RU2747782C1 - Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis - Google Patents
Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2747782C1 RU2747782C1 RU2020120291A RU2020120291A RU2747782C1 RU 2747782 C1 RU2747782 C1 RU 2747782C1 RU 2020120291 A RU2020120291 A RU 2020120291A RU 2020120291 A RU2020120291 A RU 2020120291A RU 2747782 C1 RU2747782 C1 RU 2747782C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mannanase
- ogataea
- haglerorum
- strain
- yeast
- Prior art date
Links
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 241000081017 Ogataea haglerorum Species 0.000 title claims abstract description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 49
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims description 11
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 101001016810 Bacillus subtilis Mannan endo-1,4-beta-mannosidase Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 45
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 25
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 17
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 102100032487 Beta-mannosidase Human genes 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 9
- 241001112159 Ogataea Species 0.000 description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 235000010420 locust bean gum Nutrition 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 4
- 102100031004 Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 4
- 101000843187 Homo sapiens Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 4
- 241001099341 Ogataea polymorpha Species 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- OMDQUFIYNPYJFM-XKDAHURESA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-2-(hydroxymethyl)-6-[[(2r,3s,4r,5s,6r)-4,5,6-trihydroxy-3-[(2s,3s,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]methoxy]oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O1 OMDQUFIYNPYJFM-XKDAHURESA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000926 Galactomannan Polymers 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 101150092658 RTM1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N mannan Chemical class O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100114976 Cyamopsis tetragonoloba ManS gene Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 229920000161 Locust bean gum Polymers 0.000 description 2
- 101150023810 PHO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 2
- 101100271429 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ATP6 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 2
- 101100115751 Trypanosoma brucei brucei dnaaf11 gene Proteins 0.000 description 2
- -1 YNI1 Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000000711 locust bean gum Substances 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[(2r,3s,4r,5s,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5s,6r)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](OC3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N 0.000 description 1
- RJQKKZNUWRIHCS-YDPWGIMBSA-N 1,4-b-d-mannan Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O[C@@H]2[C@H](OC(O[C@@H]3[C@H](OC(O[C@@H]4[C@H](OC(O[C@@H]5[C@H](OC(O[C@@H]6[C@H](OC(O[C@@H]7[C@H](OC(O[C@@H]8[C@H](OC(O[C@@H]9[C@H](OC(O)[C@@H](O)[C@H]9O)CO)[C@@H](O)[C@H]8O)CO)[C@@H](O)[C@H]7O)CO)[C@@H](O)[C@H]6O)CO)[C@@H](O)[C@H]5O)CO)[C@@H](O)[C@H]4O)CO)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@@H](O)[C@H]1O RJQKKZNUWRIHCS-YDPWGIMBSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PZPXDAEZSA-N 4β-mannobiose Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PZPXDAEZSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- 101150078244 AMO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000981365 Aspergillus sulphureus Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003423 D-mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 101000893906 Fowl adenovirus A serotype 1 (strain CELO / Phelps) Protein GAM-1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002324 Galactoglucomannan Polymers 0.000 description 1
- 229920002581 Glucomannan Polymers 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 102100029015 Histidine-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000838688 Homo sapiens D-aminoacyl-tRNA deacylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000696493 Homo sapiens Histidine-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000600178 Homo sapiens Peroxisomal membrane protein PEX14 Proteins 0.000 description 1
- 101000795074 Homo sapiens Tryptase alpha/beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 101100502336 Komagataella pastoris FLD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000021534 Mangelwurzel Nutrition 0.000 description 1
- 101000891165 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) Ammonia monooxygenase alpha subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000891164 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) Ammonia monooxygenase beta subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001126578 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) Ammonia monooxygenase gamma subunit Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- DKXNBNKWCZZMJT-UHFFFAOYSA-N O4-alpha-D-Mannopyranosyl-D-mannose Natural products O=CC(O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O DKXNBNKWCZZMJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001221837 Ogataea thermomethanolica Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101150015692 PEX11A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100040056 Peroxisomal membrane protein 11A Human genes 0.000 description 1
- 102100037476 Peroxisomal membrane protein PEX14 Human genes 0.000 description 1
- 101000662819 Physarum polycephalum Terpene synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100008882 Pichia angusta DAS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240548 Pichia angusta YNR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100298818 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPT3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100421128 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SEI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 102100029639 Tryptase alpha/beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- LHAOFBCHXGZGOR-NAVBLJQLSA-N alpha-D-Manp-(1->3)-alpha-D-Manp-(1->2)-alpha-D-Manp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LHAOFBCHXGZGOR-NAVBLJQLSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010050200 endo-1,4-beta-D-mannanase Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940046240 glucomannan Drugs 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 235000021539 instant coffee Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 101150002012 met6 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 101150107962 pex11 gene Proteins 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000010377 protein imaging Methods 0.000 description 1
- 238000004076 pulp bleaching Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000271 synthetic detergent Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/2488—Mannanases
- C12N9/2494—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01078—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-4639, являющийся продуцентом β-маннаназы и содержащий в составе хромосомы оптимизированную последовательность гена, кодирующего β-маннаназу ЕС 3.2.1.78 Bacillus subtilis. При культивировании штамма в колбах в культуральной жидкости аккумулируется около в количестве 1.0±0.2 мг/мл, активность фермента β-маннаназы составляет 12000±500 ед./мл. При культивировании в ферментере заявляемый штамм секретирует белка 4,25 г/л, а активность β-маннаназы составляет 51066 ед./мл за 160 ч. Изобретение обеспечивает расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих β-маннаназу. 3 табл., 4 пр., 1 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения рекомбинантного штамма дрожжей Ogataea haglerorum N107 - продуцента β-маннаназы.
β-маннаназа (эндо-β-1,4-маннаназа β-1,4-D-маннаназа, 1,4-β-D-маннан манногидролаза, Е.С.3.2.1.78) относится к гемицеллюлазам, к классу ферментов О-гликозид-гидролаз и катализирует расщепление внутренних β-1,4-гликозидных связей в основной полимерной цепи молекулы маннана.
Маннан - важный компонент гемицеллюлозной фракции клеточной стенки многих растений, полисахарид, который в зависимости от строения подразделяют на четыре субсемейства: линейный маннан, галактоманнан, глюкоманнан или галактоглюкоманнан [Carbohydr Polym. 2001, 44, 107-112; Process Biochem. 2010, 45, 1203-1213]. В каждом из этих полисахаридов основная цепь состоит из остатков D-маннозы или комбинации остатков D-маннозы и D-глюкозы, связанных β-1,4-гликозидными связями.
Полная деградация маннана требует комплекса маннолитических ферментов, включающих β-маннаназу, β-маннозидазу (ЕС 3.2.1.25) и β-глюкозидазу (ЕС 3.2.1.21).
Основную роль в разрушении маннана играет β-маннаназа, которая катализирует случайный гидролиз маннана до низкомолекулярных манноолигосахаридов, преимущественно до маннобиозы и маннотриозы [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Низкомолекулярные манноолигосахариды и манноза могут усваиваться живыми организмами.
β-маннаназу применяют в целлюлозно-бумажной промышленности для отбеливания пульпы, в пищевой промышленности (растворимый кофе, экстракция растительных масел из семян, диетические пищевые продукты), производстве синтетических моющих средств, получении биотоплива из лигноцеллюлозы [Appl Microbiol Biotechnol. 2008, 79, 165-178. DOI 10.1007/s00253-008-1423-4]. Важной областью применения β-маннаназы является кормовая промышленность. Наличие маннанов в кормах приводит к повышению вязкости содержимого желудочно-кишечного тракта птицы и животных с однокамерным желудком из-за способности маннанов связывать свободную воду. Введение в корма животных β-маннаназы увеличивает их питательную ценность и энергетический уровень, уменьшает вязкость перевариваемого субстрата, способствует улучшению физиологического состояния животных, приросту их массы и продуктивности [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Манноза - продукт расщепления маннанов, легко усваивается организмом. Неусвояемые формы манноолигосахаридов - маннотриоза и маннобиоза, являются хорошим субстратом для роста бифидобактерий и способствуют улучшению показателей здоровья птицы. Введение маннаназы и других ферментов, разрушающих растительные субстраты, в рацион животных с однокамерным желудком и птиц позволяет использовать такие дешевые корма, как ячмень, овес и отходы сельскохозяйственного производства (отруби, жом), содержащие трудноусвояемые компоненты.
Природными источниками β-маннаназ являются преимущественно бактерии и грибы. Среди грамположительных бактерий преобладают виды рода Bacillus и Clostridium [Carbohydr Polym. 2006, 66, 88-96; J Food Biochem. 2011, 35, 1451-1460; J. Bacteriol. 2004, 186 (19), 6544-6552]. β-Маннаназы синтезируются некоторыми штаммами грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas [Biochem J. 1995, 305, 1005-1010], Vibrio [Biosci Biotechnol Biochem. 2009, 73, 109-116]. Обширная группа маннолитиков среди грибов представлена родами Aspergillus и Trichoderma [J. Biotechnol. 1998, 63, 199-210; PLOS One. 2011, 6(12), e29302. doi:10.1371/journal. Pone.0029302].
Большое количество генов β-маннаназ экспрессировано в гетерологичных хозяевах. Гены β-маннаназ из бактериальных источников экспрессированы в Escherichia coli, Bacillus megaterium, Brevibacillus brevis, Pichia pastoris, Kluyveromyces cicerisporous, гены β-маннаназ из грибов экспрессировали в Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Aspergillus sp., Trichoderma reesei [Biotechnology Advances. 2016. doi:10.1016/j.biotechadv.2016.11.00; Process Biochemistry 2010, 45, 1203-1213. doi:10.1016/j.procbio.2010.05.011].
Грибные штаммы, как правило, продуцируют комплекс ферментов, относящихся к карбогидразам и разрушающих растительные субстраты, а именно, β-маннаназу, ксиланазу, целлюлазу, глюканазу и пектиназу. В этом ферментном коктейле на долю β-маннаназ приходится не более 3% [Carbohydr Polym. 2004, 57, 23-29].
Для производства моноферментных препаратов используют рекомбинантные дрожжевые штаммы.
Наиболее продуктивные рекомбинантные штаммы-продуценты β-маннаназы получены на основе дрожжей Pichia pastoris.
Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris являются модельным организмом для экспрессии гетерологичных генов под контролем сильного регулируемого метанолом промотора гена АОХ1. При использовании несбраживаемых источников углерода (глицерина, метанола и т.п.) дрожжи Pichia pastoris способны к росту с образованием биомассы высокой плотности, что позволяет получать значительные количества гетерологичного белка [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54(6), 741-750]. При этом процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24: 45-66, doi: 10.1111/j.l574-6976.2000.tb00532.x].
На базе дрожжей Pichia pastoris получены рекомбинантные штаммы, содержащие гены маннаназ из грибов.
В дрожжах Pichia pastoris Х-33 экспрессирован ген manM Aspergillus sulphureus с кодонами, адаптированными для этого вида дрожжей. Штамм продуцирует 3 мг/мл белка, активность фермента составляет 1100 ед./мл КЖ через 96 ч культивирования в 10 л ферментере. Рекомбинантная β-маннаназа имеет максимальную активность при рН 2,4 и температуре 50°С, удельная активность фермента 344,8 ед./мг [Biologia 2009, 64/2, 235-238. doi: 10.2478/s11756-009-0043-5].
Грибные β-маннаназы, в основном, проявляют максимальную активность при кислых значениях рН (2.0-4.5) и характеризуются невысокой удельной активностью по сравнению с бактериальными β-маннаназами.
Известны примеры создания высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов на основе дрожжей Pichia pastoris, содержащих гены бактериальных β-маннаназ, преимущественно из Bacillus. Бактериальные β-маннаназы проявляют максимальную активность при нейтральных и щелочных значениях рН и характеризуются в массе своей относительно высокой удельной активностью по сравнению с грибными β-маннаназами, например, удельная активность очищенной β-маннаназы из Bacillus subtilis SA-22 составляет 34780 ед./мг, из Bacillus circulans М-21 - 19373 ед./мг, из Bacillus subtilis WY34 - 8302 ед./мг, из Bacillus sp. MSJ-5 - 5383 ед./мг [Int J Pharm Bio Sci. 2014, 5(1): (B), 176-192] и, в целом, более термостабильны, чем грибные β-маннаназы, что важно для промышленного использования фермента [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 93, 1817-1830. DOI 10.1007/s00253-012-3887-5].
Получен продуцент на основе штамма P. pastoris GS115, в котором экспрессирован ген β-маннаназы из Bacillus megaterium FB101. Активность маннаназы составляет 22000 ед./мл через 120 ч ферментации и не меняется при увеличении времени культивирования до 190 ч. Удельная активность фермента в КЖ составляет 3427 ед./мг, очищенного фермента - 16718 ед./мг. Фермент проявляет максимальную активность при рН 6.5 и температуре 55°С [WO 2012079222].
Ген β-маннаназы mannS из Bacillus subtilis MAFIC-S11, имеющий адаптированные для дрожжей P. pastoris кодоны, экспрессирован в дрожжах P. pastoris. Для секреции использована модифицированная сигнальная последовательность [Biotechnology and Bioengineering 2009, 103, 1192-1201]. Штамм секретирует 6,6 мг/мл белка, активность маннаназы составляет 24600 ед./мл через 144 ч ферментации в 10 л ферментере. Фермент имеет максимальную активность при рН 6,0 и температуре 50°С [Appl Biochem Biotechnol. 2013, 169, 2326-2340. DOI 10.1007/sl2010-013-0156-8].
Получен [CN 110093331] рекомбинантный штамм Pichia pastoris, содержащий искусственно созданный ген маннаназы ManGold. Штамм секретирует 3,25 мг/мл фермента, активность маннаназы составляет 35000 ед./мл через 96 ч ферментации.
Еще одной известной метилотрофной системой для гетерологичной экспрессии являются термотолерантные дрожжи Ogataea (Hansenula). Дрожжи рода Ogataea, как и дрожжи Pichia pastoris, обладают уникальной организацией и регуляцией метаболизма в присутствии метанола благодаря наличию сильных промоторов, индуцируемых метанолом. Подобно Pichia pastoris, дрожжи рода Ogataea сочетают преимущества простоты выращивания на недорогой ростовой среде с высокой секретирующей способностью, а при культивировании в биореакторе достигают высокой плотности клеток, что способствует высокому выходу целевого продукта [FEMS Yeast Res. 2005, 5, 1079-1096; Microb. Cell Fact. 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fnz052].
В отличие от Pichia pastoris дрожжи рода Ogataea являются термотолерантными, что позволяет проводить ферментацию при температуре не ниже 37°С. Повышение температуры процесса ферментации снижает контаминацию и затраты на охлаждение биореактора [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] и в результате сокращает длительность ферментации.
Вид Ogataea haglerorum выделен из дрожжей рода Ogataea в 2017 г. в результате проведения анализа последовательностей D1/D1 гена LSU rRNA, ITS1-5.8S-ITS2, фактора элонгации трансляции EF-1α и комплексного генетического анализа Наумовым Г.И. с соавторами [Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017, 67, 2465-2469. DOI 10.1099/ijsem.0.002012].
Для дрожжей Ogataea haglerorum разработаны генетические технологии конструирования штаммов-продуцентов, включая экспрессионный вектор и метод введения ДНК в клетки реципиента [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56]. Описано использование штамма Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584 для экспрессии различных генов фитазы. Других сведений об использовании дрожжей Ogataea haglerorum для экспрессии гетерологичных генов не выявлено.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих β-маннаназу.
Задача решена путем получения трансформанта дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующего β-маннаназу, содержащего в составе хромосомы оптимизированную последовательность гена MANS, кодирующего β-маннаназу Bacillus subtilis.
В данном изобретении термотолерантные метилотрофные дрожжи рода Ogataea впервые использованы для гетерологичной экспрессии β-маннаназы.
Получение заявляемого трансформанта включает
- трансформацию в клетки дрожжей Ogataea haglerorum экспрессионной кассеты (фиг. 1), содержащей синтетический ген MANS β-маннаназы из Bacillus subtilis;
- отбор репликативного трансформанта, способного продуцировать β-маннаназу;
- селекцию на многокопийную интеграцию экспрессионной кассеты в состав хромосомы трансформанта.
Конструирование экспрессионной кассеты осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами рода Ogataea (Hansenula). В качестве промоторов могут быть использованы МОХ, FMD, DAS, TPS1, FLD1, PHO1, YNT1, YNI1, YNR1, GAP, ACT, РМА1, АОХ, MAL, АМО, TEF1, РЕХ14, РЕХ11 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiol Lett., 2018, 365, 1-6; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278].
В качестве сигнальных пептидов используют лидерную последовательность PHO1, пре-про-лидерную последовательность MFα из Saccharomyces cerevisiae или Ogataea thermomethanolica, GAM1 из Schwanniomyces occidentalis [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; Appl Biochem Biotechnol., 2016, 178, 710-724].
В качестве терминаторов транскрипции используют МОХ, AMO1, PHO5, АОХ1 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54, 741-750; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 175-184].
В качестве селективных маркеров используют любые подходящие маркеры, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, генетицину (G418), гигромицину В, норзеотрицину или бластицидину а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме дрожжей рода Ogataea, например, LEU2, HIS3, TRP3, ADE2, URA3, МЕТ6, ADE11 [FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; Yeast, 1995, 11, 343-353].
В качестве последовательностей, обеспечивающих эффективную трансформацию и автономную репликацию, используют HARS1, HARS2, HARS3, HARS 36 [Mol. Gen Genet., 1986, 202, 302-308; Yeast, 1995, 11, 343-353; Journal of Bacteriology, 1996, 178 (15), 4420-4428].
В качестве плечей для гомологичной интеграции используют, например, последовательности генов МОХ, TRP, URA3, LEU2, GAP, кластер генов для рибосомальной ДНК, HARS, АМО, TEF1 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей рода Ogataea.
Синтетический ген MANS размером 1032 п.н. с проведенной нами оптимизацией кодонов для метилотрофных дрожжей синтезирован в компании ООО «Иннова плюс» (Санкт-Петербург) по заказу НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика. Ген MANS кодирует белок ManS, который по последовательности аминокислот наиболее близок к β-маннаназам из бактерий рода Bacillus subtilis. β-Маннаназа ManS идентична β-маннаназам из Bacillus subtilis MAFIC-S11, Bacillus subtilis WL-7, Bacillus subtilis 168 на 97.4-97.7% на основании анализа, проведенного с использованием программы BLAST.
Изобретение проиллюстрировано следующей фигурой.
Фиг. 1. Экспрессионная кассета.
Пример 1. Конструирование штамма дрожжей Ogataea haglerorum, содержащего оптимизированный ген, кодирующий β-маннаназу из Bacillus subtilis.
Для трансформации штамма Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584 используют экспрессионную кассету с геном MANS (фиг. 1).
При конструировании плазмиды, содержащей экспрессионную кассету с геном MANS, используют экспрессионный вектор pMOX-Km-HARS, 6967 п.н. [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56].
С матрицы амплифицируют ген MANS методом ПЦР с использованием олигонуклеотидов manS-F и manS-R:
manS-F: 5'-ctgaattcagatctagatctgaagctcac-3',
manS-R: 5' -cagcggccgcttactactcaacgattggagtc-3'.
Амплификацию проводят в присутствии Кара-полимеразы (KapaBiosystems, США) при следующих условиях:
1 цикл: 98°С - 2 мин.
35 циклов: 98°С - 20 с, 53°С - 15 с, 72°С - 60 с
1 цикл: 72°С - 3 мин.
Полученную последовательность ДНК встраивают в состав экспрессионного вектора pMOX-Km-HARS по сайтам EcoRI и NotI и получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету (фиг. 1), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Синтетический ген MANS, встроенный в рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида MFα из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, транскрипция которого находится под контролем промотора рМОХ, наработанного с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546 (линия CBS4732);
2. Терминатор транскрипции tMOX, наработанный с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546;
3. Дрожжевой селективный маркер KmMX, фланкированный сайтами lox66 и lox71, транскрипция которого находится под контролем промотора pGAPD гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, наработанного с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546, и терминатора транскрипции tTEF. Маркер KmMX обеспечивает устойчивость дрожжей Ogataea haglerorum к антибиотику генетицину (G418);
4. Последовательность HARS, наработанная с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-916 (линия DL1) и обеспечивающая сохранение трансформируемой ДНК в клетках реципиентного штамма и являющаяся возможным местом интеграции;
5. Область интеграции - нуклеотидная последовательность 3'- области региона МОХ.
Экспрессионную кассету трансформируют в штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 6 ч до достижения культурой оптической плотности (OD600) 1,5. Клетки собирают центрифугированием (здесь и далее 6000 об/мин.) в течение 10 мин. при комнатной температуре, ресуспендируют в буфере TED состава: 100 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8.0, 25 мМ дитиотрейтола в 1 л воды SQ, инкубируют при 37°С в течение 15 мин. и собирают центрифугированием в течение 10 мин. при комнатной температуре. Далее клетки промывают дважды холодным буфером STM состава: 270 мМ сахароза, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ MgCl2 в 1 л воде SQ, собирают центрифугированием в течение 10 мин при температуре 5°С. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в холодном растворе STM в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 60 мкл клеточной суспензии переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 500 нг ДНК экспрессионной кассеты и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при 1500 В, 200 Ом, 25 uF. После электропорации к клеткам добавляют 1 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %), переносят клеточную суспензию в стерильные пробирки на 1,5 мл и инкубируют при 37°С в течение 60 мин. при качании.
Селекцию трансформантов проводят на агаризованной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (G418) в количестве 200 мкг/мл при температуре 37°С в течение 4-х суток.
Для отбора наиболее продуктивных трансформантов осуществляют их культивирование в пробирках в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Затем проводят индукцию метанолом, который добавляют дважды в количестве 3 об. % через 24 и 48 ч культивирования при 37°С на качалке (250 об/мин). Общее время культивирования 6 дней. В качестве контроля используют штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584.
Активность маннаназы в культуральной жидкости (КЖ) определяют методом ДНС с использованием динитросалициловой кислоты [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428], используя маннозу как стандарт. В качестве субстрата используют галактоманнан Locust bean gum (LBG, Sigma, США). Стандартная реакционная смесь состоит из 0,1 мл 1% раствора субстрата в 0,1М ацетатном буфере, рН 5,0 и 0,1 мл рабочего раствора анализируемого образца. Рабочий раствор анализируемого образца готовят из КЖ путем разведения ее дистиллированной водой таким образом, чтобы значение оптической плотности при длине волны 540 нм (OD540) находилось в пределах рабочей зоны градуировочного графика. Реакционную смесь инкубируют при 45°С в течение 10 мин, затем добавляют 0,3 мл раствора ДНС и инкубируют при 98°С в течение 5 мин. Оптическую плотность OD540 измеряют в плашке на 96 лунок на спектрофотометре Multiskan spectrum (Thermo scientific).
За единицу ферментативной активности маннаназы (1 ед.) принимают количество фермента, действующего на субстрат с высвобождением 1 μМ восстанавливающих сахаров (маннозы) за одну минуту.
По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант Т1, который при культивировании в пробирках синтезирует маннаназу в количестве 900 ед./мл.
Трансформант Т1 растят в неселективных условиях, в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %), в пробирках на качалке при 37°С в течение 24 ч, затем производят пять последовательных пересевов культуры из неселективньгх условий в пробирки со свежей средой YP с глюкозой (2 мас. %), культивируя каждый раз при тех же условиях, после чего рассевают культуру до отдельных колоний на чашки Петри с агаризованной неселективной средой YP с глюкозой (2 мас. %). С помощью репликатора отбирают 100 независимых колоний и анализируют их на способность расти на среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (200 мкг/мл) и контрольной среде - YP с глюкозой (2 мас. %). Появление отдельных колоний, не растущих на селективной среде с антибиотиком, указывает на то, что экспрессионная кассета содержится в клетках трансформанта Т1 в виде автономно-реплицирующейся ДНК.
Далее проводят селекцию на стабилизацию (многокопийную интеграцию) экспрессионной кассеты. Трансформант Т1 инкубируют в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Переносят 1/10 объема культуры в свежую жидкую среду YP с глюкозой (2 мас. %) и инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Затем 1/50 объема культуры переносят в колбу с 50 мл селективной среды YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (200 мкг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Рассевают культуру до отдельных колоний на чашки с селективной средой YP с глюкозой (2 мас. %) и разной концентрацией генетицина (200, 400 и 600 мкг/мл). Чашки инкубируют при 37°С в течение 3-х суток. Наблюдают появление гетерогенных по размеру колоний. Отбирают колонии крупного размера, которые анализируют на способность продуцировать β-маннаназу и на стабильность наследования признака - способности сохранять устойчивость к генетицину после продолжительного роста культуры в неселективных условиях.
Таким образом, отобран трансформант Ogataea haglerorum N107 с множественной интеграцией экспрессионной кассеты в состав хромосомы, способный к синтезу β-маннаназы.
Отобранный рекомбинантный штамм Ogataea haglerorum N107 является продуцентом β-маннаназы и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1) как Ogataea haglerorum N107 ВКПМ Y-4639.
Штамм характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:
При культивировании при температуре 37°С в течение 48 ч на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.
Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 0.5, ацетат натрия - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное при 25°С в течение 3-4 дней. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.
На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2, мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.
При росте в жидкой среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода -остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %), при 37°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.
Физиолого-биохимические признаки заявляемого штамма:
Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать глюкозу, глицерин, метанол, этанол, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу; не способен ассимилировать D-глюконат, L-арабинозу, сукцинат, лактозу, крахмал.
Штамм способен синтезировать β-маннаназу при культивировании в жидкой среде YP в присутствии глюкозы, биосинтез фермента усиливается при культивировании в присутствии метанола.
Пример 2. Получение β-маннаназы при культивировании штамма Ogataea haglerorum N107 в колбах
Посевную культуру готовят в пробирках в 5 мл среды YP с глюкозой (2 мас. %). Пробирки инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). В колбу на 0,75 л с 50 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %) переносят 5 мл посевной культуры и колбу инкубируют при 37°С на качалке (250 об/мин.) в течение 6 дней. Метанол (3 об. %) добавляют к культуре через 24 и 48 часов культивирования. Биомассу отделяют центрифугированием в течение 15 мин.
Культуральную жидкость без биомассы (КЖ) используют для определения активности β-маннаназы по методу ДНС и определения количества секретируемого белка по методу Бредфорд с использованием кита Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США).
Рекомбинантный штамм продуцирует белок в количестве 1.0±0.2 мг/мл, активность фермента β-маннаназы составляет 12000±500 ед./мл.
Пример 3. Характеристика рекомбинантной β-маннаназы
Для определения оптимального значения рН для функционирования фермента активность β-маннаназы по отношению к субстрату LBG (галактоманнан Locust bean gum, Sigma, США) измеряют в диапазоне значений рН 1.0-10.0 с использованием 0.1М растворов цитратного (рН 1.0-3.0), ацетатного (рН 4.0-5.0), фосфатного (рН 6.0-8.0) и боратного (рН 9.0-10.0) буферов. Реакцию проводят при температуре 45°С в течение 10 мин. Относительную активность рассчитывают, как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех независимых реакциях в диапазоне значений рН 1.0-10.0. Значения рН 5.0-6.0 являются оптимальными для функционирования β-маннаназы, синтезированной дрожжами Ogataea haglerorum, которые содержат ген MANS.
Стабильность полученной β-маннаназы при разных рН определяют путем измерения остаточной активности (в %) после инкубации фермента в течение 24 ч при температуре 35°С в 0,1М буферных растворах с рН 1.0-10.0. Реакцию с субстратом LBG проводят при рН 5.0 и температуре 45°С в течение 10 мин. Остаточную активность (стабильность фермента) рассчитывают, как процент от активности образца фермента (хранится при +5°С в холодильнике), измеренной в 0,1М ацетатном буфере (рН 5,0) и температуре 45°С.
Установлено, что фермент стабилен при значениях рН от 5.0 до 10.0 (сохраняет более 90% активности). В кислой области рН от 1.0 до 3.0 фермент сохраняет около 30% активности, при рН 4.0-75% активности.
Для определения температурного профиля активности фермента β-маннаназы проводят реакции образцов с субстратом LBG в 0.1М ацетатном буфере (рН 5.0) в диапазоне температур от 25 до 80°С с шагом 5°С. Относительную активность рассчитывают, как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех реакциях в диапазоне значений температур от 25 до 80°С.
Установлено, что фермент проявляет максимальную активность при температуре 55°С. В интервале температур 35-45°С (температура тела животного) фермент сохраняет 45-65% активности. При температурах выше 65°С активность фермента значительно падает.
Перед определением термостабильности β-маннаназы образцы выдерживают в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.0) при температурах от 25°С до 60°С с шагом 5°С в течение 24 ч. Реакцию с субстратом проводят при температуре 45°С в течение 10 мин. Остаточную активность (стабильность фермента) рассчитывают, как процент от наибольшей активности фермента.
Установлено, что фермент проявляет высокую стабильность (сохраняет более 90% активности) в диапазоне температур 25-40°С, близкой к температуре желудочно-кишечного тракта животных.
Для определения молекулярного веса полученной β-маннаназы проводят электрофоретическое разделение белков из образца КЖ в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) в камере для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN Tetra Bio-Rad (Bio-Rad США). Для визуализации белков используют Кумасси бриллиантовый синий R250.
β-Маннаназа, синтезированная штаммом Ogataea haglerorum N107, имеет молекулярный вес 40 кДа.
Пример 4. Получение β-маннаназы при культивировании штамма Ogataea haglerorum N107 в ферментере
Из суточной биомассы штамма Ogataea haglerorum N107 с чашки Петри со средой YP с глюкозой (2 мас. %) готовят суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде, определяют оптическую плотность клеточной суспензии (OD600). В качал очные колбы объемом 750 мл с рабочим объемом 110 мл жидкой посевной среды YP с глюкозой (2 мас. %) вносят суспензию клеток до получения OD600 равной 0.1. Колбы инкубируют при температуре 37°С на качалке при 220 об/мин. до достижения культурой оптической плотности равной 12.
Основную ферментацию проводят в ферментере КФ-103 (ООО-фирма «Проинтех») объемом 3 л на питательной среде состава (табл. 1).
Раствор микроэлементов РТМ1 имеет состав (табл. 2).
Исходный объем жидкости в ферментере составляет 1 л. Культивирование проводят при следующих параметрах: температура 37°С; начальное перемешивание 500 об/мин., аэрация 1.0 л/мин., рН 4.6 поддерживается титрованием 25% водным раствором аммиака. Значение pO2 поддерживают на уровне 20.0% (от насыщения среды воздухом) с использованием каскадной регулировки скорости вращения мешалки.
В рабочий ферментер вносят культуру, выращенную на качалке в колбах, до стартового значения оптической плотности равной 1.8. Наращивание биомассы осуществляют в два этапа. На первом этапе проводят рост биомассы на глюкозе, введенной в ферментер с начальной средой (16 часов). На втором этапе производят наращивание биомассы путем подачи в ферментер глюкозной подпитки состава (мас. %): глюкоза - 28.6, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.1 (об./об.), биотин - 0.0004, вода - остальное до значения сырого веса биомассы 18±1 (мас. %).
Далее в ферментер со скоростью 1,2 г/ч на л подается раствор метанольной подпитки состава (мас. %): метанол - 95.9, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.4 об./об., биотин - 0.00054, вода - остальное. Индукция метанолом продолжается в течение 134 ч.
Во время культивирования отбирают образцы КЖ для определения активности маннаназы при рН 5.0 и температуре 55°С по методу ДНС [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428]. Концентрацию белка в отобранных образцах КЖ определяют по методу Бредфорд с использованием кита Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США). Результаты приведены в табл. 3
Таким образом, при культивировании в 3-х литровом ферментере штамм Ogataea haglerorum N107 ВКПМ Y-4639 продуцирует 4.25 мг/мл белка, при этом активность β-маннаназы через 160 ч культивирования при 37°С составляет 51066 ед./мл КЖ.
Заявляемый штамм по своим биотехнологическим показателям сравним с лучшими зарубежными штаммами - продуцентами β-маннаназы.
Claims (1)
- Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum ВКПМ Y-4639, содержащий в составе хромосомы оптимизированную последовательность гена, кодирующего β-маннаназу ЕС 3.2.1.78 Bacillus subtilis, - продуцент β-маннаназы.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020120291A RU2747782C1 (ru) | 2020-06-18 | 2020-06-18 | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020120291A RU2747782C1 (ru) | 2020-06-18 | 2020-06-18 | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2747782C1 true RU2747782C1 (ru) | 2021-05-14 |
Family
ID=75919853
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020120291A RU2747782C1 (ru) | 2020-06-18 | 2020-06-18 | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2747782C1 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110093331A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-06 | 武汉轻工大学 | 一种高产的耐高温宽pH稳定性的甘露聚糖酶ManGold及基因与应用 |
-
2020
- 2020-06-18 RU RU2020120291A patent/RU2747782C1/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110093331A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-06 | 武汉轻工大学 | 一种高产的耐高温宽pH稳定性的甘露聚糖酶ManGold及基因与应用 |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
IntEnz Enzyme Nomenclature EC 3.2.1.25. Найдено онлайн:. https://www.ebi.ac.uk/intenz/query?q=3.2.1.25&submit=1. Дата обращения 27.12.2020. * |
IntEnz Enzyme Nomenclature EC 3.2.1.78. Найдено онлайн: https://www.ebi.ac.uk/intenz/query?q=3.2.1.78&submit=1. Дата обращения 27.12.2020. * |
LV J. et al. Cloning, expression, and characterization of β-mannanase from Bacillus subtilis MAFIC-S11 in Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol. 2013 Apr;169(8):2326-40. * |
LV J. et al. Cloning, expression, and characterization of β-mannanase from Bacillus subtilis MAFIC-S11 in Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol. 2013 Apr;169(8):2326-40. база данных GenBank: * |
NAUMOV G., NAUMOVA E. Ogataea haglerorum sp. Nov., a novel member of the species complex, Ogataea (Hansenula) polymorpha. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2017, 67:2465-2469. * |
база данных GenBank: AY601725.1, 22.05.2004. Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY601725.1. Дата обращения 27.12.2020. * |
Найдено онлайн: https://www.ebi.ac.uk/intenz/query?q=3.2.1.78&submit=1. Дата обращения 27.12.2020. NAUMOV G., NAUMOVA E. Ogataea haglerorum sp. Nov., a novel member of the species complex, Ogataea (Hansenula) polymorpha. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2017, 67:2465-2469. ТАРУТИНА М.Г. и др. Сравнительная характеристика фитаз из Citrobacter freundii и Yersinia intermedia, экспрессированных в метилотрофных дрожжах Ogataea polymorpha и Pichia pastoris. Биотехнология, 2019, Т. 35, N 6, С. 51-56. * |
Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY601725.1. Дата обращения 27.12.2020. IntEnz Enzyme Nomenclature * |
Найдено онлайн:. https://www.ebi.ac.uk/intenz/query?q=3.2.1.25&submit=1. Дата обращения 27.12.2020. IntEnz Enzyme Nomenclature * |
ТАРУТИНА М.Г. и др. Сравнительная характеристика фитаз из Citrobacter freundii и Yersinia intermedia, экспрессированных в метилотрофных дрожжах Ogataea polymorpha и Pichia pastoris. Биотехнология, 2019, Т. 35, N 6, С. 51-56 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2408910B1 (en) | Chrysosporium lucknowense protein production system | |
CN102517304B (zh) | 重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用 | |
KR20010103596A (ko) | 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서 | |
KR20190069014A (ko) | 활성이 개선된 자일라나제 변이체 및 이의 생산방법 | |
CN108048473B (zh) | 一种阿魏酸酯酶基因、基因工程菌株以及制备方法和用途 | |
RU2701308C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы | |
RU2701642C1 (ru) | Штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы | |
RU2747782C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis | |
CN109295031A (zh) | 一种抗真菌蛋白β-1,3-葡聚糖酶和含有该基因的工程菌及其应用 | |
RU2764793C1 (ru) | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу, содержащий в составе хромосомы синтетический ген MANS | |
KR101106061B1 (ko) | 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합 벡터 및 그 형질 전환체 | |
RU2736441C1 (ru) | Штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующий бета-глюканазу из Bacillus pumilus и бета-глюканазу из Paenibacillus jamilae | |
RU2736440C1 (ru) | Дрожжи Komagataella kurtzmanii - рекомбинантный продуцент бета-глюканазы | |
RU2701494C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент бета-глюканазы | |
RU2730577C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii - продуцент бета-глюканазы из Paenibacillus jamilae | |
RU2725475C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы из Pyromyces finnis | |
RU2728243C1 (ru) | Штамм дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу из Paenibacillus brasilensis | |
RU2771079C1 (ru) | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | |
WO2012060389A1 (ja) | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法 | |
KR101412468B1 (ko) | 활성이 증진된 변이 베타-글루코시다제 및 이를 이용한 바이오 에탄올의 제조방법 | |
RU2288267C2 (ru) | Способ получения кормового комплексного ферментного препарата (варианты) и штамм penicillium canescens (варианты) | |
RU2720914C1 (ru) | Трансформант дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий бета-глюканазу | |
RU2238974C2 (ru) | Фрагмент днк мицелиального гриба penicillium verruculosum, кодирующий синтез секретируемой эндоглюканазы iii и группа штаммов penicillium canescens, синтезирующих эндоглюканазу iii penicillium verruculosum, сконструированных методами трансформации и генетической инженерии на основе этого фрагмента днк | |
CN117568314B (zh) | 一种高稳定性葡聚糖酶突变体及其应用 | |
RU2701640C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii - продуцент бета-глюканазы |