CN114807095B

CN114807095B - 几丁质酶突变体及应用

Info

Publication number: CN114807095B
Application number: CN202210481149.0A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 雷波; 蔡冬波; 廖永庆
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114807095A

Abstract

本发明属于蛋白质工程改造领域，具体涉及几丁质酶突变体及应用。本发明通过对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）来源的几丁质酶进行改造，其相对于原始氨基酸序列，将其第293位氨基酸由Asn变为Trp，且第299位氨基酸由Ala变为Arg，并构建该突变体的地衣芽胞杆菌表达菌株。所构得的地衣芽胞杆菌工程菌株的几丁质酶活力达到144.63 U/mL，相比原始几丁质酶表达菌株提高了31％。

Description

几丁质酶突变体及应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程改造领域，具体涉及几丁质酶突变体及应用。

背景技术

几丁质又名甲壳素，是由β-(1-4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(GlcNAc)通过β-1，4糖苷键连接形成的高分子碳水化合物，这些化合物和一些蛋白质、酚类、脂类或其他碳水化合物，如β-葡聚糖等交联形成高度有序的高分子支架，构成虾壳、蟹壳、昆虫外壳及真菌细胞壁，在自然界含量非常丰富，仅次于纤维素和半纤维素。几丁质分子间和分子内可形成大量的氢键，致使结构紧密，难溶于水。几丁质和壳聚糖作为一类可再生资源，在食品、化工、医药和农业等领域有广泛的应用前景，如几丁质或壳聚糖可用于手术缝合线、药物递呈载体、染料吸附剂、重金属吸附剂等。几丁质和壳聚糖进一步的降解产物几丁寡糖、壳寡糖不仅具有几丁质和壳聚糖的某些生物学功能，如植物生长发育调节、吸附螯合重金属等，而且具有自身特殊的性质，如水溶性、抗菌抑菌作用、减肥与降低胆固醇及抗肿瘤活性等功能。

几丁质酶(chitinase，EC3.2.1.14)是一种能专一性地催化GlcNAc-GlcNAc或GlcNAc-GlcNC糖苷键断裂，从而使几丁质降解成为几丁寡糖或单糖的一类酶的总称，在自然界的碳、氮素循环，微生物侵染植物组织、机体免疫、生物防御等方面起了重要作用，广泛分布于微生物、植物、脊椎动物及昆虫中。与其它来源的几丁质酶相比，微生物几丁质酶具有种类多、活力高、性质多样等优点，

酶分子的定向进化，是模拟自然进化过程的人工策略，属于蛋白质的非理性设计方式，通过利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，迅速获得理想的突变体。近几年酶的定向进化主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面(Johannes TW et al.Curr.Microbiol,2006,9:261-267)。酶的定向进化技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径，在工业、农业、食品业、环境等领域取得巨大成功。

由于几丁质结晶度高，使得几丁质酶与底物(几丁质)无法充分接触，使得目前几丁质酶比活力普遍较低。目前，许多微生物能够分泌一定量的几丁质酶，但是普遍存在分泌量不足、活性不高等问题。重组蛋白技术是直接获取大量高纯度几丁质酶的重要技术手段。与其他外源基因表达系统相比，微生物表达系统因生长快、培养周期短、成本低廉等特点在蛋白表达技术中应用广泛。其中,芽胞杆菌被证明是优良的蛋白表达宿主，能够用于外源蛋白的高效生产。与其他表达系统相比，芽胞杆菌具有多种优点，包括无毒、基因修饰方便、营养廉价、发酵周期短、蛋白质能力强、工业发酵中的分泌和稳健性等。然而，目前异源表达几丁质酶的酶活依然较低，影响了几丁质酶的应用推广。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种几丁质酶突变体BL10/chiA299，其蛋白为SEQ IDNO.4所示。

本发明的另一个目的在于提供了几丁质酶突变体BL10/chiA293-299，其蛋白为SEQ ID NO.6所示。

本发明的另一个目的在于提供了几丁质酶突变体的应用。本发明获得的几丁质酶突变体能在温和条件下能提高酶活，有望提高制备几丁寡糖的反应效率，降低生产成本。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

在原始几丁质酶ChiA氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的基础上，将其第293位氨基酸由Asn变为Trp，突变体命名为ChiA-293，蛋白为SEQ ID NO.3所示；将第299位氨基酸由Ala变为Arg，突变体命名为ChiA-299，蛋白为SEQ ID NO.4所示；将第293位氨基酸由Asn变为Trp，且将第299位氨基酸由Ala变为Arg，突变体命名为ChiA-293-299，蛋白为SEQ ID NO.6所示。

携带有SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体的编码基因的重组表达载体，属于本发明的保护范围。

表达SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体的重组地衣芽胞杆菌，也属于本发明的保护范围。现有技术中用于表达外源蛋白的地衣芽胞杆菌均可用于本发明。

所述的地衣芽胞杆菌优选的为地衣芽胞杆菌BL10。

上述的重组表达载体或重组地衣芽胞杆菌用于制备几丁质酶也属于本发明的保护范围。

本发明的保护范围还包括：SEQID NO.4或SEQ ID NO.6突变体在降解几丁质中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明以来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶ChiA为基础，通过定点突变技术获得了两个几丁质酶突变体BL10/chiA293和BL10/chiA299，并在地衣芽孢杆菌中对上述突变体进行了发酵，其发酵上清液酶活分别为121.28U/mL和130.36U/mL，比原始几丁质酶的地衣芽孢杆菌酶活BL10/pHY-chiA(113.04U/mL)分别提高了8％和17％，再将这两个突变位点进行叠加组合得到几丁质酶突变体BL10/chiA293-299,其发酵上清液酶活可达到144.63U/mL，比原始几丁质酶表达菌株BL10/pHY-chiA(113.04U/mL)提高了31％。

附图说明

图1为几丁质酶表达载体的质粒图谱。

图2为几丁质酶单突变体的相对酶活图。

图3为几丁质酶突变体的相对酶活图。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：

对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：

几丁质酶活性测定所用试剂

1.定义：在37℃，pH6.0时，通过β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶辅助的两步反应，每分钟催化生成1mg N-乙酰葡萄糖的几丁质酶量为一个活力单位，单位为U。

2.胶体几丁质的制备

a)准确称取2g粉末几丁质，加入预冷的45mL浓盐酸后并在磁力搅拌器上搅拌2h，此时粉末几丁质完全溶解成黄色。放入冰箱4℃，静置24h。

b)将上述混合液，加入300mL 50％的预冷酒精，在磁力搅拌器上搅拌2h，此时溶液变为浑浊的乳白色。

c)4000rpm离心10min，得到乳白色沉淀，加入去离子水反复重悬离心清洗至pH值为6.5左右。

d)最后用去离子水定容到100mL，制备成2％(20mg/mL)胶体几丁质。115℃，30min高压灭菌后，4℃保存留用。

3.几丁质酶运用DNS方法测定蛋白酶的活力，

a)制备好的菌株发酵上清液分为两组做如下处理:取第一组发酵上清液1mL，先经过沸水浴15min(注意防止溶液体积减少)，第二组发酵上清液稀释到合适的倍数直接取1mL不做其他处理。

b)吸取1mL的第一组发酵上清液，加入500uL配置好的2％胶体几丁质(pH＝6.0)，500uLPBS缓冲液(PBS终浓度为50mM，pH 7.2-7.4)。

c)空白对照用第二组发酵上清液替换第一组发酵上清液。

d)混合均匀后，37℃水浴反应20min。

e)12000rpm-min'离心5min。

f)分别取上清1mL加入相同体积的DNS溶液沸水浴10min。

g)溶液在波长540nm处的吸光值。

h)菌株发酵上清液的酶活力(E)＝第二组发酵上清液酶活力(E2)一第一组发酵上清液酶活力(E1)。

4.几丁质酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示几丁质酶突变体中突变的氨基酸，其中原始几丁质酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。如chiA-293，表示位置293的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的Asn替换成Trp，如chiA-299，表示位置299的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的Asn替换成Arg，位置的编号对应于SEQ ID NO.2中的编号。如chiA-293-299，表示位置293和位置299的氨基酸都发生了突变。

实施例1：

构建含有几丁质酶原始表达载体和突变表达菌株

以PHY300PLK质粒作为模板，使用引物(PHY-GJ-F、PHY-GJ-R)PCR扩增载体DNA序列，从而获得待克隆的载体骨架序列。以苏云金芽孢杆菌基因组DNA作为模板，使用引物(chiA-F、chiA-R)PCR扩增ChiA完整基因核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)，从而获得几丁质酶ChiA序列，利用重组克隆试剂盒将表达框和载体骨架进行同源重组，并转化到大肠杆菌DH5α中，将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-F与pHY-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由武汉擎科生物技术有限公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，得到游离表达载体pHY-chiA。使用的引物如下：

PHY-GJ-F：aagagcagagaggacgga

PHY-GJ-R：tgcatctgccgaaaatgc

chiA-F：gcattttcggcagatgcagcaaacaatttaggttcaaaattac

chiA-R：tccgtcctctctgctcttttatttttgcaaggaaagacc

pHY-F：gtttattatccatacccttac

pHY-R：cagatttcgtgatgcttgtc

以载体pHY-chiA为模板，使用设计的突变引物，扩增出突变体的骨架。设计的突变引物序列如下：

ChiA-293-F：gtataaactttcttggcagagtggctatcctgcattccg

ChiA-293-R：ggatagccactctgccaagaaagtttatactttcctccgaac

ChiA-299-F：gagtggctatcctcgcttccgcggcctaatgtcttggtc

ChiA-299-R：ggccgcggaagcgaggatagccactctggttagaaagtttatac

琼脂糖凝胶电泳分离出目的骨架DNA，使用OMEGA的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，随后将少量突变体骨架DNA加入到大肠杆菌DH5α感受态中，利用菌株自身修复系统，完成突变载体的环化。将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-F与pHY-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由北京擎科生物技术有限公司武汉分公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即突变载体构建成功，该载体表达的几丁质酶突变体chiA-293(SEQ ID NO.3所示)、chiA-299(SEQ ID NO.4所示)。

实施例2：

几丁质酶分泌表达工程菌BL10/pHY-chiA的构建

将测序验证正确的载体pHY-chiA、chiA-293、chiA-299和空载体pHY300PLK电转化到地衣芽胞杆菌BL10(CN104630124A)。接种地衣芽胞杆菌BL10于5mL LB培养基，37℃,230r/min过夜培养。转接至50mL地衣芽胞杆菌的电转化生长培养基中,230r/min，37℃3h(OD为0.8～0.9)，将摇瓶置冰浴10min，7500r/min离心7min后收集菌体,用地衣芽胞杆菌的电转化洗涤培养基洗涤菌体3次(30mL洗涤液/次)，最后重悬于1mL洗涤培养基中,并迅速分装于1.5mL离心管中，每管100u L，-80℃保存，即为感受态细胞。取一管感受态细胞加入5uL质粒DNA(50ng/uL),将细胞转至预冷的电转化杯(0.2cm)中，冰浴1～1.5min，用电脉冲转化仪2.4kV电击1次，电击完后迅速加800u L地衣芽胞杆菌的电转化恢复培养基，37℃，再在摇床上110r/min恢复培养3h,涂含有20ug/mL的四环素抗性平板,37℃培养过夜,筛选转化子。

挑取转化子单菌落在含抗生素的平板上划线，过夜培养，挑适量的菌落于装有30uL的1.5mL EP管中,混匀,沸水浴中20min。取出后在离心机中10000r/min离心30sec，吸取上清作为菌落PCR的模板。PCR和测序验证阳性克隆,即得到几丁质酶分泌表达工程菌BL10/pHY-chiA、BL10/chiA-293、BL10/chiA-299。

实施例3：

几丁质酶突变体摇瓶发酵检测

1、菌株活化

将上述构建的几丁质酶原始工程菌以及突变体重组菌株BL10/pHY-chiA、BL10/chiA-293、BL10/chiA-299，划线于四环素抗性平板上，37℃培养12-14h。挑取单菌落接种于5mL(有四环素抗性的)LB培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12-14h。随后将培养好的菌液转接到20mL(有四环素抗性的)种子液培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12-14h。

种子培养基为LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH7.0-7.2。

种子培养：250mL,三角瓶,装液量20mL,培养温度37℃,摇床转速220r/min,培养到OD₆₀₀为1.0。

2、液体发酵培养

液体发酵培养基:100g/L饼粕；45g/L玉米淀粉；10g/L碳酸钙；1g/L硫酸铵﹔pH7.0-7.2；

液体发酵培养条件:250mL三角瓶,装液量20mL,发酵温度37℃,摇床转速230r/min,发酵时间48h，离心取上清液。

3、酶活测定

采用DNS方法测定蛋白酶活检测，分别检测上述重组菌株(BL10/chiA-293、BL10/chiA-299)和对照菌地衣芽孢杆菌(BL10/pHY-chiA)发酵上清液的几丁质酶酶活，其发酵上清液酶活分别为121.28U/mL和130.36U/mL，比表达原始几丁质酶chiA的地衣芽孢杆菌酶活(113.04U/mL)分别提高了8％和17％，酶活数据见图2。

实施例4：

叠加突变菌株构建与酶活力检测

将实施例3中有利突变位点293、299(酶活提高已达显著水平，即p<0.05)进行叠加组合，以载体chiA-293为模板，使用设计的突变引物，扩增出突变体的骨架。设计的突变引物序列如下：

ChiA-299-F：gagtggctatcctcgcttccgcggcctaatgtcttggtc

ChiA-299-R：ggccgcggaagcgaggatagccactctggttagaaagtttatac

琼脂糖凝胶电泳分离出目的骨架DNA，使用OMEGA的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，随后将少量突变体骨架DNA加入到大肠杆菌DH5α感受态中，利用菌株自身修复系统，完成突变载体的环化。将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-F与pHY-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由北京擎科生物技术有限公司武汉分公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即突变载体构建成功，构建得到突变载体chiA-293-299(SEQ ID NO.5所示序列，编码SEQ ID NO.6所示蛋白)，将叠加突变载体分别转化入地衣芽胞杆菌BL10中，得到几丁质酶突变菌株BL10/chiA-293-299。

将该菌株于对照菌株BL10/pHY-chiA、BL10/chiA293、BL10/chiA-299和BL10/chiA293-299按照实施例3中方法进行几丁质酶发酵和酶活检测(具体数据见图3)，由图可见叠加突变工程菌BL10/chiA293-299其发酵上清液酶活可达到144.63U/mL，比表达原始几丁质酶BL10/pHY-chiA的地衣芽孢杆菌酶活(113.04U/mL)提高了31％。本发明由此获得了摇瓶水平达到144.63U/mL的几丁质酶高产菌株BL10/chiA293-299。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 几丁质酶突变体及应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaaacaatt taggttcaaa attactcgtt ggatactggc ataactttga taacggtact 60

ggcattatta aattaaaaga cgtttcacca aaatgggatg taatcaatgt atcttttggt 120

gaaactggtg gtgatcgttc cactgttgaa ttttctcctg tgtatggtac agatgcagac 180

ttcaaatcag atatttctta tttaaaaagt aaaggaaaga aagtagttct ttcaatagga 240

ggacaaaatg gagtcgtttt acttcctgac aatgccgcta agcaacgttt tattaattcc 300

atacaatctc taatcgataa atacggtttt gatggaatag atattgacct tgaatcaggt 360

atttacttaa acggaaatga cattaatttc aaaaacccaa ctactcccca aatcgtaaat 420

cttatatcag ctattcgaac aatctcagat cattatggtc cagattttct attaagcatg 480

gctcctgaaa cagcttatgt tcaaggcggt tatagcgcat acggaagtat ctggggtgca 540

tatttaccaa ttatttacgg agtgaaagat aaactaacat acattcacgt tcaacactac 600

aacgctggca gcggggttgg aatggacggt aataactaca atcaaggtac tgcagactac 660

gaagtcgcta tggcagatat gctcttacat ggttttcctg taggtggtaa tccaaataac 720

attttcccag ctcttcgctc agatcaagtt atgattgggc ttccagcagc accagcggca 780

gctccaagtg gtggatacat ttcgccaact gaaatgaaaa aagctttaaa ttatatcatt 840

aaaggagttc cgttcggagg aaagtataaa ctttctaacc agagtggcta tcctgcattc 900

cgcggcctaa tgtcttggtc tattaattgg gatgcaaaaa acaactttga attctctagt 960

aactatagaa catattttga tggtctttcc ttgcaaaaat aa 1002

<210> 2

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Asn Asn Leu Gly Ser Lys Leu Leu Val Gly Tyr Trp His Asn Phe

1 5 10 15

Asp Asn Gly Thr Gly Ile Ile Lys Leu Lys Asp Val Ser Pro Lys Trp

20 25 30

Asp Val Ile Asn Val Ser Phe Gly Glu Thr Gly Gly Asp Arg Ser Thr

35 40 45

Val Glu Phe Ser Pro Val Tyr Gly Thr Asp Ala Asp Phe Lys Ser Asp

50 55 60

Ile Ser Tyr Leu Lys Ser Lys Gly Lys Lys Val Val Leu Ser Ile Gly

65 70 75 80

Gly Gln Asn Gly Val Val Leu Leu Pro Asp Asn Ala Ala Lys Gln Arg

85 90 95

Phe Ile Asn Ser Ile Gln Ser Leu Ile Asp Lys Tyr Gly Phe Asp Gly

100 105 110

Ile Asp Ile Asp Leu Glu Ser Gly Ile Tyr Leu Asn Gly Asn Asp Ile

115 120 125

Asn Phe Lys Asn Pro Thr Thr Pro Gln Ile Val Asn Leu Ile Ser Ala

130 135 140

Ile Arg Thr Ile Ser Asp His Tyr Gly Pro Asp Phe Leu Leu Ser Met

145 150 155 160

Ala Pro Glu Thr Ala Tyr Val Gln Gly Gly Tyr Ser Ala Tyr Gly Ser

165 170 175

Ile Trp Gly Ala Tyr Leu Pro Ile Ile Tyr Gly Val Lys Asp Lys Leu

180 185 190

Thr Tyr Ile His Val Gln His Tyr Asn Ala Gly Ser Gly Val Gly Met

195 200 205

Asp Gly Asn Asn Tyr Asn Gln Gly Thr Ala Asp Tyr Glu Val Ala Met

210 215 220

Ala Asp Met Leu Leu His Gly Phe Pro Val Gly Gly Asn Pro Asn Asn

225 230 235 240

Ile Phe Pro Ala Leu Arg Ser Asp Gln Val Met Ile Gly Leu Pro Ala

245 250 255

Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Ser Pro Thr Glu Met

260 265 270

Lys Lys Ala Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Gly Val Pro Phe Gly Gly Lys

275 280 285

Tyr Lys Leu Ser Asn Gln Ser Gly Tyr Pro Ala Phe Arg Gly Leu Met

290 295 300

Ser Trp Ser Ile Asn Trp Asp Ala Lys Asn Asn Phe Glu Phe Ser Ser

305 310 315 320

Asn Tyr Arg Thr Tyr Phe Asp Gly Leu Ser Leu Gln Lys

325 330

<210> 3

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Asn Asn Leu Gly Ser Lys Leu Leu Val Gly Tyr Trp His Asn Phe

1 5 10 15

Asp Asn Gly Thr Gly Ile Ile Lys Leu Lys Asp Val Ser Pro Lys Trp

20 25 30

Asp Val Ile Asn Val Ser Phe Gly Glu Thr Gly Gly Asp Arg Ser Thr

35 40 45

Val Glu Phe Ser Pro Val Tyr Gly Thr Asp Ala Asp Phe Lys Ser Asp

50 55 60

Ile Ser Tyr Leu Lys Ser Lys Gly Lys Lys Val Val Leu Ser Ile Gly

65 70 75 80

Gly Gln Asn Gly Val Val Leu Leu Pro Asp Asn Ala Ala Lys Gln Arg

85 90 95

Phe Ile Asn Ser Ile Gln Ser Leu Ile Asp Lys Tyr Gly Phe Asp Gly

100 105 110

Ile Asp Ile Asp Leu Glu Ser Gly Ile Tyr Leu Asn Gly Asn Asp Ile

115 120 125

Asn Phe Lys Asn Pro Thr Thr Pro Gln Ile Val Asn Leu Ile Ser Ala

130 135 140

Ile Arg Thr Ile Ser Asp His Tyr Gly Pro Asp Phe Leu Leu Ser Met

145 150 155 160

Ala Pro Glu Thr Ala Tyr Val Gln Gly Gly Tyr Ser Ala Tyr Gly Ser

165 170 175

Ile Trp Gly Ala Tyr Leu Pro Ile Ile Tyr Gly Val Lys Asp Lys Leu

180 185 190

Thr Tyr Ile His Val Gln His Tyr Asn Ala Gly Ser Gly Val Gly Met

195 200 205

Asp Gly Asn Asn Tyr Asn Gln Gly Thr Ala Asp Tyr Glu Val Ala Met

210 215 220

Ala Asp Met Leu Leu His Gly Phe Pro Val Gly Gly Asn Pro Asn Asn

225 230 235 240

Ile Phe Pro Ala Leu Arg Ser Asp Gln Val Met Ile Gly Leu Pro Ala

245 250 255

Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Ser Pro Thr Glu Met

260 265 270

Lys Lys Ala Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Gly Val Pro Phe Gly Gly Lys

275 280 285

Tyr Lys Leu Ser Trp Gln Ser Gly Tyr Pro Ala Phe Arg Gly Leu Met

290 295 300

Ser Trp Ser Ile Asn Trp Asp Ala Lys Asn Asn Phe Glu Phe Ser Ser

305 310 315 320

Asn Tyr Arg Thr Tyr Phe Asp Gly Leu Ser Leu Gln Lys

325 330

<210> 4

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Asn Asn Leu Gly Ser Lys Leu Leu Val Gly Tyr Trp His Asn Phe

1 5 10 15

Asp Asn Gly Thr Gly Ile Ile Lys Leu Lys Asp Val Ser Pro Lys Trp

20 25 30

Asp Val Ile Asn Val Ser Phe Gly Glu Thr Gly Gly Asp Arg Ser Thr

35 40 45

Val Glu Phe Ser Pro Val Tyr Gly Thr Asp Ala Asp Phe Lys Ser Asp

50 55 60

Ile Ser Tyr Leu Lys Ser Lys Gly Lys Lys Val Val Leu Ser Ile Gly

65 70 75 80

Gly Gln Asn Gly Val Val Leu Leu Pro Asp Asn Ala Ala Lys Gln Arg

85 90 95

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Asn Phe Lys Asn Pro Thr Thr Pro Gln Ile Val Asn Leu Ile Ser Ala

130 135 140

Ile Arg Thr Ile Ser Asp His Tyr Gly Pro Asp Phe Leu Leu Ser Met

145 150 155 160

Ala Pro Glu Thr Ala Tyr Val Gln Gly Gly Tyr Ser Ala Tyr Gly Ser

165 170 175

Ile Trp Gly Ala Tyr Leu Pro Ile Ile Tyr Gly Val Lys Asp Lys Leu

180 185 190

Thr Tyr Ile His Val Gln His Tyr Asn Ala Gly Ser Gly Val Gly Met

195 200 205

Asp Gly Asn Asn Tyr Asn Gln Gly Thr Ala Asp Tyr Glu Val Ala Met

210 215 220

Ala Asp Met Leu Leu His Gly Phe Pro Val Gly Gly Asn Pro Asn Asn

225 230 235 240

Ile Phe Pro Ala Leu Arg Ser Asp Gln Val Met Ile Gly Leu Pro Ala

245 250 255

Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Ser Pro Thr Glu Met

260 265 270

Lys Lys Ala Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Gly Val Pro Phe Gly Gly Lys

275 280 285

Tyr Lys Leu Ser Asn Gln Ser Gly Tyr Pro Arg Phe Arg Gly Leu Met

290 295 300

Ser Trp Ser Ile Asn Trp Asp Ala Lys Asn Asn Phe Glu Phe Ser Ser

305 310 315 320

Asn Tyr Arg Thr Tyr Phe Asp Gly Leu Ser Leu Gln Lys

325 330

<210> 5

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaaacaatt taggttcaaa attactcgtt ggatactggc ataactttga taacggtact 60

ggcattatta aattaaaaga cgtttcacca aaatgggatg taatcaatgt atcttttggt 120

gaaactggtg gtgatcgttc cactgttgaa ttttctcctg tgtatggtac agatgcagac 180

ttcaaatcag atatttctta tttaaaaagt aaaggaaaga aagtagttct ttcaatagga 240

ggacaaaatg gagtcgtttt acttcctgac aatgccgcta agcaacgttt tattaattcc 300

atacaatctc taatcgataa atacggtttt gatggaatag atattgacct tgaatcaggt 360

atttacttaa acggaaatga cattaatttc aaaaacccaa ctactcccca aatcgtaaat 420

cttatatcag ctattcgaac aatctcagat cattatggtc cagattttct attaagcatg 480

gctcctgaaa cagcttatgt tcaaggcggt tatagcgcat acggaagtat ctggggtgca 540

tatttaccaa ttatttacgg agtgaaagat aaactaacat acattcacgt tcaacactac 600

aacgctggca gcggggttgg aatggacggt aataactaca atcaaggtac tgcagactac 660

gaagtcgcta tggcagatat gctcttacat ggttttcctg taggtggtaa tccaaataac 720

attttcccag ctcttcgctc agatcaagtt atgattgggc ttccagcagc accagcggca 780

gctccaagtg gtggatacat ttcgccaact gaaatgaaaa aagctttaaa ttatatcatt 840

aaaggagttc cgttcggagg aaagtataaa ctttcttggc agagtggcta tcctcgcttc 900

cgcggcctaa tgtcttggtc tattaattgg gatgcaaaaa acaactttga attctctagt 960

aactatagaa catattttga tggtctttcc ttgcaaaaat aa 1002

<210> 6

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Asn Asn Leu Gly Ser Lys Leu Leu Val Gly Tyr Trp His Asn Phe

1 5 10 15

Asp Asn Gly Thr Gly Ile Ile Lys Leu Lys Asp Val Ser Pro Lys Trp

20 25 30

Asp Val Ile Asn Val Ser Phe Gly Glu Thr Gly Gly Asp Arg Ser Thr

35 40 45

Val Glu Phe Ser Pro Val Tyr Gly Thr Asp Ala Asp Phe Lys Ser Asp

50 55 60

Ile Ser Tyr Leu Lys Ser Lys Gly Lys Lys Val Val Leu Ser Ile Gly

65 70 75 80

Gly Gln Asn Gly Val Val Leu Leu Pro Asp Asn Ala Ala Lys Gln Arg

85 90 95

Phe Ile Asn Ser Ile Gln Ser Leu Ile Asp Lys Tyr Gly Phe Asp Gly

100 105 110

Ile Asp Ile Asp Leu Glu Ser Gly Ile Tyr Leu Asn Gly Asn Asp Ile

115 120 125

Asn Phe Lys Asn Pro Thr Thr Pro Gln Ile Val Asn Leu Ile Ser Ala

130 135 140

Ile Arg Thr Ile Ser Asp His Tyr Gly Pro Asp Phe Leu Leu Ser Met

145 150 155 160

Ala Pro Glu Thr Ala Tyr Val Gln Gly Gly Tyr Ser Ala Tyr Gly Ser

165 170 175

Ile Trp Gly Ala Tyr Leu Pro Ile Ile Tyr Gly Val Lys Asp Lys Leu

180 185 190

Thr Tyr Ile His Val Gln His Tyr Asn Ala Gly Ser Gly Val Gly Met

195 200 205

Asp Gly Asn Asn Tyr Asn Gln Gly Thr Ala Asp Tyr Glu Val Ala Met

210 215 220

Ala Asp Met Leu Leu His Gly Phe Pro Val Gly Gly Asn Pro Asn Asn

225 230 235 240

Ile Phe Pro Ala Leu Arg Ser Asp Gln Val Met Ile Gly Leu Pro Ala

245 250 255

Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Ser Pro Thr Glu Met

260 265 270

Lys Lys Ala Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Gly Val Pro Phe Gly Gly Lys

275 280 285

Tyr Lys Leu Ser Trp Gln Ser Gly Tyr Pro Arg Phe Arg Gly Leu Met

290 295 300

Ser Trp Ser Ile Asn Trp Asp Ala Lys Asn Asn Phe Glu Phe Ser Ser

305 310 315 320

Asn Tyr Arg Thr Tyr Phe Asp Gly Leu Ser Leu Gln Lys

325 330

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagagcagag aggacgga 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcatctgcc gaaaatgc 18

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcattttcgg cagatgcagc aaacaattta ggttcaaaat tac 43

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccgtcctct ctgctctttt atttttgcaa ggaaagacc 39

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtttattatc cataccctta c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagatttcgt gatgcttgtc 20

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtataaactt tcttggcaga gtggctatcc tgcattccg 39

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggatagccac tctgccaaga aagtttatac tttcctccga ac 42

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagtggctat cctcgcttcc gcggcctaat gtcttggtc 39

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggccgcggaa gcgaggatag ccactctggt tagaaagttt atac 44

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagtggctat cctcgcttcc gcggcctaat gtcttggtc 39

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggccgcggaa gcgaggatag ccactctggt tagaaagttt atac 44

Claims

1. 一种几丁质酶突变体，所述突变体为SEQ ID NO.6所示。

2. 携带有SEQ ID NO.6突变体的编码基因的重组表达载体。

3. 表达SEQ ID NO.6突变体的重组地衣芽胞杆菌。

4.根据权利要求3所述的重组地衣芽胞杆菌，所述的重组地衣芽胞杆菌在重组前为地衣芽胞杆菌BL10。

5.权利要求2所述的重组表达载体或权利要求3所述的重组地衣芽胞杆菌在制备几丁质酶中的应用。

6. SEQ ID NO.6所示突变体在降解几丁质中的应用。