CN116083468A - 构建以葡萄糖、甘油和co2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株 - Google Patents

构建以葡萄糖、甘油和co2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株。本申请通过对罗尔斯通氏菌基因组中编码N‑乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行突变(G265R)、并敲除编码GntR家族的转录调节因子的nagR使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖。在此基础上构建了一株以可再生底物(葡萄糖、甘油)以及可直接以CO2为碳源合成肌醇的罗尔斯通氏菌H16工程菌株。基于该项技术，不但能够实现生物活性物质的合成，同时也是一种高效消除大气中的温室气体的方法。

Description

构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株。
背景技术
化石燃料的大量使用所释放的温室气体(如CO2)所导致的气候变化是造成极端天气出现的主要因素。通过技术手段来消除大气中的CO2同时利用其作为原料进行燃料、糖及生物活性物质的生产是一种一举两得的手段。光催化和电催化方法为将CO2转化为化学品或染料提供了可行途径。然而，通过该类方式进行CO2的转化需要大量能源的输入。基于微生物细胞工厂的碳回收技术更有应用潜力。最近有报道表明通过代谢工程手段改造后的罗尔斯通氏菌H16能够将CO2直接转化为高价值的化学品。
肌醇(顺-1,2,3,5-反-4,6环己醇)是一种具有五个平面羟基和一个轴向羟基的环多醇。目前，利用体外酶法合成肌醇的路线已被建立起来。然而，体外酶法具有酶寿命短、肌醇分离困难、反应速度慢等缺陷。随着合成生物学技术的发展，利用代谢工程手段直接将可再生原料高效且廉价地转化为肌醇逐渐成为可能。目前已有利用代谢工程手段生产肌醇的报道见于以大肠杆菌和毕赤酵母为宿主菌株。碳源包括纤维素、淀粉和葡萄糖等。但目前尚无利用廉价的可再生碳源甘油或温室气体之一的CO2作为唯一碳源进行肌醇合成的相关报道。
罗尔斯通氏菌H16(Cupriavidus necator H16)是一种兼性化能自养的革兰氏阴性菌株。由于其缺失6-磷酸果糖激酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶，造成了其缺失完整的糖酵解途径和磷酸戊糖途径。葡萄糖-6-磷酸的代谢经由Entner-Doudoroff(ED)途径生成丙酮酸而后进入三羧酸循环或供给聚([R]-3羟基丁酸)合成。作为一个具有潜在“细胞农业”候选菌株，罗尔斯通氏菌H16能够利用广泛的有机物作为碳源(如甘油等)，更为重要的是其通过Calvin-Benson-Bassham(CBB)循环可以直接以CO2作为碳源。由于缺少葡萄糖转运蛋白，其野生型菌株无法利用葡萄糖作为碳源。罗尔斯通氏菌H16具有一个天然PHB合成途径，通过代谢途径的重构，可将该部分碳流量转向合成其他高附加值化合物。目前，利用代谢工程改造后的罗尔斯通氏菌H16已成功实现了以甘油或CO2为碳源的异丁醇、甲基酮、海藻糖和甘露糖等的合成。
发明内容
为实现利用可再生物质及温室气体CO2进行肌醇生产，本发明的目的是提供构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法。
本发明的再一目的是提供提供构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌。
根据本发明的构建产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，包括以下步骤：
(1)将罗尔斯通氏菌基因组中编码N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE(H16_A0312)进行突变，使其编码的蛋白质的第265位氨基酸由G突变为R，并敲除编码GntR家族的转录调节因子nagR(H16_A0310)，使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖，其中，所述N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的编码基因为nagE(H16_A0312)编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2，所述GntR家族的转录调节因子的编码基因为nagR(H16_A0310)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(2)异源表达酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶(ScIPS)基因或大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶(EcIMP)基因，构建突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞，其中，所述酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶(ScIPS)基因为酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶(EcIMP)基因为大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
根据本发明的构建产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，进一步包括以下步骤：
敲除ED途径和/或PHB合成途径中的关键基因，其中，
所述ED途径关键基因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf1(H16_A0316)、zwf2(H16_B1501)和zwf3(H16_B2566)，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述zwf2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述zwf3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述PHB合成途径关键基因为聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1(H16_A1437)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA(H16_A1438)和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1(H16_A1439)，所述聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
SEQ ID NO：1(nagE编码氨基酸序列)
SEQ ID NO：1
MKMDLLPRVQRLGATLMLPIAVLPVAGLLLRLGQPDVFDIKLMAEAGNAVFANLALLFAIGVAVGFARDNNGAAALAGTIGYLVLTTVLKTIDKSLDMGVLAGIVAGAVAGGLYNRYRNVALPPYLGFFSGKRFVPIVTALCCLLLGIVLAYAWAPVQAGINAAGAWLTTAGSAGALVFGLLNRLLLVTGLHHLINTLAWFVFGNYADPATGAAVSGDLHRYFAGDPGAGLFMTGFFPVMMFGLPAACLAMYHETPPARRALVGGMLFSMALTSFLTGITEPIEFSFMFLAPVLYGLHALMTGLSMALCHALDIRLGFTFSAGAIDYVLGYGLSSRGWLAIPLGLAYALVYYGLFRFFIRRFNLLTPGRDEVVPVAAAGGAAQPAAGSVAQQYVEALGGPANLVVVDACTTRLRLNVADIGAVSEPRLKALGVRGVLKRPPNVVQVVIGPQAEQVAGDIRAVLQQAPQATAVVAAAPAVATQASVPAAGAFDPAWWIDALGGAANIASVGVVALTRLRVVVRERARVRADHLAGSQLMWIGDDTAHIAFGHAADGHAAAFERALQAMPT。
SEQ ID NO：2(nagE)
SEQ ID NO：2：
atgaagatggacctgctgcccagggtgcaacgcctgggcgccacgctgatgctgccgattgccgtgctgcccgtggccggcctgctgctgcgcctgggccagcccgacgtattcgacatcaagctgatggccgaggccggcaacgcggtctttgccaacctggccctgctgttcgcgatcggcgtggcggtgggctttgcgcgcgacaacaacggcgcggcggcactggccggcaccatcggctacctggtgctgaccacggtgctgaagaccatcgacaaatcgctcgacatgggcgtgctggccggcatcgtcgccggcgcggtggcgggcgggctctacaatcgctatcgcaatgtcgcgctgccaccctatctgggcttcttttccggcaagcgcttcgttcccatcgtcaccgcgctgtgctgcctgctgctgggcatcgtgctggcctatgcgtgggcgccggtgcaggccggcattaacgcggccggcgcgtggctgaccacggcgggctcggccggcgccttggtgttcgggctgctgaaccggctgctgctggtcaccgggctgcaccacctgatcaataccctggcgtggttcgtgttcggcaactacgccgatccggccacgggggcggcggtatcgggcgacctgcaccgctactttgccggcgaccccggcgcaggcctgttcatgaccggctttttcccggtgatgatgttcggcctgcccgcggcctgcctggcgatgtaccacgagacgccgccggcgcggcgcgcgctggttggcggcatgctgttctcgatggcactgacctcgttcctgaccggcatcaccgagccgatcgagttcagcttcatgttcctggcgccggtgctgtacggcctgcatgcgctgatgaccggcctgtcgatggcgctgtgccatgcgctcgatatccggctgggcttcaccttctcggccggcgcgatcgactatgtgctgggctacgggctgtccagccgcggctggctggcgattccgctggggctggcctatgcgctggtctattacgggctgttccgcttctttatccgccgcttcaacctgctgacgccgggccgcgatgaagtggtgcccgtggcggccgccggcggtgccgcgcagccggccgcgggcagcgtggcgcaacagtatgtcgaagcgctgggcggccctgccaacctggtcgtggtcgatgcctgcaccacgcgtctgcggctgaacgtggccgacatcggcgcggtgtccgagccgcggctcaaggcactgggcgtacgcggcgtgctcaagcgcccgcccaatgtggtgcaggtggtgatcgggccgcaggccgagcaggttgccggtgatatccgcgcggtgctgcagcaggcgccgcaggccacggccgtggtggctgctgcgcccgccgttgctacccaggcgtccgtgccggctgccggtgctttcgatcccgcctggtggatcgatgcgctgggcggcgccgccaatatcgcctcggtcggcgtggtggcactgacgcggctgcgcgtggtggtgcgcgagcgcgcccgggtgcgcgccgaccaccttgcgggcagccagctgatgtggatcggcgatgacaccgcccatatcgccttcggccatgcggcagacggacacgctgccgccttcgagcgcgccctgcaggccatgcccacctga。
SEQ ID NO：3(nagR基因序列)
Atggatcaacggctgcaggctctcaagccggacgaagcggaggcgacgccgatctacctgcaagtggcgcgcaggctggccgcggccatccaggccggccaatggcgggttggcgacgcgctgccgtccgagcgcacgctggtggattcactggagatttcacgcgtcacggcgcggcgcgcgctgcaggtgctggcagaggaaggcgcgatcacgcgcagccgcggcgcgggcacctttgtcgcgccgcgccctgagcagaaggcggcgcggctggacaacttcagcgagctggcgcgccggcgcggcatgacgccggccagcgaactggtggcgttcgaacgccgccgcgccacgccccaggaggctgcggcgctggcgctgcaggaaggggaagagattgtcagcctgacccgcctgcgcaaggccgacgggcaggtcttctggatggatgtcaccacgctggcactggccgtgctgcccgacgccagcgccatcggcgaatcgctgtacgcctacctggagcggatcggcaagccggtgctgcgcgtcaccgaaaggctgcgcgcgatcgtcgccggcgaagcactggccgcgcgcctgcagatcgcgcccggcgagccgctgctgcatatcctgcgcaccggctacacccatggcgaccagccggtcgaactgaccgacggctactgcctgaacgatttctacgagctgaagcagtag。
SEQ ID NO：4(ScIPS基因序列)
atgaccgaggacaacatcgccccgatcaccagcgtgaaggtggtgaccgacaagtgcacctacaaggacaacgagctgctgaccaagtactcgtacgagaacgccgtggtgaccaagaccgcctcgggccgcttcgacgtgaccccgaccgtgcaggactacgtgttcaagctggacctgaagaagccggagaagctgggcatcatgctgatcggcctgggcggcaacaacggcagcaccctggtggccagcgtgctggccaacaagcacaacgtggagttccagaccaaggagggcgtgaagcagccgaactacttcggctcgatgacccagtgcagcaccctgaagctgggcatcgacgccgagggcaacgacgtgtacgccccgttcaactcgctgctgccgatggtgtcgccgaacgacttcgtggtgtcgggctgggacatcaacaacgccgacctgtacgaggccatgcagcgcagccaggtgctggagtacgacctgcagcagcgcctgaaggccaagatgtcgctggtgaagccgctgccgtcgatctactacccggacttcatcgccgccaaccaggacgagcgcgccaacaactgcatcaacctggacgagaagggcaacgtgaccacccgcggcaagtggacccacctgcagcgcatccgccgcgacatccagaacttcaaggaggagaacgccctggacaaggtcattgtgctgtggaccgccaacaccgagcgctacgtggaggtgtcgccgggcgtgaacgacaccatggagaacctgctgcagagcatcaagaacgaccacgaggagatcgccccgtcgaccatcttcgccgccgcctcgatcctggagggcgtgccgtacatcaacggcagcccgcagaacaccttcgtgccgggcctggtgcagctggccgagcatgagggcaccttcatcgccggcgacgacctgaagagcggccagaccaagctgaagagcgtgctggcgcagttcctggtggacgccggcatcaagccggtgagcatcgccagctacaaccacctgggcaacaacgacggctacaacctgtcggccccgaagcagttccgctcgaaggagatctcgaagtcgtcggtcattgacgacatcatcgcctcgaacgacatcctgtacaacgacaagctgggcaagaaggtggaccactgcatcgtgatcaagtacatgaagccggtgggcgacagcaaggtggccatggacgagtactactcggagctgatgctgggcggccacaaccgcatctcgatccacaacgtgtgcgaggactcgctgctggccaccccgctgatcatcgacctgctggtcatgaccgagttctgcacccgcgtgagctacaagaaggtggacccggtgaaggaggacgccggcaagttcgagaacttctacccggtgctgaccttcctgagctactggctgaaggccccgctgacccgcccgggcttccatccggtgaacggcctgaacaagcagcgcaccgccctggagaacttcctgcgcctgctgatcggcctgccgtcgcagaacgagctgcgcttcgaggagcgcctgctgtaa。
SEQ ID NO：5(EcIMP基因序列)，
Atgcacccgatgctgaacatcgccgtgcgcgccgcccgcaaggccggcaacctgatcgccaagaactacgagaccccggacgccgtggaggcctcgcagaagggctcgaacgacttcgtgaccaacgtggacaaggccgccgaggccgtgatcatcgacaccatccgcaagagctacccgcagcacaccatcatcaccgaggagtcgggcgagctggagggcaccgaccaggacgtgcagtgggtcattgacccgctggacggcaccaccaacttcatcaagcgcctgccgcacttcgccgtgagcatcgccgtgcgcatcaagggccgcaccgaggtggccgtggtgtacgacccgatgcgcaacgagctgttcaccgccacccgcggccagggcgcccagctgaacggctatcgcctgcgcggctcgaccgcccgcgacctggacggcacgatcctggccaccggcttcccgttcaaggccaagcagtacgccaccacctacatcaacatcgtgggcaagctgttcaacgagtgcgccgacttccgccgcaccggctcggccgccctggacctggcctatgtggccgccggccgcgtggacggcttcttcgaaatcggcctgcgcccgtgggacttcgccgccggcgagctgctggtgcgcgaagccggcggcatcgtgtcggacttcaccggcggccacaactacatgctgaccggcaacatcgtggccggcaacccgcgcgtggtgaaggccatgctggccaacatgcgcgacgagctgtcggacgccctgaagcgctaa。
SEQ ID NO：6(基因zwf1)
atgcaaaccacccgaaccgcctcttcttccggcactgccgacgcgcggccactggacctcgtcatcttcggcggcgccggcgacctgtcggcacgcaagctgctgccatcgctctacatgtgccaccgcgacggcaacctgcccgacggcacccgcatcatcggcgtgggccggcaccgctgggaccgcgaggcctttgtcaattttgccgatgaaagcgcacaaccctttgtcgaagcgcgctatctcgagccggccaaatggcagaccttcctgcagcggctggatttcgtgcacgttgacgcgtcgcagtccggggactatccggcgctggccgcgcaactgcgccaggaggcgctgcgcatctattacatggcgatgccgccgggcttgttcgcggccacctgcgacaaccttgccagccatggcctgatcgccaacgacacccggctggtgctggaaaaaccgctgggcgtggacctggcctcggccatcggcatcggcgaggtggtcagccgctacttcagcgaggaccgcacctaccggatcgaccactacctgggcaaggaaacggtgcagaacctgatggcgctgcgcttcggcaattcgatcttcgagccgctgtggcgcacgccgttcgtgcgcagcgtgcagatcaccgtggccgagaccgtgggcgtgggcacgcgcggcggcttctacgacgaggccggcgccatgcgcgacatggtgcagaaccacctgctgcagctggtcagcatcctggcgatggagccgccggcagcgctcacctccgatgcggtgcgcgatgagaagctcaaggtgctgcgctcgctgcggccgatgtcgcccgaggacgtacgccgcaataccgtgcgcggccagtacaccgcgggcgccatcgccggcgagctggtgcgcggctacctgcaggaagaaggcattccgccagacagccgcaccgagaccttcgtcgcgatgcgcgccgagctcggcacgtggcgctggaacaaggtgccgttctacctgcgcactggcaagcgcatgcaggagcgcgtgaccgaggtggtgatcaacttcgccgaggtgccgcattcgatcttcgatgccggcagcacgctgcagcccaaccgcatggtgatccggctgcagccggaagagtcggtgcggctgacgctgatggtcaagcagccaggcgagggcatgaagctgaagccgctgagcctggcgctgaacctggactcggccttcaccacccggcgcgccgaagcctacgagcgcctgctgctcgacgtgatacgcggacggctggcgctgttcgtgcggcgcgacgaactgcaggccgcctggacctgggtcgacccgatcctggaagcgtggcgccagcaggacgaaggcccgcgcccctataccgccggcacctggggcccggcggcttcgtcggcgttcatggcgcgcgaaggcgtgcagtggtctgaggaggcgtga。
SEQ ID NO：7(基因zwf2)
atgatggctagcccccctgccggcgctccggcacctgaacctgctccagagttcgatttcgtactgttcggcgccaccggcgacctggcgcggcgcaagctgctgccggcactgttcgatgcccacgccgccggttcgctgcatccgcgcgggcgcatcctggcactgggcagccagccgctgtcgcatgacgcctacctggcgatgctaaacgacgaagtgctgccagcgctggccggcaacgccgcggccgcagcgtggcagggctttctcgaccgcatcgtgtacctgcaggtcgatgccaacgccgatgccggcttcggcgcgctggccgagctggtcaatgcgcgcgcggcgccagtggtggtgttctacctggccacggccccgcacctgttcgtcaccatctgcgagcaactggcgcgcgtgggcctgaccggcccgcgcagccgcatcgtgctggaaaaaccgctcgggcacgacctggcctcgtccgaggccatcaacgcggaagtggcgcggcactttgccgaggaccagatctaccggatcgaccactacctgggcaaggagtcggtgcagaacctgatggcggtgcgctttggcaacgtgctgttcgagccgctgtggcggcgcgaatgggtgcgccaggtgcagatcaccatcgccgaagagctgggcgtggagcgccgcggcaacttctatgacggcatcggcgcgctgcgcgacatggtgcagaaccacctgctgcagctgctgtgcatggtggcgatggagccgcccacgagcctgtcggaagacgccatccgcgatgagaagctcaagatcctgaaggcgctgcggccgatccggccggaagacgtggccgaaaaggtggtgcgtggccagtactcccgtggcgccgcgggcggcgacccggtgcccggctatgccagtgaacccggcatcgcgcccgacagccgcaccgagaccttcgtcgctatccgcgccgagatcgccaactggcgctgggccggggtgccgttctacctgcgtaccggcaagcgcatgcagtcgcgcgtggcggagatcgtaatccatttccatgacgtgccctacccgctgttcccgcacccgctgggaatcatgtccggcaaccggctggtgatcacgctgcagcccgaggagagcatccggctgtatttcctgaccaagcagccgggcgacacgcaggcgctgattcccgcgtccctcgacctgcagctgaacactgccgccccacgtgtacggcgcgtgggcgcgtacgagcgcctgctgctcgacgtgatccgcggccggctgggcctgttcgtgcggcgcgatgagcaggtacaggcgtggcgctgggtcgcgcccatcctgaagacgtgggagaactcgcccacgccgcccaagccttacaccgccggcacctggggcccggcagcctccagtgccctgctgtcgcgagacggcatggcctggcatgaagagatgtag。
SEQ ID NO：8(基因zwf3)
atgcctgatttcgacatggtgctgttcggcggcaccggcgacctggcgcggcgcaagctgctgccgtccctgttcgatgcccaccacgccggcctgctgcatccggccgcacgcatcctcgccaccggcagccagccgctctcgaccgcggactacctcgcctcgctggagcagaccgtgcgccccgggctagcccatgcgccgcccgagtcatgggacaagttctgcgcgcgcattgtctacgtgcaggccgatgcacgcgtgcccgcgcatttcgatgcgctcgcggagcaggtgctggcacgcaagcctgaagtggtggtgtgctatctcgccaccgcgccgcacctgttcgtgtcgatctgcgagcagctggcacgcaccggcctgaacacgcgccaggcgcccaacgtgcgcatcgtgctggaaaaaccgctggggcatgacctcgaatccaacgaggcaatcaactcggcagtggcgaagttcttcgccgaagagcagatctaccgcatcgatcattacctcggcaaggagtcggtgcagaacctgatggcgatccgcttcggcaacgcgctgttcgagccgctgtggcggcgcgagtgggtgcaggacgtgcagatcaccatcgccgaagaactcggcgtggaaacgcgcggcgacttctacgaccgcaccggcgcgctgcgcgacatggtgcagaaccacttgctgcagctcttgtgcatggtggcgatggagccgccggccagcctcagcgaagatgccatccgcgacgagaagatcaagatcctgaaggcgctcaagccgatcacgccgcaggacgtggccgagaagaccgtgcgcggccagtaccgctccggtgccatcggcggcaagccggtgccgggctacctggaagaagcgggcatcgcgcccgacagccgcaccgagacctttgtcgcgatcaaggccgagatcgccaactggcgctgggaaggcgtgccgttctacctgcgcaccggcaagcgtatgcagtcgcgcgtggccgagatcgtgatccatttccgcgacgtgccgcacgcgatcttcccgcggccgctgacgctgtcgccgcagaaccggctggtgatccagctgcagccggaagaaagcatccgcctgtactgcctggtcaagcagcctggcgacacgctggagctgacgccgacctcgctcgacctggactttgccaactcgttcaaggtgcgccgcgccggcgcctacgaacgcttgctgctcgacgtgatccgcggccggctgggcctgttcgtgcgccgcgatgaacaagtgcaggcctggcgctgggtcgaacccatcatcgacacctgggatgccagcaccgtgccgcccaagccctataccgccggcacctggggaccggccgcgtcgtcggcgctgatgtcgcgcgacggcgggctgtggcacgaggaagcctga。
SEQ ID NO：9(基因phaC1)
atggcgaccggcaaaggcgcggcagcttccacgcaggaaggcaagtcccaaccattcaaggtcacgccggggccattcgatccagccacatggctggaatggtcccgccagtggcagggcactgaaggcaacggccacgcggccgcgtccggcattccgggcctggatgcgctggcaggcgtcaagatcgcgccggcgcagctgggtgatatccagcagcgctacatgaaggacttctcagcgctgtggcaggccatggccgagggcaaggccgaggccaccggtccgctgcacgaccggcgcttcgccggcgacgcatggcgcaccaacctcccatatcgcttcgctgccgcgttctacctgctcaatgcgcgcgccttgaccgagctggccgatgccgtcgaggccgatgccaagacccgccagcgcatccgcttcgcgatctcgcaatgggtcgatgcgatgtcgcccgccaacttccttgccaccaatcccgaggcgcagcgcctgctgatcgagtcgggcggcgaatcgctgcgtgccggcgtgcgcaacatgatggaagacctgacacgcggcaagatctcgcagaccgacgagagcgcgtttgaggtcggccgcaatgtcgcggtgaccgaaggcgccgtggtcttcgagaacgagtacttccagctgttgcagtacaagccgctgaccgacaaggtgcacgcgcgcccgctgctgatggtgccgccgtgcatcaacaagtactacatcctggacctgcagccggagagctcgctggtgcgccatgtggtggagcagggacatacggtgtttctggtgtcgtggcgcaatccggacgccagcatggccggcagcacctgggacgactacatcgagcacgcggccatccgcgccatcgaagtcgcgcgcgacatcagcggccaggacaagatcaacgtgctcggcttctgcgtgggcggcaccattgtctcgaccgcgctggcggtgctggccgcgcgcggcgagcacccggccgccagcgtcacgctgctgaccacgctgctggactttgccgacacgggcatcctcgacgtctttgtcgacgagggccatgtgcagttgcgcgaggccacgctgggcggcggcgccggcgcgccgtgcgcgctgctgcgcggccttgagctggccaataccttctcgttcttgcgcccgaacgacctggtgtggaactacgtggtcgacaactacctgaagggcaacacgccggtgccgttcgacctgctgttctggaacggcgacgccaccaacctgccggggccgtggtactgctggtacctgcgccacacctacctgcagaacgagctcaaggtaccgggcaagctgaccgtgtgcggcgtgccggtggacctggccagcatcgacgtgccgacctatatctacggctcgcgcgaagaccatatcgtgccgtggaccgcggcctatgcctcgaccgcgctgctggcgaacaagctgcgcttcgtgctgggtgcgtcgggccatatcgccggtgtgatcaacccgccggccaagaacaagcgcagccactggactaacgatgcgctgccggagtcgccgcagcaatggctggccggcgccatcgagcatcacggcagctggtggccggactggaccgcatggctggccgggcaggccggcgcgaaacgcgccgcgcccgccaactatggcaatgcgcgctatcgcgcaatcgaacccgcgcctgggcgatacgtcaaagccaaggcatga。
SEQ ID NO：10(基因phaA)
Atgactgacgttgtcatcgtatccgccgcccgcaccgcggtcggcaagtttggcggctcgctggccaagatcccggcaccggaactgggtgccgtggtcatcaaggccgcgctggagcgcgccggcgtcaagccggagcaggtgagcgaagtcatcatgggccaggtgctgaccgccggttcgggccagaaccccgcacgccaggccgcgatcaaggccggcctgccggcgatggtgccggccatgaccatcaacaaggtgtgcggctcgggcctgaaggccgtgatgctggccgccaacgcgatcatggcgggcgacgccgagatcgtggtggccggcggccaggaaaacatgagcgccgccccgcacgtgctgccgggctcgcgcgatggtttccgcatgggcgatgccaagctggtcgacaccatgatcgtcgacggcctgtgggacgtgtacaaccagtaccacatgggcatcaccgccgagaacgtggccaaggaatacggcatcacacgcgaggcgcaggatgagttcgccgtcggctcgcagaacaaggccgaagccgcgcagaaggccggcaagtttgacgaagagatcgtcccggtgctgatcccgcagcgcaagggcgacccggtggccttcaagaccgacgagttcgtgcgccagggcgccacgctggacagcatgtccggcctcaagcccgccttcgacaaggccggcacggtgaccgcggccaacgcctcgggcctgaacgacggcgccgccgcggtggtggtgatgtcggcggccaaggccaaggaactgggcctgaccccgctggccacgatcaagagctatgccaacgccggtgtcgatcccaaggtgatgggcatgggcccggtgccggcctccaagcgcgccctgtcgcgcgccgagtggaccccgcaagacctggacctgatggagatcaacgaggcctttgccgcgcaggcgctggcggtgcaccagcagatgggctgggacacctccaaggtcaatgtgaacggcggcgccatcgccatcggccacccgatcggcgcgtcgggctgccgtatcctggtgacgctgctgcacgagatgaagcgccgtgacgcgaagaagggcctggcctcgctgtgcatcggcggcggcatgggcgtggcgctggcagtcgagcgcaaataa。
SEQ ID NO：11(phaB1)
Atgactcagcgcattgcgtatgtgaccggcggcatgggtggtatcggaaccgccatttgccagcggctggccaaggatggctttcgtgtggtggccggttgcggccccaactcgccgcgccgcgaaaagtggctggagcagcagaaggccctgggcttcgatttcattgcctcggaaggcaatgtggctgactgggactcgaccaagaccgcattcgacaaggtcaagtccgaggtcggcgaggttgatgtgctgatcaacaacgccggtatcacccgcgacgtggtgttccgcaagatgacccgcgccgactgggatgcggtgatcgacaccaacctgacctcgctgttcaacgtcaccaagcaggtgatcgacggcatggccgaccgtggctggggccgcatcgtcaacatctcgtcggtgaacgggcagaagggccagttcggccagaccaactactccaccgccaaggccggcctgcatggcttcaccatggcactggcgcaggaagtggcgaccaagggcgtgaccgtcaacacggtctctccgggctatatcgccaccgacatggtcaaggcgatccgccaggacgtgctcgacaagatcgtcgcgacgatcccggtcaagcgcctgggcctgccggaagagatcgcctcgatctgcgcctggttgtcgtcggaggagtccggtttctcgaccggcgccgacttctcgctcaacggcggcctgcatatgggctga。
本发明另一个目的是提供一种发酵生产肌醇的方法，包括如下步骤：摇瓶发酵上述的产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌株，得到肌醇。
根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，利用以葡萄糖、甘油或CO2为唯一碳源的培养基进行摇瓶发酵。
根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，发酵培养基的配方为：3.5g/L Na2HPO4，1.5g/L KH2PO4，1.0g/L(NH4)2SO4，80mg/L MgSO4·7H2O，1mg/L CaSO4·2H2O，0.56mg/LNiSO4·7H2O，0.4mg/L柠檬酸铁，200mg/L NaHCO3，分别添加5g/L葡萄糖、甘油或者充入H2:O2:CO2≈8:1:1的混合气体作为碳源。
根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，所述发酵培养基中添加卡那霉素抗生素终浓度为200mg/L。
根据本发明的发酵生产肌醇的方法，其中，所述摇瓶发酵条件为温度30℃，转速200rpm。
本申请的技术方案的优点：
1.利用罗尔斯通氏菌H16工程菌株进行肌醇合成的优势在于其不能利用肌醇，不需要对菌株进行改造即可实现产物的积累。同时，罗尔斯通氏菌H16具有广泛的底物谱。能够利用甘油等有机物作为碳源进行产物合成的同时，还具有高效的CO2固定能力，即能够直接利用CO2进行肌醇的合成，而不需要电化学手段的辅助。
本申请通过对罗尔斯通氏菌基因组中编码N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行突变(G265R)、并敲除编码GntR家族的转录调节因子的nagR使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖。在此基础上构建了一株以可再生底物(葡萄糖、甘油)以及可直接以CO2为碳源合成肌醇的罗尔斯通氏菌H16工程菌株。基于该项技术，不但能够实现生物活性物质的合成，同时也是一种高效消除大气中的温室气体的方法。
2.筛选获得了在罗尔斯通氏菌中具有高催化活性的肌醇-3-磷酸合酶。在罗尔斯通氏菌异源表达布氏锥虫(Trypanosoma brucei)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来源的肌醇-3-磷酸合酶，利用罗尔斯通氏菌的内源肌醇单磷酸酶以葡萄糖(5g/L)为唯一碳源进行肌醇合成。结果表明，布氏锥虫来源的肌醇-3-磷酸合酶(TbIPS)在罗尔斯通氏菌中无催化活性。异源表达酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶(ScIPS)的罗尔斯通氏菌肌醇产量为122.5mg/L。
3.为提高罗尔斯通氏菌的肌醇，在异源表达酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶(ScIPS)基因的基础上表达大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶(EcIMP)。以葡萄糖为碳源，相较于仅表达酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶(ScIPS)基因的罗尔斯通氏菌菌株，肌醇产量提高了2.2倍，达到394.2mg/L。
4.通过单敲除或组合敲除ED途径和PHB合成途径中的关键基因来通过截断各途径对葡萄糖合成前体葡萄糖6-磷酸的分流，提高了突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞中的产物前体供应。利用葡萄糖、甘油及CO2为唯一碳源的培养基发酵生产肌醇，最优菌株的肌醇产量分别达到了520.2、1076.3和1054.8mg/L。
附图说明
图1显示罗尔斯通氏菌野生株和工程菌对葡萄糖和果糖的利用及菌体生长情况；
图2显示罗尔斯通氏菌以葡萄糖为碳源筛选不同来源肌醇-3-磷酸合酶时的细胞干重；
图3显示罗尔斯通氏菌以葡萄糖为碳源筛选不同来源肌醇-3-磷酸合酶时的碳源消耗；
图4显示罗尔斯通氏菌以葡萄糖为碳源筛选不同来源肌醇-3-磷酸合酶时的肌醇合成结果；
图5显示罗尔斯通氏菌工程菌株以葡萄糖为碳源合成肌醇时的细胞干重测定结果；
图6显示罗尔斯通氏菌工程菌株以葡萄糖为碳源合成肌醇时的碳源消耗结果；
图7显示罗尔斯通氏菌工程菌株以葡萄糖为碳源合成肌醇的结果；
图8显示罗尔斯通氏菌工程菌株以甘油为碳源合成肌醇时的细胞干重测定结果；
图9显示罗尔斯通氏菌工程菌株以甘油为碳源合成肌醇时的碳源消耗结果；
图10显示罗尔斯通氏菌工程菌株以甘油为碳源合成肌醇的结果；
图11显示罗尔斯通氏菌工程菌株以CO2为碳源合成肌醇时的细胞干重测定结果；
图12显示罗尔斯通氏菌工程菌株以CO2为碳源合成肌醇的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请对罗尔斯通氏菌的改造过程如以下表1所示：
表1
Figure BDA0003933021630000091
Figure BDA0003933021630000101
实施例1 具有葡萄糖利用能力的罗尔斯通氏菌H16-RE菌株构建
罗尔斯通氏菌H16能够利用果糖、甘油以及CO2作为碳源进行生长。葡萄糖作为一种廉价的碳源，已经被用于作为代谢工程菌株的碳源生产多种生物活性物质，如γ-氨基丁酸、N-乙酰氨基葡萄糖等。但是由于缺少转运蛋白，罗尔斯通氏菌H16无法利用葡萄糖。基于此，本申请通过对罗尔斯通氏菌基因组中编码N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行突变(G265R)并敲除编码GntR家族的转录调节因子nagR，构建了能够利用葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16-RE。在以10g/L葡萄糖或其天然碳源果糖为唯一碳源的培养基中进行菌体培养。菌株对碳源的利用及菌体生长结果如图1所示。
对罗尔斯通氏菌基因组中编码N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行氨基酸突变(G265R)并敲除编码GntR家族的转录调节因子编码基因nagR的具体方法如下：
1.构建带有nagE基因序列突变点(G793C)上下游同源臂及突变点(G793C)的突变质粒pK18-nagE(G265R)和带有nagR基因序列上下游同源臂的敲除质粒pK18-nagR。
根据nagE(H16_A0312)和nagR(H16_A0310)基因序列设计合成引物。以罗尔斯通氏菌H16基因组为模板，利用上述设计的引物分别扩增nagE基因和nagR基因上游和下游同源臂，片段大小约500bp。将获得的片段使用GibsonAssembly连接方式连接至pK18mobSacB质粒的EcoRI/SmaI位点。将质粒电击转化至大肠杆菌S17-1宿主中，涂布LB固体平板(卡那霉素50μg/mL)，37℃过夜培养后筛选阳性克隆子，目标片段1000bp。命名为pK18-nagE(G265R)和pK18-nagR。
2.构建pK18-nagE(G265R)质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16-E菌株
将带有pK18-nagE(G265R)质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16菌株接种于LB液体培养基过夜培养，并分别添加相应抗生素(卡那霉素50μg/mL或庆大霉素10μg/mL)。4600rpm离心8min收集菌体，利用LB培养基分别洗涤菌体三次。将带有pK18-nagE(G265R)质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16菌株按照3:1的比例进行混合后点于LB平板上，于30℃过夜孵育。用LB洗下过夜孵育的混合菌体，涂布于LB固体平板(卡那霉素200μg/mL和庆大霉素10μg/mL)上。平板于30℃培养48小时后筛选阳性克隆子，目标片段为卡那霉素抗性基因片段，长度500bp。将阳性克隆子于添加有LB液体培养基1.5mL EP管中于30℃进行过夜培养。
3.构建nagE基因成功突变的罗尔斯通氏菌H16-E菌株
将菌液稀释至10-2涂布于添加有100g/L蔗糖的LB固体平板上，30℃诱导培养48小时。进行菌落PCR检测，目的片段大小为1000bp，并进行测序验证，筛选目的基因被成功突变的克隆。将成功构建的菌株接种于LB液体培养基中，命名为罗尔斯通氏菌H16-E。
4.构建pK18-nagR质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16-E菌株
将带有pK18-nagR质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16菌株接种于LB液体培养基过夜培养，并分别添加相应抗生素(卡那霉素50μg/mL或庆大霉素10μg/mL)。4600rpm离心8min收集菌体，利用LB培养基分别洗涤菌体三次。将带有pK18-nagR质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16菌株按照3:1的比例进行混合后点于LB平板上，于30℃过夜孵育。用LB洗下过夜孵育的混合菌体，涂布于LB固体平板(卡那霉素200μg/mL和庆大霉素10μg/mL)上。平板于30℃培养48小时后筛选阳性克隆子，目标片段为卡那霉素抗性基因片段，长度500bp。将阳性克隆子于添加有LB液体培养基1.5mL EP管中于30℃进行过夜培养。
5.构建nagR基因成功敲除的罗尔斯通氏菌H16-RE菌株
将菌液稀释至10-2涂布于添加有100g/L蔗糖的LB固体平板上，30℃诱导培养48小时。进行菌落PCR检测，目的片段大小为1000bp，筛选目的基因被成功敲除的克隆。将成功构建的菌株接种于LB液体培养基中，命名为罗尔斯通氏菌H16-RE。
结果表明，无论是野生型还是突变株，当以葡萄糖或果糖为唯一碳源进行培养时均有长达16h的延滞期。野生型菌株在以葡萄糖为碳源的培养基中培养32h后，培养基中的葡萄糖和细胞干重均无变化。而在以果糖为碳源的培养基中，碳源浓度降至6.3g/L，细胞干重增长到1.4g/L。在以果糖为碳源的野生型菌株培养基中，果糖在64h后被耗尽，细胞干重最大为3.5g/L，而葡萄糖始终未被野生型菌株消耗，这表明野生型菌株无葡萄糖利用能力。对于突变菌株罗尔斯通氏菌H16-RE，发酵32h后，培养基中的葡萄糖浓度为7.6g/L，果糖浓度为5.8g/L，同时细胞干重分别为0.8和1.4g/L。突变菌株培养基中的葡萄糖和果糖在发酵64h后完全耗尽，细胞干重分别达到了3.9和3.8g/L。这表明突变菌株具有了利用葡萄糖作为碳源的能力且其利用葡萄糖的速率与利用罗尔斯通氏菌天然最佳碳源果糖的速率相当。
实施例2 适用于罗尔斯通氏菌合成肌醇的肌醇-3-磷酸合酶的筛选
肌醇的酶促合成需要两步催化反应。首先，葡萄糖-6-磷酸在肌醇-3-磷酸合酶的催化下生成肌醇-3-磷酸，而后该产物在肌醇单磷酸酶的催化下生成终产物肌醇。这其中，肌醇-3-磷酸合酶是该反应中的限速步骤。在罗尔斯通氏菌基因组(GenBank:AM260479.1)中已经鉴定出了编码肌醇单磷酸酶的suhB(H16_A1214)基因，但无肌醇-3-磷酸合酶基因。基于此，对不同来源的肌醇-3-磷酸合酶进行了筛选。
1.构建带有TbIPS或ScIPS基因的表达载体TbIPS-pBBR1和ScIPS-pBBR1
根据罗尔斯通氏菌的PphaC1启动子的序列设计合成引物，以罗尔斯通氏菌的基因组为模板扩增PphaC1启动子片段，片段大小为342bp。将布氏锥虫(Trypanosoma brucei)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的肌醇-3-磷酸合酶基因经密码子优化后进行全基因合成。根据基因序列设计合成引物，以合成的基因片段为模板，利用上述设计的引物分别扩增布氏锥虫和酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因片段，片段大小分别为1587bp和1602bp。将获得的启动子片段和基因片段使用Gibson Assembly连接方式连接至pBBR1-MCS2载体质粒的EcoRI/SmaI位点，获得ScIPS-pBBR1和TbIPS-pBBR1表达载体。
2.构建罗尔斯通氏菌H16-RE-TbIPS和罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS菌株
将罗尔斯通氏菌H16-RE菌株于无抗LB平板上进行划线并于30℃培养箱中培养48h，挑取单克隆于200mL LB中，30℃、200rpm培养至OD600≈0.3-0.5。冰上放置20min。利用预冷的10％甘油清洗菌体3次。而后将细胞重悬于1.8mL 10％甘油中并分装于1.5mL EP管中(100μL/管)，液氮速冻，-80℃冰箱保存。将400ng TbIPS-pBBR1或ScIPS-pBBR1质粒加入到100μL感受态细胞并转移到2mm Bio-Rad电转杯中进行电击转化，电击电压2.5kV。加入200μL LB重悬细胞并于30℃，200rpm摇床中孵育2h后涂布含有200μg/mL卡那霉素和10μg/mL庆大霉毒的LB固体平板。阳性克隆利用PCR进行鉴定。最终获得罗尔斯通氏菌H16-RE-TbIPS和罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS菌株。
3.适用于罗尔斯通氏菌合成肌醇的肌醇-3-磷酸合酶的筛选
将各突变菌株在盐离子培养基中进行发酵，以浓度为5g/L的葡萄糖为唯一碳源。以pBBR1-MCS2转入罗尔斯通氏菌H16-RE中获得罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1作为阴性对照。发酵培养基中各菌株的生长情况如图2、图3所示。
发酵一天后，罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1和罗尔斯通氏菌H16-RE-TbIPS培养基中的葡萄糖已被全部耗尽，最终的细胞干重分别为1.5和1.4g/L。而此时罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS培养基中的葡萄糖为2.1g/L。发酵两天后，罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS的细胞干重达到1.3g/L，此时培养基中的葡萄糖已被耗尽。
尽管前期已有研究表明布氏锥虫来源的肌醇-3-磷酸合酶的催化效率优于酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶，且已经被应用于大肠杆菌宿主进行肌醇的合成。但在本申请中，产物肌醇仅可以在罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS菌株的培养基上清中被检测到(图4)，即布氏锥虫来源的肌醇-3-磷酸合酶(TbIPS)在罗尔斯通氏菌中无活性或基因无法表达。作为一个两步酶促反应，产物的合成相对于碳源消耗略有延迟。发酵5天后，罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS发酵液中的肌醇浓度为122.5mg/L。
实施例3 罗尔斯通氏菌中肌醇合成通路的构建
在已构建的能够以葡萄糖为碳源合成肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS菌株的基础上，本申请对肌醇单磷酸酶对肌醇产量的影响进行进一步探讨，将具有高催化活性的大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶(EcIMP)基因连接到已构建好的ScIPS-pBBR1上并由调控ScIPS表达的PphaC1启动子调控表达，获得表达载体ScIPS-EcIMP-pBBR1。将上述表达载体导入罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS中，构建了罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP来进行肌醇的生产。
1.构建带有ScIPS和EcIMP基因的表达载体ScIPS-EcIMP-pBBR1
根据罗尔斯通氏菌的PphaC1启动子的序列设计合成引物，以罗尔斯通氏菌的基因组为模板扩增PphaC1启动子片段，片段大小约342bp。将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来源的肌醇-3-磷酸合酶基因和大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因经密码子优化后进行全基因合成。根据基因序列设计合成引物，以合成的基因片段为模板，利用上述设计的引物分别扩增1602bp的酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶基因片段和804bp的大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因片段。将获得的启动子片段和基因片段使用GibsonAssembly连接方式连接至pBBR1-MCS2载体质粒的EcoRI/SmaI位点，获得ScIPS-EcIMP-pBBR1表达载体。
2.构建罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP菌株
将罗尔斯通氏菌H16-RE菌株于无抗LB平板上进行划线并于30℃培养箱中培养48h，挑取单克隆于200mL LB中，30℃、200rpm培养至OD600≈0.3-0.5。冰上放置20min。利用预冷的10％甘油清洗菌体3次。而后将细胞重悬于1.8mL 10％甘油中并分装于1.5mL EP管中(100μL/管)，液氮速冻，-80℃冰箱保存。将400ng ScIPS-EcIMP-pBBR1质粒加入到100μL感受态细胞并转移到2mm Bio-Rad电转杯中进行电击转化，电击电压2.5kV。加入200μL LB重悬细胞并于30℃，200rpm摇床中孵育2h后涂布含有200μg/mL卡那霉素和10μg/mL庆大霉毒的LB固体平板。阳性克隆利用PCR进行鉴定。最终获得罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP菌株。
将该菌株于盐离子培养基中以5g/L葡萄糖为唯一碳源进行发酵，结果如图2、图3和图4所示。发酵一天后，其最大细胞干重达到了1.4g/L，与罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS菌株相当，优于罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS。过表达大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶后，肌醇的产量由122.5提高到了394.2mg/L。
实施例4 构建产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌株
产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌株为表达肌醇合成通路中所需酶的基因、敲除ED途径关键基因和PHB合成途径关键基因的突变菌株。肌醇合成通路中的酶基因为酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶和大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶，所述ED途径关键基因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf1(H16_A0316)、zwf2(H16_B1501)和zwf3(H16_B2566)，所述PHB合成途径关键基因为聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1(H16_A1437)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA(H16_A1438)和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1(H16_A1439)。
一、构建罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP菌株
依次将zwf基因靶敲除载体pK18-zwf1、pK18-zwf2及pK18-zwf3利用结合转移的方法导入罗尔斯通氏菌H16-RE宿主中。利用卡那霉素进行第一轮筛选，获得敲除载体成功整合到菌株基因组上的宿主菌株。在此基础上利用蔗糖进行第二轮筛选，获得成功敲除zwf基因的罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf菌株。具体方法如下：
1.构建带有zwf1、zwf2及zwf3基因序列上下游同源臂的敲除质粒pK18-zwf1、pK18-zwf2及pK18-zwf3
根据zwf1(H16_A0316)、zwf2(H16_B1501)和zwf3(H16_B2566)基因序列设计合成引物。以罗尔斯通氏菌H16基因组为模板，利用上述设计的引物分别扩增glk基因上游和下游同源臂，片段大小约500bp。将获得的片段使用GibsonAssembly连接方式连接至pK18mobSacB质粒的EcoRI/SmaI位点。将质粒电击转化至大肠杆菌S17-1宿主中，涂布LB固体平板(卡那霉素50μg/mL)，37℃过夜培养后筛选阳性克隆子，目标片段1000bp。命名为pK18-zwf1、pK18-zwf2及pK18-zwf3。
2.构建pK18-zwf1质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16-RE菌株
将带有pK18-zwf1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16-RE菌株接种于LB液体培养基过夜培养，并分别添加相应抗生素(卡那霉素50μg/mL或庆大霉素10μg/mL)。4600rpm离心8min收集菌体，利用LB培养基分别洗涤菌体三次。将带有pK18-zwf1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16-RE菌株按照3:1的比例进行混合后点于LB平板上，于30℃过夜孵育。用LB洗下过夜孵育的混合菌体，涂布于LB固体平板(卡那霉素200μg/mL和庆大霉素10μg/mL)上。平板于30℃培养48小时后筛选阳性克隆子，目标片段为卡那霉素抗性基因片段，长度500bp。将阳性克隆子于添加有LB液体培养基1.5mL EP管中于30℃进行过夜培养。
3.构建zwf1基因成功敲除的罗尔斯通氏菌H16-RE菌株
将菌液稀释至10-2涂布于添加有100g/L蔗糖的LB固体平板上，30℃诱导培养48小时。进行菌落PCR检测，筛选目的基因被成功敲除的克隆，目的片段大小为1000bp。将成功构建的菌株接种于LB液体培养基中，命名为罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf1。
4.构建zwf2和zwf3基因成功敲除的罗尔斯通氏菌H16-RE菌株
按照上述步骤，分别以罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf1和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf1△zwf2为宿主，进行zwf2和zwf3的敲除。最终获得罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf菌株。
5.构建合成肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP菌株
将罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf菌株于无抗LB平板上进行划线并于30℃培养箱中培养48h，挑取单克隆于200mL LB中，30℃、200rpm培养至OD600≈0.3-0.5。冰上放置20min。利用预冷的10％甘油清洗菌体3次。而后将细胞重悬于1.8mL 10％甘油中并分装于1.5mL EP管中(100μL/管)，液氮速冻，-80℃冰箱保存。将400ng ScIPS-EcIMP-pBBR1质粒加入到100μL感受态细胞并转移到2mm Bio-Rad电转杯中进行电击转化，电击电压2.5kV。加入200μL LB重悬细胞并于30℃，200rpm摇床中孵育2h后涂布含有200μg/mL卡那霉素和10μg/mL庆大霉毒的LB固体平板。阳性克隆利用PCR进行鉴定。最终获得罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP菌株。
二、构建罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP菌株
将phaC1AB1操纵子(含有phaC1、phaA和phaB1基因)靶敲除载体pK18-PHB利用结合转移的方法导入罗尔斯通氏菌H16-RE宿主中。利用卡那霉素进行第一轮筛选，获得敲除载体成功整合到菌株基因组上的宿主菌株。在此基础上利用蔗糖进行第二轮筛选，获得成功敲除phaC1AB1操纵子的罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB菌株。
具体方法如下：
1.构建带有phaC1AB1操纵子序列上下游同源臂的敲除质粒pK18-phaC1AB1
根据phaC1AB1操纵子(phaC1(H16_A1437)、phaA(H16_A1438)和phaB1(H16_A1439))序列设计合成引物。以罗尔斯通氏菌H16基因组为模板，利用上述设计的引物分别扩增操纵子基因上游和下游同源臂，片段大小约500bp。将获得的片段使用GibsonAssembly连接方式连接至pK18mobSacB质粒的EcoRI/SmaI位点。将质粒电击转化至大肠杆菌S17-1宿主中，涂布LB固体平板(卡那霉素50μg/mL)，37℃过夜培养后筛选阳性克隆子，目标片段1000bp。命名为pK18-phaC1AB1。
2.构建pK18-phaC1AB1质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16-RE菌株
将带有pK18-phaC1AB1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16-RE菌株接种LB液体培养基过夜培养，并分别添加相应抗生素(卡那霉素50μg/mL或庆大霉素10μg/mL)。4600rpm离心8min收集菌体，利用LB培养基分别洗涤菌体三次。将带有pK18-phaC1AB1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16-RE菌株按照3:1的比例进行混合后点于LB平板上，于30℃过夜孵育。用LB洗下过夜孵育的混合菌体，涂布于LB固体平板(卡那霉素200μg/mL和庆大霉素10μg/mL)上。平板于30℃培养48小时后筛选阳性克隆子，目标片段为卡那霉素抗性基因片段，长度500bp。将阳性克隆子于添加有LB液体培养基1.5mL EP管中于30℃进行过夜培养。
3.构建敲除phaC1、phaA和phaB1基因的罗尔斯通氏菌H16-RE菌株
将菌液稀释至10-2涂布于添加有100g/L蔗糖的LB固体平板上，30℃诱导培养48小时。进行菌落PCR检测，筛选目的基因被成功敲除的克隆，目的片段大小为1000bp。将成功构建的菌株接种于LB液体培养基中，命名为罗尔斯通氏菌H16-RE-△PHB。
4.构建合成肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP菌株
将罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB菌株于无抗LB平板上进行划线并于30℃培养箱中培养48h，挑取单克隆于200mL LB中，30℃、200rpm培养至OD600≈0.3-0.5。冰上放置20min。利用预冷的10％甘油清洗菌体3次。而后将细胞重悬于1.8mL 10％甘油中并分装于1.5mL EP管中(100μL/管)，液氮速冻，-80℃冰箱保存。将400ng ScIPS-EcIMP-pBBR1质粒加入到100μL感受态细胞并转移到2mm Bio-Rad电转杯中进行电击转化，电击电压2.5kV。加入200μL LB重悬细胞并于30℃，200rpm摇床中孵育2h后涂布含有200μg/mL卡那霉素和10μg/mL庆大霉毒的LB固体平板。阳性克隆利用PCR进行鉴定。最终获得罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP菌株。
三、构建罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP菌株
将phaC1AB1操纵子(含有phaC1、phaA和phaB1基因)靶敲除载体pK18-PHB利用结合转移的方法导入罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf宿主中。利用卡那霉素进行第一轮筛选，获得敲除载体成功整合到菌株基因组上的宿主菌株。在此基础上利用蔗糖进行第二轮筛选，获得成功敲除phaC1AB1操纵子的罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB菌株。具体方法如下：
1.构建pK18-phaC1AB1质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf菌株
将带有pK18-phaC1AB1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf菌株接种LB液体培养基过夜培养，并分别添加相应抗生素(卡那霉素50μg/mL或庆大霉素10μg/mL)。4600rpm离心8min收集菌体，利用LB培养基分别洗涤菌体三次。将带有pK18-phaC1AB1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf菌株按照3:1的比例进行混合后点于LB平板上，于30℃过夜孵育。用LB洗下过夜孵育的混合菌体，涂布于LB固体平板(卡那霉素200μg/mL和庆大霉素10μg/mL)上。平板于30℃培养48小时后筛选阳性克隆子，目标片段为卡那霉素抗性基因片段，长度500bp。将阳性克隆子于添加有LB液体培养基1.5mLEP管中于30℃进行过夜培养。
2.构建phaC1、phaA和phaB1基因成功敲除的罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf菌株
将菌液稀释至10-2涂布于添加有100g/L蔗糖的LB固体平板上，30℃诱导培养48小时。进行菌落PCR检测，筛选目的基因被成功敲除的克隆，目的片段大小为1000bp。将成功构建的菌株接种于LB液体培养基中，命名为罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB。
3.构建合成肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP菌株
将罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB菌株于无抗LB平板上进行划线并于30℃培养箱中培养48h，挑取单克隆于200mL LB中，30℃、200rpm培养至OD600≈0.3-0.5。冰上放置20min。利用预冷的10％甘油清洗菌体3次。而后将细胞重悬于1.8mL 10％甘油中并分装于1.5mL EP管中(100μL/管)，液氮速冻，-80℃冰箱保存。将400ng ScIPS-EcIMP-pBBR1质粒加入到100μL感受态细胞并转移到2mm Bio-Rad电转杯中进行电击转化，电击电压2.5kV。加入200μL LB重悬细胞并于30℃，200rpm摇床中孵育2h后涂布含有200μg/mL卡那霉素和10μg/mL庆大霉毒的LB固体平板。阳性克隆利用PCR进行鉴定。最终获得罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP菌株。
实施例5 利用罗尔斯通氏菌工程菌株以葡萄糖为碳源发酵生产肌醇
将罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1及产肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP工程菌株接种于添加有200mg/L卡那霉素的50mL的LB液体培养基中，于30℃200rpm复壮16小时。
制备以葡萄糖为唯一碳源的发酵培养基：准确称取3.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，1.0g(NH4)2SO4，80mg MgSO47H2O，1mg CaSO4·2H2O，0.56mgNiSO4·7H2O，0.4mg柠檬酸铁和200mg NaHCO3，5g葡萄糖，以水作为溶剂定容至1L，115℃高压湿热灭菌灭菌30分钟，得到以葡萄糖为唯一碳源的发酵培养基。
将罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1、罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS、罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP及罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP工程菌株按1％的接种量转接至添加有200mg/L卡那霉素的200mL发酵培养基中，于30℃200rpm下进行摇瓶培养过夜。待OD600达到1.0以上，4600rpm离心8min收集菌体。PBS洗涤三次后，利用发酵培养基重悬菌体并调整OD600≈1.0，于30℃200rpm下进行摇瓶发酵。定时取样测定培养基内葡萄糖和肌醇浓度。
菌液OD600测定：利用可见光分光光度计，测定波长600nm下菌液的吸收值。细胞干重的计算根据文献报道的公式：细胞干重(g/L)/OD600≈0.363g/L计算获得。
葡萄糖浓度、肌醇浓度测定：使用高效液相色谱仪对样品中葡萄糖、肌醇进行检测。利用检测器为岛津视差折光检测器，色谱柱为Agilent Hi-Plex Ca column(300mm×7.7mm)，柱温80℃。流动相为超纯水，流速0.5mL/min，进样量10μL。
如图5所示发酵1天后，罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1、罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP的细胞干重达到最大值，分别为1.50、1.45和0.86g/L。而罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP菌株的干重直到发酵5天后才达到最大值，分别为0.77和1.23g/L。截断ED途径使得菌株具有了一个较长的延滞期。单独截断ED途径或PHB合成途径导致了相对较低的生物量，而碳流量的去向尚未知。而同时截断ED途径和PHB合成途径罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP的最大细胞干重相较于单截断ED途径的菌株(罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP)高，这可能是由于PHB途径截断后，碳流量供给了菌株的生长。
根据葡萄糖的利用速率，菌株可被分为三类：罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1、罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP，发酵液中的葡萄糖发酵一天后即被耗尽。而此时罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP发酵液中的葡萄糖为4.5g/L和4.7g/L，且葡萄糖直至发酵5天后才被耗尽。这与细胞干重的测定数据一致。
肌醇检测结果表明，除罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1外，其余菌种发酵液上清中均可检测到产物肌醇，如图7所示。当利用葡萄糖为唯一碳源时，葡萄糖的消耗主要是经由ED途径进行。截断ED途径能够增加产物肌醇合成前体物质(葡萄糖-6-磷酸)的供给，进而显著提高了肌醇的产量。发酵7天后，罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP的肌醇产量达到了520.2mg/L，是罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP菌株的1.4倍。而截断PHB合成途径并没有提升罗尔斯通氏菌的肌醇产量，该结果与甲基酮合成研究的结果相一致。可能是由于敲除PHB后，碳流被以丙酮酸等代谢产物的形式损失。罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP的肌醇产量分别为213.5和248.6mg/L，显著低于罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP菌株。综上所述，单截断ED途径有利于罗尔斯通氏菌利用葡萄糖为碳源的肌醇合成，而截断PHB合成途径会导致菌株代谢的复杂改变，从而对肌醇的合成具有负面影响。
实施例6 利用罗尔斯通氏菌工程菌株以甘油为碳源发酵生产肌醇
将罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1及产肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP工程菌株接种于添加有200mg/L卡那霉素的50mL的LB液体培养基中，于30℃200rpm复壮16小时。
制备以甘油为唯一碳源的发酵培养基：准确称取3.5gNa2HPO4，1.5g KH2PO4，1.0g(NH4)2SO4，80mg MgSO4·7H2O，1mg CaSO4·2H2O，0.56mgNiSO4·7H2O，0.4mg柠檬酸铁和200mg NaHCO3，5g甘油，以水作为溶剂定容至1L，115℃高压湿热灭菌灭菌30分钟，得到以甘油为唯一碳源的发酵培养基。
将罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1及产肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP工程菌株按1％的接种量转接至添加有200mg/L卡那霉素的200mL发酵培养基中，于30℃200rpm下进行摇瓶培养过夜。待OD600达到1.0以上，4600rpm离心8min收集菌体。PBS洗涤三次后，利用发酵培养基重悬菌体并调整OD600≈1.0，于30℃200rpm下进行摇瓶发酵。定时取样测定培养基内肌醇、甘油浓度。
菌液OD600测定：利用可见光分光光度计，测定波长600nm下菌液的吸收值。细胞干重的计算根据文献报道的公式：细胞干重(g/L)/OD600≈0.363g/L计算获得。
甘油浓度、肌醇浓度测定：使用高效液相色谱仪对样品中的甘油、肌醇进行检测。利用检测器为岛津视差折光检测器，色谱柱为Agilent Hi-Plex Ca column(300mm×7.7mm)，柱温80℃。流动相为超纯水，流速0.5mL/min，进样量10μL。
如图8所示，菌株发酵4天后，罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1和罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP菌株的最大细胞干重为1.3和1.1g/L。罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP在发酵5天后细胞干重达到最高值，分别为1.0和0.8g/L。截断ED途径和PHB合成途径的罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP菌株直到7天后菌体还在生长，最大细胞干重为0.8g/L。罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1培养基中的甘油在发酵四天后就被耗尽，而罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP发酵液中的甘油浓度分别为0.4、0.9、1.8和3.8g/L。
除罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1菌株外，其余菌株发酵液中均可检测到产物肌醇。已有报道表明，罗尔斯通氏菌可通过糖异生途径和ED途径进行甘油的代谢。截断ED途径会导致相对较低的生物量，但由于产物前体供给得到了提高使得产物肌醇的产量得到了提升。相较于罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP菌株539.8mg/L的肌醇产量，罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP的肌醇产量(1076.3mg/L)提升了99.4％(如图10所示)。然而，罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP菌株的肌醇产量下降至了386.8mg/L。这可能归因于敲除PHB合成途径后导致菌株的生物量降低。同时，据文献报道，PHB合成途径敲除后会造成碳流量以丙酮酸的形式流失，这可能也是造成肌醇产量下降的原因之一。此外，对ED途径和PHB合成途径进行双截断后，虽然菌体生长受到了严重的影响而导致了碳源消耗缓慢(如图10所示)，但因此也能够阻断碳流量的损失，从而使得肌醇产量得到了提高，最终产量为753.8mg/L。
实施例7 利用罗尔斯通氏菌工程菌株以CO2为碳源发酵生产肌醇
将罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1及产肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP工程菌株接种于添加有200mg/L卡那霉素的50mL的LB液体培养基中，于30℃200rpm复壮16小时。
制备以CO2为唯一碳源的发酵培养基：准确称取3.5gNa2HPO4，1.5g KH2PO4，1.0g(NH4)2SO4，80mg MgSO4·7H2O，1mg CaSO4·2H2O，0.56mgNiSO4·7H2O，0.4mg柠檬酸铁和200mgNaHCO3，以水作为溶剂定容至1L，115℃高压湿热灭菌灭菌30分钟。
将罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1及产肌醇的罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP工程菌株按1％的接种量转接至200mL发酵培养基中，于30℃200rpm下进行摇瓶培养过夜。待OD600达到1.0以上，4600rpm离心8min收集菌体。PBS洗涤三次后，利用发酵培养基重悬菌体并调整OD600≈1.0，于30℃200rpm下进行厌氧瓶摇瓶发酵。每天充入混合气体(H2:O2:CO2≈8:1:1)来补充碳源，定时取样测定培养基内肌醇浓度。
菌液OD600测定：利用可见光分光光度计，测定波长600nm下菌液的吸收值。细胞干重的计算根据文献报道的公式：细胞干重(g/L)/OD600≈0.363g/L计算获得。
肌醇浓度测定：使用高效液相色谱仪对样品中的甘油、肌醇进行检测。利用检测器为岛津视差折光检测器，色谱柱为Agilent Hi-Plex Ca column(300mm×7.7mm)，柱温80℃。流动相为超纯水，流速0.5mL/min，进样量10μL。
在气体发酵的最初8天，各菌株的生长速率均较快，其中罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1具有最快的生长速率。其细胞干重达到了0.8g/L，而其它菌株的细胞干重均介于0.5-0.6g/L之间，如图11所示。而后各菌株的生长速率率减慢。发酵64天后，罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1、罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP的细胞干重为1.1、1.0、0.9、0.8和0.8g/L。
如图12所示，除罗尔斯通氏菌H16-RE-pBBR1菌株外，其余菌株发酵液中均可检测到产物肌醇。截断ED途径和PHB合成途径有助于提升肌醇合成前体物质葡萄糖-6-磷酸的供给，进而提升产物的产量。气体发酵24天后，相较于罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP菌株的肌醇产量，罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP菌株发酵液中的肌醇分别为498.6、579.5和574.4mg/L，即提高了13.3％、31.7％和30.6％。但发酵40天后，由于罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP的菌体量的增大，其肌醇产量反而达到最高的720.2mg/L。而ED途径和PHB合成途径对肌醇产量的负面影响开始显示出来。罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP的肌醇合成达到了平台期。发酵64天后，最终罗尔斯通氏菌H16-RE-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf-ScIPS-EcIMP、罗尔斯通氏菌H16-RE△PHB-ScIPS-EcIMP和罗尔斯通氏菌H16-RE△zwf△PHB-ScIPS-EcIMP的肌醇产量分别为1054.8、874.0、978.0和711.2mg/L。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (8)

1.一种构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将野生型的罗尔斯通氏菌基因组中编码N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行突变，使其编码的蛋白质的第265位氨基酸由G突变为R，并敲除编码GntR家族的转录调节因子nagR，使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖，其中，所述N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的编码基因为nagE编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1的蛋白质，所述GntR家族的转录调节因子nagR的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(2)异源表达酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶ScIPS基因，构建突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞，其中，所述酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶ScIPS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
2.根据权利要求1所述的构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
敲除ED途径和/或PHB合成途径中的关键基因，其中，
所述ED途径关键基因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf1、zwf2和zwf3，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述zwf2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述zwf3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述PHB合成途径关键基因为聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA(H16_A1438)和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1，所述聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
3.一种以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌株，其特征在于，所述工程菌株通过包括以下步骤的方法获得：
(1)将野生型的罗尔斯通氏菌基因组中编码N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行突变，使其编码的蛋白质的第265位氨基酸由G突变为R，并敲除编码GntR家族的转录调节因子nagR，使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖，其中，所述N-乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的编码基因为nagE编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1的蛋白质，所述GntR家族的转录调节因子nagR的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(2)异源表达酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶ScIPS基因，构建突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞，其中，所述酿酒酵母来源的肌醇-3-磷酸合酶ScIPS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
4.根据权利要求3所述的以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌株，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
敲除ED途径和/或PHB合成途径中的关键基因，其中，
所述ED途径关键基因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf1、zwf2和zwf3，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因zwf1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述zwf2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述zwf3的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示；
所述PHB合成途径关键基因为聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA(H16_A1438)和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1，所述聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
5.一种发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述方法包括摇瓶发酵权利要求3或4所述的以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌株的步骤。
6.根据权利要求5所述的发酵生产肌醇的方法，其特征在于，利用不同碳源的培养基进行发酵，其中，所述碳源培养基的配方为：3.5g/L Na2HPO4，1.5g/L KH2PO4，1.0g/L(NH4)2SO4，80mg/L MgSO4·7H2O，1mg/L CaSO4·2H2O，0.56mg/L NiSO4·7H2O，0.4mg/L柠檬酸铁，200mg/L NaHCO3，分别添加5g/L葡萄糖或甘油、或者充入H2:O2:CO2＝8:1:1的混合气体作为碳源。
7.根据权利要求6所述的发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述碳源培养基含终浓度为200mg/L的卡那霉素抗生素。
8.根据权利要求6所述的发酵生产肌醇的方法，其特征在于，发酵条件为温度30℃，转速200rpm。
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