CN114921390B

CN114921390B - 一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN114921390B
Application number: CN202210175702.8A
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 徐菲; 刘扬; 孙晓慧; 张霞; 陈秀兰
Original assignee: Shandong University; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Shandong University; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114921390A

Abstract

本发明涉及一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法与应用。该菌株于2021年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M20211413，地址：中国，武汉，武汉大学。所述生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23是以枯草芽孢杆菌工程菌ZPL为出发菌株，通过紫外诱变的方法筛选获得。该突变菌株摇瓶发酵上清液中褐藻胶裂解酶酶活高达12.27U/mL，比出发菌株提高了117％，有利于降低褐藻胶裂解酶的生产成本，可广泛应用于褐藻胶的生物降解，生产单糖，促进该酶在食品工业及医药领域中的广泛应用。

Description

一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体随机排列组成的多聚物，这两种单体通过β-1，4-糖苷键连接能形成三种不同形式的多糖片段:聚β-D-甘露糖醛(Polymannuronic acid，PolyM)片段、聚α-L-古罗糖醛酸(Polyguluronic acid，PolyG)片段以及二者杂合片段(PolyMG)。褐藻胶因其具有抗肿瘤、降血压等生理活性，被广泛应用于食品、医疗、农业、能源等行业。目前，生物酶法是降解褐藻胶的重要方法，具有反应条件温和可控、专一性强等优势。褐藻胶裂解酶可通过β-消除反应将褐藻胶降解为一系列不饱和糖醛酸寡糖和单体，这些降解产物具有促进植物生长、缓解植物胁迫、抗炎、抑菌、抗肿瘤及抗氧化等生理活性。

褐藻胶裂解酶来源广泛，在藻类、细菌、海洋软体动物、真菌和病毒中均有发现。微生物来源的褐藻胶裂解酶种类最为丰富，这些微生物包括弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、微泡菌属(Microbulbifer)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)等的成员。按照作用方式不同，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型两种。外切型褐藻胶裂解酶能将海藻降解为不饱和单体，这些单体是藻酸盐生理代谢的中间体，也是获取生物燃料的潜在碳源，因此，寻找具有应用价值的外切型褐藻胶裂解酶资源势在必行。

枯草芽孢杆菌作为一种应用广泛的工业微生物，生长速度快，发酵周期短，可直接将蛋白分泌到胞外培养基中，是FDA认证的GRAS(generallyregarded as safe)菌株，成为很多工业酶的理想表达宿主。多年来，科学家们对其菌株的代谢研究、遗传操作手段开发和培养条件摸索等成果不断报道与积累，为其应用于实际工业生产小分子化合物或酶制剂提供了很好的理论研究基础。此外，因为其菌株的安全性较高，枯草芽孢杆菌逐渐成为系统与合成生物技术中研究的主要菌株。以其为底盘细胞可实现如维生素、乙偶姻等小分子化合物的生产，也可进行如植酸酶、木聚糖酶等工业酶制剂的合成与生产。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法与应用。申请人首先构建得到重组表达外切褐藻胶裂解酶基因的枯草芽孢杆菌菌株，进一步对工程菌进行紫外诱变，筛选获得外切褐藻胶裂解酶产量明显提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进外切褐藻胶裂解酶的广泛应用。

一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌ZPL23(Bacillus subtilis ZPL23)，该菌株于2021年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M20211413，地址：中国，武汉，武汉大学。

根据本发明优选的，所述生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23是以枯草芽孢杆菌工程菌ZPL为出发菌株，通过紫外诱变的方法筛选获得。

根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌工程菌ZPL携带有用于重组表达外切型褐藻胶裂解酶PL1877的重组质粒。

根据本发明优选的，所述外切型褐藻胶裂解酶PL1877来源于假交替单胞菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌工程菌ZPL的构建方法，包括步骤如下：

(1)合成大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因并克隆到质粒载体pUC57上，然后以合成基因为模板，用引物对assp302-f1-F/assp302-f1-Rv进行PCR扩增，得到大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因的扩增产物，命名为p302-f1，PCR引物序列如下：

assp302-f1-F：5'-ccgcttcgatccacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaattttt-3'，

assp302-f1-Rv：5'-cgatgatgtttcagtccatgtggggccctatggtgcactctcagtac-3'；

PCR扩增程序为：预变性，98℃2min；变性，98℃10s；退火，58℃20s；延伸，72℃60s，30个循环；终止延伸，72℃5min，最后4℃保温；

(2)以B.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物对assp302-f2-F/assp302-f2-Rv、assp302-f3-F/assp302-f3-Rv进行PCR，得到同源重组的上游同源臂扩增产物，命名为p302-f2；下游同源臂扩增产物，命名为p302-f3，PCR引物序列如下：

assp302-f2-F：5'-gtactgagagtgcaccatagggccccacatggactgaaacatcatcggc-3'，

assp302-f2-Rv：5'-attacagctccagatctctttaccctctccttttaaaaaa-3'；

assp302-f3-F：5'-aacgacggccagtggcatgctagtaaaaagaagcaggttcctccatac-3'，

assp302-f3-Rv：5'-gacttacttaaaagactattctgtggatcgaagcggccgtgccttttcgg-3'；

(3)合成氯霉素抗性基因克隆到质粒载体pUC57上，然后以合成基因为模板，用引物对assp302-f4-F/assp302-f4-Rv进行PCR扩增，得到扩增产物p302-f4，PCR引物序列如下：

assp302-f4-F：5'-ttttaaaaggagagggtaaagagatctggagctgtaatataaaaacc-3'，

assp302-f4-Rv：5'-ttttaaaaggagagggtaaagagatctggagctgtaatataaaaacc-3'；

(4)将扩增产物p302-f1、p302-f2、p302-f3和p302-f4按照摩尔数比为1:3:3:3混合，然后在50℃下反应60min，取10μL反应液转化大肠杆菌，将大肠杆菌均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB转化平板，37℃过夜培养，提取质粒，得到载体质粒p302；

(5)以假交替单胞菌基因组为模板，用引物对ass1877-F/ass1877-Rv进行PCR扩增，得到外切型褐藻胶裂解酶PL1877序列，PCR引物序列如下：

ass1877-F：5'-gtcacgacgttgtaaaacgacggccagtggcatgcaattctccattttcttctgctatc-3'，

ass1877-Rv：5'-gtcacgacgttgtaaaacgacggccagtggcatgcaattctccattttcttctgctatc-3'；

将载体质粒p302用限制性内切酶SphI酶切后，经连接酶连接得到p302-1877质粒；

(6)将p302-1877质粒化学转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，挑选阳性重组子，得到枯草芽孢杆菌工程菌ZPL。

根据本发明优选的，所述紫外诱变的方法，包括步骤如下：

a、将枯草芽孢杆菌工程菌ZPL接种于LB液体培养基中，在25～35℃下培养9～11h，得到菌液；然后将菌液离心去上清，悬浮于生理盐水中，制成细胞浓度至10⁸个/mL的菌悬液；

b、将步骤a得到的菌悬液稀释，取10mL稀释液置于培养皿中搅拌震荡后，在紫外灯下照射120～125s，得到突变菌株；

c、选取步骤b中长势良好的突变菌株，接种于发酵培养基中，在37℃下发酵培养72h，测定褐藻胶裂解酶的酶活；

d、筛选褐藻胶裂解酶的酶活最高的突变株作为下一轮紫外诱变的菌株进行步骤b和步骤c，连续进行多轮循环操作，筛选得到枯草芽孢杆菌突变株ZPL23。

根据本发明优选的，步骤b中，所述紫外灯的功率为9W，照射方式为垂直照射，距离为15cm，照射时间为123s。

根据本发明优选的，步骤c中，所述发酵培养基的配方为：酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂ 0.1～0.5％，MgSO₄ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2％，均为质量百分比。

上述枯草芽孢杆菌突变株ZPL23在生产褐藻胶裂解酶中的应用。

上述枯草芽孢杆菌突变株ZPL23在生物降解褐藻胶中的应用。

本发明有益效果在于：

1、本发明将褐藻胶裂解酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中表达，构建得到重组表达该酶的工程菌株枯草芽孢杆菌ZPL，该菌株摇瓶发酵上清液中褐藻胶裂解酶酶活可以达到5.64U/mL。

2、本发明为了进一步提高褐藻胶裂解酶的产量，申请人以枯草芽孢杆菌ZPL为出发菌株，通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌枯草芽孢杆菌ZPL23。该突变菌株摇瓶发酵上清液中褐藻胶裂解酶酶活高达12.27U/mL，比出发菌提高了117％，有利于降低褐藻胶裂解酶的生产成本，可广泛应用于褐藻胶的生物降解，生产单糖，促进该酶在食品工业及医药领域中的广泛应用。

附图说明

图1为重组表达质粒p302-1877的图谱。

图2为褐藻胶裂解酶PL1877的温度曲线图。

图3为褐藻胶裂解酶PL1877的pH曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：

GM I配方为：1×最低盐溶液96mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.4mL，10％酵母粉汁1mL；其中1×最低盐溶液的配方为：K₂HPO₄ 14g/L，KH₂PO₄ 6g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，柠檬酸三钠1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，在蒸馏水中依次溶解。

GM II配方为：1×最低盐溶液97mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.08mL，10％酵母粉汁0.04mL，1M MgCl₂ 0.25mL，1M CaCl₂ 0.05mL。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L。

种子培养基：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 18g/L，氯霉素10μg/mL；

发酵培养基：酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂0.1～0.5％，MgSO₄ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2％，均为质量百分比。

NEB phusion聚合酶，青岛青科赛尔生物技术有限公司有售。

实施例中所述枯草芽孢杆菌和假交替单胞菌均为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得。

实施例1、整合表达质粒p302的构建

褐藻胶裂解酶基因PL1877的整合位点为宿主细胞枯草芽孢杆菌168染色体上的aprE基因区域。整合表达质粒p302包括：氯霉素抗性基因(cat)、整合位点aprE区域的上游同源臂upstream-1kb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，整合位点aprE区域的下游同源臂downstream-1kb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

整合表达质粒p302的具体构建过程如下：

(1)制备p302-f1片段：合成大肠杆菌复制子(ColE1 rep)和氨苄青霉素抗性基因(bla)并克隆到质粒载体pUC57(kan)上，然后利用NEB phusion聚合酶，以合成基因为模板，用引物assp302-f1-F/assp302-f1-Rv进行扩增，得到ColE1 rep和bla的扩增产物，命名为p302-f1；

大肠杆菌复制子(ColE1 rep)和氨苄青霉素抗性基因(bla)由北京六合华大基因科技有限公司合成。

(2)挑取新活化的枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，在37℃摇床200rpm下振荡培养过夜，按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取B.subtilis 168的基因组。该基因组中含有整合位点aprE区域的上游同源臂upstream-1kb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，整合位点aprE区域的下游同源臂downstream-1kb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

(3)制备p302-f2片段：利用NEB phusion聚合酶，以B.subtilis 168的基因组为模板，用引物assp302-f2-F/assp302-f2-Rv进行扩增，利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，得到扩增产物p302-f2。

(4)制备p302-f3片段：利用NEB phusion聚合酶，以B.subtilis 168的基因组为模板，用引物assp302-f3-F/assp302-f3-Rv进行扩增，利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，得到扩增产物p302-f3。

(5)制备p302-f4片段：合成氯霉素抗性基因(cat)并克隆到质粒载体pUC57上，以合成基因为模板，用引物对assp302-f4-F/assp302-f4-Rv进行PCR扩增，得到cat的扩增产物，命名为p302-f4；

氯霉素抗性基因(cat)由北京六合华大基因科技有限公司合成。

以上PCR的具体引物序列详见表1。

表1质粒p302构建扩增引物序列表

引物名称	引物序列
		assp302-f1-F	ccgcttcgatccacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaattttt
assp302-f1-Rv	cgatgatgtttcagtccatgtggggccctatggtgcactctcagtac
		assp302-f2-F	gtactgagagtgcaccatagggccccacatggactgaaacatcatcggc
assp302-f2-Rv	attacagctccagatctctttaccctctccttttaaaaaa
		assp302-f3-F	aacgacggccagtggcatgctagtaaaaagaagcaggttcctccatac
assp302-f3-Rv	gacttacttaaaagactattctgtggatcgaagcggccgtgccttttcgg
		assp302-f4-F	ttttaaaaggagagggtaaagagatctggagctgtaatataaaaacc
assp302-f4-Rv	ggaggaacctgcttctttttactagcatgccactggccgtcgttttacaacgtc

以上PCR扩增程序为：预变性，98℃2min；变性，98℃10s；退火，58℃20s；延伸，72℃60s，30个循环；终止延伸，72℃5min，最后4℃保温。

将扩增产物p302-f1、p302-f2、p302-f3和p302-f4按照摩尔数比为1:3:3:3混合，总体系为20μL，然后在50℃下反应60min，取10μL反应液转化大肠杆菌，将大肠杆菌均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养，得到转化子。

从含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上挑选10个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒分别提取质粒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析。将得到的符合预期序列的质粒，将其命名为p302。

实施例2、褐藻胶裂解酶整合表达质粒p302-1877构建

将来源于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)的褐藻胶裂解酶基因命名为PL1877，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。以假交替单胞菌基因组为模板，用引物对ass1877-F/ass1877-Rv进行PCR扩增，得到外切型褐藻胶裂解酶PL1877序列。具体引物序列见表2。

表2基因PL1877扩增引物序列表

引物名称	引物序列
		ass1877-F	gtcacgacgttgtaaaacgacggccagtggcatgcaattctccattttcttctgctatc
ass1877-Rv	gtatggaggaacctgcttctttttactaaccatgattacgccaagctgggcccttaagc

PCR扩增程序为：预变性，98℃2min；变性，98℃10s；退火，58℃20s；延伸，72℃60s，30个循环；终止延伸，72℃5min，最后4℃保温。

所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，得到大小约为2.2kb的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，然后用限制性内切酶SphI酶切载体p302，再利用NEB Gbison assembly试剂盒将目的片段和SphI酶切载体p302(p302/SphI)混合，混合体系为10μL，反应体系中p302/SphI和目的片段的摩尔数比为1:3，在50℃，反应30min，；取10μL反应液用电转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，然后将大肠杆菌均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。

从LB固体培养基上挑选10个阳性重组子，采用omega公司的质粒提取试剂盒分别提取质粒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析，测序结果表明插入方向正确，且未发生碱基突变、缺失以及增加的情况，将质粒命名为p302-1877，质粒图谱如图1所示。

实施例3、枯草芽孢杆菌工程菌ZPL的构建及发酵验证

1、枯草芽孢杆菌感受态细胞制备

(1)将枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)划线LB平板，37℃培养过夜；

(2)第二天挑取1个单菌落接种到5mL的GMⅠ溶液中，在30℃、125rpm下振荡培养过夜；

(3)第三天取2mL过夜培养液转接到18mL的GMⅠ中，在37℃、250rpm下培养3.5h；

(4)再取5mL上一步骤的培养液转接到45mL的GMⅡ中，在37℃、125rpm下培养90min后，在5000g下离心10min收集菌体，然后用5mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。

2、枯草芽孢杆菌工程菌ZPL的构建

取0.2mL枯草芽孢杆菌感受态细胞中加入2μg的p302-1877质粒，在37℃、200rpm下振荡培养1h后涂布含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。

次日选取58个单菌落在含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基划线纯化，然后每个平板选取3个单菌落接种于20mL种子培养基中，在37℃、220rpm下振荡培养7-8h。然后分别取2.5mL种子培养物接种到50mL发酵培养基中，在37℃、220rpm下振荡培养72h，8000rpm离心10min取上清液，测定不同转化子发酵液中褐藻胶裂解酶酶活。

结果显示：其中一株重组菌发酵上清液中褐藻胶裂解酶酶活达5.64U/mL，显著高于另外57株重组菌。申请人将该菌株命名为枯草芽孢杆菌工程菌ZPL(Bacillus subtilisZPL)。

酶活的具体检测方法如下：

①酶活力单位定义

在40℃，pH为7.5条件下，在本方法规定反应体系下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。

②原理

褐藻胶裂解酶可以通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键，产物非还原性端具有不饱和双键，双键位于产物非还原末端C4、C5之间，并在235nm处产生最大紫外吸收。

③测定方法

1)液体样品：用缓冲液稀释至适当倍数，控制在吸光值OD₂₃₅在0.22-0.35之间，酶活约为0.5U/mL。

2)酶反应：取三支15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入稀释好的酶液0.2mL，准确计时，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

3)空白：取15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入缓冲液0.2mL，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm比色，并记录吸光值A₀和A样。

计算：

X＝(A₀－A样)×2×N/(t×0.1)。

式中：

X—酶活力，U/mL或U/g；

2—加入2mL磷酸终止液的体积系数；

t(min)—酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)；

0.1—体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1；

N—稀释倍数。

经简化：酶活力(U/mL)＝(A₀－A样)×2×N。

实施例4、褐藻胶裂解酶的酶学性质分析

1、最适温度测定：

DNS法：按照下表3的反应体系，在不同温度(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)条件下反应15min，加入100μL DNS，煮沸10min显色，13000r离心5min，取上清测OD₅₄₀。

酶活定义：每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。

表3反应体系

结果如图2所示，枯草芽孢杆菌工程菌ZPL产的褐藻胶裂解酶PL1877的最适反应温度为40℃。

2、最适pH测定：

DNS法：按照下表4反应体系，在pH 5-11条件下反应15min，加入100μL的DNS，煮沸10min显色，13000r离心5min，取上清测OD₅₄₀。

表4反应体系

结果如图3所示，枯草芽孢杆菌工程菌ZPL产的褐藻胶裂解酶PL1877的最适pH为7.0。

实施例5褐藻胶裂解酶高产菌株的诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以实施例3构建得到的枯草芽孢杆菌工程菌ZPL为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高褐藻胶裂解酶的产量。

1、枯草芽孢杆菌ZPL生长曲线的测定

取新鲜活化的枯草芽孢杆菌工程菌ZPL单菌落接种于LB液体培养基中，摇床培养，从2h后开始，每隔2h取样测其OD₆₀₀值，以培养时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标绘制枯草芽孢杆菌工程菌ZPL的生长曲线，根据生长曲线选择对数中前期的细胞进行诱变实验。结果显示，枯草芽孢杆菌工程菌ZPL的对数生长期为5h-15h，15h后进入稳定期，因此选择培养10h的菌液进行紫外诱变处理。

2、紫外诱变处理及诱变剂量确定

取培养至10h的枯草芽孢杆菌工程菌ZPL菌液离心去上清，枯草芽孢杆菌工程菌ZPL菌体用无菌生理盐水洗涤两次后，将打散的细胞悬浮于生理盐水中，最后调整得到细胞浓度为10⁸个/mL的菌悬液。

打开9W紫外灯开关，预热约30min；取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10⁸个/mL的菌悬液10mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距离为15cm处，进行不同时间(0s～300s)的紫外照射，每隔20s取样一次。盖上平皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30min。

将照射后的菌悬液用0.85％生理盐水梯度稀释至10^-1～10^-6；取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布LB固体培养基，每个稀释度涂布三个LB固体培养基；以同样的操作，取未经紫外线照射处理的菌液稀释涂布LB固体培养基作对照。将上述涂布均匀的LB固体培养基，用黑布或报纸包好后，置于37℃过夜培养。

统计不同照射时间下每个稀释度下LB固体培养基上长出的单菌落数，若在某个稀释度下长出的单菌落数在30～300个之间，则认为该稀释度合适。将该稀释度下三个LB固体培养基上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度(CFU/mL)＝某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

致死率(％)＝(1-某剂量处理后的菌悬液浓度/处理前菌悬液浓度)×100％

以致死率约80％-90％的诱变剂量处理菌悬液，当照射时间为123s时，致死率达88.74％。因此，最终确定的诱变时间为123s。

3、摇瓶筛选

从致死率为88.74％的LB固体培养基上挑取112个菌落，划线培养获得单菌落分别接种于20mL种子培养基，37℃，220rpm培养7-8h后，取各取2.5mL转接于50mL摇瓶发酵培养基中，37℃，220rpm发酵培养72h后，离心取上清液，分别测定发酵上清液中的褐藻胶裂解酶酶活，同时以出发菌株作为对照。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的112株突变菌中，63株突变菌的褐藻胶裂解酶酶活与出发菌基本相当，34株突变菌的褐藻胶裂解酶酶活比出发菌低，其余15株突变菌的酶活比出发菌仅提高了不足5％-8％，效果不理想。

按照上述方法以褐藻胶裂解酶的酶活最高的突变株作为下一轮紫外诱变的菌株继续进行8轮紫外诱变筛选，最终获得一株褐藻胶裂解酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为枯草芽孢杆菌ZPL23(Bacillus subtilis ZPL23)。该菌株在50mL摇瓶发酵培养基中，37℃，220rpm发酵培养72h后，离心取上清液，上清液中褐藻胶裂解酶酶活高达12.27U/mL，比出发菌提高了约117％，取得了意料不到的技术效果，将其命名为枯草芽孢杆菌突变株ZPL23。

实施例6、枯草芽孢杆菌突变株ZPL23的稳定性验证

将枯草芽孢杆菌突变株ZPL23接种于LB液体培养基，连续传代培养30次后，稀释涂布LB固体培养基，挑取20个单菌落接种于20mL种子培养基中，在37℃、220rpm下振荡培养约8h。然后取2.5mL种子液接种到50mL发酵培养基中，在37℃、220rpm下振荡培养72h，离心取上清液，分别测定其褐藻胶裂解酶酶活。

结果显示，传代培养30次后，枯草芽孢杆菌突变株ZPL23的发酵酶活仍都超过12U/mL，与传代前相比，酶活没有明显降低。从而说明，本发明通过紫外诱变方法进一步筛选获得的高产褐藻胶裂解酶的突变菌株仍能有效保持不同生产批次发酵酶活的一致性，传代稳定，效果显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学,青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株及其构建方法与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2208

<212> DNA

<213> 假交替单胞菌（Pseudoalteromonas atlantica）

<400> 1

atgtatctga gcaaacgcca gtttaacatt aaagcaattg cagcgagcgt ctttatgaca 60

tttctgtcag ttgatgcata tgcggcacat ccgaatctgg ttattacaga agatgatatt 120

agccatatga gacaagcgat tggctcagaa ggcaaatttt caacagcatt tgaactgctg 180

aaagcgcaag tcgatgaaca aattgcacaa ccgattgcag ttccggttcc gaaagatggc 240

ggaggcggat atacacatga acgccataaa aagaactacc agctgatgta taatgcaggc 300

atcatttatc aactgagcca ggatgataaa tacgcgaatt atgttagaga catgctgctg 360

gaatatgcga aactgtatcc gacactgggc ctgcatccga aaagaaaaat ggattcacaa 420

aaccctggca agtttttctg gcaatcactg aatgaagcaa tgtggctggt ctatacaatt 480

caagcgtatg atctgattca tgatagcctg aatgcggaca acatcaaaac aattgaaaat 540

gatctgctta gaccggtcag cctgtttaca tcagttggac aaccgtcaac atttaacaaa 600

gtccataatc atggcacatg ggcaacagca ggcgttggca tggcaggcta tgttctgaat 660

gaaccggaat gggttgaaaa atccctgtat gacctggaaa aatcaggcaa aggcggattt 720

atcaaacaac ttgagatgct gttttcaccg cagggctatt ataacgaagg accgtattat 780

caaagatttg cactgctgcc gtttgtcaca tttgcaaaag cgattgaaaa taatgaaccg 840

cagcgcaaaa tcttcgaata tagagatggc attctgctga aggcgattga tacaacaatt 900

cagctgtcat ataacggcct gtttttcccg attaacgatg cgattaaaag caaaggcatc 960

gatacaattg aactggttaa tggcgttaca gcagcatatg gcctgacaaa tgatgcaggc 1020

tatctggata ttgcgaaaca acaggatcag attattctga gcggagatgg cctgaaagtt 1080

gcacaagcac tggataataa actggaaaca ccgtacacat ttaaaagcgt tgcatttgga 1140

gatggcaacg atggcaaaca aggcgcactg gttgttatga gaacagaagt tggcggagat 1200

caagcactgc tgtttaaacc ggcagcacaa ggacttggcc atggacattt tgataaactg 1260

acgtggcagt tttatgatca cggcaatgaa attgttagcg attatggcgc agcacgcttt 1320

ctgaatgttg aagcaaaata tggcggaaga tatctgccgg aaaatgaaac gtatgcaaaa 1380

catacagtcg cgcataatac agttgttgtc gatgaaacaa cgcattttga tgcaaatgtc 1440

gaagtcggca ataacaatta tccgacgctg aactttttcg aaacgaacga atttggcaca 1500

gttagctcag gcgaaattag cacagcatat aaaggcgttg atctggaaag aacactggca 1560

ctgattaatc ttccggaact tgaatcaaca cttgcgctgg atgtttttga tgtcgttgca 1620

gataaagcac atcaactgga tctgccgctt cattataaag gccaacttat cgatacgagc 1680

ttcgaactga aagcaaatgc gacacaactg tcagcactgg gcacgaaaaa tggctatcaa 1740

catctgtggc tgaaaggcca agcacaaccg gaatcaggcc tggcaaaagt tacatggctg 1800

aatgaaaatg gacgctttta tacacaaacg agcctggtta aaggcgacga atcatttctg 1860

tttacacaaa ttggcgcaaa cgacccgcat tttaatctga gaaatgaaaa cggctttatc 1920

agaagagtcg aagcgcaaaa acagcacaaa tttatctcag ttctggaacc gcatggcgaa 1980

tataatccgt caaaagaata tacactggaa gcagtttcaa gagttacagg cctggaatat 2040

tctgaacaag gcgatctgac actggttgaa ctggaaatta aaggcaaaac gtatctggtc 2100

gcaattaaca aagcacaaac aagcgcgaaa aatacgttca actaccagaa caaagaattc 2160

acactgaatg gcagactggg cgtttatatg atgaacaaca atcaagaa 2208

<210> 2

<211> 736

<212> PRT

<213> 假交替单胞菌（Pseudoalteromonas atlantica）

<400> 2

Met Tyr Leu Ser Lys Arg Gln Phe Asn Ile Lys Ala Ile Ala Ala Ser

1 5 10 15

Val Phe Met Thr Phe Leu Ser Val Asp Ala Tyr Ala Ala His Pro Asn

20 25 30

Leu Val Ile Thr Glu Asp Asp Ile Ser His Met Arg Gln Ala Ile Gly

35 40 45

Ser Glu Gly Lys Phe Ser Thr Ala Phe Glu Leu Leu Lys Ala Gln Val

50 55 60

Asp Glu Gln Ile Ala Gln Pro Ile Ala Val Pro Val Pro Lys Asp Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Tyr Thr His Glu Arg His Lys Lys Asn Tyr Gln Leu Met

85 90 95

Tyr Asn Ala Gly Ile Ile Tyr Gln Leu Ser Gln Asp Asp Lys Tyr Ala

100 105 110

Asn Tyr Val Arg Asp Met Leu Leu Glu Tyr Ala Lys Leu Tyr Pro Thr

115 120 125

Leu Gly Leu His Pro Lys Arg Lys Met Asp Ser Gln Asn Pro Gly Lys

130 135 140

Phe Phe Trp Gln Ser Leu Asn Glu Ala Met Trp Leu Val Tyr Thr Ile

145 150 155 160

Gln Ala Tyr Asp Leu Ile His Asp Ser Leu Asn Ala Asp Asn Ile Lys

165 170 175

Thr Ile Glu Asn Asp Leu Leu Arg Pro Val Ser Leu Phe Thr Ser Val

180 185 190

Gly Gln Pro Ser Thr Phe Asn Lys Val His Asn His Gly Thr Trp Ala

195 200 205

Thr Ala Gly Val Gly Met Ala Gly Tyr Val Leu Asn Glu Pro Glu Trp

210 215 220

Val Glu Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Glu Lys Ser Gly Lys Gly Gly Phe

225 230 235 240

Ile Lys Gln Leu Glu Met Leu Phe Ser Pro Gln Gly Tyr Tyr Asn Glu

245 250 255

Gly Pro Tyr Tyr Gln Arg Phe Ala Leu Leu Pro Phe Val Thr Phe Ala

260 265 270

Lys Ala Ile Glu Asn Asn Glu Pro Gln Arg Lys Ile Phe Glu Tyr Arg

275 280 285

Asp Gly Ile Leu Leu Lys Ala Ile Asp Thr Thr Ile Gln Leu Ser Tyr

290 295 300

Asn Gly Leu Phe Phe Pro Ile Asn Asp Ala Ile Lys Ser Lys Gly Ile

305 310 315 320

Asp Thr Ile Glu Leu Val Asn Gly Val Thr Ala Ala Tyr Gly Leu Thr

325 330 335

Asn Asp Ala Gly Tyr Leu Asp Ile Ala Lys Gln Gln Asp Gln Ile Ile

340 345 350

Leu Ser Gly Asp Gly Leu Lys Val Ala Gln Ala Leu Asp Asn Lys Leu

355 360 365

Glu Thr Pro Tyr Thr Phe Lys Ser Val Ala Phe Gly Asp Gly Asn Asp

370 375 380

Gly Lys Gln Gly Ala Leu Val Val Met Arg Thr Glu Val Gly Gly Asp

385 390 395 400

Gln Ala Leu Leu Phe Lys Pro Ala Ala Gln Gly Leu Gly His Gly His

405 410 415

Phe Asp Lys Leu Thr Trp Gln Phe Tyr Asp His Gly Asn Glu Ile Val

420 425 430

Ser Asp Tyr Gly Ala Ala Arg Phe Leu Asn Val Glu Ala Lys Tyr Gly

435 440 445

Gly Arg Tyr Leu Pro Glu Asn Glu Thr Tyr Ala Lys His Thr Val Ala

450 455 460

His Asn Thr Val Val Val Asp Glu Thr Thr His Phe Asp Ala Asn Val

465 470 475 480

Glu Val Gly Asn Asn Asn Tyr Pro Thr Leu Asn Phe Phe Glu Thr Asn

485 490 495

Glu Phe Gly Thr Val Ser Ser Gly Glu Ile Ser Thr Ala Tyr Lys Gly

500 505 510

Val Asp Leu Glu Arg Thr Leu Ala Leu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Glu

515 520 525

Ser Thr Leu Ala Leu Asp Val Phe Asp Val Val Ala Asp Lys Ala His

530 535 540

Gln Leu Asp Leu Pro Leu His Tyr Lys Gly Gln Leu Ile Asp Thr Ser

545 550 555 560

Phe Glu Leu Lys Ala Asn Ala Thr Gln Leu Ser Ala Leu Gly Thr Lys

565 570 575

Asn Gly Tyr Gln His Leu Trp Leu Lys Gly Gln Ala Gln Pro Glu Ser

580 585 590

Gly Leu Ala Lys Val Thr Trp Leu Asn Glu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr

595 600 605

Gln Thr Ser Leu Val Lys Gly Asp Glu Ser Phe Leu Phe Thr Gln Ile

610 615 620

Gly Ala Asn Asp Pro His Phe Asn Leu Arg Asn Glu Asn Gly Phe Ile

625 630 635 640

Arg Arg Val Glu Ala Gln Lys Gln His Lys Phe Ile Ser Val Leu Glu

645 650 655

Pro His Gly Glu Tyr Asn Pro Ser Lys Glu Tyr Thr Leu Glu Ala Val

660 665 670

Ser Arg Val Thr Gly Leu Glu Tyr Ser Glu Gln Gly Asp Leu Thr Leu

675 680 685

Val Glu Leu Glu Ile Lys Gly Lys Thr Tyr Leu Val Ala Ile Asn Lys

690 695 700

Ala Gln Thr Ser Ala Lys Asn Thr Phe Asn Tyr Gln Asn Lys Glu Phe

705 710 715 720

Thr Leu Asn Gly Arg Leu Gly Val Tyr Met Met Asn Asn Asn Gln Glu

725 730 735

<210> 3

<211> 1018

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cacatggact gaaacatcat cggcattttt ttctgcctgc aaggcttgaa ataacgttga 60

cattcggcac actccttttc atttatatcg taaccgaaga acgttcaaaa aaccaaatca 120

tcaagccgcc attttcactt cgccggcaca ttgagacaat aatggacaaa tccggtatcc 180

tcttcatagc cgttttgctc atacaagctt cttgccttcc ggttgtggtg ctcagtctga 240

agtgttaaac attttgcccc gttttgccct gcataatcct ttgcggcaga aagcagccgg 300

ccgccggctc cctttgtacg cgcatgagga acgacaaata agtcatttaa tatgtatatc 360

cttttcattg acacagaaga aaacgttgga tagagctggg taaagcctat gaattctcca 420

ttttcttctg ctatcaaaat aacagactcg tgattttcca aacgagcttt caaaaaagcc 480

tctgcccctt gcaaatcgga tgcctgtcta taaaattccc gatattggtt aaacagcggc 540

gcaatggcgg ccgcatctga tgtctttgct tggcgaatgt tcatcttatt tcttcctccc 600

tctcaataat tttttcattc tatccctttt ctgtaaagtt tatttttcag aatactttta 660

tcatcatgct ttgaaaaaat atcacgataa tatccattgt tctcacggaa gcacacgcag 720

gtcatttgaa cgaatttttt cgacaggaat ttgccgggac tcaggagcat ttaacctaaa 780

aaagcatgac atttcagcat aatgaacatt tactcatgtc tattttcgtt cttttctgta 840

tgaaaatagt tatttcgagt ctctacggaa atagcgagag atgatatacc taaatagaga 900

taaaatcatc tcaaaaaaat gggtctacta aaatattatt ccatctatta caataaattc 960

acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt aaaaggagag ggtaaaga 1018

<210> 4

<211> 1048

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tagtaaaaag aagcaggttc ctccatacct gcttcttttt atttgtcagc atcctgatgt 60

tccggcgcat tctcttcttt ctccgcatgt tgaatccgtt ccatgatcga cggatggctg 120

cctctgaaaa tcttcacaag caccggagga tcaacctggc tcagccccgt cacggccaaa 180

tcctgaaacg ttttaacagc ggcttctctg ttctctgtca actcgatccc atactggtca 240

gccttattct cctgataacg cgagacagca ttagaaaaag gcgtaaccgc aaagctcaaa 300

acagaaaaca aaagcaataa cagcggaagt gccgcaagat catgccgccc ttctaaatga 360

aacatgctgc gggttaggcg aaccgtccgc ttgtaaagct tatcaatgac ataaaatccg 420

gcgagcgaca cgagcaaata gccagccaga ccgatgtaaa cgtgcttcat gacataatgg 480

cccatttcgt ggcccataat aaacagaatt tctgaatcgt caagtttgtt cagcgtcgta 540

tcccacaata caatccgttt attggcccca attcctgtaa cataggcatt cagcgcattt 600

gttttttctg acatgttcac ttcatataca tggtcagccg gaatattggc ttcatctgcc 660

agctctaaaa ttttgctttc aagctctttg tttttcagcg gataaaaatc attgtataaa 720

ggatcgataa tgaccggctg aataaaaaac agaaacagcg aaaacggcac tgttaacagc 780

caggcgtata accaccattt tttttcatgc cttttgatca gccaataaaa aacgagaacg 840

caaagcgtaa agattggaaa gctgatccaa aagctgataa cctgatcctt agcccagctg 900

gccgttgtct gtgtggaaat gttatagtca agcgatactt gatagcctat ccaatctaaa 960

ggcagcgtca ccaatgttgt aatcagcgaa agcacaaaca caaaaccaac ggtctgcaaa 1020

aaccgaaaag gcacggccgc ttcgatcc 1048

Claims

1.一株生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23（Bacillus subtilis ZPL23），其特征在于，所述枯草芽孢杆菌突变株ZPL23于2021年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M20211413，地址：中国，武汉，武汉大学。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23，其特征在于，所述生产褐藻胶裂解酶的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23是以枯草芽孢杆菌工程菌ZPL为出发菌株，通过紫外诱变的方法筛选获得。

3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌工程菌ZPL携带有用于重组表达外切型褐藻胶裂解酶PL1877的重组质粒。

4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23，其特征在于，所述外切型褐藻胶裂解酶PL1877来源于假交替单胞菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌工程菌ZPL的构建方法包括步骤如下：

（1）合成大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因并克隆到质粒载体pUC57上，然后以合成基因为模板，用引物对assp302-f1-F/assp302-f1-Rv进行PCR扩增，得到大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因的扩增产物，命名为p302-f1，PCR引物序列如下：

assp302-f1-F：5'-ccgcttcgatccacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaattttt-3'，

assp302-f1-Rv：5'-cgatgatgtttcagtccatgtggggccctatggtgcactctcagtac-3'；

PCR扩增程序为：预变性，98℃ 2min；变性，98℃ 10 s；退火，58℃ 20 s；延伸，72℃ 60s，30个循环；终止延伸，72℃ 5 min，最后4℃保温；

（2）以B.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物对assp302-f2-F/assp302-f2-Rv、assp302-f3-F/assp302-f3-Rv进行PCR，得到同源重组的上游同源臂扩增产物，命名为p302-f2；下游同源臂扩增产物，命名为p302-f3，PCR引物序列如下：

assp302-f2-F：5'-gtactgagagtgcaccatagggccccacatggactgaaacatcatcggc-3'，

assp302-f2-Rv：5'-attacagctccagatctctttaccctctccttttaaaaaa-3'；

assp302-f3-F：5'-aacgacggccagtggcatgctagtaaaaagaagcaggttcctccatac-3'，

assp302-f3-Rv：5'-gacttacttaaaagactattctgtggatcgaagcggccgtgccttttcgg-3'；

（3）合成氯霉素抗性基因克隆到质粒载体pUC57上，然后以合成基因为模板，用引物对assp302-f4-F/assp302-f4-Rv进行PCR扩增，得到扩增产物p302-f4，PCR引物序列如下：

assp302-f4-F：5'-ttttaaaaggagagggtaaagagatctggagctgtaatataaaaacc-3'，

assp302-f4-Rv：5'-ttttaaaaggagagggtaaagagatctggagctgtaatataaaaacc-3'；

（4）将扩增产物p302-f1、p302-f2、p302-f3和p302-f4按照摩尔数比为1:3:3:3混合，然后在50℃下反应60 min，取10 μL反应液转化大肠杆菌，将大肠杆菌均匀涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB转化平板，37℃过夜培养，提取质粒，得到载体质粒p302；

（5）以假交替单胞菌基因组为模板，用引物对ass1877-F/ass1877-Rv进行PCR扩增，得到外切型褐藻胶裂解酶PL1877序列，PCR引物序列如下：

（6）将p302-1877质粒化学转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，挑选阳性重组子，得到枯草芽孢杆菌工程菌ZPL。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23在生产褐藻胶裂解酶中的应用。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌突变株ZPL23在生物降解褐藻胶中的应用。