CN106544333A

CN106544333A - 一种β‑琼胶酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN106544333A
Application number: CN201610976223.0A
Authority: CN
Inventors: 王燕; 张文博; 周晨妍; 朱新术; 解丽芹; 朱武凌; 郭帅; 张鹏; 陈超群
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2016-11-07
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明涉及一种β‑琼胶酶及其编码基因和应用，所述β‑琼胶酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述β‑琼胶酶的编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明所述的β‑琼胶酶，具有良好的热稳定性和酶活性，能够特异性降解琼脂糖，产生单一的终产物新琼四糖，为琼胶寡糖的制备提供了新的酶源。

Description

一种β-琼胶酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β-琼胶酶及其编码基因和应用。

背景技术

利用生物技术向海洋索取药物和功能性食品的研究日益受到人们重视。大型海藻多糖——琼胶(agar)是红藻细胞壁的主要成分，近年来，随着糖生物学的深入研究，人们发现其降解产物琼胶寡糖(agaro-oligosaccharide，AOS)具有抑菌、抗病毒、增值肠道益生菌、抗肿瘤、提高机体免疫力、抗炎、抗氧化、清除羟基自由基、保湿和美白等多种特殊的生物学活性，从而使其在医药、食品、化妆品等行业具有较高的应用价值。

传统的琼胶寡糖制备方法包括物理法和化学法，其中物理法主要是利用超声、微波和辐射降解，化学法主要是利用酸、碱降解。这些方法虽然效率较高，但是均存在降解条件不易控制、产物均一性差等缺点，而且还存在着物理降解能耗高、化学降解环境污染严重等问题，成为制约琼胶寡糖高效制备的主要瓶颈。

琼胶酶(agarases)是琼胶酶解过程中的重要酶类，是一类能够降解琼脂糖的糖苷水解酶。琼脂糖是由(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖残基与(1-4)-O-3,6-内醚-α-L-吡喃半乳糖残基交替连接组成的线性链状分子，经琼胶酶作用后可产生由琼二糖的重复单位连接而成的低聚合度(2-10)的琼胶寡糖。随着琼胶酶研究的兴起和蓬勃发展，酶法制备琼胶寡糖已经成为新的研究趋势，利用琼胶酶水解琼胶生产琼胶寡糖，具有专一性强、反应条件温和等优点，被认为是当今最理想的绿色环保生产技术。

虽然现在已有多达几十种琼胶酶得到了研究，但由于现有的琼胶酶多为中温琼胶酶，其活性低、不稳定、产量低，所以难以实现大规模生产，难以为琼胶寡糖的高效制备提供基础保障和技术支撑。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种新的β-琼胶酶及其编码基因和应用，该β-琼胶酶具有良好的热稳定性和酶活性，能够特异性降解琼脂糖，为琼胶寡糖的制备提供新的酶源。

本发明所采用的技术方案如下：

一种β-琼胶酶，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

一种β-琼胶酶基因，编码本发明所述的β-琼胶酶，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:2所示。

本发明所述β-琼胶酶基因的制备方法，包括以下步骤：以柠檬假交替单胞菌Pseudoalteromonas citrea YTW1-15-1的基因组DNA为模板，在上游引物、下游引物的作用下进行PCR反应；PCR反应结束后，对PCR产物进行电泳，切胶回收产物，即得到所述的β-琼胶酶基因。

一种β-琼胶酶基因重组载体，由所述的β-琼胶酶基因与表达载体pET28a(+)构建而成。

本发明所述β-琼胶酶基因重组载体的制备方法，包括以下步骤：1)取所述的β-琼胶酶基因与pMD19T载体连接，构建β-琼胶酶基因克隆载体；2)用限制性内切酶分别酶切步骤1)得到的β-琼胶酶基因克隆载体以及表达载体pET28a(+)，酶切产物用DNA连接酶进行连接，构建所述的β-琼胶酶基因重组载体。

一种β-琼胶酶重组表达菌株，由所述的β-琼胶酶基因重组载体转化导入大肠杆菌BL21(DE3)plySs而成。该β-琼胶酶重组表达菌株(大肠杆菌BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917)，拉丁名称为Escherichia coil BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917，分类命名为大肠杆菌BL21(DE3)plySs，已于2016年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2016585，存活性检测结果为存活。

本发明所述β-琼胶酶重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：取所述的β-琼胶酶基因重组载体与感受态大肠杆菌BL21(DE3)plySs进行转化培养，即得到所述的β-琼胶酶重组表达菌株。

本发明所述β-琼胶酶的制备方法，包括以下步骤：取所述的β-琼胶酶重组表达菌株，接种于培养基中进行培养，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达；收集菌体，经超声破碎后离心，收集上清液进行柱层析分离，然后进行透析纯化，即得到所述的β-琼胶酶。

本发明所述β-琼胶酶可用于降解琼脂糖，制备琼胶寡糖。

本发明所述的β-琼胶酶，具有良好的热稳定性和酶活性，能够特异性降解琼脂糖，产生单一的终产物新琼四糖，为琼胶寡糖的制备提供了新的酶源。

本发明所述的β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)PlySs/Pet28a(+)/Aga0917能够高效表达本发明所述的β-琼胶酶，且易于纯化，能够适用于工业化大规模生产。

附图说明

图1为重组β-琼胶酶的酶解产物薄层层析结果图。

具体实施方式

为了更好地理解和实施，下面结合实施例对本发明作详细说明。

实施例1：β-琼胶酶基因Aga0917的获取

对产琼胶酶的柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromonas citrea)YTW1-15-1菌株进行全基因组分析，设计上、下游引物，如下：

上游引物：5’-CGCGGATCCGCAGATTGGGACGCATATAG-3’，

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAGTTTGCTTTGTAAACACG-3’。

将Pseudoalteromonas citrea YTW1-15-1菌株接种于海洋肉汤2216液体培养基，在28℃、120rpm下振荡培养24h，取1.5ml培养液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(Takara)中说明书的方法，提取Pseudoalteromonas citrea YTW1-15-1菌株的基因组DNA。

以Pseudoalteromonas citrea YTW1-15-1菌株的基因组DNA为模板，在上述上、下游引物的作用下进行PCR反应。PCR反应结束后，对PCR产物进行电泳，切胶回收分子量为810bp的电泳条带，得到β-琼胶酶基因Aga0917，经基因测序，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:2所示。

PCR反应体系如下(25μl)：

其中，2×Taq PCR Master Mix为PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTP、Taq DNA聚合酶的混合液，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，62℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃终延伸5分钟。

实施例2：β-琼胶酶基因克隆载体pMD19T-Aga0917的构建

为了提高与表达载体连接时目的基因片段(β-琼胶酶基因Aga0917)的浓度并保证目的基因片段的完全酶切，减少重组载体的假阳性结果，本实施例采用pMD19T载体与β-琼胶酶基因Aga0917构建了克隆载体pMD19T-Aga0917。

采用DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit)将纯化后的β-琼胶酶基因Aga0917与pMD19T载体连接，得到连接产物——β-琼胶酶基因克隆载体pMD19T-Aga0917。

连接反应体系如下(10μl)：

pMD19T载体(50ng/μl) 1.0μl，

β-琼胶酶基因Aga0917(165ng/μl) 4.0μl，

DNA连接试剂盒 5.0μl。

连接反应条件：16℃孵育反应16小时。

实施例3：大肠杆菌重组菌株DH5α-pMD19T-Aga0917的构建

将冰上解冻的100μl浓度为5×10⁷cfu/ml的感受态大肠杆菌E.coli DH5α细胞和10μl实施例2得到的连接产物混匀，冰浴30min，42℃热休克90s后，迅速置于冰中3min，加入890μl LB液体培养基，在37℃、170r/min的摇床上复苏1h，然后在4℃、4000r/min下离心5min，吸出890μl上清液，将剩余的上清液与菌体混匀，菌液与8μl异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、40μl 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)混合后均匀涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，正置约10min后使平板表面晾干，然后倒置，于37℃培养12～16h。

挑取白色菌落，采用质粒提取试剂盒提取其质粒，然后进行酶切鉴定。

酶切反应体系如下(10μl)：

酶切反应条件：在37℃下孵育反应1小时。

取酶切反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。琼脂糖凝胶电泳中出现810bp特异性条带者为阳性克隆，即含有克隆载体pMD19T-Aga0917的大肠杆菌重组菌株DH5α-pMD19T-Aga0917。采用M13测序通用引物进行基因测序，测定结果表明阳性克隆含有β-琼胶酶基因Aga0917的核苷酸序列。

实施例4：β-琼胶酶基因重组载体pET28a(+)-Aga0917的构建

使用限制性内切酶BamHI与XhoI分别酶切实施例2得到的β-琼胶酶基因克隆载体pMD19T-Aga0917和表达载体pET28a(+)，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，回收810bp、5.3kb片段的产物，分别为β-琼胶酶Aga0917基因片段和表达载体pET28a(+)片段，采用T₄连接酶将二者连接，得到连接产物——β-琼胶酶基因重组载体pET28a(+)-Aga0917。

克隆载体pMD19T-Aga0917双酶切反应体系如下(30μl)：

表达载体pET28a(+)双酶切反应体系如下(20μl)：

酶切反应条件：在37℃下孵育反应4小时。

连接反应体系如下(10μl)：

连接反应条件：16℃孵育反应16小时。

实施例5：β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917的构建

将冰上解冻的100μl浓度为5×10⁷cfu/ml的感受态大肠杆菌BL21(DE3)plySs细胞和10μl实施例4得到的连接产物混匀，冰浴30min，42℃热休克90s后，迅速置于冰中3min，加入890μl LB液体培养基，在37℃、170r/min的摇床上复苏1h，然后在4℃、4000r/min下离心5min，吸出890μl上清液，将剩余的上清液与菌体混匀，菌液涂布在含有100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，于37℃培养12～16h。

挑取培养得到的菌落，采用质粒提取试剂盒提取其质粒，然后进行酶切鉴定。

酶切反应体系如下(10μl)：

酶切反应条件：在37℃下孵育反应1小时。

取酶切反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。琼脂糖凝胶电泳中出现810bp特异性条带者为阳性克隆，即含有pET28a(+)-Aga0917质粒的β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917。

实施例6：β-琼胶酶Aga0917的制备

挑取β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917单克隆接种于含有100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、160rpm下振荡培养过夜，然后按1:100的比例接种于200ml含有100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、160rpm下振荡培养，使其OD₆₀₀达到0.4～0.6，然后加入终浓度为0.05mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，于16℃诱导表达16h。诱导菌液在4℃、6000rpm下离心10min，收集菌体，菌体用10ml 1×Ni柱结合缓冲液(含50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10Mm咪唑的水溶液，pH＝8.0)重悬，并进行超声破碎，破碎后在4℃、12000rpm下离心30min，收集上清液。上清液上样于用结合缓冲液平衡好的Ni柱，用10倍体积1×Ni柱结合缓冲液洗涤，然后依次用含有不同浓度咪唑(20mM、50mM、100mM、150Mm)的结合缓冲液洗涤Ni柱，最后用含有250mM咪唑的结合缓冲液洗脱Ni柱，收集洗脱液。洗脱液于透析液(含50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10％甘油的水溶液，pH＝8.0)中透析24h后，用SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含有分子量为33kD的单一目的条带的洗脱液，即得到所述的β-琼胶酶Aga0917。用Bradford法测定该β-琼胶酶的蛋白浓度为134ug/ml，分装后进行冻干，于-20℃保存备用。

实施例7：β-琼胶酶Aga0917的活性检测及酶学性质检测

分别挑取β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917单克隆和作为空白对照的大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)单克隆，分别接种于含有100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、160rpm下振荡培养过夜，然后按1:100的比例接种于200ml含有100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、160rpm下振荡培养，使其OD₆₀₀达到0.4～0.6，然后加入终浓度为0.05mM的IPTG进行诱导，于16℃诱导表达16h。分别取诱导菌液在4℃、6000rpm下离心10min，收集菌体，用磷酸缓冲液(pH＝7.4)重悬，并进行超声破碎，破碎后在4℃、12000rpm下离心30min，收集上清液。

分别取100μl诱导后的大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)上清液、β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917上清液以及实施例6制得的纯化β-琼胶酶Aga0917点在打好孔的琼脂平板上，于37℃放置3h，然后用卢戈氏碘液染色。结果显示，β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917上清液以及实施例6制得的纯化β-琼胶酶Aga0917均产生明显的透明圈，表明其均具有较强的琼胶酶活性，也就是说，实施例6制得的β-琼胶酶重组表达菌株BL21(DE3)plySs-pET28a(+)-Aga0917所表达的β-琼胶酶Aga0917具有较强的琼胶酶活性。

用DNS法测得β-琼胶酶Aga0917的酶学性质如下：

1、最适反应温度：60℃；

2、热稳定性：于4～80℃放置1h，其中，在4～40℃下能保持100％的活性，50℃下仍能保持57％以上的活性；

3、最适反应pH值：6.0；

4、pH稳定性：在pH4.0～11.0的缓冲液中放置1h，其中，在pH6～9下能保持82.4％以上的活性；

5、不同离子对酶活性的影响：浓度为1mM的金属离子，如Na⁺、K⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Mg² ⁺可以提高酶的活力，分别提高123％、118％、106％、122％、147％、116％；金属离子Fe³⁺对酶活性有完全抑制作用；

6、酶比活力：在60℃下测得的酶比活力为333U/mg。

目前已报道的琼胶酶多为中温琼胶酶，最适反应温度大都在35～50℃范围内，热稳定性都低于40℃或在50℃下只维持较短时间(10～30min)的稳定，而本发明所述β-琼胶酶Aga0917的最适反应温度高达60℃，在50℃保温1h后仍能保持57％以上的活性。由此可见，本发明所述的β-琼胶酶Aga0917属于耐高温琼胶酶，其一方面允许琼胶酶与其底物琼脂糖溶液能够在较高温度下进行酶解反应，解决了中温琼胶酶在酶解反应时出现底物琼脂糖溶液发生凝固、终止酶解反应的问题；另一方面，其在4～40℃下保温1h能够保持100％的活性，在50℃下保温1h仍能保持57％以上的活性，表明其寿命高于现有中温琼胶酶，能够便于储存、运输及酶解反应过程的操作。此外，目前已报道的主要产物为新琼四糖的琼胶酶，其酶比活力大都在200U/mg以下；本发明所述的β-琼胶酶Aga0917，其比酶活高达333U/mg，具有较强的酶活性。

由上述实验结果可见，本发明所述的β-琼胶酶Aga0917具有良好的热稳定性、酶活性，具有良好的工业应用前景。

实施例8：β-琼胶酶Aga0917用于制备琼胶寡糖

将琼脂糖溶于20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.0)中，配制成浓度为0.25％的琼脂糖溶液，将浓度为134ug/ml的β-琼胶酶Aga0917溶液与琼脂糖溶液按1︰40的体积比混合均匀后，在40℃温浴反应24h，然后于-20℃终止反应。在不同的反应时间(5min、10min、30min、1h、3h、6h、12h、24h) 分别取反应产物，离心，取上清液进行薄层层析(展开剂为：正丁醇︰乙酸︰水＝2︰1︰1；显色剂为：2％苯胺甲醇溶液5ml+2％二苯胺甲醇溶液5ml+三氯乙酸5g)。反应产物的薄层层析结果如图1所示。

β-琼胶酶Aga0917与琼脂糖反应24h后，于12000rpm离心30min，取上清液进行柱分离层析，获得反应终产物。反应终产物冻干后进行质谱分析，确定该β-琼胶酶的主要降解产物为新琼四糖。实验结果表明，采用该β-琼胶酶Aga0917对琼脂糖进行降解，能够获得单一类型的琼胶寡糖——新琼四糖，降解产物的单一性，为降解产物的分离纯化节省了大量的成本，有利于琼胶寡糖的大规模生产。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> 一种β-琼胶酶及其编码基因和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> β-琼胶酶

<400> 1

Met Asn Ile Leu Lys Leu Leu Ser Cys Ser Thr Cys Ala Ile Leu

5 10 15

Cys Thr Ala Thr His Ala Ala Asp Trp Asp Ala Tyr Ser Ile Pro

20 25 30

Ala Ser Ala Gly Ser Gly Lys Thr Trp Gln Leu Gln Thr Val Ser

35 40 45

Asp Gln Phe Asn Tyr Gln Ala Gly Thr Ser Asn Lys Pro Ala Ala

50 55 60

Phe Thr Asn Arg Trp Asn Ala Ser Tyr Ile Asn Ala Trp Leu Gly

65 70 75

Pro Gly Asp Thr Glu Phe Ser Ser Gly His Ser Tyr Thr Thr Gly

80 85 90

Gly Ala Leu Gly Leu Gln Ala Thr Glu Lys Ala Gly Thr Asn Lys

95 100 105

Val Leu Ala Gly Ile Val Ser Ser Lys Ala Thr Phe Thr Tyr Pro

110 115 120

Leu Tyr Leu Glu Ala Met Val Lys Pro Ser Asn Asn Thr Met Ala

125 130 135

Asn Ala Val Trp Met Leu Ser Ser Asp Ser Thr Gln Glu Ile Asp

140 145 150

Ala Met Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gln Glu Trp Phe

155 160 165

Asp Gln Arg Met His Val Ser His His Val Phe Ile Arg Glu Pro

170 175 180

Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ala Trp Val Tyr Asn

185 190 195

Asn Gly Glu Thr Tyr Arg Asn Lys Phe Arg Arg Tyr Gly Val His

200 205 210

Trp Lys Asp Ala Trp Asn Leu Asp Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Leu

215 220 225

Val Arg Ser Val Ser Gly Pro Asn Ile Ile Asp Pro Glu Gly Tyr

230 235 240

Thr Gly Gly Thr Gly Leu Asn Lys Pro Met His Ile Ile Leu Asp

245 250 255

Met Glu His Gln Pro Trp Arg Asp Val Lys Pro Asn Ser Thr Glu

260 265 270

Leu Ala Asp Ser Asn Lys Ser Ile Phe Trp Ile Asp Trp Val Arg

275 280 285

Val Tyr Lys Ala Asn

290

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> β-琼胶酶基因

<400> 2

ATGAATATAT TAAAACTACT ATCCTGTTCT ACTTGCGCAA TACTCTGCAC 50

AGCAACACAT GCTGCAGATT GGGACGCATA TAGTATTCCG GCTTCTGCTG 100

GATCAGGTAA AACATGGCAA TTACAAACTG TTTCCGACCA ATTTAACTAC 150

CAAGCCGGTA CTTCAAATAA ACCGGCAGCA TTTACCAATC GTTGGAATGC 200

TTCGTATATT AATGCTTGGC TTGGGCCTGG TGATACTGAA TTCAGTTCAG 250

GTCATTCCTA CACTACTGGT GGTGCGTTAG GCCTTCAGGC AACTGAAAAA 300

GCAGGAACAA ATAAAGTGCT TGCAGGAATT GTTTCTTCAA AAGCAACTTT 350

TACATACCCA CTTTATCTTG AGGCAATGGT AAAACCGAGT AATAACACTA 400

TGGCTAATGC CGTATGGATG TTGAGCTCTG ATTCAACTCA AGAAATTGAT 450

GCAATGGAGT CCTACGGCAG TGATCGTGTA GGGCAAGAGT GGTTTGACCA 500

ACGTATGCAC GTAAGTCACC ATGTTTTTAT ACGTGAGCCA TTTCAAGATT 550

ACCAACCAAA AGACGCAGGC GCATGGGTAT ACAATAACGG CGAAACATAC 600

CGAAATAAAT TTCGTCGCTA CGGTGTTCAT TGGAAGGACG CGTGGAACCT 650

AGATTACTAT ATTGATGGCG TATTAGTTCG CAGCGTTTCG GGTCCGAATA 700

TAATTGATCC TGAAGGCTAT ACAGGCGGCA CAGGGCTAAA TAAACCAATG 750

CACATCATTT TAGATATGGA ACATCAACCT TGGCGTGATG TAAAACCGAA 800

TTCAACCGAG CTAGCTGATT CAAACAAAAG TATATTTTGG ATTGATTGGG 850

TACGTGTTTA CAAAGCAAAC TAA 873

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> β-琼胶酶基因上游引物

<400> 3

CGCGGATCCG CAGATTGGGA CGCATATAG 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> β-琼胶酶基因下游引物

<400> 4

CCGCTCGAGT TAGTTTGCTT TGTAAACACG 30

Claims

1.一种β-琼胶酶，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.一种β-琼胶酶基因，编码权利要求1所述的β-琼胶酶，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:2所示。

3.权利要求2所述β-琼胶酶基因的制备方法，包括以下步骤：以柠檬假交替单胞菌Pseudoalteromonas citrea YTW1-15-1的基因组DNA为模板，在上游引物、下游引物的作用下进行PCR反应；PCR反应结束后，对PCR产物进行电泳，切胶回收产物，即得到所述的β-琼胶酶基因。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

所述的上游引物为5’-CGCGGATCCGCAGATTGGGACGCATATAG-3’，

所述的下游引物为5’-CCGCTCGAGTTAGTTTGCTTTGTAAACACG-3’。

5.一种β-琼胶酶基因重组载体，由权利要求2所述的β-琼胶酶基因与表达载体pET28a(+)构建而成。

6.权利要求5所述β-琼胶酶基因重组载体的制备方法，包括以下步骤：

1)取权利要求2所述的β-琼胶酶基因与pMD19T载体连接，构建β-琼胶酶基因克隆载体；

2)用限制性内切酶分别酶切步骤1)得到的β-琼胶酶基因克隆载体以及表达载体pET28a(+)，酶切产物用DNA连接酶进行连接，构建所述的β-琼胶酶基因重组载体。

7.一种β-琼胶酶重组表达菌株，由权利要求5所述的β-琼胶酶基因重组载体转化导入大肠杆菌BL21(DE3)plySs而成；所述的β-琼胶酶重组表达菌株于2016年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016585。

8.权利要求7所述β-琼胶酶重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：取权利要求5所述的β-琼胶酶基因重组载体与感受态大肠杆菌BL21(DE3)plySs进行转化培养，即得到所述的β-琼胶酶重组表达菌株。

9.权利要求1所述β-琼胶酶的制备方法，包括以下步骤：取权利要求7所述的β-琼胶酶重组表达菌株，接种于培养基中进行培养，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达；收集菌体，经超声破碎后离心，收集上清液进行柱层析分离，然后进行透析纯化，即得到所述的β-琼胶酶。

10.权利要求1所述的β-琼胶酶在制备琼胶寡糖中的应用。