CN106995811B - 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 - Google Patents

一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用，所述褐藻裂解酶的成熟蛋白包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其前体蛋白包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。所述褐藻裂解酶性质稳定，比酶活高达4600U/mL以上，可将褐藻胶酶解为具有特殊生物学活性的小分子褐藻寡糖，具备工业应用的潜质。

Description

一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用。
背景技术
褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-1,4-mannuronic acid，简称M)和其5位差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-1,4-guluronicacid，简称G)以C-1,4糖苷键非均聚形成的线性分子。，分子内聚M段、聚G段和M/G混合段交替排列。通常，褐藻胶由海带、马尾藻等食用型褐藻加工制得。铜绿假单胞菌、棕色固氮菌等微生物能分泌具有乙酰基修饰的褐藻胶。
研究发现褐藻胶的降解产物褐藻寡糖具有抗肿瘤、抗凝血、增强植物抗逆性、促进肠道内双歧杆菌生长等众多生理活性，其功能评价和开发研究得到不断深入，活性及药用价值研究已经成为新的热点。最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。
褐藻寡糖有多种方法制备，如酸降解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法等。褐藻胶裂解酶作为工具酶酶解生产褐藻寡糖和低分子量多糖具有降解条件温和，过程可控，得率高等优点，已逐渐取代传统的酸解方法而成为褐藻寡糖生产的主要方式。此外，褐藻胶裂解酶可以作为工具酶用于褐藻胶精细结构的分析，海藻单细胞及原生质体的制备，治疗囊性纤维化(CF)患者的肺部感染及生产生物燃料等。褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化降解褐藻胶单体间的1,4糖苷键，在C4，C5之间形成不饱和双键，并伴随4-O-糖苷键的消除，且在还原端生成4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyl uronic acid。褐藻胶裂解酶按其降解褐藻多糖作用方式的不同在EC数据库中被分为多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和α-L-1，4-古洛糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)。
CN 102994407 A公开了一种内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列及其制备方法与应用。该发明所涉及的褐藻胶裂解酶Alg2A来源土壤新分离菌株Flavobacterium sp.S20。该发明还提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Alg2A，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。CN 104293754 A公开了一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用，内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5，所述的褐藻胶裂解酶AlgL-5降解褐藻胶过程中寡糖主产物包括不饱和二糖、不饱和三糖、和不饱和四糖不饱和五糖。酶的最小不饱和寡糖底物是五糖，最小不饱和寡糖产物是二糖。但是这两种酶的活性不够高，底物专一性差，无法实现产业化生产。
在自然界中能够产生褐藻胶裂解酶的生物分布广泛，已报到产褐藻胶裂解酶的物种有海洋软体动物、棘皮动物、细菌、真菌等,其中对细菌产褐藻胶裂解酶的研究最多。目前褐藻胶裂解酶的产品开发依然面临不安全、酶活力较低、酶稳定性差、酶的底物谱窄等问题。因此，筛选酶活力高、酶活稳定、产酶量高的褐藻胶裂解酶具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用，所述褐藻胶裂解酶活性好，底物专一性好。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种褐藻裂解酶，所述褐藻裂解酶包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明中，所述褐藻裂解酶专一性强，能够将褐藻胶中的聚甘露糖醛酸降解为寡聚甘露糖醛酸或甘露糖醛酸寡糖，且酶活高，比酶活为4600U/mL以上，(比酶活定义：每分钟催化底物产生1μg还原糖所需的酶量)。
优选地，所述褐藻胶裂解酶包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
优选地，所述褐藻裂解酶包含的氨基酸序列的分子量为57kD。
优选地，所述褐藻裂解酶的N端氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为：EEREDVTY。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的褐藻裂解酶的前体蛋白，所述褐藻裂解酶的前体蛋白包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
本发明中，褐藻裂解酶的前体蛋白含有褐藻裂解酶，两者性质相同，且同样具有褐藻裂解酶的功能，且褐藻胶裂解酶是褐藻裂解酶的前体蛋白经修饰剪切所形成，具有和褐藻裂解酶相同的酶活性质，也能够将聚甘露糖醛酸降解为寡聚甘露糖醛酸或甘露糖醛酸寡糖，比酶活也能达到4300U/mL以上，(比酶活定义：每分钟催化底物产生1μg还原糖所需的酶量)。
优选地，所述褐藻胶裂解酶的前体蛋白包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
优选地，所述褐藻裂解酶的前体蛋白包含的氨基酸序列的分子量为143KD。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第一方面或第二方面所述的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的表达载体。
优选地，所述表达载体选自但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母中的任意一种。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的褐藻裂解酶的纯化方法，包括如下步骤：
(1)制备粗酶液；
(2)将步骤(1)得到的粗酶液浓缩，得到浓缩的粗酶液；
(3)将步骤(2)得到的浓缩粗酶液进行离子交换层析，得到所述褐藻裂解酶。
优选地，步骤(1)所述的制备粗酶液包括以下步骤：将保存的芽孢杆菌Alg07进行活化后再接种到发酵培养基中，收集菌体，离心取上清液得到所述粗酶液；
具体地，(a)取-80℃保存的芽孢杆菌Alg07，在优化后的固体培养基上划线，30℃培养箱静置培养；
(b)挑取单菌落，接种至含5mL发酵培养基的30mL试管中，30℃震荡培养16h；
(c)以0.5％(v/v)的接种量接种至含40mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件下培养24h；
(d)收集步骤(c)培养的菌体，4℃、12000r/min离心30min，取上清液，弃去菌体沉淀，即得到粗酶液。
优选地，步骤(2)所述的粗酶液浓缩包括以下步骤：取发酵上清液于烧杯中，将切向流超滤器的进样管、回流管置于发酵上清液中，其中进样管固定于蠕动泵上，蠕动泵转速为80-150r/min，浓缩至原体积的1/8-1/10时，向烧杯中加20mmol/L Tris-HCl pH7.0缓冲液至原体积，继续浓缩，重复三次，将发酵上清液浓缩至原体积的1/15-1/25，优选为1/20，过0.22μm纤维素膜，得到粗酶液浓缩液。
本发明中，重复三次浓缩为了去除发酵液中的金属离子。
优选地，步骤(3)所述的离子交换层析采用强阴离子交换柱Source 15Q；
优选地，步骤(3)所述的离子交换层析采用20mmol/L Tris-HCl pH 7.0Buffer A上样，20mmol/L Tris-HCl+1mol/L NaCl pH 7.0Buffer B洗脱，上样结束后，用Buffer A进行冲洗，直到280nm吸收峰为零时，开始收集各组分洗脱液；
具体地，包括如下步骤：(a)将保存于20％乙醇的强阴离子交换柱Source15Q与快速纯化液相色谱系统(AKTA Apurifier10)连接，用dd H2O冲洗10mL(流速1mL/min)；
(b)将上样Buffer A(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)装液瓶与AKTA系统A泵连接，洗脱Buffer B(20mmol/L Tris-HCl+1mol/L NaCl,pH 7.0)装液瓶与AKTA系统B泵相连接。用Buffer A对离子交换柱进行柱平衡(流速1mL/min)；
(c)浓缩后的粗酶液与AKAT系统A泵相连，以1mL/min的速度上样到离子交换柱；
(d)上样结束后，用Buffer A进行冲洗，直到280nm吸收峰为零(流速1mL/min)；
(e)用0-0.5mol/L的NaCl线性洗脱120min(流速1mL/min)，用自动收集器收集各组分，每管收集3mL。
本发明还提供一种如第一方面所述的褐藻裂解酶或如第二方面所述的褐藻裂解酶的前体的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过PCR扩增技术获得所述褐藻裂解酶的基因序列，并将褐藻裂解酶的基因序列重组到表达载体中，构建重组载体；
(2)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述褐藻裂解酶基因序列的阳性转化菌；
(3)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述褐藻裂解酶基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述褐藻裂解酶蛋白表达；
(4)分离纯化所述褐藻裂解酶蛋白。
优选地，所述PCR扩增的引物为：
其中，所述褐藻裂解酶所示序列的PCR扩增引物为：
上游引物如SEQ ID NO.6所示，下游引物如SEQ ID NO.7所示；
上游引物：5'-GGAATTCCATATGTCTATTGTTTTTAATAAA-3'，(SEQ ID NO.6)，其中下划线为NdeⅠ酶切位点；
下游引物：5'-ACGCGTCGACCTCTATCTTCATACCTTTTC-3'，(SEQ ID NO.7)，其中下划线为SalⅠ酶切位点；
其中，所述褐藻裂解酶的前体所示序列的PCR扩增引物为：
上游引物如SEQ ID NO.8所示，下游引物如SEQ ID NO.9所示；
上游引物：5'-GGAATTCCATATGGAGGAAAGAGAAGATGTCAC-3'，(SEQ ID NO.8)，其中下划线为NdeⅠ酶切位点；
下游引物：5'-CCGCTCGAGTTCACTCCATGTATCATCAG-3'，(SEQ ID NO.9)，其中下划线为Xho I酶切位点。
第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的褐藻裂解酶或如第二方面所述的褐藻裂解酶的前体在制备褐藻寡糖的应用。
第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的褐藻裂解酶或如第二方面所述的褐藻裂解酶的前体在制备食品风味配料、保健品、化妆品或海藻肥等领域的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明褐藻胶裂解酶来自于芽孢杆菌Alg07，酶的性质稳定，且底物专一，能够将褐藻胶中的聚甘露糖醛酸主要酶解降解为寡聚甘露糖醛酸或甘露糖醛酸寡糖；
(2)本发明褐藻裂解酶的比酶活可达4600U/mL以上，最适反应温度为40℃，最适反应pH为7，且Mg2+、Ca2+能够提高褐藻裂解酶的酶活，且底物专一，产物均一，具备工业化应用的潜质。。
附图说明
图1是本发明Source 15Q阴离子交换层析图谱；
图2是本发明纯化后褐藻裂解酶的蛋白电泳图谱；
图3是本发明褐藻胶裂解酶在不同温度下的相对酶活力结果图；
图4是本发明褐藻胶裂解酶在不同pH下的相对酶活力结果图；
图5是本发明褐藻胶裂解酶在不同NaCl浓度下的相对酶活力结果图；
图6是本发明褐藻胶裂解酶在不同金属离子下的相对酶活力结果图；
图7是本发明褐藻胶裂解酶在不同温度下保存后的剩余相对酶活力结果图；
图8是本发明褐藻胶裂解酶对不同底物特异性的结果图；
图9是本发明褐藻胶裂解酶酶解产物的液相色谱图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 原始菌中纯化褐藻裂解酶
原始菌中纯化褐藻裂解酶，包括如下步骤：
(1)制备粗酶液：
(a)取-80℃保存的芽孢杆菌Alg07，在优化后的固体培养基上划线，30℃培养箱静置培养；
(b)挑取单菌落，接种至含5mL发酵培养基的30mL试管中，30℃震荡培养16h；
(c)以0.5％(v/v)的接种量接种至含40mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、180r/min条件下培养24h；
(d)收集步骤(c)培养的菌体，4℃、12000r/min离心30min，取上清液，弃去菌体沉淀，即得到粗酶液。
(2)将步骤(1)得到的粗酶液浓缩：取1000mL发酵上清液于烧杯中，将切向流超滤器的进样管、回流管置于发酵上清液中，其中进样管固定于蠕动泵上，蠕动泵转速为100r/min，浓缩至100mL时，向烧杯中加20mmol/L Tris-HCl pH7.0缓冲液至原体积，继续浓缩，重复三次，将发酵上清液浓缩至50mL，过0.22μm纤维素膜，得到粗酶液浓缩液。
(3)将步骤(2)得到的浓缩粗酶液进行离子交换层析：(a)将保存于20％乙醇的强阴离子交换柱Source 15Q与快速纯化液相色谱系统(AKTA Apurifier10)连接，用dd H2O冲洗10mL(流速1mL/min)；
(b)将上样Buffer A(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)装液瓶与AKTA系统A泵连接，洗脱Buffer B(20mmol/L Tris-HCl+1mol/L NaCl,pH 7.0)装液瓶与AKTA系统B泵相连接。用Buffer A对离子交换柱进行柱平衡(流速1mL/min)；
(c)浓缩后的粗酶液与AKAT系统A泵相连，以1mL/min的速度上样到离子交换柱；
(d)上样结束后，用Buffer A进行冲洗，直到280nm吸收峰为零(流速1mL/min)；
(e)用0-0.5mol/L的NaCl线性洗脱120min(流速1mL/min)，用自动收集器收集各组分，每管收集3mL；
(f)对各管收集的组分测定褐藻裂解酶的酶活，离子交换层析图如图1所示，将经过强阴离子交换柱Source 15Q后，第二个蛋白质洗脱峰有褐藻胶裂解酶活性，收集此蛋白峰，跑SDS-PAGE结果如图2所示，该褐藻裂解酶的蛋白大小为57-60KD。
实施例2 褐藻裂解酶的N端测序
(1)建立标准氨基酸图谱
①利用混合氨基酸标准品(PTH-AA)，在常规条件下运行生成一张标准品色谱图
②对混合氨基酸标品的保留时间进行校正，生成标准方法文件
(2)上机检测
将PVDF膜夹于两片PTFE滤膜间，置于蛋白测序仪PPSQ-31A的反应器里，设定循环数量。
(3)将褐藻裂解酶SEQ ID NO.2转PVDF膜。
实施例3 褐藻胶裂解酶的基因挖掘
用RAST软件分析的结果显示，芽孢杆菌(Bacillus weihaiensis)Alg07菌株基因组DNA上携带褐藻胶裂解酶的编码基因No.2004。用生物学软件DNAMAN进行分析，显示基因No.2004编码蛋白质(AlgA)的理论分子量约为143kD。用信号肽在线预测软件SignalP4.1Server分析，结果显示蛋白质2004的氨基酸序列中含有分泌型信号肽。
实施例4 褐藻胶裂解酶前体蛋白的异源表达
褐藻胶裂解酶基因的克隆，表达载体的构建及鉴定：
(1)根据芽孢杆菌Alg07的褐藻胶裂解酶基因序列(SEQ NO.5)设计引物：
上游引物：5'-GGAATTCCATATGTCTATTGTTTTTAATAAA-3'，(SEQ ID NO.6)，其中下划线为NdeⅠ酶切位点；
下游引物：5'-ACGCGTCGACCTCTATCTTCATACCTTTTC-3'，(SEQ ID NO.7)，其中下划线为SalⅠ酶切位点。
采用OMEGA细菌基因组提取试剂盒提取菌株Alg07的全基因组。
PCR扩增：以提取的质粒为模板进行PCR扩增，反应体系如下：
设置一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
所获得PCR产物核酸胶进行验证，验证后用OMEGA胶回收试剂盒进行切胶回收。
(2)验证：所述酶切采用将过夜培养的菌液采用试剂盒的提取的方法纯化质粒，电泳检测无误后进行双酶切，酶切体系如下：
同时酶切pET-21a(+)质粒，作为阴性对照，酶切温度为37℃，时间1h。所获得酶切产物进行1.2％的琼脂糖凝胶回收目的条带。
(3)连接：将酶切后的基因片段及相应的pET-21a(+)载体用基因纯化试剂盒进行纯化，将纯化后的目的基因片段与对应的载体用T4DNA连接酶进行连接。
具体地，将上述回收到的目的片段和载体进行连接，体系如下：
(4)转化：取100μL冷冻大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，至于冰浴中解冻，然后加入10μL连接产物，轻弹管壁混匀后，冰浴30min，然后立即放入42℃水浴锅中热休克90s后，迅速取出，冰浴1-2min，加入500μL LB培养基，37℃，200r/min复苏培养1h，离心浓缩后涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上37℃过夜培养。
(5)重组质粒的提取及验证：从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，PCR验证并酶切验证，验证基因片段的大小，证明PCR得到的序列正确。
具体地，挑取在含有氨苄青霉素的LB固体平板上生长的菌株，接入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养12h。取适量菌液，用质粒提取试剂盒提取质粒，将提取的质粒DNA和原始质粒对照用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检测目的基因是否插入质粒中。以提取的基因重组质粒为模板，以基因的的引物序列及PCR反应体系与方法扩增基因，用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小分别为3.9k的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将重组质粒进行测序，结果表明，在pET-21a(+)的NdeⅠ和SalⅠ酶切位点之间分别插入了该基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确。
(6)重组蛋白诱导表达及纯化：将所述测序证明正确的重组载体转化到表达菌BL21大肠杆菌中，得到含有所述基因序列的阳性表达菌；
具体地，将验证成功的阳性转化子转入E.coli BL21表达宿主菌，选取阳性菌落加入IPTG进行诱导表达，诱导条件为：37℃培养3～4h至OD600约0.4～0.6，即细菌生长对数期，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导表达，16℃、120r/min培养24h。同时，利用相同条件培养含有pET-21a(+)的E.coli BL21作为对照。培养完成后，6000r/min离心10min弃上清。将菌体用20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液悬浮后，超声破碎，结果发现溶液变澄清，表达的蛋白基本在上清液中，褐藻胶裂解酶大小约为145kDa，与空质粒所表达蛋白比对可以发现，两种褐藻胶裂解酶基因均成功表达。
实施例5 褐藻胶裂解酶的异源表达
褐藻胶裂解酶成熟蛋白的异源表达方法同实施例4，其中所述褐藻胶裂解酶SEQID NO.2所示序列的PCR扩增引物为：
上游引物如SEQ ID NO.8所示，下游引物如SEQ ID NO.9所示；
上游引物：5'-GGAATTCCATATGGAGGAAAGAGAAGATGTCAC-3'，(SEQ ID NO.8)，其中下划线为NdeⅠ酶切位点；
下游引物：5'-CCGCTCGAGTTCACTCCATGTATCATCAG-3'，(SEQ ID NO.9)，其中下划线为Xho I酶切位点。
实施例6 温度对褐藻裂解酶的影响
将纯化的褐藻裂解酶稀释适当的倍数，取0.1mL稀释好的酶液加入1.9mL底物pH7.5,20mmol/L Tris-HCl缓冲液中，底物中含1％的NaCl，分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃温度下反应20min，测定酶活力，判断最适反应温度。以酶反应最适温度下所测得的酶活力为100％，其它温度下酶活力与最高酶活力的比值为该温度下的相对酶活力，作温度-相对酶活力曲线，结果如图3所示。
从图3可以看出，褐藻裂解酶的最适反应温度为40℃。
实施例7 pH对褐藻裂解酶的影响
用不同的缓冲液配制1％的褐藻胶底物，底物中含1％的NaCl，加入适当稀释的褐藻胶裂解酶的纯酶，40℃下反应20min，测定酶活力，判断最适反应pH值。以酶反应最适pH值下所测得的酶活力为100％，其它pH值下酶活力与最高酶活力的比值为该pH值下的相对活性，作pH-相对酶活力曲线，结果如图4所示。
所选用缓冲液为：pH为4.0、5.0、5.5、6.0的20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH为9.0、10.0、11.0的20mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
从图4可以看出，褐藻裂解酶的最适反应pH为7
实施例8 NaCl浓度对褐藻裂解酶的影响
以不同浓度的NaCl配制1％的褐藻胶底物，NaCl的浓度分别为0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200mmol/L，检测酶活力，以酶反应最适NaCl浓度下所测得的酶活力为100％，其它NaCl浓度下酶活力与最高酶活力的比值为该NaCl浓度下的相对活性，作pH-相对酶活力曲线，结果如图5所示。
从图5可以看出，褐藻裂解酶随着NaCl浓度增高酶活也增高，当NaCl浓度达到160mmol/L时达到最高，随着NaCl浓度继续增高，酶活保持不变。
实施例9 不同金属离子及EDTA对褐藻裂解酶的影响
在底物中添加1％(w/v)的NaCl，在此基础上测定不同金属离子对褐藻裂解酶的影响。配制1mol/L的各种金属离子母液，金属离子包括：Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、K+、Mn2 +、K+、Ba2+和EDTA。将稀释适当倍数的褐藻裂解酶纯酶液平均分装至1.5mL EP管中，向其中加入各种金属离子母液，使金属离子终浓度为5mmol/L，室温下静置30min。在最适温度与最适pH值条件下，测定酶活。只含1％NaCl的反应液作为对照组，其酶活力设定为100％，测定结果如图6所示。
从图6可以看出，Mg2+、Ca2+能够提高褐藻裂解酶的酶活，而其他金属离子和EDTA均会对褐藻裂解酶的酶活产生影响。
实施例10 褐藻裂解酶的温度稳定性
将褐藻裂解酶纯酶分别放入40℃、45℃和50℃水浴保温，间隔30min取样至360min，所取样品4℃低温放置，取样结束后，测定样品的剩余酶活力，测定结果如图7所示。
从图7可以看出，褐藻裂解酶在40℃时可以一直维持酶活稳定，而在45℃时，2h后酶活降到原来的60％，在50℃时，1h后酶活降到原来的20％。
实施例11 褐藻裂解酶的底物特异性
聚甘露糖醛酸(PM)、聚古洛糖醛酸(PG)的制备：称取20g褐藻胶加水1000mL溶胀，磁力搅拌器搅拌，充分溶胀24h。向2％的褐藻胶溶液中加入浓盐酸，使盐酸终浓度约1mol/L，100℃水浴保温12h，期间不断搅拌。7500r/min离心30min，沉淀用水悬浮，用10mol/L的NaOH调节至中性(7-8)，使沉淀完全溶解。再用浓盐酸调节pH值，至pH＝3，7500r/min离心30min，收集沉淀得到PG；取上清液，用浓盐酸调pH值，pH＝1，7500r/min离心30min，收集沉淀得到PM。分别配制1％(w/v)的褐藻胶、PG、PM、淀粉、琼脂、纤维素底物，考察的褐藻裂解酶底物特异性，结果如图8所示。
从图8可以看出，该褐藻胶裂解酶对最适底物为PM，而对淀粉、琼脂、纤维素等均没有活性。
实施例12 褐藻裂解酶的酶解产物分析
用20mM pH7.5Tris-HCl Tris-HCl缓冲液，配制1％的褐藻胶底物，在2mL的褐藻胶底物中加入终浓度为1％的NaCl和100μL的纯酶(500U/mL)，40℃反应6h，得到酶解产物。
主要采用高效液相色谱法对酶解产物进行分析。将1％的褐藻胶酶解产物用0.22μm膜过滤后，用安捷伦高效液相色谱系统，采用阴离子交换色谱柱TSK-GEL DEAE-2SW 4.6mm×250mm，流动相流速为0.8mL/min，上样后，用ddH2O冲洗30min，以便除去酶解产物中的金属离子，之后用0-0.5mol/L NaCl线性洗脱120min，235nm紫外光谱下测定吸收峰，结果如图9所示。
从图9可以看出，褐藻裂解酶可以将褐藻胶进行降解，降解后可以得到二糖、三糖、五糖、六糖等小分子量的褐藻寡糖。
综上所述，本发明褐藻裂解酶性质稳定，最适反应温度为40℃，最适反应pH为7，且Mg2+、Ca2+能够提高褐藻裂解酶的酶活，且底物专一，产物为具有生物学活性的小分子褐藻寡糖，具备工业化应用的潜质。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的前体蛋白，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶的前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.编码如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸如SEQ IDNO.2所示。
4.编码如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的前体蛋白的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸如SEQ ID NO.5所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求3或权利要求4所述的核苷酸。
6.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母中的任意一种。
8.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶或如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的前体蛋白在制备褐藻寡糖中的应用。
9.一种如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶或如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶的前体蛋白在制备食品风味配料、保健品、化妆品或海藻肥料中的应用。
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