CN104293865B - 一种多分支淀粉的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种多分支淀粉的合成方法，属于淀粉资源开发技术领域。本发明利用淀粉分支酶的转糖基作用，转化直链糊精和糯玉米淀粉制备高度支化的多分支淀粉。主要步骤包括：按一定质量配比的DP30‑40直链糊精和糯玉米淀粉（外侧A链DP30‑40）为底物，分散于磷酸盐缓冲液中,沸水浴糊化，并保温，加入来源于Thermomonospora curvata的重组淀粉分支酶，45℃恒温反应6h，沸水浴灭酶，离心去除沉淀，加入无水乙醇使沉淀，沉淀分离淀粉转化产物，45℃下烘干、粉碎即得到分支化度达到10%‑15%的多分支淀粉，分支链聚合度集中在DP30‑40。该类多分支淀粉能够包埋保护光敏、易氧化组分，可广泛应用于食品、医药、化工等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种多分支淀粉的合成方法，具体涉及利用微生物来源的淀粉分支酶转化直链糊精和糯玉米淀粉合成多分支淀粉的方法，属于淀粉资源开发技术领域。
背景技术
多分支淀粉是一种高度分支化的可溶性的α-D-葡聚糖，具有显著的慢消化性，抗回生等特点。分支淀粉在食品，纺织，精细化工行业有着广泛的应用。目前国内外学者对其的研究集中在合成机理、性质及结构等方面。
淀粉分支酶是合成支链淀粉的关键酶，具有转移酶活性，是淀粉体内合成支链淀粉的关键酶。其对淀粉主要有两个作用，一方面能切断直链或者支链淀粉的α-1,4键，另一方面将切断的短链通过α-1,6键接到受体上，形成分支点。目前国内外主要是用植物或者微生物来源的淀粉分支酶在体外对淀粉底物进行催化，分析其作用机理及产物结构，并对产物的慢消化性进行研究。
经研究，前期通过重组质粒的异源表达获取高纯度的淀粉分支酶，发现该酶能够专一转化DP30-40的直链糊精与外侧A链DP30-40糯玉米淀粉的外侧链上，使原糯玉米淀粉结构非晶化、分支化度由原糯玉米淀粉的6%-10%提高到10%-15%，致使其包埋缓释特性显著提高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种多分支淀粉的合成方法。
本发明的技术方案，一种多分支淀粉的合成方法，步骤为：
（1）底物的制备：采用DP30-40直链糊精和外侧链A链DP30-40糯玉米淀粉为底物；采用醇酸降解木薯淀粉分级制备DP30-40的直链糊精；
（2）淀粉分支酶的获取：来源于Thermomonospora curvata的淀粉分支酶基因的全核苷酸序列（NCBI登陆序列：YP_003301175.1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成；通过基因克隆将编码淀粉分支酶的基因克隆到 pUC 57载体上，并且亚克隆到E.coli表达载体pET22b(+)上，并且在DNA序列的C端融合6个组氨酸标签，重组质粒命名为pET- Thcu - GBE；
所述编码淀粉分支酶的基因其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
重组质粒pET- Thcu-GBE转化到 E. coli BL21进行淀粉分支酶的表达，再用镍亲和层析对细胞破碎后的上清液进行纯化，即得到目的重组淀粉分支酶Thcu-GBE；
重组淀粉分支酶Thcu-GBE酶学性质：最适温度为45℃，最适pH为7.5，比酶活为80U/mg；
（3）多分支淀粉的合成：以DP30-40直链糊精和外侧链A链DP30-40糯玉米淀粉为底物，其质量比为1-9︰1，总质量10g，分散于100mL 50mM、pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，沸水浴中加热30min，冷却至45℃，加入6000-12000U重组淀粉分支酶Thcu-GBE，于45℃振荡水浴中反应6h；
沸水浴灭酶，5000g离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积无水乙醇沉淀，5000g离心15min；沉淀用乙醇反复洗涤三次，于45℃烘箱中干燥过夜，粉碎，得到产品多分支淀粉。
（4）多分支淀粉的结构鉴定：采用高效排阻色谱联合多角度激光检测器和示差检测器对反应产物进行分析，测定多分支淀粉的分子量和分散系数；采用高效阴离子色谱，分析多分支淀粉的侧链分布；采用异淀粉酶脱分支和DNS测定还原糖相结合的方法，分析多分支淀粉的分支密度。结果证明所制备的多分支淀粉的外侧链DP分布在DP30-40，平均链长DP34-37，分支化度为10%-15%，重均分子量为数量级106-107。
本发明的有益效果：本发明与现有技术相比，本发明提供了一种新的多分支淀粉的合成方法，具有分支度高、副产物少、处理量大、易于工业化制备等有益效果。
具体实施方式
实施例1
采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法获取DP30-40直链糊精，分散系数为1.35。其制备过程如下：称取25g木薯淀粉分散于100mL正丁醇（分析纯）中，加入1mL浓盐酸（分析纯），于40℃下水解72h，加入14mL 1M NaNO3终止反应，于4000g下离心15min，用50%乙醇洗涤沉淀数次至无氯离子，40℃烘箱干燥24h。将降解的淀粉溶于蒸馏水，配置成2.7%的溶液。取100mL淀粉水解物溶液加入15g数均分子量8000Da的聚乙二醇（化学纯），加热搅拌直到聚乙二醇溶解即溶液澄清，在空气中自然冷却到25℃，置于25℃水浴锅24h，于4000g下离心20min，得到的浓相用三氯甲烷洗涤除去残留的聚乙二醇，40℃干燥24h，粉碎、干燥得到DP30-40直链糊精组分。
将Thermomonospora curvata编码淀粉分支酶目的基因SEQ ID No. 1克隆到pUC 57载体上，并且亚克隆到E.coli表达载体pET- 22b(+)上，并且在DNA序列的C末端融合6个组氨酸标签构成重组质粒pET- Thcu - GBE。将此重组质粒转化到E. coli BL21表达宿主中进行表达。采用镍亲和层析对表达的蛋白分离纯化得到重组淀粉分支酶（Thcu-GBE）。该酶酶学性质为：最适温度45℃，最适pH7.5，比酶活为80U/mg。
称取总共10g以质量配比1:1 的DP30-40直链糊精和外侧链A链DP30-40糯玉米淀粉，分散于100mL 磷酸盐缓冲液（50mM，pH 7.5）中，沸水浴中加热30min，冷却至45℃，加入6000U重组淀粉分支酶，于45℃振荡水浴中反应6h。沸水浴灭酶，5000g下离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积无水乙醇沉淀，5000g下离心15min。沉淀用乙醇反复洗涤三次，于45℃烘箱中干燥过夜，粉碎，得到多分支淀粉产品，其侧链集中在DP 30-38范围，平均链长DP为35.4，重均分子量为7.5*106Da，分支度达到10.5%-13.7%。
实施例2
采用醇酸降解-聚乙二醇沉淀法获取DP30-40直链糊精，分散系数为1.35。
其制备过程如下：称取25g木薯淀粉分散于100mL正丁醇（分析纯）中，加入1mL浓盐酸（分析纯），于40℃下水解72h，加入14mL 1M NaNO3终止反应，于4000g下离心15min，用50%乙醇洗涤沉淀数次至无氯离子，40℃烘箱干燥24h。将降解的淀粉溶于蒸馏水，配置成2.7%的溶液。取100mL淀粉水解物溶液加入15g数均分子量8000Da的聚乙二醇（化学纯），加热搅拌直到聚乙二醇溶解即溶液澄清，在空气中自然冷却到25℃，置于25℃水浴锅24h，于4000g下离心20min，得到的浓相用三氯甲烷洗涤除去残留的聚乙二醇，40℃干燥24h，粉碎、干燥得到DP30-40直链糊精组分.
将Thermomonospora curvata编码淀粉分支酶目的基因SEQ ID No. 1克隆到pUC 57载体上，并且亚克隆到E.coli表达载体 pET- 22b(+)上，并且在DNA序列的C末端融合6个组氨酸标签构成重组质粒。将此重组质粒转化到E. coli BL21表达宿主中进行表达。采用镍亲和层析对表达的蛋白分离纯化得到重组淀粉分支酶（Thcu-GBE）。该酶酶学性质为：最适温度45℃，最适pH7.5，比酶活为80 U/mg。
称取总共10g以质量比9:1 DP30-40直链糊精和外侧链A链DP30-40糯玉米淀粉，分散于100mL磷酸盐缓冲液（50mM，pH 7.5）中，沸水浴中加热30min，冷却至45℃，加入12000U重组淀粉分支酶，于45℃振荡水浴中反应6h。沸水浴灭酶，5000g下离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积无水乙醇沉淀，5000g下离心15min。沉淀用乙醇反复洗涤三次，于45℃烘箱中干燥过夜，粉碎，得到多分支淀粉产品，其侧链集中分布在DP 33-40范围，平均链长DP为36.2，重均分子量为1.0*107Da，分支化度达到12.3%-14.5%。
SEQ ID No. 1
atgacagggg tgacgcacga ggacctcgac cggctcgtcg gcgggcacca ccacgatccg 60
cactcgatcc tgggagccca tcccggtccc gacggggtcg tcatccgggc gctgcggccg 120
ctggccgagc aggtggaggc gatcttgccg gacggcaccc gtcaccggct gcaccacgtc 180
cacgaagggg tgttcgaggt cgtcctcgag gcgcaccggg ccgttcccga ctaccggctg 240
gcggtgcgtt atgccggcgg gcccgagctg atccaggacg acccttaccg gcacctgccc 300
accgtggggg aactggacct gcacctgttc ggcgaggggc gccatgagga gctgtggcgg 360
gcgctgggcg cccgggtgcg ttccttcccc tcgcagttcg gcgagacccg cggggtgtcc 420
ttcacggtgt gggcgcccaa cgcccgcggg gtgcgggtga tcggcgactt caaccactgg 480
gacgggcggg cccacccgat gcggtcgctg ggcgccagcg gcgtgtggga gctgttcgtt 540
cccggcctgg gcaacggcac cacctataag ttcgaggtgc tcggcgcgga cggccaatgg 600
cgcggcaagg ccgacccgat ggcccggtgg accgagcagc cgccggccac cgcgtcccgg 660
gtgttcgagt cctcctatga gtggggcgac ggcgcgtgga tggagcagcg cgcctcccgc 720
gactggctgc acgagccgat gagcatctac gaagtccacc tggggtcctg gcgcaaaggg 780
ctcggctacc gggagctggc cgaggagctc accgcctacg tgcaggagat gggcttcacc 840
cacgtggagt tcctgccggt cgccgagcac ccctacggcc cgtcctgggg ctaccaggtg 900
acctcctact acgctcccac gtcccggttc ggcacccccg acgacttccg ccacctggtc 960
gaccggctgc accaggccgg catcggcgtg ctgatcgact gggtgcccgc gcacttcccc1020
agggacgagt gggcgctggc ccgcttcgac ggcaccgccc tgtacgagca cgacgacccg1080
cgcaagggcg agcatcccga ctggggcacg ctggtgttca actacggccg cgccgaggtg1140
cgcaacttcc tggtcgccaa cgcctgctac tggctggagg agttccacat cgacgggctg1200
cgcgtggacg ccgtcgcctc catgctgtac ctggactact cccgcaagga cggggagtgg1260
acccccaacg tctacggcgg ccgggagaac ctggaggcca tctccttcct gcaggagacc1320
aacgccaccg tctaccggcg ctacccgggc atcatcaccg tcgccgagga gtccaccgcc1380
tggcccggag tcacccgccc cacccatctg ggcgggctgg gcttcggctt caagtggaac1440
atgggctgga tgcacgacac cctgacctac ctgcagcacg acccggtgtt ccggcactac1500
caccacaacg agatcacctt ctcgctgatc tacgccttct ccgagaacta cgtgctgccg1560
ctgtcccacg atgaggtcgt gcacctgaag ggctcgctgc tggccaagat gcccggcgac1620
acctggaaga agttcgccgg cctgcgcgcc ttgttcgcct acatgtgggc gcacccgggc1680
aagcagctgc tgttcatggg cggggagttc gcccagggcg gcgagtgggc cgaagaacgc1740
cccctggact ggtggctgct ggacaacgcc gccgagggcg ccgcgcacct gggcgtccaa1800
aagctcgtgc gcgacctcaa ccgcgtctac cgctcctgcc cggccctgta caccatcgac1860
aacgagcccg gcggcttcca ctggatcgac gccggcgacg ccggccgcaa caccctgtcg1920
ttcctgcgct acggctccga cggctcggtg ctggcctgcg tggtcaactt ctccggcagc1980
ccccatgaga actaccgcat cggcctgccc caggccggcg gctggcgcga gatcgtcaac2040
accgacgcct acgagtacgg cggcagcggc gtgggcaaca tgggccatgt gaccgccgtc2100
gacgagccct cccacgccca gccggcctcc gccgtcatcc gcgtcccccc gctgggcgcc2160
ctctggctcg tccccgaaga gtccgcccgc ccccgcccga ccgcgcgcta g 2211
Claims (1)
1.一种多分支淀粉的合成方法，其特征在于步骤为：
（1）底物的制备：采用DP30-40直链糊精和外侧链A链DP30-40糯玉米淀粉为底物；采用醇酸降解木薯淀粉分级制备DP30-40的直链糊精；
（2）淀粉分支酶的获取：来源于Thermomonospora curvata的淀粉分支酶基因的全核苷酸序列，NCBI登陆序列：YP_003301175.1；通过基因克隆将编码淀粉分支酶的基因克隆到pUC 57载体上，并且亚克隆到E.coli表达载体 pET-22b(+)上，并且在DNA序列的C端融合6个组氨酸标签，重组质粒命名为pET- Thcu - GBE；
所述编码淀粉分支酶的基因其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
重组质粒pET- Thcu-GBE转化到 E. coli BL21进行淀粉分支酶的表达，再用镍亲和层析对细胞破碎后的上清液进行纯化，即得到目的重组淀粉分支酶Thcu-GBE；
重组淀粉分支酶Thcu-GBE酶学性质：最适温度为45℃，最适pH为7.5，比酶活为80 U/mg；
（3）多分支淀粉的合成：以DP30-40直链糊精和外侧链A链DP30-40糯玉米淀粉为底物，其质量比为1-9︰1，总质量10g，分散于100mL 50mM、pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，沸水浴中加热30min，冷却至45℃，加入6000-12000U重组淀粉分支酶Thcu-GBE，于45℃振荡水浴中反应6h；
沸水浴灭酶，5000g离心5min，去掉沉淀，清液用5倍体积无水乙醇沉淀，5000g离心15min；沉淀用乙醇反复洗涤三次，于45℃烘箱中干燥过夜，粉碎，得到产品多分支淀粉。
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