CN103194435A - 一种β-琼胶酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β-琼胶酶,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1,编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的β-琼胶酶具有耐高温的特性,能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖,终产物为新琼四糖和新琼六糖,具有很好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因筛选应用技术领域,具体涉及一种β-琼胶酶及其应用,即一种来源于嗜琼胶卵链菌(Catenivulum agarivorans gen.nov. sp. nov.)YM01的β-琼胶酶基因YM01-3及其应用。
背景技术
在自然环境中,琼胶酶的分布较广,很多微生物和一些海洋软体动物都能产生琼胶酶。现阶段,绝大多数被分离研究的琼胶酶都是来自微生物,而海洋细菌又是产琼胶酶最多的类群。琼胶降解菌在海洋生态系统中分布广泛,在海洋植物、动物、海水及海洋沉积物中均有分布。根据氨基酸序列的相似性,琼胶酶被归属为糖苷水解酶家族(Glycoside hydrolase family)中的GH- l6,GH- 50和GH- 86。根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式不同,可以把琼胶酶分为两类:α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1, 3糖苷键,生成以β- D- 半乳糖为非还原性末端和以3, 6- 内醚- α- L- 半乳糖为还原性末端的的琼寡糖系列;β- 琼胶酶裂解琼脂糖的β- 1, 4糖苷键,生成以β- D- 半乳糖为还原性末端和以3, 6- 内醚- α-L- 半乳糖为还原性末端的新琼寡糖系列。已有证据表明,这些琼胶寡糖尤其是新琼寡糖具有很多的生理和生物活性。例如新琼寡糖对黑色素瘤细胞具有保湿和美白效果,还具有抑制微生物生长,刺激巨噬细胞活性的作用;琼胶寡糖在体内体外都具有清除ROS(Reactive Oxygen Species,活性氧簇)造成的氧化损伤的作用,因此可以应用在化妆品和保健品领域。综上所述,可以看出琼寡糖在功能食品、药物、化妆品等领域都有非常广泛的应用前景。
目前常用的琼寡糖生产方法主要有化学法和酶解法两种。传统的化学制备方法反应条件比较剧烈,专一性差,很难得到单一大小的寡糖,而且水解产物容易破坏,不利于产物的分析和回收,这些都限制了琼寡糖的使用。而琼胶酶酶解法由于高度专一高效,反应条件温和,易于控制,产物不易被破坏,因此有利于特定寡糖的大量制备和回收,必将成为琼寡糖生产的主要方法 。
虽然琼胶酶制备寡糖具有很多优势,但目前在工业上并没有得到广泛应用。这主要是因为目前发现和研究较多的是中温琼胶酶。由于提取纯化的费用高、酶产量低,贮藏和处理过程中酶活容易损失,贮存期短、运输费用高等缺点,导致这些酶的应用受到限制;而耐高温琼胶酶由于具有良好的高温稳定性,寿命一般长于中温酶,而且制备和使用过程中不需要冷却设备,可以显著降低成本,因此,在工业上具有更广泛的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种β-琼胶酶基因及其应用,所提供的β-琼胶酶具有耐高温的特性,从而弥补现有技术的不足。
本发明的一个方面提供一种β-琼胶酶,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
用于编码本发明β-琼胶酶的基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的另一个方面提供一种用于表达上述β-琼胶酶的重组表达载体。
本发明的β-琼胶酶用于降解琼胶制备新琼寡糖。
本发明的β-琼胶酶具有耐高温的特性,能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖,终产物为新琼四糖和新琼六糖,具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1:本发明的β-琼胶酶的耐高温效果检测(显示降解圈),其中左边样品未煮过,右边样品沸水煮过5min;
图2:本发明的β-琼胶酶的应用效果。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明,并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常可按常规条件,如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件运行。
实施例1:β-琼胶酶基因YM01-3的分离
通过对嗜琼胶卵链菌YM01进行全基因组测序得到15个琼胶酶基因及其基因序列,包括13个β-琼胶酶基因和2个α-琼胶酶基因,YM01-3是其中的一个β-琼胶酶基因。利用生物学软件Primer5.0设计上游引物(5′- CCGGAATTCATGTATGCAGCAGACTGGGAT-3′)和下游引物(5′-CCGCTCGAGTTGGAACTTCCATTGCTGG-3′)以基因组DNA为模板,进行PCR反应,PCR反应组成如下(25μl反应体系):ddH2O 10.5μl、上游和下游引物各0.5μl,DNA模板1μl、2×MasterMix 12.5μl。反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸1.5min,72℃终延伸10min,共30个循环。反应结束后,将PCR产物回收得到β-琼胶酶基因YM01-3,其核苷酸序列为SEQ ID NO:2,其翻译的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。多个测序结果也获得了相同的结果。
实施例2:大肠杆菌克隆载体PUCm-T—YM01-3的构建
将β-琼胶酶基因YM01-3与载体PUCm-T的连接,采用DNA LigationKit连接,连接体系(10μl)如下:SolutionⅠ5μl,DNA片段4μl,PUCm-T载体1μl。16℃连接16h所得到的连接液即可获得大肠杆菌克隆载体PUCm-T—YM01-3,用于转化大肠杆菌JM109。
实施例3:大肠杆菌重组株JM109—PUCm-T—YM01-3的构建
加入200μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl实施例2得到的连接液至2ml Eppendorf 管中,冰浴30min,42℃90s,冰浴2min,加入LB培养基800μl,37℃振荡培养1小时。菌液与4μl IPTG及40μl X-gal 混合后涂布于含有100μg/ml 氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12-14h。挑取白色菌落做PCR及双酶切检测,酶切体系(20μl)如下:ddH2O 8μl,PUCm-T—YM01-3质粒DNA 8μl,EcoRⅠ1μl,XholⅠ1μl,10×H Buffer 2μl,琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆,即含有PUCm-T—YM01-3的大肠杆菌JM109—PUCm-T—YM01-3。将1ml阳性克隆菌液送测,以M13测序通用引物测定外源插入序列YM01-3核苷酸序列。
实施例4:大肠杆菌表达载体pET24a(+)—YM01-3的构建
克隆载体PUCm-T—YM01-3和表达载体pET24a(+)分别用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切,酶切体系(20μl)如下:
反应体系1:ddH2O 8μl,PUCm-T—YM01-3质粒DNA 8μl,EcoRⅠ1μl,XholⅠ1μl, 10×H Buffer 2μl
反应体系2:ddH2O 8μl,pET24a(+)质粒DNA 8μl,EcoRⅠ1μl,XholⅠ1μl,10×H Buffer 2μl37℃酶切2小时,电泳后分别回收两个目的片段1260bp和5.3Kb,二者分别与β-琼胶酶YM01基因全长片段与表达载体PET24a(+)片段大小相同,用DNA Ligation Kit 连接,连接体系(10μl)如下:SolutionⅠ5μl,DNA片段1.5μl,pET24a(+)载体1.1μl,ddH2O 2.4μl。16℃连接16小时即可获得大肠杆菌表达载体pET24a(+)—YM01-3,用于转化大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例5:大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3的构建
加入200μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl实施例4得到的连接液至2ml Eppendorf 管中,冰浴30min,42℃90s,冰浴2min,加入LB培养基800μl,37℃振荡培养1小时。菌液涂布于含有100μg/ml 卡那霉素的LB平板上,37℃培养12-14h。挑取白色菌落做双酶切检测,酶切体系(10μl)如下:ddH2O 4μl,pET24a(+)—YM01-3质粒DNA4μl,EcoRⅠ0.5μl,XholⅠ0.5μl,10×H Buffer 1μl。琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆,即含有pET24a(+)—YM01-3的大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3。
实施例6:重组β-琼胶酶的制备
挑取大肠杆菌重组株BL21(DE3)—pET24a(+)—YM01-3单克隆于含有浓度为100μg/ml 卡那霉素的LB的液体培养基中,37℃振荡培养过夜,按1%接种量接种至200ml含有100μg/ml 卡那霉素的LB的液体培养基中,37℃150rpm振荡培养至OD600 为0.4-0.5,加入终浓度为0.1mMIPTG,16℃诱导表达10-12h。诱导菌液4℃12000rpm离心10min,收集菌体,菌体用10ml1×Ni柱结合缓冲液(20mM Tris-HCl ,PH=8.0;10 mM 咪唑;0.5 mM NaCl)重悬并进行超声波破碎,破碎后4℃12000rpm离心10min,收集上清液,破碎沉淀用2ml结合缓冲液冲洗,离心收集上清,将两次上清液混合。上清液上至用平衡好的Ni柱,用10倍体积1×Ni柱洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl ,PH=8.0;20 mM 咪唑;0.5 mM NaCl)洗脱,然后依次用不同浓度(50 mM,100 mM,150 mM,200 mM,250mM)咪唑的洗涤缓冲液洗涤亲和柱,最后用浓度为500mM咪唑的洗脱液洗涤亲和柱,收集洗脱液。洗脱液于透析液(20mM Tris-HCl ,PH=8.0;0.85(g/v)NaCl,10%甘油(v/v))中透析24h后SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布,合并含单一目的条带的洗脱液即可得到重组β-琼胶酶,其氨基酸序列见。用Bradford法测定目的蛋白的浓度,分装后将蛋白冻于-20℃保存以备用。
实施例7:重组β-琼胶酶活性检测及其酶学性质
将同样大小的圆滤纸片放在2%的琼脂糖平板上,分别取10微升未处理的纯化的重组酶和沸水中煮5min的纯化的重组酶滴在滤纸片上,37℃放置3h,然后用卢戈氏碘液染色,结果可在棕色背景上看到两个明显的透明圈(见附图1),说明纯化的重组酶有活性且煮5min后仍有活性。
用DNS试剂法测得此琼胶酶的酶学性质如下:
1、最适温度为60℃
2、温度稳定性:0℃-100℃下放置1h,其中0℃-50℃能保持90%的活性,60℃下还能保持30%的活性。
3、最适PH为6.0
4、PH稳定性:PH=4 ~PH=11缓冲液中放置12h,其中PH=4-9能保持87%的活性。
5、不同离子对酶活的影响:重金属离子如Fe3+、Mn2+、Cu2+、Ni2+对酶活有明显的抑制作用,其他金属离子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+以及β-巯基乙醇,尿素对酶活影响不大
6、酶比活:在底物浓度为0.25%琼脂糖,PH=6,60℃下测得酶比活为174.4U/mg
7、酶促动力学参数:Km=3.5mg/ml ;Vmax=1111.1U/mg
实施例8:表达产物用于制备新琼寡糖
制备新琼寡糖时,将琼脂糖溶于20mM Tris-HCl缓冲液(PH=8.0)中配成浓度为0.25%的溶液,按重组酶体积:反应体系体积=1-2:1000加入实施例6中所得的重组β-琼胶酶,混合均匀后,50℃温浴24h,反应不同时间(5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h),于-20℃终止反应,12000rpm离心10min,上清即作为薄层层析的样品。
薄层层析板使用前置于 110℃烘箱中干燥 1h。在层析板上距离底部1cm 处用铅笔划出底线,将样品 10μl 点于底线上,用风筒吹干,置于自制层析缸中展层。展开剂配方为正丁醇:冰乙酸:水=2:1:1(体积比)。待前沿线到达离层析板顶端 1cm 处时停止展层,烘箱中干燥。最后往层析板喷洒显色剂(2%二苯胺丙酮溶液5ml,2%苯胺丙酮溶液5ml,三氯乙酸5g),105℃烘箱中显色。显色结果显示了降解产物随时间的变化(见图2)。
根据以上结果,进行降解产物--新琼寡糖聚合度的分析,具体方法如下:同一块薄层层析板上点一个样品,展层结束后,遮住层析板的四分之三面积,只往剩下的四分之一上喷洒上述显色剂进行显色。显色后对照显色部分的条带,将未显色部位的对应条带刮下,加入一定体积的去离子水浸泡,12000rpm离心10min,取上清冻干后即作为做质谱的样品。质谱分析表明降解过程能产生聚合度为4-10的新琼寡糖,终产物为新琼四糖和新琼六糖。
Claims (5)
1.一种β-琼胶酶,所述的β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.用于编码权利要求1所述的β-琼胶酶的基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种重组表达载体,所述的重组表达载体用于表达利要求1所述的β-琼胶酶。
4.权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于,插入有权利要求2所述的基因。
5.权利要求1所述的β-琼胶酶在降解琼胶制备新琼寡糖中的应用。
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