CN114940963B

CN114940963B - 一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN114940963B
Application number: CN202210175704.7A
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 徐菲; 刘扬; 王小涵; 陈秀兰; 张霞
Original assignee: Shandong University; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Shandong University; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114940963A

Abstract

本发明涉及一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用。所述枯草芽孢杆菌工程菌包含重组质粒和表达宿主；重组质粒包含目的基因、信号肽以及表达载体；目的基因为褐藻胶裂解酶基因；信号肽为SaprE基因，其核苷酸序列如SED ID NO.5所示，氨基酸序列如SED ID NO.15所示，该菌株已于2021年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M20211414，地址：中国，武汉，武汉大学。本发明强化了褐藻胶裂解酶的表达，胞外分泌酶活可达到8.76U/mL，是褐藻胶裂解酶自身信号肽表达褐藻酸裂解酶酶活的2.5倍，可应用于褐藻胶的生物降解。

Description

一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

褐藻胶作为一种重要的海洋多糖类物质，为多种微生物提供了能源物质。通常褐藻胶是褐藻酸的钠盐——褐藻酸钠，又名海藻酸钠，分子式为(C₆H₇O₈Na).n，是由β-D-甘露糖醛酸(M)与α-L-古罗糖醛酸(G)两种单糖通过β-1,4-糖苷键相连接形成，易溶于碱水，吸水膨胀变软，成黏稠状胶体。褐藻胶的降解产物——褐藻胶寡糖具有免疫调节、抑菌、抗病毒能力等多种生物活性，在食品、医药等领域具有很大的应用价值。已发现有很多海洋细菌能产生内切褐藻胶裂解酶将大分子的褐藻胶降解为小分子的褐藻胶寡糖。这些海洋细菌的内切褐藻胶裂解酶在褐藻胶寡糖制备中具有应用潜力。

工业上常用的褐藻胶寡糖制备方法有化学法、物理法和酶法。酸解法是目前获取褐藻胶寡糖和单糖的主要化学方法，但该方法反应条件剧烈，反应条件不易控制，副产物多，目标产物浓度低，而且对环境具有一定的破坏。物理降解法可以将高粘度的褐藻胶变为低粘度的褐藻胶，从而促进褐藻胶的浓度，主要是应用在褐藻胶的前处理过程中。酶法降解是指利用褐藻胶裂解酶特异性的降解褐藻胶获取褐藻胶寡糖、单糖。褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶(Polysaccharide Lyase，PLs)的一类，褐藻胶裂解酶分布于PL5、6、7、14、15、17、18、32和34等多个家族中。。褐藻胶裂解酶作用于单体间的1-4糖苷键，产物非还原性末端六元环C4和C5位会生成不饱和双键，从而生成不饱和4-deoxy-L-erythrohex-4-enopyranosyl糖醛酸。根据酶切方式不同，褐藻胶裂解酶分为内切酶和外切酶两种。内切褐藻酸裂解酶能将褐藻胶降解成单一的或长短不一的寡糖片段。酶法制备效率高，大大提高低聚糖的产率，反应条件温和，可控性强，便于定向制备褐藻胶寡糖，绿色环保，其研究具有深远理论意义和应用前景，将会逐渐取代传统的化学降解法。

褐藻胶裂解酶的来源有很多，但大多数存在于细菌中，常见的有海洋弧菌，交替假单胞菌，盐单胞菌，黄杆菌属等。决定酶活性的两个关键性因素，一个是足够的酶表达量，另一个是酶的结构决定单位酶活性。足够的酶表达量，可以利用分子生物学的方法实现，将不同生物来源的褐藻胶裂解酶基因进行超量异源表达。酶的单位活性可以通过研究催化机制、改造蛋白质结构来提高。随着分子生物学的发展，通过基因工程和蛋白质工程来设计适用于不同工业化应用的褐藻胶裂解酶生产菌株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5，所述枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、信号肽以及表达载体；所述目的基因为褐藻胶裂解酶基因；所述信号肽为SaprE基因，其核苷酸序列如SED ID NO.5所示，氨基酸序列如SED ID NO.15所示。

根据本发明优选的，所述表达载体为p301，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌WB600。

根据本发明优选的，所述褐藻胶裂解酶来源于灿烂弧菌，其编码基因为AL186，核苷酸序列如SED ID NO.21所示，氨基酸序列如SED ID NO.22所示。

所述枯草芽孢杆菌ZAL5(Bacillus subtilis ZAL5)已于2021年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M20211414，地址：中国，武汉，武汉大学。

上述枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5的构建方法，包括如下步骤：

(1)以灿烂弧菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到褐藻胶裂解酶基因AL186序列，PCR引物序列如下：

AL-F:5′-atgacctttaaaccttgcaaactcacttc-3′，

AL-Rv:5′-tcagttgtgattgttgtttaactgatag-3′；

PCR扩增程序：预变性，98℃2min；变性，98℃10sec；退火，58℃20sec；延伸，72℃1min(30个循环)；终止延伸，72℃5min；最后4℃保温；

(2)以褐藻胶裂解酶基因AL186序列为模板进行PCR扩增，扩增得到包含有信号肽SaprE基因序列的重组基因SaprE-AL186序列，PCR引物序列如下：

aprE-F：

5′-atgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcgttcagcaacatgtctgtgcaggcagaaacacttaatattcaatcagc-3′，

AL-Rv:5′-tcagttgtgattgttgtttaactgatag-3′；

将PCR扩增产物和载体质粒p301分别用限制性内切酶HindIII酶切后，经连接酶连接得到pAL5质粒；

(3)将步骤(2)得到的pAL5质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，挑选阳性重组子，得枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5。

上述枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5在制备褐藻酸裂解酶中的应用。

根据本发明优选的，所述应用的具体方法如下：

将上述枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入种子培养基中，在37℃、220rpm/min培养6h，按照3％～10％的接种量接入发酵培养基中，在37℃、220r/min培养振荡培养72h，离心菌体，上清液即为褐藻酸裂解酶。

根据本发明优选的，所述种子培养基的配方为：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 18g/L，氯霉素10μg/mL；

根据本发明优选的，所述发酵培养基的配方为：酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂ 0.1～0.5％，MgSO₄ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2％，均为质量百分比。

上述枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5在生物降解褐藻胶中的应用。

本发明的有益效果：

本发明在构建表达载体时比较筛选了10个不同信号肽对褐藻胶裂解酶基因AL186表达的影响，其中以SaprE基因作为褐藻胶裂解酶AL186的信号肽，强化了褐藻胶裂解酶的表达，胞外分泌酶活可达到8.76U/mL，是褐藻胶裂解酶AL186自身信号肽SaL基因表达褐藻酸裂解酶酶活的2.5倍。本发明的枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5制备的褐藻酸裂解酶可应用于褐藻胶的生物降解，产生二糖到五糖的褐藻胶寡糖，促进其在食品工业及医药领域中的广泛应用。

附图说明

图1为工程菌ZAL5重组质粒的图谱

图2为不同信号肽重组菌株的摇瓶发酵酶活。

图3为褐藻酸裂解酶的温度曲线图。

图4为褐藻酸裂解酶的pH曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

本发明中使用的枯草芽孢杆菌WB600、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和大肠杆菌均为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得。

本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：

GM I配方为：1×最低盐溶液96mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.4mL，10％酵母粉汁1mL；其中1×最低盐溶液的配方为：K₂HPO₄ 14g/L，KH₂PO₄ 6g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，柠檬酸三钠1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，在蒸馏水中依次溶解。

GM II配方为：1×最低盐溶液97mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.08mL，10％酵母粉汁0.04mL，1M MgCl₂ 0.25mL，1M CaCl₂ 0.05mL。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L。

种子培养基：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 18g/L，氯霉素10μg/mL；

发酵培养基：酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂ 0.1～0.5％，MgSO₄ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2％，均为质量百分比。

NEB phusion聚合酶，青岛青科赛尔生物技术有限公司有售。

实施例1、质粒构建

1、申请人将来源于灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的褐藻胶裂解酶基因命名为AL186，核苷酸序列如SED ID NO.21所示，氨基酸序列如SED ID NO.22所示。

以灿烂弧菌基因组为模板进行PCR扩增，根据灿烂弧菌褐藻胶裂解酶AL186的特征，利用生物信息学软件设计扩增引物，扩增得到褐藻胶裂解酶基因AL186序列(WP065681228.1)，PCR引物序列如下：

AL-F:5′-atgacctttaaaccttgcaaactcacttc-3′，

AL-Rv:5′-tcagttgtgattgttgtttaactgatag-3′；

PCR扩增程序：预变性，98℃2min；变性，98℃10sec；退火，58℃20sec；延伸，72℃1min(30个循环)；终止延伸，72℃5min；最后4℃保温。

所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析，得到大小约为1.2kb的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，通过无酶法克隆到载体p301，得到重组质粒p301-AL186，将p301-AL186用化学转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含10μg/mL氨苄青霉素LB固体培养基上37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒从转化子中提取p301-AL186质粒，送至青岛华大基因研究中心进行测序分析，结果显示目的片段序列和褐藻胶裂解酶AL186相符。

限制性内切酶HindIII酶切体系中，载体质粒p301和目的片段的的摩尔数比为1:3，温度50℃，反应60min。

化学转化体系中，p301-AL186为10μL，大肠杆菌DH5α感受态细胞为100μL。

2、褐藻胶裂解酶AL186的自身信号肽为SaL基因，氨基酸序列如SED ID NO.1所示，核苷酸序列如SED ID NO.11所示。申请人又根据褐藻胶裂解酶AL186的特征，选取了来自枯草芽孢杆菌的9个信号肽，依次为SoppA、Slip、SamyE、SaprE、SnprE、SyddH、Smpr、SacB和SnprB，其氨基酸序列如SED ID NO.2～10所示，核苷酸序列如SED ID NO.12～20所示。

根据以上9个不同的信号肽核苷酸序列，由北京六合华大基因科技有限公司合成扩增用的上游引物oppA-f、lip-f、amyE-f、aprE-f、nprE-f、yddH-f、mpr-f、mpr-f1、acB-f、nprB-f、nprB-f1，然后均以AL-rv为下游引物，再以褐藻胶裂解酶基因AL186序列为模板进行PCR扩增，得到褐藻胶裂解酶基因AL186序列的10个N端融合不同信号肽的重组基因序列，依次为AL186(SaL)、SoppA-AL186、Slip-AL186、SamyE-AL186、SaprE-AL186、SnprE-AL186、SyddH-AL186、Smpr-AL186、SacB-AL186、SnprB-AL186，具体引物信息如表1所示。

表1重组基因扩增引物

所得的PCR产物分别经1％的琼脂糖凝胶电泳，再将目的片段通过胶回收试剂盒回收。其中信号肽mpr和AL186的融合pcr需要两步完成：1.以AL186为模板，引物mpr-f1和AL-rv扩增，凝胶回收得到pcr1片段。2.以pcr1为模板，引物mpr-f和AL-rv扩增，凝胶回收得到Smpr-AL186。信号肽nprB和AL186的融合pcr同样需要两步完成：1.以AL186为模板，引物nprB-f1和AL-rv扩增，凝胶回收得到pcr1片段。2.以pcr1为模板，引物nprB-f和AL-rv扩增，凝胶回收得到SnprB-AL186。

将9个N端融合不同信号肽的基因片段克隆到载体pMD18T，得到pMD18T-SoppA-AL186、pMD18T-Slip-AL186、pMD18T-SamyE-AL186、pMD18T-SaprE-AL186、pMD18T-SnprE-AL186、pMD18T-SyddH-AL186、pMD18T-Smpr-AL186、pMD18T-SacB-AL186、pMD18T-SnprB-AL186质粒。将以上质粒用化学转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含10μg/mL氨苄青霉素LB固体培养基上37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒从转化子中提取质粒，送至青岛华大基因研究中心进行测序分析，9个重组基因片段SoppA-AL186、Slip-AL186、SamyE-AL186、SaprE-AL186、SnprE-AL186、SyddH-AL186、Smpr-AL186、SacB-AL186、SnprB-AL186中信号肽核苷酸序列扩增正确。

3、利用无酶克隆法，即NEB Gbison assembly试剂盒，构建重组质粒。

10个N端不同信号肽的片段克隆到载体p301，其中AL186克隆后的重组质粒为pAL1，SoppA-AL186克隆后的重组质粒为pAL2、Slip-AL186克隆后的重组质粒为pAL3、SamyE-AL186克隆后的重组质粒为pAL4、SaprE-AL186克隆后的重组质粒为pAL5、SnprE-AL186克隆后的重组质粒为pAL6、SyddH-AL186克隆后的重组质粒为pAL7、Smpr-AL186克隆后的重组质粒为pAL8、SacB-AL186克隆后的重组质粒为pAL9、SnprB-AL186克隆后的重组质粒为pAL10。

根据褐藻胶裂解酶基因AL186序列和其他9个重组基因序列和质粒p301上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计10个正向无酶克隆引物：assAL1-F至assAL10-F，然后均以assAL-Rv为反向无酶克隆引物，用NEB phusion保真酶，以AL186片段为模板，扩增得到AL1至AL10序列，具体的引物序列如表2所示。

表2扩增引物

引物名称	引物序列(5’—3’)
		assAL1-F：	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgacctttaaaccttgcaaactcacttc
assAL2-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaaaaagcgctggtcaattg
		assAL3-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaaattcgtcaagcgcagaat
assAL4-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgtttgcgaaacgctttaaaac
		assAL5-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgagaagcaaaaaattgtgg
assAL6-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgggcctgggcaaaaagctgtcag
		assAL7-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgatcagcaaaaaggttgttctg
assAL8-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaaactggtcccgagatttcgc
		assAL9-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaac
assAL10-F	ccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgctggtctactacaacaacatc
		assAL-Rv	tatgtaagcttcgtcggccatgattgccttgctcagttgtgattgttgtttaactgatag

所得的PCR产物分别经1％的琼脂糖凝胶电泳，再将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒p301和回收之后的目的片段分别用限制性内切酶HindIII酶切后，经连接酶连接得到重组质粒p301-AL1至p301-AL10。将以上质粒用化学转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含10μg/mL氨苄青霉素LB固体培养基上37℃过夜培养。

从每个LB固体培养基上挑选3个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒分别提取质粒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析。符合预期序列的质粒，分别被命名为pAL1、pAL2、pAL3、pAL4、pAL5、pAL6、pAL7、pAL8、pAL9和pAL10。

实施例2、枯草芽孢杆菌工程菌的构建

将上述10个重组表达质粒pAL1、pAL2、pAL3、pAL4、pAL5、pAL6、pAL7、pAL8、pAL9、pAL10通过感受态方法共转化宿主细胞枯草芽孢杆菌WB600。

具体转化过程如下：将新鲜活化的枯草芽孢杆菌168由LB平板接种到5ml GMI溶液，在30℃、125rpm振荡培养过夜；第二天取1ml转接到9ml GMI中，37℃、220rpm培养3.5h；再取1ml上一步骤的培养液转接到9ml GMⅡ溶液中，37℃、125rpm培养90min后，5000g、10min离心收集菌体；用1ml GMⅡ溶液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。共做10个转化体系，每个体系为0.2ml感受态细胞，加入10μL重组质粒，于37℃、200rpm振荡培养60min后，涂布含10μg/mL四环素的LB平板，37℃培养过夜培养，次日检查转化子。重组表达质粒pAL1、pAL2、pAL3、pAL4、pAL5、pAL6、pAL7、pAL8、pAL9、pAL10转化枯草芽孢杆菌得到的重组菌株分别命名为ZAL1、ZAL2、ZAL3、ZAL4、ZAL5、ZAL6、ZAL7、ZAL8、ZAL9、ZAL10。

实施例3、枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5的筛选

每个LB固体培养基挑取3个转化子，在含10μg/mL四环素的LB固体培养基上划线纯化，分别接种于20mL种子培养基中，37℃、220rpm振荡培养约6h；然后分别取2.5mL种子液接种到50mL发酵培养基中，37℃、220rpm振荡培养72h；离心菌体获得上清液，分别进行褐藻胶裂解酶酶活力检测，结果如图2所示。

由图2可知，上述获得的阳性转化子在摇瓶发酵条件下，其中菌株ZAL5发酵上清液中的褐藻胶裂解酶酶活最高，为8.76U/mL，即为枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5。枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5所表达的褐藻胶裂解酶酶活是枯草芽孢杆菌ZAL1(褐藻胶裂解酶AL186的自身信号肽为SaL基因)表达的褐藻酸裂解酶酶活的2.5倍，是其它菌株的2～17倍。

酶活的具体检测方法如下：

①酶活力单位定义

在40℃，pH为7.5条件下，在本方法规定反应体系下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。

②原理

褐藻胶裂解酶可以通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键，产物非还原性端具有不饱和双键，双键位于产物非还原末端C4、C5之间，并在235nm处产生最大紫外吸收。

③测定方法

1)液体样品：用缓冲液稀释至适当倍数，控制在吸光值OD235在0.22-0.35之间，酶活约为0.5U/mL。

2)酶反应：取三支15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入稀释好的酶液0.2mL，准确计时，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

3)空白：取15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入缓冲液0.2mL，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm比色，并记录吸光值A0和A样。

计算：

X＝(A0－A样)×2×N/(t×0.1)。

式中：

X—酶活力，U/mL或U/g；

2—加入2mL磷酸终止液的体积系数；

t(min)—酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)；

0.1—体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1；

N—稀释倍数。

经简化：酶活力(U/mL)＝(A0－A样)×2×N。

实施例4、利用枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5制备褐藻酸裂解酶

将枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入种子培养基中，在37℃、220rpm/min培养6h，按照5％的接种量接入发酵培养基中，在37℃、220r/min培养振荡培养72h，离心菌体，上清液即为褐藻酸裂解酶。

对本实施例制备的褐藻酸裂解酶进行酶学性质测定。

1、最适温度

按照表3反应体系，在不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)下反应10min，煮沸10min失活，13000r离心10min，取上清测A235。

酶活定义:A235数值每分钟上升0.1所需的酶量为一个酶活单位。

表3，反应体系

结果如图3所示，枯草芽孢杆菌ZAL5产的褐藻胶裂解酶AL186的最适温度为30℃。

2、最适pH

按照表4反应体系，在pH 5-11条件下反应10min，煮沸10min失活，13000r离心10min，取上清测A235。

表4，反应体系

结果如图4所示，枯草芽孢杆菌ZAL5产的褐藻胶裂解酶AL186的最适pH为8.0。

综上所述，本发明提供的枯草芽孢杆菌工程菌ZAL5能有效提高褐藻胶裂解酶的酶活，有利于降低该酶的生产成本，提高其应用效果，从而有利于其在食品、医药工业领域中的广泛应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学,青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> PRT

<213> 灿烂弧菌（Vibrio splendidus）

<400> 1

Met Thr Phe Lys Pro Cys Lys Leu Thr Ser Cys Lys Pro Arg Thr His

1 5 10 15

Gln Phe Lys Pro Tyr Lys Gln Leu Ser Cys Ala Val Leu Leu Ala Met

20 25 30

Ala Thr Tyr Gly Val Ser Ala

35

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 2

Met Lys Lys Arg Trp Ser Ile Val Thr Leu Met Leu Ile Phe Thr Leu

1 5 10 15

Val Leu Ser Ala

20

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 3

Met Lys Phe Val Lys Arg Arg Ile Ile Ala Leu Val Thr Ile Leu Met

1 5 10 15

Leu Ser Val Thr Ser Leu Phe Ala Leu Gln Pro Ser Ala Lys Ala

20 25 30

<210> 4

<211> 27

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 4

Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly

1 5 10 15

Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ala Gly

20 25

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 5

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Val Gln Ala

20 25

<210> 6

<211> 27

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 6

Met Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Phe Met

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala

20 25

<210> 7

<211> 29

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 7

Met Ile Ser Lys Lys Val Val Leu Pro Leu Val Phe Ser Ala Pro Phe

1 5 10 15

Ile Phe Phe Phe Val Leu Cys Ile Val Val Val Met Thr

20 25

<210> 8

<211> 34

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 8

Met Lys Leu Val Pro Arg Phe Arg Lys Gln Trp Phe Ala Tyr Leu Thr

1 5 10 15

Val Leu Cys Leu Ala Leu Ala Ala Ala Val Ser Phe Gly Val Pro Ala

20 25 30

Lys Ala

<210> 9

<211> 29

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 9

Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr

1 5 10 15

Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala

20 25

<210> 10

<211> 46

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 10

Met Leu Val Tyr Tyr Asn Asn Ile Ser Phe His Tyr Phe Gln Lys Gly

1 5 10 15

Gly Phe Ile Val Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala

20 25 30

Ser Phe Met Ser Leu Thr Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala

35 40 45

<210> 11

<211> 117

<212> DNA

<213> 灿烂弧菌（Vibrio splendidus）

<400> 11

atgaccttta aaccttgcaa actcacttct tgcaaacctc gaactcacca atttaaacct 60

tacaaacaat tgtcgtgcgc ggttctttta gcgatggcta cttatggcgt atcggct 117

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 12

atgaaaaagc gctggtcaat tgttacactg atgctgattt ttacactggt tctgtcagca 60

<210> 13

<211> 93

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 13

atgaaattcg tcaagcgcag aattattgcg ctggttacaa ttctgatgct gtcagttaca 60

tcactgtttg cactgcaacc gtcagcaaaa gca 93

<210> 14

<211> 81

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 14

atgtttgcga aacgctttaa aacatcactg ctgccgctgt ttgcaggctt tctgctgctg 60

tttcatctgg ttctggcagg c 81

<210> 15

<211> 87

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 15

atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgt gcaggca 87

<210> 16

<211> 81

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 16

atgggcctgg gcaaaaagct gtcagttgca gttgcagcat catttatgtc actgtcaatt 60

tcactgcctg gcgttcaagc a 81

<210> 17

<211> 87

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 17

atgatcagca aaaaggttgt tctgccgctg gtttttagcg caccgtttat ctttttcttt 60

gtcctgtgca ttgttgtcgt gatgaca 87

<210> 18

<211> 102

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 18

atgaaactgg tcccgagatt tcgcaaacaa tggtttgcat atctgacagt tctgtgcctg 60

gcactggcag cagcagtttc atttggcgtt ccggcaaaag ca 102

<210> 19

<211> 87

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 19

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60

gcaggaggcg caactcaagc ttttgcc 87

<210> 20

<211> 138

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

<400> 20

atgctggtct actacaacaa catcagcttt cactactttc agaaaggcgg atttattgtt 60

ggcctgggca aaaaactgtc agttgcagtt gcagcatcat ttatgtcact gacaatttca 120

ctgcctggcg ttcaagca 138

<210> 21

<211> 1395

<212> DNA

<213> 灿烂弧菌（Vibrio splendidus）

<400> 21

atgaccttta aaccttgcaa actcacttct tgcaaacctc gaactcacca atttaaacct 60

tacaaacaat tgtcgtgcgc ggttctttta gcgatggcta cttatggcgt atcggctgaa 120

acactgaaca ttcaatccgc atcagactgg ggtggagcgc acagctctta cccagcatcg 180

aatacgattg atggaagcac tgattggtca tcacgttggg ccgctcagaa tgcgcccgtc 240

aatttagtgc tcgaccttgg ctcggtacaa aatgttcaag acgtcgcgat agcttggggt 300

aaaggcgaag agcaaactta taagttcgag atcagagcgt tagctgatga aagttcaagc 360

agctggaaca aggtttatta tggatatagt agtggcagca catctggttt tgaaacctac 420

gatgtgacgg atgttcaggc tcgttgggtt cgtatcaaag tctttgaaaa caatgcggaa 480

agtgtttgga cgaatattac tgaagtcgaa atcagtggca acgatagccc tgactacgga 540

ctcgatccaa acctaccgcc atcaggcaac ttcgacttac tggattggta tgtgagcatt 600

cccgttgatg aaggtgatgg ctacgcgact tctatcaaag agaacacgct tgatgcgggt 660

tatgaagacc aattcttcta taccggtagt gatggtggct tggtgttcta cacacctgtc 720

gaaggtgtga caacatctag cggaacaaaa tatgttcgta ccgaattaag agagatgctt 780

cgtcgcggtg atacctctta ctccacttcg ggtaaagaca ataactgggc gttttcgtct 840

attccatcga gtgaccagtc ggactttggt ggtatcgacg ggacgttaaa tgcaacgtta 900

gccatcaacc acgtgacaac aactacttcg aacactgaac aagtgggccg aatcgtgatt 960

ggccaaattc atgctgagaa aaacgaacct attcgtctgt actaccataa actgccaggt 1020

aacgacaaag gcgcaatcta ctttgctcat gaaacctcga acttgagcgg tggcgatgaa 1080

acttggcata acctattagg taacatggtg acgtctgacg gtgacttaaa cagcactaac 1140

aacccaagtg acggtattgc actcaatgaa actttctcgt attccattgt tgtcgaaggt 1200

gacaagttga ttactactat tagtcaaaat ggctcggaat tggcggcaaa agaagtggat 1260

atgagtaaca gcggttatga cgatgcagat aactacatgt acttcaaagc aggtatctat 1320

ttgcaagata actcaagtga cgacagcgat tatgcgcaag tgactttcta tcagttaaac 1380

aacaatcaca actga 1395

<210> 22

<211> 464

<212> PRT

<213> 灿烂弧菌（Vibrio splendidus）

<400> 22

Met Thr Phe Lys Pro Cys Lys Leu Thr Ser Cys Lys Pro Arg Thr His

1 5 10 15

Gln Phe Lys Pro Tyr Lys Gln Leu Ser Cys Ala Val Leu Leu Ala Met

20 25 30

Ala Thr Tyr Gly Val Ser Ala Glu Thr Leu Asn Ile Gln Ser Ala Ser

35 40 45

Asp Trp Gly Gly Ala His Ser Ser Tyr Pro Ala Ser Asn Thr Ile Asp

50 55 60

Gly Ser Thr Asp Trp Ser Ser Arg Trp Ala Ala Gln Asn Ala Pro Val

65 70 75 80

Asn Leu Val Leu Asp Leu Gly Ser Val Gln Asn Val Gln Asp Val Ala

85 90 95

Ile Ala Trp Gly Lys Gly Glu Glu Gln Thr Tyr Lys Phe Glu Ile Arg

100 105 110

Ala Leu Ala Asp Glu Ser Ser Ser Ser Trp Asn Lys Val Tyr Tyr Gly

115 120 125

Tyr Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Phe Glu Thr Tyr Asp Val Thr Asp

130 135 140

Val Gln Ala Arg Trp Val Arg Ile Lys Val Phe Glu Asn Asn Ala Glu

145 150 155 160

Ser Val Trp Thr Asn Ile Thr Glu Val Glu Ile Ser Gly Asn Asp Ser

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Leu Asp Pro Asn Leu Pro Pro Ser Gly Asn Phe Asp

180 185 190

Leu Leu Asp Trp Tyr Val Ser Ile Pro Val Asp Glu Gly Asp Gly Tyr

195 200 205

Ala Thr Ser Ile Lys Glu Asn Thr Leu Asp Ala Gly Tyr Glu Asp Gln

210 215 220

Phe Phe Tyr Thr Gly Ser Asp Gly Gly Leu Val Phe Tyr Thr Pro Val

225 230 235 240

Glu Gly Val Thr Thr Ser Ser Gly Thr Lys Tyr Val Arg Thr Glu Leu

245 250 255

Arg Glu Met Leu Arg Arg Gly Asp Thr Ser Tyr Ser Thr Ser Gly Lys

260 265 270

Asp Asn Asn Trp Ala Phe Ser Ser Ile Pro Ser Ser Asp Gln Ser Asp

275 280 285

Phe Gly Gly Ile Asp Gly Thr Leu Asn Ala Thr Leu Ala Ile Asn His

290 295 300

Val Thr Thr Thr Thr Ser Asn Thr Glu Gln Val Gly Arg Ile Val Ile

305 310 315 320

Gly Gln Ile His Ala Glu Lys Asn Glu Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr His

325 330 335

Lys Leu Pro Gly Asn Asp Lys Gly Ala Ile Tyr Phe Ala His Glu Thr

340 345 350

Ser Asn Leu Ser Gly Gly Asp Glu Thr Trp His Asn Leu Leu Gly Asn

355 360 365

Met Val Thr Ser Asp Gly Asp Leu Asn Ser Thr Asn Asn Pro Ser Asp

370 375 380

Gly Ile Ala Leu Asn Glu Thr Phe Ser Tyr Ser Ile Val Val Glu Gly

385 390 395 400

Asp Lys Leu Ile Thr Thr Ile Ser Gln Asn Gly Ser Glu Leu Ala Ala

405 410 415

Lys Glu Val Asp Met Ser Asn Ser Gly Tyr Asp Asp Ala Asp Asn Tyr

420 425 430

Met Tyr Phe Lys Ala Gly Ile Tyr Leu Gln Asp Asn Ser Ser Asp Asp

435 440 445

Ser Asp Tyr Ala Gln Val Thr Phe Tyr Gln Leu Asn Asn Asn His Asn

450 455 460

Claims

1.一种高效表达褐藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、信号肽以及表达载体；

所述目的基因为褐藻胶裂解酶基因，来源于灿烂弧菌，其编码基因为AL186，核苷酸序列如SED ID NO.21所示，氨基酸序列如SED ID NO.22所示；

所述信号肽为SaprE基因，其核苷酸序列如SED ID NO.5所示，氨基酸序列如SED IDNO.15所示。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌WB600。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌工程菌已于2021年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M20211414，地址：中国，武汉，武汉大学。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以灿烂弧菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到褐藻胶裂解酶基因AL186序列，PCR引物序列如下：

AL-F:5′- atgacctttaaaccttgcaaactcacttc -3′，

AL-Rv:5′-tcagttgtgattgttgtttaactgatag-3′；

PCR扩增程序：预变性，98℃ 2min；变性，98℃ 10sec；退火，58℃ 20sec；延伸，72℃1min，30个循环；终止延伸，72℃ 5min；最后4℃保温；

（2）以褐藻胶裂解酶基因AL186序列为模板进行PCR扩增，扩增得到包含有信号肽SaprE基因序列的重组基因SaprE-AL186序列，PCR引物序列如下：

aprE-F：

AL-Rv:5′-tcagttgtgattgttgtttaactgatag-3′；

将PCR扩增产物和载体质粒分别用限制性内切酶HindIII酶切后，经连接酶连接得到重组质粒；

（3）将步骤（2）得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，挑选阳性重组子，得枯草芽孢杆菌工程菌。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在制备褐藻酸裂解酶中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法如下：

将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接入种子培养基中，在37℃、220r/min培养6h，按照3%~10%的接种量接入发酵培养基中，在37℃、220r/min培养振荡培养72 h，离心菌体，上清液即为褐藻酸裂解酶。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述种子培养基的配方为：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 18g/L，氯霉素10 μg/mL。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl₂ 0.1~0.5%，MgSO₄ 0.1~0.5%，K₂HPO₄ 0.5~2%，均为质量百分比。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在生物降解褐藻胶中的应用。