用的酶为具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶。例如可以是单独的具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶,或者可以是酶组合(I-a-1):具有催化甲酸转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶,或酶组合(I-a-2):具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的组合。
具体地,步骤(a)中,当以甲醇为原料合成甲醛时,该反应可以在醇氧化酶或醇脱氢酶的催化下进行。其中在醇脱氢酶的催化下进行的反应记为反应1,在醇氧化酶的催化下进行的反应记为反应2。
具体地,步骤(a)中,当以甲酸为原料合成甲醛时,可以按照如下的步骤(a1)、(a2)或(a3)中的任一个进行:
步骤(a1):甲酸为原料,在具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛(该反应记为反应3);
步骤(a2):首先,甲酸为原料,在具有催化甲酸转化为甲酰辅酶A功能的酶的催化下,转化为甲酰辅酶A(该反应记为反应4);然后,甲酰辅酶A在具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛(该反应记为反应7);或者
步骤(a3):首先,甲酸为原料,在具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶的催化下,转为为甲酰磷酸(该反应记为反应5);随后,甲酰磷酸在具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶的催化下,转化为甲酰辅酶A(该反应记为反应6);然后,甲酰辅酶A在具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛(该反应记为反应7)。
本发明还提供一种合成淀粉的方法(II),其包括以下步骤:
步骤1):甲醇为原料,在多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及任选的步骤2):步骤1)得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉。
根据本发明的方法(II)的实施方案,步骤1)中所使用的酶为经过多步反应催化甲醇合成淀粉的酶的组合。例如可以是以下的酶组合:
酶组合(II-1-a):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(II-1-b):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(II-1-c):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或者
酶组合(II-1-d):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合。
具体地,步骤1)可按照上面所述的反应2、8、9、10、13、15、16、17和18的组合,反应2、8、9、10、14、15、16、17和18的组合,反应2、8、9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应2、8、9、10、13、15、16和19的组合,反应2、8、9、10、14、15、16和19的组合,或者反应2、8、9、10、11、12、15、16和19的组合进行。
根据本发明的方法(II)的实施方案,步骤2)中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
具体地,步骤2)可按照上面所述的反应20进行。
本发明还提供一种合成淀粉的方法(III),其包括以下步骤:
步骤1):甲醇为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物D,即二羟丙酮;
步骤2):步骤1)得到的二羟丙酮,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤3):步骤2)得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉。
根据本发明的方法(III)的实施方案,步骤1)中所使用的酶为酶组合(III-1):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶和具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合。
具体地,步骤1)可按照上面所述的反应1和8的组合或反应2和8的组合进行。
根据本发明的方法(III)的实施方案,步骤2)中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(III-2-a):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(III-2-b):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(III-2-c):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或者
酶组合(III-2-d):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合。
具体地,步骤2)可按照上面所述的反应9、10、13、15、16、17和18的组合,反应9、10、14、15、16、17和18的组合,或反应9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应9、10、13、15、16和19的组合,反应9、10、14、15、16和19的组合,或者反应9、10、11、12、15、16和19的组合进行。
根据本发明的方法(III)的实施方案,步骤3)中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
具体地,步骤3)可按照上面所述的反应20进行。
本发明还提供一种合成淀粉的方法(IV),其包括以下步骤:
步骤①:甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为二羟丙酮;
步骤②:步骤①得到的二羟丙酮,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤③:步骤②得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉。
根据本发明的方法(IV)的实施方案,步骤①中所使用的酶为经过一步或多步反应催化甲酸转化为二羟丙酮功能的酶或酶的组合。例如可以为以下的酶组合:
酶组合(IV-1-a):具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶与具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合;
酶组合(IV-1-b):具有催化甲酸转化为甲酰辅酶A功能的酶、具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶与具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合;或
酶组合(IV-1-c):具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶、具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶与具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合。
具体地,步骤①可以按照上面所述的反应3和8的组合,反应4、7和8的组合或者反应5、6、7和8的组合进行。
根据本发明的方法(IV)的实施方案,步骤②中所使用的酶为经过一步或多步反应催化二羟丙酮转化为直链淀粉功能的酶或酶的组合。例如可以为以下的酶组合:
酶组合(IV-2-a):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(IV-2-b):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(IV-2-c):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或
酶组合(IV-2-d):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合。
具体地,步骤②可按照上面所述的反应9、10、13、15、16和19的组合,反应9、10、14、15、16和19的组合,反应9、10、13、15、16、17和18的组合,反应9、10、14、15、16、17和18的组合,反应9、10、11、12、15、16和19的组合或者反应9、10、11、12、15、16、17和18的组合进行。
根据本发明的方法(IV)的实施方案,步骤③中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
具体地,步骤③可按照上面所述的反应20进行。
本发明还提供一种合成淀粉的方法(V),其包括以下步骤:
步骤①:甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为甲醛;
步骤②:步骤①得到的甲醛,在一个或多个酶的催化下,转化为二羟丙酮;
步骤③:步骤②得到的二羟丙酮,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤④:步骤③得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉。
根据本发明的方法(V)的实施方案,步骤①中所使用的酶为单独的具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶;或者为以下的酶组合:酶组合(V-1-a):具有催化甲醛转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶,或酶组合(V-1-b):具有催化甲醛转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的组合。
具体地,步骤①可以按照上面所述的反应3,反应4和7的组合或者反应5、6和7的组合进行。
根据本发明的方法(V)的实施方案,步骤②中所使用的酶为具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶。
具体地,步骤②可以按照上面所述的反应8进行。
根据本发明的方法(V)的实施方案,步骤③中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(V-3-a):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(V-3-b):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(V-3-c):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或
酶组合(V-3-d):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合。
具体地,步骤③可按照上面所述的反应9、10、13、15、16和19的组合,反应9、10、14、15、16和19的组合,反应9、10、13、15、16、17和18的组合,反应9、10、14、15、16、17和18的组合,反应9、10、11、12、15、16和19的组合或者反应9、10、11、12、15、16、17和18的组合进行。
根据本发明的方法(V)的实施方案,步骤④中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
具体地,步骤④可按照上面所述的反应20进行。
本发明还提供一种合成淀粉的方法(VI),其包括以下步骤:
步骤①:甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为甲醛;
步骤②:步骤①得到的甲醛,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物,F即D-3-磷酸甘油醛;
步骤③:步骤②得到的D-3-磷酸甘油醛,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物I即D-葡萄糖-6-磷酸;
步骤④:步骤③得到的D-葡萄糖-6-磷酸,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤⑤:步骤④得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉。
根据本发明的方法(VI)的实施方案,步骤①中所使用的酶为酶组合(VI-1):具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶和具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的组合。
具体地,步骤①可按照上面所述的反应3,反应4和7的组合或者反应5、6和7的组合进行。
根据本发明的方法(VI)的实施方案,步骤②中所使用的酶为酶组合(VI-2):具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶和具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶的组合。
具体地,步骤②可按照上面所述的反应8、9和10的组合进行。
根据本发明的方法(VI)的实施方案,步骤③中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(VI-3-a):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合;或者
酶组合(VI-3-b):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合。
具体地,步骤③可按照上面所述的反应11、12和15的组合进行,或者步骤③也可以按照上面所述的反应13和15的组合或者反应14和15的组合进行。
根据本发明的方法(VI)的实施方案,步骤④中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(VI-4-a):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;或者
酶组合(VI-4-b):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合。
具体地,步骤④可按照上面所述的反应16、17和18的组合进行,或者步骤④也可以按照上面所述的反应16和19的组合进行。
根据本发明的方法(VI)的实施方案,步骤⑤中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
具体地,步骤⑤可按照上面所述的反应20进行。
本发明还提供一种二羟丙酮的合成方法,其包括甲醇为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为二羟丙酮的步骤。
根据本发明的实施方案,所述二羟丙酮的合成方法包括以下步骤:
步骤(1):甲醇为原料,在具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛;以及
步骤(2):步骤(1)得到的甲醛在具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的催化下,转化为二羟丙酮。
根据本发明的实施方案,步骤(1)中所述具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶包括但不限于醇氧化酶(AOX)或其突变体、胆甾醇氧化酶或其突变体、醇脱氢酶(ADH)或其突变体、甲醇脱氢酶或其突变体、L-苏氨酸-3-脱氢酶或其突变体、环己醇脱氢酶或其突变体、正丁醇脱氢酶或其突变体。
步骤(2)中所述具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶包括但不限于甲醛裂解酶(FLS)或其突变体(FLS-M),羟基乙醛合酶(GALS)或其突变体。
根据本发明的实施方案,步骤(1)和(2)可以同步进行,也可以分步进行。
根据本发明的实施方案,步骤(1)和(2)同步进行,例如反应体系包含底物甲醇、具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶以及具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶。例如,反应体系中包含底物甲醇、醇氧化酶或醇脱氢酶、以及甲醛裂解酶。此外,反应体系中还可任选地包含辅助酶,如过氧化氢酶。
根据本发明的实施方案,所述反应体系还包含NaCl、Mg2+、Zn2+等。
根据本发明的实施方案,所述反应体系pH为6.5-8.5,例如7-8,例如以Hepes缓冲液提供所述pH环境。
根据本发明,本发明的各方法的各个步骤、亚步骤以及具体反应(如反应1、反应2等,反应编号可参见上述发明内容部分或者附图1)可以分步进行,或者任何相邻的两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个步骤、亚步骤或者具体反应也可以同步进行,或者所有步骤或者具体反应可以同步进行。所述“相邻的”步骤、亚步骤或具体反应,是指前一步骤、亚步骤或具体反应的产物可用作后一步骤、亚步骤或具体反应的反应物,则这两个步骤、亚步骤或具体反应可称之为“相邻的”。所述“分步进行”是指前一步反应结束后,进行或者不进行产物的纯化,再投入催化后一步反应的酶或者所需组分进行后一步反应;所述“同步进行”是指在反应开始时,将催化所涉及的各个反应的酶与底物一起投入反应器中进行反应。例如,以下以“-”连接的各反应表示它们同步进行:反应2-8,反应4-7,反应5-6-7,反应5-6-7-8,反应8-9-10,反应11-12-15,反应13-15,反应14-15,反应16-17-18,反应16-19,反应9-10-11-12-15-16-17-18,反应9-10-13-15-16-17-18,反应9-10-14-15-16-17-18,反应9-10-13-15-16-19,反应9-10-11-12-15-16-17-18-20,反应2-8-9-10-11-12-15-16-17-18。例如,“反应2-8”表示反应2和反应8同步进行;“反应4-7”表示反应4和反应7同步进行,以此类推。
在本发明的上下文中,“反应A和B...的组合”是指通过进行组合中的各个反应实现了从反应物到产物的转化,组合中的各反应可以分步进行也可以同步进行。例如,“反应4和7的组合”是指通过进行反应4和反应7实现了从甲酸到甲醛的转化,其中反应4和反应7可分步进行也可以同步进行;“反应9、10、11、12、15、16和19的组合”是指通过进行反应9、反应10、反应11、反应12、反应15、反应16和反应19实现了从二羟丙酮到直链淀粉的转化,其中反应9、反应10、反应11、反应12、反应15、反应16和反应19中的相邻的两个、三个、四个、五个、六个或七个反应可分步进行也可同步进行;以此类推。
根据本发明,各方法中同一步骤或者亚步骤中原料和产物均相同的不同反应之间可以相互替换。
根据本发明,各方法中不同步骤或亚步骤中的各个反应之间可以随意进行组合,只要后一反应以前一反应的产物作为原料且它们的组合能够实现终产物淀粉的合成即可。
例如,化合物1(即直链淀粉)可以以二羟丙酮为原料通过以下反应的组合来实现(反应编号参见图1):反应9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应9、10、13、15、16、17和18的组合,反应9、10、14、15、16、17和18的组合,反应9、10、11、12、15、16和19的组合,反应9、10、13、15、16和19的组合,反应9、10、14、15、16和19的组合。
化合物2(即支链淀粉)可以以二羟丙酮为原料通过以下反应的组合来实现(反应编号参见图1):反应9、10、11、12、15、16、17、18和20的组合,反应9、10、13、15、16、17、18和20的组合,反应9、10、14、15、16、17、18和20的组合,反应9、10、11、12、15、16、19和20的组合,反应9、10、13、15、16、19和20的组合,反应9、10、14、15、16、19和20的组合。
化合物1(即直链淀粉)可以以甲醛为原料通过以下反应的组合来实现(反应编号参见图1):反应8、9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应8、9、10、13、15、16、17和18的组合,反应8、9、10、14、15、16、17和18的组合,反应8、9、10、11、12、15、16和19的组合,反应8、9、10、13、15、16和19的组合,反应8、9、10、14、15、16和19的组合。
化合物2(即支链淀粉)可以以甲醛为原料通过以下反应的组合来实现(反应编号参见图1):反应8、9、10、11、12、15、16、17、18和20的组合,反应8、9、10、13、15、16、17、18和20的组合,反应8、9、10、14、15、16、17、18和20的组合、反应8、9、10、11、12、15、16、19和20的组合,反应8、9、10、13、15、16、19和20的组合,反应8、9、10、14、15、16、19和20的组合。
化合物1(即直链淀粉)可以以甲醇、甲酸为原料通过以下反应的组合来实现(反应编号参见图1):反应1、8、9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应2、8、9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应3、8、9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应4、7、8、9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应5、6、7、8、9、10、11、12、15、16、17和18的组合,反应1、8、9、10、13、15、16、17和18的组合,反应2、8、9、10、13、15、16、17和18的组合,反应3、8、9、10、13、15、16、17和18的组合,反应4、7、8、9、10、13、15、16、17和18的组合,反应5、6、7、8、9、10、13、15、16、17和18的组合,反应1、8、9、10、14、15、16、17和18的组合,反应2、8、9、10、14、15、16、17和18的组合,反应3、8、9、10、14、15、16、17和18的组合,反应4、7、8、9、10、14、15、16、17和18的组合,反应5、6、7、8、9、10、14、15、16、17和18的组合,反应1、8、9、10、11、12、15、16和19的组合,反应2、8、9、10、11、12、15、16和19的组合,反应3、8、9、10、11、12、15、16和19的组合,反应4、7、8、9、10、11、12、15、16和19的组合,反应5、6、7、8、9、10、11、12、15、16和19的组合,反应1、8、9、10、13、15、16和19的组合,反应2、8、9、10、13、15、16和19的组合,反应3、8、9、10、13、15、16和19的组合,反应4、7、8、9、10、13、15、16和19的组合,反应5、6、7、8、9、10、13、15、16和19的组合,反应1、8、9、10、14、15、16和19的组合,反应2、8、9、10、14、15、16和19的组合,反应3、8、9、10、14、15、16和19的组合,反应4、7、8、9、10、14、15、16和19的组合,以及反应5、6、7、8、9、10、14、15、16和19的组合。
化合物2(即支链淀粉)可以以甲醇、甲酸为原料通过以下反应的组合来实现(反应编号参见图1):反应1、8、9、10、11、12、15、16、17、18和20的组合,反应2、8、9、10、11、12、15、16、17、18和20的组合,反应3、8、9、10、11、12、15、16、17、18和20的组合,反应4、7、8、9、10、11、12、15、16、17、18和20的组合,反应5、6、7、8、9、10、11、12、15、16、17、18和20的组合,反应1、8、9、10、13、15、16、17、18和20的组合,反应2、8、9、10、13、15、16、17、18和20的组合,反应3、8、9、10、13、15、16、17、18和20的组合,反应4、7、8、9、10、13、15、16、17、18和20的组合,反应5、6、7、8、9、10、13、15、16、17、18和20的组合,反应1、8、9、10、14、15、16、17、18和20的组合,反应2、8、9、10、14、15、16、17、18和20的组合,反应3、8、9、10、14、15、16、17、18和20的组合,反应4、7、8、9、10、14、15、16、17、18和20的组合,反应5、6、7、8、9、10、14、15、16、17、18和20的组合,反应1、8、9、10、11、12、15、16、19和20的组合,反应2、8、9、10、11、12、15、16、19和20的组合,反应3、8、9、10、11、12、15、16、19和20的组合,反应4、7、8、9、10、11、12、15、16、19和20的组合,反应5、6、7、8、9、10、11、12、15、16、19和20的组合,反应1、8、9、10、13、15、16、19和20的组合,反应2、8、9、10、13、15、16、19和20的组合,反应3、8、9、10、13、15、16、19和20的组合,反应4、7、8、9、10、13、15、16、19和20的组合,反应5、6、7、8、9、10、13、15、16、19和20的组合,反应1、8、9、10、14、15、16、19和20的组合,反应2、8、9、10、14、15、16、19和20的组合,反应3、8、9、10、14、15、16、19和20的组合,反应4、7、8、9、10、14、15、16、19和20的组合,以及反应5、6、7、8、9、10、14、15、16、19和20的组合。
本申请的上下文中所使用的酶当采用“具有催化A物质转化为B物质功能的酶”这样的表述时,是指所述酶可以催化A物质转化为B物质的反应,所述反应可以为一步反应也可以为多步反应,所述酶可以是由A物质生成B物质中任一步反应所需的酶,因此,所述酶可以是催化一步反应的单一的酶,也可以是催化多步反应中的一步或多步的酶的组合。具有所述催化功能的酶的氨基酸序列和来源不受特别限制,只要它们能够实现所述催化功能即可。具体而言,“具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶”是指可以催化甲醇转化为甲醛的反应的酶,包括但不限于醇氧化酶(AOX,EC 1.1.3.13)或其突变体、胆甾醇氧化酶(EC 1.1.3.6)或其突变体、醇脱氢酶(ADH,EC 1.1.1.1;EC 1.1.1.2;EC 1.1.1.71;EC 1.1.2.8)或其突变体、甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244;EC 1.1.2.7;EC 1.1.2.B2)或其突变体、L-苏氨酸-3-脱氢酶(EC 1.1.1.103)或其突变体、环己醇脱氢酶(EC 1.1.1.245或其突变体)、正丁醇脱氢酶(EC 1.1.2.9)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于毕赤酵母、假丝酵母、链霉菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、红球菌、陶厄氏菌等不同的物种。“具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶”是指可以催化甲酸转化为甲醛的反应的酶,包括但不限于醛脱氢酶(ADH,EC 1.2.1.3;EC 1.2.1.4;EC 1.2.1.5)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于伯克霍尔德菌、假单胞菌、醋酸菌、酵母等不同的物种。“具有催化甲酸转化为甲酰辅酶A功能的酶”是指可以催化甲酸转化为甲酰辅酶A的反应的酶,包括但不限于乙酰-辅酶A合成酶(ACS,EC 6.2.1.1)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、穆尔氏菌、热棒菌等不同的物种。“具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶”是指可以催化甲酰辅酶A转化为甲醛的反应的酶,包括但不限于乙醛脱氢酶(ACDH,EC 1.2.1.10)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于李斯特菌、假单胞菌、不动杆菌、贾第鞭毛虫属等不同的物种。“具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶”是指可以催化甲酸转化为甲酰磷酸的反应的酶,包括但不限于乙酸激酶(ACKA,EC 2.7.2.1)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌、甲烷八叠球菌等不同的物种。“具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶”是指可以催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A的反应的酶,包括但不限于磷酸乙酰基转移酶(PTA,EC 2.3.1.8)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、梭菌、热袍菌、甲烷八叠球菌等不同的物种。“具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶”是指可以催化甲醛转化为二羟丙酮的反应的酶,包括但不限于甲醛裂解酶(FLS)或其突变体(FLS-M),羟基乙醛合酶(GALS)或其突变体。“具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶”是指可以催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮的反应的酶,包括但不限于丙糖激酶(EC 2.7.1.28)或其突变体、羟基丙酮激酶(DAK,EC 2.7.1.29)或其突变体、甘油激酶(EC 2.7.1.30)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、梭菌、酿酒酵母、毕赤酵母、柠檬酸杆菌、嗜热芽孢杆菌、人等不同的物种。“具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶”是指可以催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛的反应的酶,包括但不限于磷酸丙糖异构酶(TPI,EC 5.3.1.1)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、酵母、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、拟南芥、人等不同的物种。
“具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶”是指可以催化D-3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮转化为D-果糖-1,6-二磷酸的反应的酶,包括但不限于果糖-二磷酸醛缩酶(FBA,EC 4.1.2.13)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、藻类、梭菌、人等不同的物种。“具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶”是指可以催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸的反应的酶,包括但不限于果糖-二磷酸酶(FBP,EC 3.1.3.11)或其突变体(FBP-M)、肌醇磷酸酶(EC3.1.3.25)或其突变体、N-酰基神经氨(糖)-酸-9-磷酸酶(EC 3.1.3.29)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母、芽孢杆菌、藻类、梭菌、人等不同的物种。“具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶”是指可以催化D-3-磷酸甘油醛和二羟丙酮或磷酸二羟丙酮转化为D-果糖-6-磷酸的反应的酶,包括但不限于6-磷酸果糖醛缩酶(FSA)或其突变体、转醛缩酶(EC 2.2.1.2)或其突变体、6-磷酸果糖醛缩酶磷酸酶(FBAP,EC 4.1.2.13&3.1.3.11)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、酵母、藻类、古菌、人等不同的物种。“具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶”是指可以催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸的反应的酶,包括但不限于葡糖磷酸异构酶(PGI,EC 5.3.1.9)或其突变体、磷酸甘露糖异构酶(EC 5.3.1.8)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、酵母、产甲烷菌、结核杆菌、沙门氏菌、根瘤菌等不同的物种。“具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶”是指可以催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸的反应的酶,包括但不限于磷酸己糖磷酸变位酶(PGM,EC 5.4.2.2)或其突变体、磷酸乙酰葡糖胺变位酶(EC 5.4.2.3)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、乳酸乳球菌、酵母、芽孢杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、玉米、人等不同的物种。“具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶”是指可以催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖的反应的酶,包括但不限于葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶(GlgC,EC 2.7.7.27)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、乳酸乳球菌、酵母、芽孢杆菌、假单胞菌、根癌农杆菌、玉米、土豆等不同的物种。“具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶”是指可以催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉的反应的酶,包括但不限于淀粉合酶(GlgA,EC 2.4.1.21)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、藻类、玉米、土豆等不同的物种。“具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶”是指可以催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉的反应的酶,包括但不限于单独的淀粉磷酸化酶(αGP,EC 2.4.1.1)或其突变体,或者葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶(GlgC,EC2.7.7.27)或其突变体与淀粉合酶(GlgA,EC 2.4.1.21)或其突变体的组合,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、藻类、玉米、土豆等不同的物种。“具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶”是指可以催化直链淀粉转化为支链淀粉的反应的酶,包括但不限于1,4-α-D-葡聚糖分支酶(GlgB,EC 2.4.1.18)或其突变体,这些酶可以来源于但不局限于大肠杆菌、芽孢杆菌、弧菌、酵母、玉米、土豆等不同的物种。
在本发明的上下文中所使用的酶或其突变体可以是粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式。所述粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞可商购获得或者按照文献中已知的方法或者本领域的常规方法制备;例如所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶均按照包括如下步骤的方法制备得到:在宿主细胞中表达所述酶或其突变体,得到重组细胞;裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶;所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到:在宿主细胞中表达所述酶或其突变体,得到的重组细胞即为所述全细胞。
有益效果
本发明的方法可以实现从二羟丙酮、甲醛、甲酸以及甲醇等简单化合物至淀粉的人工生物合成,通过与目前已经比较成熟的二氧化碳化学还原等方法偶联,甚至可以以二氧化碳作为起始原料实现淀粉的全人工生物合成。天然淀粉合成需要经过卡尔文循环,共需要21-22步反应,而本发明的方法只需要9-12步反应,减少近一半的反应步骤,并且,本发明的方法不需要公认的限速酶Rubisco,合成速度更具有优势,可大大缩短合成周期。此外,相比于农业种植只能利用空气中低浓度二氧化碳和低能量密度的太阳能,本发明的方法可以利用高浓度的二氧化碳和高能量密度的电能和氢能,更适合工业生产模式,生产周期可从农业种植的数个月缩减到数天,并且有望大幅缩减农业用地、用水,对于解决我国人口多、耕地少、淡水资源有限的问题具有重要意义。除此之外,这些特点也使本发明的方法适合在航天器、空间站等封闭空间实现淀粉的循环供给,对于我国的太空探索战略具有重要意义。
附图说明
图1示出了以甲醇或甲酸为起始原料合成化合物1即直链淀粉和化合物2即支链淀粉的合成路径。
图2示出了化合物1的结构示意图。
图3示出了化合物2的结构示意图。
图4示出了从甲醇到化合物D(即二羟丙酮)的合成路径的产量。
图5示出了从化合物1(即直链淀粉)到化合物2(支链淀粉)的路径反应前后的全波长扫描图谱。
图6示出了从化合物D到化合物1的不同路径的产量。
图7示出了从化合物D到化合物2的不同路径的产量。
图8示出了从甲醇到化合物1的合成路径的产量。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的合成方法做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过已知方法制备。
如无特殊说明,各实施例所涉及的各反应中所使用的催化剂(酶)如下表1所示:
表1各实施例所涉及的各反应中所使用的催化剂
#:FLS基因信息来源于参考文献(Siegel,J.B.,et al.,Computational proteindesign enables anovel one-carbon assimilation pathway.Proc Natl Acad Sci U SA,2015.112(12):p.3704-9.)
其中,醇脱氢酶和醇氧化酶购买自Sigma公司(https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland.html)。醛脱氢酶、乙酰-辅酶A合成酶、乙酸激酶、磷酸乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、过氧化氢酶、甲酸脱氢酶、无机焦磷酸酶通过PCR或基因合成的方式获得,并通过简单克隆(Simple Cloning)(You,C.,et al.(2012).″Simple Cloning via DirectTransformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillussubtilis.″Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法分别克隆至pET20b、pET21b、pET26b和pET28a载体(Novagen,Madison,WI)中,获得相应的表达载体pET28a-FADH、pET21b-ACS、pET28a-ACKA、pET28a-PTA、pET21b-ACDH、pET26b-CAT、pET20b-FDH、pET21b-PPase。这八个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并进行蛋白的表达与纯化。
甲醛裂解酶、羟基丙酮激酶、磷酸丙糖异构酶通过PCR或基因合成的方式获得,并通过简单克隆(You,C.,et al.(2012).Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法分别克隆至pET21a、pET21b和pET28a载体(Novagen,Madison,WI)中,获得相应的表达载体pET21a-FLS、pET21b-TPI、pET28a-DAK。这三个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并进行蛋白的表达与纯化。
果糖-二磷酸醛缩酶、果糖-二磷酸酶、6-磷酸果糖醛缩酶、6-磷酸果糖醛缩酶磷酸酶、葡糖磷酸异构酶通过PCR或基因合成的方式获得,并通过简单克隆(You,C.,et al.(2012).Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法分别克隆至pET21b载体(Novagen,Madison,WI)中,获得相应的表达载体pET21b-FBA、pET21b-FBP、pET21b-FSA、pET21b-FBAP、pET21b-PGI。这五个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并进行蛋白的表达与纯化。
磷酸己糖磷酸变位酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、淀粉合酶、淀粉磷酸化酶通过PCR或基因合成的方式获得,并通过简单克隆(You,C.,et al.(2012).Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法分别克隆至pET20b、pET21b载体(Novagen,Madison,WI)中,获得相应的表达载体pET21b-PGM、pET21b-GlgC、pET21b-GlgA、pET20b-αGP。这四个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并进行蛋白的表达与纯化。
1,4-α-D-葡聚糖分支酶通过PCR或基因合成的方式获得,并通过简单克隆(You,C.,et al.(2012).Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法分别克隆至pET28a载体(Novagen,Madison,WI)中,获得相应的表达载体pET28a-GlgB。这一个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并进行蛋白的表达与纯化。
实施例1从甲酸或甲醇到化合物C即甲醛的合成
从甲酸或甲醇到化合物C的转化有五个路径可以实现,分别为:路径1(从甲醇到甲醛),路径2(从甲醇到甲醛),路径3(从甲酸到甲醛),路径4-7(从甲酸到甲酰辅酶A再到甲醛),以及路径5-6-7(从甲酸到甲酰磷酸、再到甲酰辅酶A、再到甲醛)(反应编号见图1)。首先选择可以催化各路径的各化学反应的催化剂(即酶)(见表1),但具有相应催化功能的酶并不限定于表1列出的那些。然后将不同的催化剂按照路径组合,建立相应的反应体系,反应一段时间后,检测甲醛的产量。
化合物C的产量按照以下方法检测:在200μL水中,加入50μL适当稀释的待测溶液,再加入25μL乙酰丙酮溶液(100mL乙酰丙酮溶液含有0.5mL乙酰丙酮,50g乙酸铵和6mL冰乙酸),在60℃,反应15min后,离心取200μL上清液检测OD414值,并根据甲醛标准曲线计算化合物C的含量。
路径1:反应体系是pH8.5的Tris缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,ADH3.5mg/mL,NAD+100mM,甲醇1M;反应3小时,甲醛产量为0.27mM。
路径2:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,AOX 1U/mL,CAT 300U/mL(辅助酶,用于消除AOX产生的过氧化氢),甲醇20mM;反应0.5小时,甲醛产量为12mM。
路径3:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,FADH 4mg/mL,NADH 100mM,甲酸钠250mM,反应3小时,甲醛产量为0.1mM。
路径4-7:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,ATP 2mM,NADH 1.5mM,CoA 0.1mM,ACS 3.7mg/mL,ACDH 0.2mg/mL,FDH 0.024mg/mL(辅助酶,用于再生NADH),PPase 0.1mg/mL(辅助酶,用于水解焦磷酸),甲酸钠50mM,反应1小时,甲醛产量为0.6mM。
路径5-6-7:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,NADH 0.5mM,ATP 10mM,CoA 0.1mM,β-巯基乙醇2mM,ACKA 0.24mg/mL,PTA 1.2mg/mL,ACDH 0.2mg/mL,FDH 0.024mg/mL(辅助酶,用于再生NADH),甲酸钠50mM;反应1小时,甲醛产量为2mM。
实施例2从甲醇到化合物D即二羟丙酮的合成
从甲醇到化合物D的合成可通过以下路径实现:
路径2-8:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,AOX 1U/mL,CAT 300U/mL,甲醇20mM,FLS 5mg/mL;反应2小时,化合物D的产量为2.1mM。
化合物D的检测方法:5mM稀硫酸为流动相,HX87柱子(Bio-Rad,Aminex@,300mm×78mm),流速0.6mL/min,上样量为10μL/针,根据DHA标准曲线计算化合物D的产量。图4中示出了从甲醇到化合物D的路径2-8的产量。
实施例3从甲醛到化合物D即二羟丙酮的合成
从甲醛到化合物D的合成可通过以下路径实现:
路径8:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,甲醛25mM,TPP 0.5mM,FLS(来源:Pseudomonas putida)10mg/mL;反应2小时,采用实施例2中的方法检测化合物D,结果:利用甲醛裂解酶FLS合成化合物D的产量为7.092mM。
实施例4从甲酸到化合物D即二羟丙酮的合成
从甲醛到化合物D的合成可通过以下路径实现:
路径5-6-7-8:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,甲酸钠50mM,TPP 0.5mM,CoA 0.1mM,ATP 10mM,β-巯基乙醇2mM,ACKA 0.24mg/mL,PTA1.2mg/mL,ACDH 0.2mg/mL,FDH 0.024mg/mL,NADH 0.5mM,30℃反应1-1.5小时后,加入FLS(来源:Pseudomonas putida)7.5mg/mL,30℃继续反应3.5小时后,采用气相-质谱方法检测化合物D,结果路径5-6-7-8合成化合物D的产量为0.23mM。
化合物D的气相-质谱检测方法如下:
1)样品预处理,500μL适当稀释的样品,100μL 200mM的PFBOA(O-(2,3,4,5,6-Pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride,O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)羟胺盐酸盐),30℃反应1小时,加入100μL正己烷萃取,取40μL有机相加入等体积的MSTFA(N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺),37℃反应2小时。
2)气相色谱条件:Agilent 7890A气相色谱仪,载气为氦气,载气流速为1.2mL/min,色谱柱为DB-5MS Ultra Inert毛细管柱(30m×250μm×0.25μm),起始温度60℃,保持1分钟,运行1分钟,升温速率1,5℃/min至240℃,运行9分钟,升温速率2,25℃/min至300℃,保持5分钟,运行22分钟,进样量1μL/针,进样口温度250℃。
3)质谱条件:Agilent 7200Q-TOF质谱仪,溶剂延迟设置4分钟,电力方式为EI,电子能量70eV,离子源温度:230℃,扫描范围:35-550amu,质谱采集速率5spectra/s。
4)数据分析,使用Mass Hunter软件Qualitative Analysis,通过NIST化学数据库比对和人工解析确定目标代谢物,计算DHA的产量。
实施例5从化合物C即甲醛到化合物F即D-3-磷酸甘油醛的合成
从化合物C到化合物F的转化可通过路径8-9-10(反应编号见图1)实现。首先选择可以催化路径中各化学反应的催化剂(见表1),但具有所述催化功能的酶并不限定于表1列出的那些。然后将不同的催化剂按照路径组合,建立相应的反应体系,反应一段时间后,检测化合物F的产量。
化合物E和化合物F为同分异构体,但由于自由能不利的原因,化合物F的累积量会很低,因此检测化合物E+化合物F的产量。化合物E+化合物F的产量按照以下方法检测:100μL的检测体系包括pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,20U/mL磷酸甘油醛脱氢酶,20U/mL磷酸丙糖异构酶,1mM的NAD+,4mM砷酸钾;反应终止后,取适当稀释的待测样品,检测其OD340的变化。根据3-磷酸甘油醛的标准曲线计算化合物E+化合物F的产量。
路径8-9-10:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,ATP 10mM,硫胺素焦磷酸0.5mM,FLS 5mg/mL,DAK 0.1mg/mL,TPI 0.14mg/mL,化合物C10mM;反应2小时,化合物E+化合物F产量为1.25mM。
实施例6从化合物F即D-3-磷酸甘油醛到化合物I即D-葡萄糖-6-磷酸的合成
从化合物F到化合物I的转化可通过三个路径实现,分别为路径11-12-15,路径13-15以及路径14-15(反应编号见图1)。首先选择可以催化各路径中各化学反应的催化剂(见表1),但具有所述催化功能的酶并不限定于表1列出的那些。然后将不同的催化剂按照路径组合,建立相应的反应体系,反应一段时间后,检测化合物I的产量。
化合物I的产量按照以下方法检测:100μL的检测体系包括pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,20U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶,1mM的NAD+,20μL反应终止后,取适当稀释的待测样品,检测其OD340的变化。根据6-磷酸葡萄糖的标准曲线计算化合物I的产量。
路径11-12-15:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,化合物F 3mM,化合物E 3mM,FBA 0.1mg/mL,FBP 0.2mg/mL和PGI 0.17mg/mL;反应0.5小时,化合物I产量为2.3mM。
路径13-15:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,化合物F 3mM,化合物D 3mM,FSA 0.3mg/mL,PGI 0.17mg/mL;反应0.5小时,化合物I产量为1.28mM。
路径14-15:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,化合物F 3mM,化合物E 3mM,FBAP 0.3mg/mL和PGI 0.17mg/mL;反应0.5小时,化合物I产量为0.13mM。
实施例7从化合物I即D-葡萄糖-6-磷酸到化合物1即直链淀粉的合成
从化合物I到化合物1的转化可通过两个路径实现,分别是路径16-17-18和路径16-19(反应编号见图1)。首先选择可以催化各路径中各化学反应的催化剂(见表1),但具有所述催化功能的酶并不限定于表1列出的那些。然后将不同的催化剂按照路径组合,建立相应的反应体系,反应一段时间后,检测化合物1的产量。
化合物1的产量按照以下方法检测:化合物1的定量检测,反应终止后适当稀释样品,然后与30U/mLα-淀粉酶和33U/mL葡萄糖淀粉酶孵育一定时间,直到化合物1完全被水解为葡萄糖,然后通过葡萄糖测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司,E1010)检测葡萄糖含量。化合物1的产量用葡萄糖含量表示。
路径16-17-18:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,化合物I 5mM,ATP 10mM,糊精10mg/L,PGM 0.275mg/mL,GlgC 0.46mg/mL,PPase0.2mg/mL和GlgA 0.235mg/mL;反应3小时,化合物1产量为436.8mg/L。
路径16-19:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,化合物I 5mM,糊精10mg/L,PGM 0.275mg/mL,和αGP 0.13mg/mL,反应3小时,化合物1产量为100.7mg/L。
实施例8从化合物1即直链淀粉到化合物2即支链淀粉的合成
从化合物1到化合物2的转化可通过路径20实现(反应编号见图1)。首先选择可以催化化学反应20的催化剂(见表1),但具有所述催化功能的酶并不限定于表1列出的那些。然后将不同的催化剂按照路径组合,建立相应的反应体系,反应一段时间后,检测化合物2的产量。
化合物2的产量按照以下方法检测:1)化合物2的定性检测:根据直链淀粉遇到碘液变蓝色(最大吸收波长在620nm左右),支链淀粉遇到碘液变紫红色(最大吸收波在长530nm左右)的原理,通过碘染检测反应前后化合物最大吸收波长的变化,定性判断化合物2是否产生;2)化合物2的定量检测,反应终止后,取适当稀释样品,然后与30U/mLα-淀粉酶和33U/mL葡萄糖淀粉酶孵育一定时间,直到化合物2完全被水解为葡萄糖,然后通过葡萄糖测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司,E1010)检测葡萄糖含量。化合物2的产量用葡萄糖含量表示。
路径20:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,化合物1 3g/L,GlgB 0.05mg/mL;反应3小时,化合物2产量为2.7g/L。图5示出了从化合物1到化合物2的路径反应前后的全波长扫描图谱。
实施例9从化合物D即二羟丙酮到化合物1即直链淀粉的合成
从化合物D到化合物I的转化可通过以下路径实现:
路径9-10-11-12-15-16-17-18:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,DAK 0.077mg/mL,TPI 0.33mg/mL,FBA 0.15mg/mL,FBP-M 0.6mg/mL,PGI 0.069mg/mL,PGM 0.565mg/mL,GlgA 0.5mg/mL,GlgC-M 1mg/mL,EDTA 0.1mM,ADP1mM,多聚磷酸0.2mM,PPK 0.22mg/mL(多聚磷酸激酶,用于ATP再生),化合物D 3mM,糊精10mg/L。反应5小时,化合物1产量为116.2mg/L。
路径9-10-13-15-16-17-18:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,DAK 0.077mg/mL,TPI 0.33mg/mL,FSA 0.3mg/mL,PGI 0.069mg/mL,PGM0.565mg/mL,GlgA 0.5mg/mL,GlgC-M 1mg/mL,EDTA 0.1mM,ADP 1mM,多聚磷酸0.2mM,PPK0.22mg/mL(多聚磷酸激酶,用于ATP再生),化合物D 3mM,糊精10mg/L。反应5小时,化合物1产量为74.5mg/L。
路径9-10-14-15-16-17-18:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,DAK 0.077mg/mL,TPI 0.33mg/mL,FBAP 2.5mg/mL,PGI 0.069mg/mL,PGM0.565mg/mL,GlgA 0.5mg/mL,GlgC-M 1mg/mL,EDTA 0.1mM,ADP 1mM,多聚磷酸0.2mM,PPK0.22mg/mL(多聚磷酸激酶,用于ATP再生),化合物D 3mM,糊精10mg/L。反应5小时,化合物1产量为134.4mg/L。
路径9-10-13-15-16-19:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl 100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,DAK 0.077mg/mL,TPI 0.33mg/mL,FSA 0.3mg/mL,PGI 0.069mg/mL,PGM0.565mg/mL,αGP 1mg/mL,EDTA 0.1mM,ADP 1mM,多聚磷酸0.2mM,PPK 0.22mg/mL(多聚磷酸激酶,用于ATP再生),化合物D10mM,糊精10mg/L。反应23小时,化合物1产量为206.55mg/L。图6示出了从化合物D到化合物1的路径的产量。
实施例9中所用的FBP-M是果糖-二磷酸酶(FBP)的突变体,共含有四个突变位点,分别为第104位的赖氨酸(由AAA编码)突变为谷氨酰胺(由CAG编码)、第132位的精氨酸(由CGC编码)突变为异亮氨酸(由ATT编码)、第210位的酪氨酸(由TAC编码)突变为苯丙氨酸(由TTT编码)、第218位的赖氨酸(由AAG编码)突变为谷氨酰胺(由CAG编码)。GlgC-M是葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶(GlgC)的突变体,共含有两个个突变位点,分别为第295位的脯氨酸(由CCG编码)突变为天冬氨酸(由GAT编码)、第336位的甘氨酸(由GGC编码)突变为天冬氨酸(由GAT编码)。通过融合PCR的方法获得含有目的突变的基因片段,并通过简单克隆(You,C.,et al.(2012).″Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNAMultimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis.″Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法均克隆至pET21b载体(Novagen,Madison,WI)中,获得相应的表达载体pET21b-FBP-M以及pET21b-GlgC-M。这两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并进行蛋白的表达与纯化。
实施例10从化合物D即二羟丙酮到化合物2即支链淀粉的合成
从化合物D到化合物2的合成可通过以下路径实现:
路径9-10-11-12-15-16-17-18-20:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,DAK 0.77mg/mL,TPI 0.33mg/mL,FBA 0.15mg/mL,FBP-M 0.43mg/mL,PGI 0.1mg/mL,PGM 0.565mg/ml,GlgA 0.47mg/mL,GlgC-M 0.92mg/mL,GlgB 0.02mg/mL,EDTA 0.1mM,ADP 1mM,多聚磷酸0.4mM(每小时补加0.2mM),PPK 0.44mg/mL(多聚磷酸激酶,用于ATP再生),化合物D 20mM,糊精0.1g/L。反应4小时,化合物2产量为1107.77mg/L。图7示出了从化合物D到化合物2的合成路径的产量。
实施例11从甲醇到化合物1即直链淀粉的合成
从甲醇到化合物1的合成可通过以下路径实现:
路径2-8-9-10-11-12-15-16-17-18:反应体系是pH7.5的Hepes缓冲液100mM,NaCl100mM,Mg2+5mM,Zn2+10μM,AOX 1U/mL,CAT 300U/mL,FLS-M 5mg/mL,焦磷酸硫胺素0.5mM,DAK 0.035mg/mL,TPI 0.33mg/mL,FBA 0.05mg/mL,FBP-M 0.2mg/mL,PGI 0.023mg/mL,PGM0.11mg/mL,GlgA 0.1mg/mL,GlgC-M 0.2mg/mL,EDTA 0.1mM,ADP 1mM,多聚磷酸0.2mM,PPK0.22mg/mL(多聚磷酸激酶,用于ATP再生),甲醇20mM,糊精0.01g/L。反应6小时,化合物1产量为221.1mg/L。图8示出了从甲醇到化合物1的合成路径的产量。
实施例11中所用的FLS-M是甲醛裂解酶(FLS)的突变体,共含有三个突变位点,分别为第28位的异亮氨酸(由ATT编码)突变为亮氨酸(由CTA编码),第90位的苏氨酸(由ACC编码)突变为亮氨酸(由CTG编码),第283位的天冬酰胺(由AAC编码)突变为组氨酸(由CAT编码)。通过融合PCR的方法获得含有目的突变的基因片段,并通过简单克隆(You,C.,et al.(2012).″Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis.″Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET21a载体(Novagen,Madison,WI)中,获得相应的表达载体pET21a-FLS-M。这两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,并进行蛋白的表达与纯化。
实施例11中所使用的FBP-M同实施例9中所使用的FBP-M。
以上实施例说明,本发明的方法可以实现从二羟丙酮、甲醛、甲酸以及甲醇等简单化合物至淀粉的全人工生物合成,并且周期短、产量高。
以上对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (25)
1.一种合成淀粉的方法(I),其包括化合物D即二羟丙酮为原料,在多个酶的催化下,转化为淀粉的步骤;
所述方法包括以下步骤:
步骤(1):化合物D即二羟丙酮为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物F即D-3-磷酸甘油醛;
步骤(2):步骤(1)得到的化合物F,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物I即D-葡萄糖-6-磷酸;和
步骤(3):步骤(2)得到的化合物I,在一个或多个酶的催化下,转化为淀粉。
2.根据权利要求1所述的方法(I),
步骤(1)中所使用的酶具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶与具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶的组合。
3.根据权利要求1所述的方法(I),
步骤(2)中所使用的酶为以下的酶组合:酶组合(I-2-a):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合;或酶组合(I-2-b):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合。
4.根据权利要求1所述的方法(I),
步骤(3)中所使用的酶为以下的酶组合:酶组合(I-3-a):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或酶组合(I-3-b):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶与具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;任选地,组合(I-3-a)或组合(I-3-b)中还包含具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
5.根据权利要求1的方法(I),其中步骤(1)包括以下亚步骤:步骤(1-1):化合物D在一个或多个酶的催化下转化为化合物E,即磷酸二羟丙酮;和
步骤(1-2):步骤(1-1)得到的化合物E在一个或多个酶的催化下转化为化合物F,即D-3-磷酸甘油醛;
步骤(1-1)中所使用的酶为具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶;
步骤(1-2)中所使用的酶为具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶。
6.根据权利要求1的方法(I),步骤(2)包括以下亚步骤:
步骤(2-1):化合物F在一个或多个酶的催化下转化为化合物H,即D-果糖-6-磷酸;和
步骤(2-2):步骤(2-1)得到的化合物H在一个或多个酶的催化下转化为化合物I,即D-葡萄糖-6-磷酸;
步骤(2-1)中所使用的酶为单独的具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶,或者是酶组合(I-2-1):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶与具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶的组合;
步骤(2-2)中所使用的酶为具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶。
7.根据权利要求6的方法(I),
步骤(2-1)如下进行:
化合物F,在具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶的催化下,转化为化合物H;或者,步骤(2-1)如下进行:首先,化合物F,在具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶的催化下,转化为化合物G,即D-果糖-1,6-二磷酸,然后,所得到的化合物G,在具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶的催化下,转化为D-果糖-6-磷酸。
8.根据权利要求1的方法(I),
步骤(3)包括以下亚步骤:
步骤(3-1):化合物I在一个或多个酶的催化下转化为化合物J,即α-D-葡萄糖-1-磷酸;
步骤(3-2):步骤(3-1)得到的化合物J在一个或多个酶的催化下转化为化合物1,即直链淀粉;
以及任选的步骤(3-3):步骤(3-2)得到的化合物1在一个或多个酶的催化下转化为化合物2,即支链淀粉。
9.根据权利要求8的方法(I),
步骤(3-1)中所使用的酶为具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶;
步骤(3-2)中所使用的酶为单独的具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶,或者是酶组合(I-3-2):具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶与具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
步骤(3-3)中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
10.根据权利要求9的方法(I),
步骤(3-2)如下进行:化合物J,在具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的催化下,转化为化合物1,即直链淀粉;或者,步骤(3-2)如下进行:首先,化合物J,在具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶的催化下,转化为化合物K,即腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖;然后,所得的化合物K,在具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的催化下,转化为直链淀粉。
11.根据权利要求1所述的方法(I),其中所述方法(I)在步骤(1)之前还包括步骤(0),以甲醛为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物D即二羟丙酮;步骤(0)中所使用的酶为具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶。
12.根据权利要求11所述的方法(I),其中所述方法(I)在步骤(0)之前还包括步骤(a),甲醇或甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为甲醛。
13.根据权利要求12所述的方法(I),其中步骤(a)中,当以甲醇为原料合成甲醛时,所使用的酶为具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶;当以甲酸为原料合成甲醛时,所使用的酶为具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶。
14.根据权利要求12所述的方法(I),具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶是单独的具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶,或者是酶组合(I-a-1):具有催化甲酸转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶,或酶组合(I-a-2):具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的组合。
15.根据权利要求14所述的方法(I),
步骤(a)按照如下的步骤(a1)、(a2)或(a3)中的任一个进行:
步骤(a1):甲酸为原料,在具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛;
步骤(a2):首先,甲酸为原料,在具有催化甲酸转化为甲酰辅酶A功能的酶的催化下,转化为甲酰辅酶A;然后,甲酰辅酶A在具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛;或者
步骤(a3):首先,甲酸为原料,在具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶的催化下,转为为甲酰磷酸;随后,甲酰磷酸在具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶的催化下,转化为甲酰辅酶A;然后,甲酰辅酶A在具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛。
16.一种合成淀粉的方法(II),其包括以下步骤:
步骤1):甲醇为原料,在多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及任选的步骤2):直链淀粉为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉;
步骤1)中所使用的酶为经过多步反应催化甲醇合成淀粉的酶的组合,选自:
酶组合(II-1-a):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(II-1-b):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(II-1-c):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或者
酶组合(II-1-d):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶、具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;
步骤2)中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
17.一种合成淀粉的方法(III),其包括以下步骤:
步骤1):甲醇为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物D即二羟丙酮;步骤2):步骤1)得到的二羟丙酮,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤3):步骤2)得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉;
步骤1)中所使用的酶为酶组合(III-1):具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶和具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合;
步骤2)中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(III-2-a):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(III-2-b):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(III-2-c):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或者
酶组合(III-2-d):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;
步骤3)中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
18.一种合成淀粉的方法(IV),其包括以下步骤:
步骤①:甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为二羟丙酮;
步骤②:步骤①得到的二羟丙酮,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤③:步骤②得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉;
步骤①中所使用的酶为经过一步或多步反应催化甲酸转化为二羟丙酮功能的酶或酶的组合,选自:
酶组合(IV-1-a):具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶与具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合;
酶组合(IV-1-b):具有催化甲酸转化为甲酰辅酶A功能的酶、具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶与具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合;或
酶组合(IV-1-c):具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶、具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶与具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的组合;
步骤②中所使用的酶为经过一步或多步反应催化二羟丙酮转化为直链淀粉功能的酶或酶的组合,选自:
酶组合(IV-2-a):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(IV-2-b):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(IV-2-c):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或
酶组合(IV-2-d):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
步骤③中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
19.一种合成淀粉的方法(V),其包括以下步骤:
步骤①:甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为甲醛;
步骤②:步骤①得到的甲醛,在一个或多个酶的催化下,转化为二羟丙酮;
步骤③:步骤②得到的二羟丙酮,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤④:步骤③得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉;
步骤①中所使用的酶为单独的具有催化甲酸转化为甲醛功能的酶;或者为以下的酶组合:酶组合(V-1-a):具有催化甲醛转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶,或酶组合(V-1-b):具有催化甲醛转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶与具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的组合;
步骤②中所使用的酶为具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶;
步骤③中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(V-3-a):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(V-3-b):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
酶组合(V-3-c):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;或
酶组合(V-3-d):具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶、具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶、具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶、具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;
步骤④中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
20.一种合成淀粉的方法(VI),其包括以下步骤:
步骤①:甲酸为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为甲醛;
步骤②:步骤①得到的甲醛,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物F即D-3-磷酸甘油醛;
步骤③:步骤②得到的D-3-磷酸甘油醛,在一个或多个酶的催化下,转化为化合物I即D-葡萄糖-6-磷酸;
步骤④:步骤③得到的D-葡萄糖-6-磷酸,在一个或多个酶的催化下,转化为直链淀粉;以及
任选的步骤⑤:步骤④得到的直链淀粉,在一个或多个酶的催化下,转化为支链淀粉;
步骤①中所使用的酶为酶组合(VI-1):具有催化甲酸转化为甲酰磷酸功能的酶、具有催化甲酰磷酸转化为甲酰辅酶A功能的酶和具有催化甲酰辅酶A转化为甲醛功能的酶的组合;
步骤②中所使用的酶为酶组合(VI-2):具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶、具有催化二羟丙酮转化为磷酸二羟丙酮功能的酶和具有催化磷酸二羟丙酮转化为D-3-磷酸甘油醛功能的酶的组合;
步骤③中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(VI-3-a):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-1,6-二磷酸功能的酶、具有催化D-果糖-1,6-二磷酸转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合;或者
酶组合(VI-3-b):具有催化D-3-磷酸甘油醛转化为D-果糖-6-磷酸功能的酶和具有催化D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸功能的酶的组合;
步骤④中所使用的酶为以下的酶组合:
酶组合(VI-4-a):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶、具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖功能的酶和具有催化腺苷二磷酸-α-D-葡萄糖转化为直链淀粉功能的酶的组合;或者
酶组合(VI-4-b):具有催化D-葡萄糖-6-磷酸转化为α-D-葡萄糖-1-磷酸功能的酶和具有催化α-D-葡萄糖-1-磷酸转化为直链淀粉功能的酶的组合;
步骤⑤中所使用的酶为具有催化直链淀粉转化为支链淀粉功能的酶。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法,其中各方法的各个步骤、亚步骤或具体反应分步进行,或者任何相邻的两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个步骤、亚步骤或具体反应同步进行,或者所有步骤或具体反应同步进行。
22.一种二羟丙酮的合成方法,其包括甲醇为原料,在一个或多个酶的催化下,转化为二羟丙酮的步骤;
所述步骤包括以下步骤:
步骤(1):甲醇为原料,在具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶的催化下,转化为甲醛;以及
步骤(2):步骤(1)得到的甲醛在具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶的催化下,转化为二羟丙酮;
步骤(1)中所述具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶选自醇氧化酶(AOX);
步骤(2)中所述具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶选自甲醛裂合酶(FLS)。。
23.根据权利要求22所述的一种二羟丙酮的合成方法,
其中,步骤(1)和(2同步进行,或分步进行。
24.根据权利要求23所述的一种二羟丙酮的合成方法,
当步骤(1)和(2)同步进行时,反应体系包含底物甲醇、所述具有催化甲醇转化为甲醛功能的酶以及所述具有催化甲醛转化为二羟丙酮功能的酶;并任选地包含辅助酶。
25.根据权利要求24所述的一种二羟丙酮的合成方法,所述辅助酶为过氧化氢酶。
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