CN114958702B - 一种稳定、高产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌突变菌株 - Google Patents

一种稳定、高产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌突变菌株 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种稳定、高产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌突变菌株。申请人首先构建得到重组表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌株，然后通过紫外诱变筛选，获得了一株稳定性好、褐藻胶裂解酶产量高的突变株，已于2022年5月26日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022726，为褐藻胶裂解酶的工业化生产奠定了基础。

Description

一种稳定、高产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌突变菌株
技术领域
本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种稳定、高产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌突变菌株。
技术背景
褐藻胶是褐藻中含量最丰富的多糖，主要存在于海带、泡叶藻、巨藻等褐藻的细胞壁和细胞间质，由β-D-甘露糖醛酸(M)与其差向异构体α-L-古罗糖醛酸(G)通过1,4糖苷键连接而成。因其具有高粘度和凝胶性，褐藻胶常被用作食品添加剂。
近年来的研究证明，褐藻胶的降解产物——褐藻寡糖，具有多种特殊的生理活性，如抗炎抑菌、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、神经保护、促植物生长等，在药物研制、功能食品开发、农业生产等领域具有广阔的应用前景。
目前褐藻胶的降解方法可分为三种：化学降解法、物理降解法和生物酶解法。化学降解法包括稀酸降解法、碱降解法、氧化降解法等，虽适合工业化生产，但存在耗时长、反应剧烈、产物不好控制、后续处理繁琐等劣势；物理降解法包括超声波辐射、电离辐射、高温高压等，降解过程耗时长，效率低，成本高，不适合工业化生产，而且电离辐射还存在剂量安全隐患。而生物酶解法即为利用褐藻胶裂解酶（alginatelyase，Alg）对褐藻胶实现特异性酶解。褐藻胶裂解酶作为一种特异性将褐藻胶降解为褐藻寡糖的工具酶，其作用机理为：通过β消去机制催化裂解褐藻胶，在六元碳环的C-4和C-5之间形成双键，并且在235nm处有强吸收峰。生物酶解法具有条件温和、过程可控、得率高、绿色安全、环境友好等优势，具有取代化学和物理降解褐藻胶的趋势，是褐藻胶降解的主要研究方向之一。
但是生物酶解法也同样存在缺点，目前发现的多种微生物产酶能力较低，达不到工业化生产的要求，因此，利用基因工程手段，将褐藻胶裂解酶基因克隆到适于工业化生产的宿主细胞，例如大肠杆菌，开发褐藻胶裂解酶稳定、高产菌株是提高褐藻胶裂解酶产量的重要途径。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种稳定、高产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌突变菌株。申请人首先构建得到重组表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌株，然后通过紫外诱变筛选，获得了一株稳定性好、褐藻胶裂解酶产量高的突变株，为褐藻胶裂解酶的工业化生产奠定了基础，从而弥补现有技术的不足。
本发明一方面提供了一种重组质粒，其携带有褐藻胶裂解酶基因。
所述的褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列为SEQID NO:2。
本发明一方面提供了一种大肠杆菌工程菌，其携带有上述重组质粒。
本发明还提供了一种大肠杆菌突变菌，是以上述大肠杆菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。
所述大肠杆菌突变菌，命名为大肠杆菌EcNJU03（Escherichia coli EcNJU03），已于2022年5月26日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2022726，保藏地址：中国武汉武汉大学。
本发明还提供了上述突变菌在褐藻胶裂解酶生产中的应用。
本发明采用紫外诱变方法获得的大肠杆菌突变菌株能稳定、高效重组表达褐藻胶裂解酶NJU03，其摇瓶发酵和20L罐发酵酶活分别达到2590 U/mL和27420 U/mL，比出发菌分别提高了76.2%和82.8%。此外，该突变菌株重组表达的褐藻胶裂解酶NJU03最适作用温度为30℃，最适作用pH值为8.0，与出发菌株相同，褐藻胶裂解酶的酶学性质未发生改变。因此，该突变菌株可有效应用于褐藻胶裂解酶NJU03的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，实现褐藻胶裂解酶NJU03在工业领域的广泛使用。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。
本发明实施例中所述培养基中各组分及其含量分别为：
LB固体平板：胰蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 1.0%，琼脂1.5%；
LB液体培养基：胰蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 1.0%。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1大肠杆菌表达载体的构建
根据NCBI的公开报道，人工合成褐藻胶裂解酶基因，并根据大肠杆菌（Escherichia coli）的密码子偏好性进行优化。以合成的基因为模板，设计引物进行PCR扩增；PCR扩增条件为98℃2min；98℃ 10S，58℃ 20S，72℃ 1.5min 30个循环；72℃ 5min。
利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。PCR扩增产物胶回收后用BamHI/XhoI双酶切，然后连入同样酶切的pET-21a(+)载体中，获得重组质粒pET-21a(+)-NJU03，并送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果显示，扩增得到的褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
申请人将该褐藻胶裂解酶基因命名为NJU03，将构建得到的重组质粒命名为pET-21a(+)-NJU03。多个克隆的结果证明没有发生扩增错误。
实施例2大肠杆菌工程菌株发酵验证及酶活测定
将重组质粒pET-21a(+)-NJU03转化E.coliBL21(DE3)，涂布LB平板（含100ng/μL氨苄青霉素）37℃倒置过夜培养。挑取阳性转化子，接种至装有3mL LB培养基（含100ng/μL氨苄青霉素）的试管中，37℃，220rpm过夜培养。次日按1%接种量接种至装有100mL LB培养基（含100ng/μL氨苄青霉素）的摇瓶中，37℃，220rpm振荡培养至OD600约为0.6时，加入终浓度0.3mM的IPTG，20℃、220rp诱导培养20h。10000rpm离心10min收集菌体，用1/5发酵液体积的含300mM NaCl的20mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液重悬菌体，并超声破碎（P=400W~600W，工作5s，停5s，100个循环）。离心取上清，进行褐藻胶裂解酶酶活检测。
申请人将菌体裂解上清液中褐藻胶裂解酶酶活最高的阳性转化子命名为大肠杆菌NJU03-1（Escherichia coli NJU03-1），其上清液中褐藻胶裂解酶酶活达到1470U/mL。
褐藻胶裂解酶酶活的测定方法如下：
1、酶活力单位定义
在一定温度和pH值下，每毫升酶液每分钟内催化底物海藻酸钠裂解，使235nm处的吸光值升高0.1为1个酶活力单位U。
2、原理
褐藻胶裂解酶是一种多糖裂解酶，能通过β消除反应断裂褐藻胶的1,4糖苷键，在非还原性末端生成带有C4,5双键的不饱和糖醛酸，该不饱和糖醛酸在235nm处有强烈的吸收峰，这种方法简便灵敏，是目前褐藻胶裂解酶酶活测定的主要方法。
3、测定方法
取0.9mL 0.3%褐藻胶溶液（0.3g海藻酸钠溶于20mmol/L Tris-HCl+300mM NaCl，pH8.0缓冲液），加入0.1mL适当稀释的酶液（酶液同样用缓冲液稀释），30℃保温10min，而后立即加入1mL磷酸终止液终止反应，测定反应体系在235nm的光吸收值。空白组以灭活酶液（100℃5min）作对照。记录吸光值。
4、酶活力计算公式
计算：
X=（A样品－A空白）×2×N/（t×V×0.1）。
式中：
X—酶活力，U/mL；
2—加入1mL磷酸终止液的体积系数；
t—酶促反应时间（min）；
V—酶促反应体系所加入酶液的体积（mL），此处取值0.1；
0.1—将吸光值增长单位换算为0.1的体系系数；
N—稀释倍数。
经简化：酶活力（U/mL）=（A样品－A空白）×2×N×10。
实施例3紫外诱变与筛选
对微生物进行诱变育种是遗传学中常用的改造微生物的手段。诱变主要包括物理诱变和化学诱变两种方式。物理诱变剂有紫外线、X射线、γ射线、α射线，其中，紫外诱变所需设备简单、成本低廉，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，是目前最常采用的诱变手段。其原理为：DNA分子对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶能在紫外线影响下形成胸腺嘧啶二聚体，使DNA分子的结构发生改变，阻碍碱基间正常配对，阻碍DNA的复制或引起碱基排列顺序的变化，导致遗传基因发生变异，从而产生突变或死亡。
申请人以实施例2构建得到的重组菌株大肠杆菌NJU03-1为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其褐藻胶裂解酶的产量。
1、菌体的活化与培养
从LB抗性板上挑取少量大肠杆菌NJU03-1接种至装有20mL LB培养基（含100ng/μL氨苄青霉素）的摇瓶中，37℃过夜培养。次日按1%接种量转接至装有100mL LB培养基（含100ng/μL氨苄青霉素）的250ml摇瓶中，37℃培养至对数期约3-4h；将活化好的菌悬液3700rpm离心10min，弃上清；将菌体用生理盐水洗涤2次后，制成活菌数约为108个/mL的单细胞菌悬液。
2、紫外诱变
处理前先将紫外灯打开使其预热30min。吸取菌悬液5mL于直径6cm的玻璃灭菌培养皿（内装搅拌子）内，置于9W紫外灯下20cm处，打开磁力搅拌器，开盖分别照射0s（对照用）、30s、60s、90s，照射结束后避光30min。30min后将诱变后的菌悬液用0.85%生理盐水按照10倍稀释法梯度稀释成10-1~10-5；取各稀释度的菌悬液100μL涂布于LB抗性平板，每个稀释度涂布三个平板，用黑布包好，置于37℃培养箱过夜培养。以未照射的菌悬液为对照，计算致死率。其中，照射30s时，致死率约为90％，选取该照射时间进行后续诱变实验。
挑取平板上长出的单菌落，在LB抗性平板上划线纯化；共富集筛选到83株突变菌株。
3、摇瓶初筛
将富集到的83株突变菌株与出发菌大肠杆菌NJU03-1分别接种至装有3mL LB抗培养基（含100ng/μL氨苄青霉素）的试管中，37℃、220rpm过夜培养。次日按1%接种量接种至装有50mL LB抗培养基（含100ng/μL氨苄青霉素）的摇瓶中，37℃、220rpm培养2h~4h至OD600达0.6，加入终浓度0.3mM的IPTG在20℃、220rpm条件下继续诱导培养20h。10000rpm离心10min收集菌体，用含300mM NaCl的20 mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液重悬菌体，超声破壁后离心收集上清，进行褐藻胶裂解酶活性检测。
结果显示，上述83株突变菌中菌体裂解上清液中褐藻胶裂解酶酶活最高的仅为1810U/ml，比出发菌仅提高了23.1%，效果不明显。
申请人按照上述方法继续进行了3轮紫外诱变筛选，最终获得一株褐藻胶裂解酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为大肠杆菌EcNJU03（Escherichia.coliNJU03）。该突变菌株摇瓶发酵后，其菌体裂解上清液中褐藻胶裂解酶酶活达2590U/mL，比出发菌株提高了76.2%。
4、20L罐发酵
分别挑取突变菌株大肠杆菌EcNJU03和出发菌单菌落接种于0.6L LB种子培养基（胰蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 1.0%）中，34℃、210 rpm振荡培养8h；将0.6L种子培养液完全接种到含12L发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO41.8%）的20L发酵罐中，34℃发酵培养10h，添加IPTG继续诱导培养24h后，取10ml菌悬液进行高压破碎裂解，离心收集上清液检测酶活。结果显示，所述突变菌大肠杆菌EcNJU03的菌体裂解上清液中褐藻胶裂解酶酶活达到27420U/ml，比出发菌提高了82.8%，取得了意料不到的技术效果。
实施例4褐藻胶裂解酶的酶学性质
1、最适作用pH值
分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液。将突变菌株大肠杆菌EcNJU03和出发菌株大肠杆菌NJU03-1的菌体裂解上清液分别用上述缓冲液稀释至合适的浓度，然后测定其中褐藻胶裂解酶的酶活力。以原始酶活为100%，计算不同pH条件下重组表达的褐藻胶裂解酶的相对酶活。
结果显示，本发明提供的突变菌大肠杆菌EcNJU03和出发菌株重组表达的褐藻胶裂解酶相对酶活-pH变化曲线相同，最适作用pH均为8.0。
2、最适作用温度
将突变菌大肠杆菌EcNJU03和出发菌大肠杆菌NJU03-1的菌体裂解上清液用上述pH8.0的缓冲液稀释至合适的浓度，分别在25℃、30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下，测定其中褐藻胶裂解酶的酶活力。以最高酶活为100%，计算不同温度条件下的相对酶活。
结果显示，本发明提供的突变菌大肠杆菌NJU03和出发菌株重组表达的褐藻胶裂解酶的相对酶活-温度变化曲线相同，其最适作用温度均为30℃。
综上，本发明通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌株大肠杆菌EcNJU03（Escherichia coli NJU03）能显著提高褐藻胶裂解酶的产量，20L罐发酵酶活高达27420U/ml，较出发菌提高了82.8％，且该突变菌株产褐藻胶裂解酶的酶学性质较出发菌没有发生改变。
申请人已于2022年5月26日将上述突变菌大肠杆菌EcNJU03（Escherichia coli EcNJU03）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2022726。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种稳定、高产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌突变菌株
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130 135 140
Ser Glu Ile Ile Asp Pro Pro Thr Thr Ser Leu Pro Val Phe Asp Leu
145 150 155 160
Asp Pro Ala Leu Pro Pro Ser Gly Asn Phe Asp Leu Leu Asp Trp Lys
165 170 175
Leu Asp Leu Pro Val Asp Asp Asn Gly Asn Ala Ser Gly Asp Ala Gln
180 185 190
Glu Val Lys Glu Gly Glu Leu Ser Ser Gly Phe Glu Asn Ser Glu Phe
195 200 205
Phe Tyr Thr Gly Asp Asp Gly Gly Leu Val Phe Ile Ser Pro Val Glu
210 215 220
Gly Ala Thr Thr Ser Ala Asn Thr Lys Tyr Thr Arg Ser Glu Met Arg
225 230 235 240
Glu Met Leu Arg Arg Gly Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Gly Ile Thr
245 250 255
Lys Asn Asn Trp Val Phe Ala Ser Ala Pro Ser Asp Asp Gln Asn Asn
260 265 270
Ser Gly Gly Val Asp Gly Val Leu Glu Ala Thr Leu Ala Val Asn Ala
275 280 285
Val Thr Thr Thr Gly Asp Ser Ser Gln Val Gly Arg Val Ile Val Gly
290 295 300
Gln Ile His Ala Asn Asn Asp Glu Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr Arg Leu
305 310 315 320
Leu Pro Gly His Thr Lys Gly Ser Leu Tyr Phe Ala His Glu Pro Asn
325 330 335
Glu Asp Ala Ser Ser Asp Pro Glu Gln Phe Ile Asn Leu Ile Gly Ser
340 345 350
Ser Ala Ser Asn Ala Ser Glu Pro Glu Asp Gly Ile Ala Leu Asn Glu
355 360 365
Leu Phe Phe Tyr Arg Ile Glu Val Gln Gly Asn Gln Leu Ile Val Thr
370 375 380
Ile Lys Arg Asp Asp His Glu Asp Val Thr Glu Thr Val Asp Met Thr
385 390 395 400
Thr Ser Gly Tyr Asp Val Ser Gly Gln Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly
405 410 415
Val Tyr Asn Gln Asn Asn Ser Gly Asp Pro Thr Asp Tyr Val Gln Ala
420 425 430
Thr Phe Tyr Tyr Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Tyr Glu Phe Pro
435 440 445

Claims (3)

1.一种大肠杆菌突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2022726。
2.权利要求1所述的大肠杆菌突变菌株在生产褐藻胶裂解酶中的应用。
3.一种生产褐藻胶裂解酶的方法，是以权利要求1所述的大肠杆菌突变菌株为发酵菌株。
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