CN109022408A - 一种新型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有pH稳定性和热恢复特性的内切型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用。所述褐藻胶裂解酶Aly08氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的褐藻胶裂解酶为人工设计序列，氨基酸序列与已知功能的褐藻胶裂解酶相似度仅为78%。本发明所述的褐藻胶裂解酶最适反应温度为45℃，具有热恢复特性，在煮沸5分钟后，在冰水中孵育40分钟，可恢复78.3%的活性。最适反应pH为8.3，具有宽广的pH稳定性（5‑10.6）。该酶作用方式为内切，降解主产物为不饱和褐藻胶二、三糖。本发明所述的褐藻胶裂解酶产量大，性质新颖，具有良好的工业化应用潜质。

Description

一种新型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有pH稳定性和热恢复特性的内切型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

褐藻胶是多种褐藻的细胞壁主要成分，可占到褐藻干重的20-40%。我国是海藻养殖大国，褐藻胶产量世界第一。褐藻胶由互为差向异构体的α-L-甘露糖醛酸（Mannuronicacid，M）和β-D-古罗糖醛酸（Guluronic acid，G）通过1,4糖苷键连接而成的线性多糖。根据排列组合不同，褐藻胶分为多聚甘露糖醛酸片段（PolyM），多聚古洛糖醛酸片段，以及甘露糖醛酸和古洛糖醛酸交替片段（PolyMG）。褐藻胶广泛应用在化工、医药、食品等行业。今年来，越来越多的报道证实通过褐藻胶裂解酶降解而成的褐藻胶寡糖片段具有多种生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等。并且，不同聚合度的褐藻胶寡糖具有不同的生物学活性，M段寡糖和G段寡糖之间活性也各不相同。利用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“GV-971”能多靶点的抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，已完成三期临床实验；聚G寡糖能够与抗生素联合使用抑制多种临床多耐药致病菌。

褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化褐藻胶分子内1，4糖苷键的断裂，产生非还原性末端具有共轭双键的不饱和寡糖。传统的褐藻胶裂解酶是从海洋动物消化道或海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然褐藻胶裂解酶产量低，发展基因工程的褐藻胶裂解酶势在必行。目前在多糖降解酶数据库中已有几百个预测的褐藻胶裂解酶基因，其中部分基因在大肠杆菌或酵母菌中进行了重组表达，并研究了其酶学性质。但是大多数报道的褐藻胶裂解酶热稳定和热恢复性较差，容易失活，无法达到工业化应用的要求。因此，寻找具有特殊性质的褐藻胶裂解酶，并研究其降解条件及最终产物具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有宽广pH稳定性和热恢复特性的碱性内切型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用。该酶与已有褐藻胶裂解酶的氨基酸相似度仅为78%。该酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH为8.3；酶液煮沸5分钟后，放置在冰水中（0℃）孵育40分钟，可恢复其78.3%的活性。该酶降解方式为内切，降解主产物为褐藻胶不饱和二糖和三糖。

一方面，本发明提供一种新型褐藻胶裂解酶Aly08，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

MLLNKIITTSAIAIFSSFSMAFDLLDWYLSIPLDKGDGYATSIKENELAASYEDDFFYTGSDGGMVFYTPVKGYKTSENTKYVRTELREMLRRGDTSKSTSGAENNWAFSSISSGVQSDFAGIDGTLKATLAVNHVTTTSSNDEQVGRIVVGQIHAKNNEPIRLYYHKLPNNSKGAIYFAHETSKSDGGNETWYNLLGSMVNSSGSLSSTSNPSDGIELNEEFSYDITVNGDSLIVTISQDGSQLAKKTIDMSGSGYDDASNYMYFKAGIYLQDNTSNDDDYAKATFYELSNTHDNYSY

另一方面，本发明还提供一种新型褐藻胶裂解酶Aly08对应的核酸序列，如SEQ IDNO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGTTATTGAACAAAATTATTACTACATCTGCCATCGCCATTTTTAGTTCATTTTCAATGGCCTTCGACCTACTAGACTGGTACCTATCTATCCCACTAGACAAAGGTGACGGTTACGCTACTTCTATCAAAGAAAACGAACTAGCTGCTTCTTACGAAGACGACTTCTTCTACACTGGTTCTGACGGTGGTATGGTTTTCTACACTCCAGTTAAAGGTTACAAAACTTCTGAAAACACTAAATACGTTCGTACTGAACTACGTGAAATGCTACGTCGTGGTGACACTTCTAAATCTACTTCTGGTGCTGAAAACAACTGGGCTTTCTCTTCTATCTCTTCTGGTGTTCAATCTGACTTCGCTGGTATCGACGGTACTCTAAAAGCTACTCTAGCTGTTAACCACGTTACTACTACTTCTTCTAACGACGAACAAGTTGGTCGTATCGTTGTTGGTCAAATCCACGCTAAAAACAACGAACCAATCCGTCTATACTACCACAAACTACCAAACAACTCTAAAGGTGCTATCTACTTCGCTCACGAAACTTCTAAATCTGACGGTGGTAACGAAACTTGGTACAACCTACTAGGTTCTATGGTTAACTCTTCTGGTTCTCTATCTTCTACTTCTAACCCATCTGACGGTATCGAACTAAACGAAGAATTCTCTTACGACATCACTGTTAACGGTGACTCTCTAATCGTTACTATCTCTCAAGACGGTTCTCAACTAGCTAAAAAAACTATCGACATGTCTGGTTCTGGTTACGACGACGCTTCTAACTACATGTACTTCAAAGCTGGTATCTACCTACAAGACAACACTTCTAACGACGACGACTACGCTAAAGCTACTTTCTACGAACTATCTAACACTCACGACAACTACTCTTAC

另一方面，本发明还提供一种新型褐藻胶裂解酶Aly08的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶Aly08在裂解大分子褐藻胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶Aly08在裂解大分子褐藻胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶Aly08在裂解甘露糖醛酸片段（PolyM）中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶Aly08在裂解古罗糖醛酸片段（PolyG）中的应用。

另一方面，一种裂解褐藻胶的方法，所选用的褐藻胶裂解酶为Aly08。

优选：所述裂解条件中反应温度为0~70℃。最适反应温度为45℃。

优选：所述裂解条件中反应pH为6~10。最适反应pH为8.3。

优选：所述热恢复特性中孵育时间为1~60 min。最适孵育时间为40 min。

优选：所述热恢复特性中孵育温度为0~80℃。最适孵育温度为0℃。

有益效果：

1.本发明的褐藻胶裂解酶Aly08为结构与功能新颖的褐藻胶裂解酶，归属于多糖裂解酶第7家族（PL-7），其氨基酸序列与已有的褐藻胶裂解酶序列相似度仅为78%。

2.本发明提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将Aly08的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经5 L发酵后，发酵液酶活力高达1280.9U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达90.6%，蛋白质纯度高达95%。

3.本发明的褐藻胶裂解酶Aly08具有优良的理化性质，该酶最适反应pH为8.3，具有宽广的pH稳定性，在pH 5-10.6的范围内均能保持高的活性。并且，其具有热恢复的特性，酶液煮沸5分钟后，在冰水中（0℃）放置40分钟，可恢复其78.3%的活性。利用该重组酶进行了降解产物分析，该酶降解主产物为褐藻胶二糖和三糖。本发明所述的褐藻胶裂解酶Aly08具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明褐藻胶裂解酶Aly08与已知褐藻胶裂解酶序列之间的进化关系结果；

图2为本发明褐藻胶裂解酶Aly08与相似度最高的褐藻胶裂解酶之间的多重序列比对及保守位点分析结果（星号为催化位点）；

图3为本发明褐藻胶裂解酶Aly08蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得褐藻胶裂解酶Aly08）；

图4为本发明褐藻胶裂解酶Aly08的温度和pH适应性分析（A，褐藻胶裂解酶Aly08的最适反应温度；B，褐藻胶裂解酶Aly08的温度稳定性；C，褐藻胶裂解酶Aly08的最适反应pH；D，褐藻胶裂解酶Aly08的pH稳定性）；

图5为本发明褐藻胶裂解酶Aly08的热恢复性分析（A，不同温度下孵育1 h后冰上孵育0和30 min后Aly08的热恢复性比较；B，煮沸不同时间对酶热恢复性的影响；C，不同孵育温度对褐藻胶裂解酶Aly08的热恢复性影响；D，不同孵育时间对褐藻胶裂解酶Aly08的热恢复性影响）

图6为高效液相检测本发明褐藻胶裂解酶Aly08的降解方式（DP1，褐藻胶单糖；DP2，不饱和褐藻胶二糖；DP3，不饱和褐藻胶三糖）；

图7为薄层层析（TLC）法检测本发明褐藻胶裂解酶Aly08的酶解产物（M，褐藻寡糖2糖DP2、3糖DP3标准品；0，酶解前底物；1，酶解后产物）；

图8为阴离子一级质谱（ESI-MS）检测本发明褐藻胶裂解酶Aly08的最终降解产物（175为不饱和褐藻胶单糖；351为不饱和褐藻胶二糖；527为不饱和褐藻胶三糖）。

具体实施方式

实施例1 褐藻胶裂解酶Aly08序列分析

本发明所述褐藻胶裂解酶Aly08的产酶基因aly08为全合成序列（华大基因公司合成），包含有897个碱基序列，编码299个氨基酸序列。利用National Center for BiotechnologyInformation (NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain (CDD)和多重序列比对BasicLocal Alignment Search Tool (Blast)发现，该序列包含有一个褐藻胶裂解酶第2超家族（Alginate lyase 2 superfamily）的保守区。已经报道的褐藻胶裂解酶中，与Aly08氨基酸序列相似度最高的为多糖裂解酶第7家族（PL-7）的褐藻胶裂解酶AlyL2（GenbankAJO61885），两者之间的氨基酸序列相似度（Identity）为78%。

本发明所述的褐藻胶裂解酶Aly08氨基酸序列进行Blast分析，将其与已报道的褐藻胶裂解酶，利用ClustalX软件进行多重序列比对，并利用Mega 7.1软件进行进化树分析。如图1所示，褐藻胶裂解酶Aly08与来源于Agarivorans sp. L11的PL-7家族褐藻胶裂解酶AlyL2（Genbank AJO61885），来源于Saccharophagus degradans 2-40中的PL-7家族褐藻胶裂解酶Alg7D（Genbank ABD81807），以及来源于Microbubifer sp. 6532A中的PL-7家族褐藻胶裂解酶AlgMsp（Genbank BAJ2034）进化关系最近。

上述4种褐藻胶裂解酶利用ClustalW在线运行多重序列比对和保守区分析（图2）。保守序列分析发现，4种酶均含有PL-7家族褐藻胶裂解酶中的三段保守区域：“RTELREMLR”，“QIH”，“MYFKAG”。结合进化树分析及多重序列比对分析，说明本发明所述褐藻胶裂解酶Aly08归属于PL-7家族。其氨基酸序列相似度与已经报道的褐藻胶裂解酶序列相似度仅为78%，因此，该酶为PL-7家族的一个新的成员。

实施例2 褐藻胶裂解酶Aly08的重组表达

将实施例1中全合成的algA1基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：SEQ ID NO.3：Paly08F：

5’- CATGCCATGGGTATGTTATTGAACAAAAT -3’ (Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：Paly08R：

5’- CCGCTCGAGGTAAGAGTAGTTGTC -3’ (Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b (+)质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上（含有50 μg/mL氨苄青霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL氨苄青霉素），转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-aly08。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-Aly08，保存在-80℃备用。

实施例3 褐藻胶裂解酶Aly08的发酵及纯化制备方法

将实施例2中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-Aly08转接至LB液体培养基中（50 μg/mL氨苄青霉素），在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6。5 L发酵罐装载60% (3 L)的Terrific Broth (TB)培养基，并提前灭菌处理；发酵罐中添加50 μg/mL氨苄青霉素，将锥形瓶中培养好的菌液按照5%的接种量接种至5 L发酵罐中。调整初始通气量为60 L/h，初始转速为300 rpm，温度控制在37℃，溶氧控制在10-60%；当菌体生长到OD₆₀₀=5.0时，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导60 h。期间进行补料，补料培养基（300 g甘油溶解在100 mM的pH7.6的磷酸盐缓冲液），补料体积为100 mL，流速为0.2 mL/min，经诱导产酶后，菌体密度可达到OD₆₀₀=60-90。褐藻胶裂解酶活性测定方法为：100 μl酶液加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.6），在45℃下反应10 min，用分光光度计测定A235数值。酶活力定义为1 ml酶液引起A235数值增加0.1为一个酶活力单位。发酵液酶活力可达1280.9 U/mL。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；3 L发酵上清液分10批次（每次300 mL）上样于100 mL镍离子亲和层析柱，上样流速为50 ml/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到90.6%。纯化所得褐藻胶裂解酶Aly08进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图3所示，纯化所得Aly08的分子量为35kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得褐藻胶裂解酶Aly08的蛋白纯度达到95%以上。

实施例4 温度和pH对褐藻胶裂解酶Aly08的影响

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.6），在不同温度（0-70℃）下反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下Aly08的相对酶活力。如图4A所示，褐藻胶裂解酶Aly08的最适反应温度为45℃。

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶1 ml在不同温度（0-70 ℃）下孵育1 h，取出后，立即在其最适反应温度（45℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图4B所示，褐藻胶裂解酶Aly08温度稳定性很差，在30 ℃下孵育1 h，酶即失去活性。

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM磷酸盐缓冲液，pH=7.3），在4种不同缓冲液中反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同pH条件下Aly08的相对酶活力。使用的4种缓冲液分别为50 mM磷酸盐缓冲液（pH6.0~8.0），甘氨酸-NaOH缓冲液（pH8.6~10.6），Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液（pH3.0~8.0），Tris-HCl缓冲液（pH7.05~8.95）。如图4C所示，褐藻胶裂解酶Aly08的最适反应pH为8.3。

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶1 ml在不同pH条件（4-10.6）下孵育12 h，取出后，立即在其最适反应pH（8.3）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图4D所示，褐藻胶裂解酶Aly08具有宽广的pH稳定性，在pH 5-10.6的范围内均可保持70%以上的酶活力。

实施例5褐藻胶裂解酶Aly08的热恢复性测定

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶在不同温度（0-70℃）下孵育1 h，分别在冰上孵育0 min和30 min，在其45℃下检测其酶活力。如图5A所示，在冰上孵育30 min所测得活性，显著高于不孵育直接检测的活性。

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶煮沸不同时间（5-60 min），然后将其在冰上孵育0 min和30 min后在45℃下检测其酶活力。如图5B所示，煮沸5-30 min后，在冰上孵育30 min，可部分恢复其酶活力，其中煮沸时间越短，恢复能力越强。

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶在100℃沸水中煮沸5 min，然后取出立即放置在0-80℃下孵育30 min，检测其剩余酶活力，以不煮沸酶液的活力为100%；以煮沸后直接检测所得酶活力作为阴性对照；检测不同孵育温度对其热恢复性的影响；如图5C所示，褐藻胶裂解酶Aly08经煮沸5 min后，放置在0℃孵育30分钟，效果最佳，可恢复其78.3%的活性。

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶在100℃沸水中煮沸5 min，取出后立即放置在0℃孵育不同时间（0-60 min），检测不同孵育时间对酶恢复性的影响。如图5D所示，随着孵育时间延长，酶的热恢复性逐渐增强，在40 min时热恢复性达到最高值，再延长孵育时间热恢复性不再增加。

实施例6 褐藻胶裂解酶Aly08降解方式的高效液相法测定

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶（10 U）与0.1%的褐藻胶底物共孵育不同时间（0-120 min），降解产物12,000 g离心10分钟，弃沉淀，将上清20 μl上样于预平衡（0.2 M的碳酸氢铵）的凝胶过滤柱（Superdex peptide 10/300）。流速为0.6 ml/min，流动相为0.2 M的碳酸氢铵，检测时间为40分钟，检测器为视差检测器。如图6所示，随着降解时间的延长，降解产物中中间片段的寡糖含量逐渐增多，降解产物中不饱和褐藻胶二糖和三糖的比例最高，其降解方式为内切。

实施例7 褐藻胶裂解酶Aly08酶解产物薄层层析分析

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶Aly08纯酶（10-20 U）与0.1%褐藻胶在40℃下孵育6 h，然后在高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2 h的HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:甲酸:水=4:5:1）的展缸中20 min，吹干层析板，浸入显色剂（苯胺二苯胺）中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图7所示，与标准品迁徙率比较发现，褐藻胶裂解酶Aly08酶解主产物为褐藻胶二糖（DP2）和三糖（DP3）。

实施例8 褐藻胶裂解酶Aly08酶解产物质谱（ESI-MS）分析

将实施例7中孵育所得样进行脱盐处理，并与乙腈进行等体积混合，进行ESI-阴离子一级质谱检测，确定酶解产物的分子量。阴离子模式一级质谱结果表明（图8），纯化所得纯酶Aly08降解褐藻胶之后的寡糖主产物为不饱和二糖和三糖。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种新型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用

<141> 2018-09-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Leu Asn Lys Ile Ile Thr Thr Ser Ala Ile Ala Ile Phe Ser

1 5 10 15

Ser Phe Ser Met Ala Phe Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Leu Ser Ile Pro

20 25 30

Leu Asp Lys Gly Asp Gly Tyr Ala Thr Ser Ile Lys Glu Asn Glu Leu

35 40 45

Ala Ala Ser Tyr Glu Asp Asp Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Asp Gly Gly

50 55 60

Met Val Phe Tyr Thr Pro Val Lys Gly Tyr Lys Thr Ser Glu Asn Thr

65 70 75 80

Lys Tyr Val Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg Arg Gly Asp Thr

85 90 95

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Ala Glu Asn Asn Trp Ala Phe Ser Ser Ile

100 105 110

Ser Ser Gly Val Gln Ser Asp Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr Leu Lys

115 120 125

Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr Ser Ser Asn Asp Glu

130 135 140

Gln Val Gly Arg Ile Val Val Gly Gln Ile His Ala Lys Asn Asn Glu

145 150 155 160

Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr His Lys Leu Pro Asn Asn Ser Lys Gly Ala

165 170 175

Ile Tyr Phe Ala His Glu Thr Ser Lys Ser Asp Gly Gly Asn Glu Thr

180 185 190

Trp Tyr Asn Leu Leu Gly Ser Met Val Asn Ser Ser Gly Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Thr Ser Asn Pro Ser Asp Gly Ile Glu Leu Asn Glu Glu Phe Ser

210 215 220

Tyr Asp Ile Thr Val Asn Gly Asp Ser Leu Ile Val Thr Ile Ser Gln

225 230 235 240

Asp Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Thr Ile Asp Met Ser Gly Ser Gly

245 250 255

Tyr Asp Asp Ala Ser Asn Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly Ile Tyr Leu

260 265 270

Gln Asp Asn Thr Ser Asn Asp Asp Asp Tyr Ala Lys Ala Thr Phe Tyr

275 280 285

Glu Leu Ser Asn Thr His Asp Asn Tyr Ser Tyr

290 295

<210> 2

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttattga acaaaattat tactacatct gccatcgcca tttttagttc attttcaatg 60

gccttcgacc tactagactg gtacctatct atcccactag acaaaggtga cggttacgct 120

acttctatca aagaaaacga actagctgct tcttacgaag acgacttctt ctacactggt 180

tctgacggtg gtatggtttt ctacactcca gttaaaggtt acaaaacttc tgaaaacact 240

aaatacgttc gtactgaact acgtgaaatg ctacgtcgtg gtgacacttc taaatctact 300

tctggtgctg aaaacaactg ggctttctct tctatctctt ctggtgttca atctgacttc 360

gctggtatcg acggtactct aaaagctact ctagctgtta accacgttac tactacttct 420

tctaacgacg aacaagttgg tcgtatcgtt gttggtcaaa tccacgctaa aaacaacgaa 480

ccaatccgtc tatactacca caaactacca aacaactcta aaggtgctat ctacttcgct 540

cacgaaactt ctaaatctga cggtggtaac gaaacttggt acaacctact aggttctatg 600

gttaactctt ctggttctct atcttctact tctaacccat ctgacggtat cgaactaaac 660

gaagaattct cttacgacat cactgttaac ggtgactctc taatcgttac tatctctcaa 720

gacggttctc aactagctaa aaaaactatc gacatgtctg gttctggtta cgacgacgct 780

tctaactaca tgtacttcaa agctggtatc tacctacaag acaacacttc taacgacgac 840

gactacgcta aagctacttt ctacgaacta tctaacactc acgacaacta ctcttac 897

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg gtatgttatt gaacaaaat 29

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagg taagagtagt tgtc 24

Claims (9)

1.一种新型褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在裂解大分子褐藻胶中的应用。

5.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在裂解甘露糖醛酸片段或古罗糖醛酸片段中的应用。

6.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在制备不饱和褐藻胶寡糖中的应用。

7.一种裂解褐藻胶的方法，其特征是，所选用的褐藻胶裂解酶为权利要求1所述的褐藻胶裂解酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征是，裂解条件中反应温度为0~70℃，最适反应温度为45℃。

9.如权利要求7所述的方法，其特征是，裂解条件中反应pH为6~10，最适反应pH为8.3。