JP2006025701A - 高活性耐熱性キチナーゼ及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】触媒活性ドメインが(1)特定の配列からなるアミノ酸配列、又は(2)特定の配列からなるアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキチナーゼであって、該触媒活性ドメインに直接又は連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする、キチナーゼ。並びに、(3)特定の塩基配列からなるDNA、又は(4)特定の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAからなるDNA。
【選択図】なし
Description
β-1,4結合した多糖類である。近年、その脱アセチル化体であるキトサンとともに多様な分野で用途開発が進展している(例えば、非特許文献1参照)。
端側にある触媒活性ドメインを「AD1」、3’末端側にある触媒活性ドメインを「AD2」と記す)と、2つのキチン結合ドメイン(以下、AD1の5’末端側にあるキチン結合ドメインを「CBD1」、AD2の5’末端側にあるキチン結合ドメインを「CBD2」と記す)がコードされていることが明らかにされている。この塩基配列から1004番目のアデニンを除いた塩基配列(配列番号1)を使用することにより、N末端側からCBD1、AD1、CBD2及びAD2を含むポリペプチド(分子量116kDa;以下、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼという)(配列番号2)が翻訳されることは既に報告さ
れている(非特許文献5)(図1参照)。
であり、産業用酵素としての価値は低かった。また、非特許文献4には、CBD1とAD1を有するペプチド、及びAD2を有するペプチドのキチナーゼ活性が報告されているが、これらのキチナーゼ活性はいずれも低く、産業用酵素として実用できるものではない。このように、配列番号1にコードされているキチナーゼの触媒活性ドメインであるAD1やAD2を利用した酵素で、実用レベルにあるキチナーゼ活性を示すものは、未だ取得されていないのが現状である。
ついては報告されておらず、まして、キチナーゼの触媒活性ドメインAD2を如何なるアミノ酸配列と組み合わせれば、酵素のキチナーゼ活性を向上できるかについては一切知られていない。
ロバータス・ジェイエヌ(Robertus JN)及びハート・ジェイ(Hart J.)著、サドラー・ジェイエヌ(Saddler JN)及びペナー・エムエイチ(Penner MH)編集、スリー・ディメンショナル・ストラクチャー・オブ・アン・エンドキチナーゼ・フロム・バーレイ(Three-Dimensional Structure of an Endochitinase from Barley.), エンザイマティック・ディグラデーション・オブ・インソルブル・カルボハイドレーツ(Enzymatic degradation of Insoluble Carbohydrates.)、「アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(American Chemical Society)」、ワシントン・ディー・シー(Washington, DC)、1995年、第5章(Chap.5) ヤブキ・エム(Yabuki M),ヤブキ・ワイ(Yabuki Y),ヤナイ・イー(Yanai E),アンドウ・エー(Ando A),及びフジイ・ティー(Fujii T)著、アイソレーション・アンド・キャラクタライゼーション・オブ・キチノリティック・バクテリウム:アエロモナス・ハイドロフィラ(Isolation and characterization of chitinolytic bacterium: Aeromonas hydrophila)、日本、「テクニカル・ブレチン・オブ・ファカルティ・オブ・ホーティカルチャー,千葉大学(Technical Bulletin of Faculty of Horticulture, Chiba University)」、1983年、32巻、p.51 フランコフスキー・ジェイ(Frankowski J),ロリト・エム(Lorito M),スカラ・エフ(Scala F),シュミット・アール(Schmid R),バーグ・ジー(Berg G),及びバール・エイチ(Bahl H)著、ピューリファイケーション・アンド・プロパティーズ・オブ・トゥー・キチノリティック・エンザイムズ・オブ・セラティア・プリムチカ・HRO-C48(Purification and properties of two chitinolytic enzymes of Serratia plymuthica HRO-C48)、「アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジー(Archives of Microbiology)」、2001年、176巻、p.421-426 ガオ・ジェイ(Gao J.),バウア・エム・ダブル(Bauer M. W.),ショックリー・ケイ・アール(Shockley K. R.),ピィズ・エム・エー(Pysz M. A.),及びケリー・アール・エム(Kelly R.M.)著、グロウス・オブ・ハイパーサーモフィリック・アーカエオン・パイロコッカス・フリオサス・オン・キチン・インボルブズ・トゥー・ファミリー・18キチナーゼズ(Growth of Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus on Chitin Involves Two Family 18 Chitinases)、「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー(Appl. Environ. Microbiol.)」、2003年、第69巻、p.3119-28 安藤進、東紀子、石川一彦、「Pyrococcus furiosus 由来の耐熱性キチナーゼ」、日本農芸化学会大会講演要旨集(2003年、横浜)、2A08a10, p26
ている2つの触媒活性ドメインAD1及びAD2の内、3’末端側にコードされている触媒活性ドメインAD2を用いて、この触媒活性ドメインAD2にキチン結合ドメインを連結してなるポリペプチドを調製することによって、キチナーゼ活性が顕著に向上されており、高温下で安定であるキチナーゼが得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
項1. 触媒活性ドメインが(1)配列番号3に示すアミノ酸配列、又は(2)配列番号3に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキチナーゼであって、該触媒活性ドメインに直接又は連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする、キチナーゼ。
項2. 触媒活性ドメインに連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されている、項1に記載のキチナーゼ。
項3. キチン結合ドメインが、(3)配列番号4又は5に示すアミノ酸配列、又は(4)配列番号4又は5に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、項1又は2に記載のキチナーゼ。
項4. 連結領域が、(5)配列番号6又は7に示すアミノ酸配列、又は(6)配列番号6又は7に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、項1乃至3のいずれかに記載のキチナーゼ。
項5. 下記(7)又は(8)のアミノ酸配列からなる、項1乃至4のいずれかに記載キチナーゼ:
(7)配列番号8に示すアミノ酸配列、又は
(8)配列番号8に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されているアミノ酸配列。
項6. 項1乃至5のいずれかに記載のキチナーゼをコードするDNA。
項7. 触媒活性ドメインをコードするDNA領域が、
(9)配列番号3に示す塩基配列からなるDNA、又は
(10)配列番号3に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
を含む、項6に記載のDNA。
項8. キチン結合ドメインをコードするDNA領域が、(11)配列番号10又は11に示す塩基配列からなるDNA、又は(12)配列番号10又は11に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、キチンと結合するポリペプチドをコードするDNAを含む、項6又は7に記載のDNA。
項9. 以下の(13)又は(14)のDNAである、項6乃至8のいずれかに記載のDNA:
(13)配列番号14に示す塩基配列からなるDNA、
(14)配列番号14に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAからなるDNA。
項10. 項6乃至9のいずれかに記載のDNAを含有する組換えベクター。
項11. 項10に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
項12. 項11に記載の形質転換体を培養し、培養物からキチナーゼを採取することを特徴とする、キチナーゼの製造方法。
キチナーゼ
キチナーゼとは、キチンのβ−1,4結合を加水分解してN−アセチルグルコサミンを生成する酵素である。本発明において、キチナーゼの活性測定は、以下の方法に従って行われる。
(キチナーゼ活性測定法)カニ由来の微粉末結晶性キチンを5mgをチューブに入れ、これに活性測定対象のキチナーゼを適当量(例えば、0.01〜10μg)加え、緩衝液A(25mM Tris-HCl [pH7.5], 1mM EDTA, 25mM NaCl)で全量を500μlにする。これよく
懸濁した後、85℃に加温し、10分おきにサンプリングを行い、キチナーゼ反応によりキチンから遊離したN−アセチルグルコサミンの2量体を、モルガン−エルソン法によりN−アセチルグルコサミンにまで加水分解してN−アセチルグルコサミンを定量する。反応の初速から、キチナーゼ活性(測定対象のキチナーゼ1mg当たり、1分間にキチンから遊離するN-アセチルグルコサミン量;μmol/min.mg)を求める。
領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする。
(配列番号2)の第772〜1060位に位置している3’末端側の触媒活性ドメインAD2に相当する。
ている5’末端側の触媒活性ドメイン]を含まないものである。つまり、本発明のキチナーゼにおいて、触媒活性ドメインは上記アミノ酸配列単独から構成されるものであり、本発明のキチナーゼには、他のアミノ酸配列からなる触媒活性ドメインは含まない。
ミノ酸配列、又は(4)配列番号4又は5に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列であって、キチンに対して結合可能であるアミノ酸配列、を含む配列からなるものが例示される。配列番号4に示されるアミノ酸配列は、配列番号1で示される塩基配列の第1861〜2103位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ(配列番号2)の第62
1〜701位に位置しているキチン結合ドメインCBD2である。また、配列番号5に示されるアミノ酸配列は、配列番号1で示される塩基配列の第208〜390位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ(配列番号2)の
第70〜130位に位置しているキチン結合ドメインCBD1である。
望ましく、これによってキチナーゼ活性を一層効果的に向上させることができる。
配列番号6に示されるアミノ酸配列は、配列番号1で示される塩基配列の第1618〜1860位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナー
ゼ(配列番号2)の第540〜620位に位置している「AD1とCBD1とを連結している領域」のアミノ酸配列である。また、配列番号7に示されるアミノ酸配列は、配列番号1で示される塩基配列の第2104〜2313位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ(配列番号2)の第702〜771位に位置
している「AD2とCBD2とを連結している領域」のアミノ酸配列である。
からなるポリペプチド、又は(8)配列番号8に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであってキチナーゼ活性を有するものが例示される。当該キチナーゼには、N末端側に、DNAの翻訳開始部分に相当する1又は複数のアミノ酸(例えば、MAS等;M、A、Sはアミノ酸の一文字表記を示す)を有しているものが包含される。配列番号8で示されるアミノ酸配列は、配列番号1で示される塩基配列の第1846〜3225位にコードされているアミノ酸配列であり、Pyrococcus furiosusの全長キチナーゼ(配列番号2)の第616〜
1075位に位置しているアミノ酸配列に相当する。また、当該配列番号8で示されるアミノ酸配列は、N末端側から、配列番号4で示されるアミノ酸配列(キチン結合ドメインCBD2)、配列番号7で示されるアミノ酸配列(連結領域)、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列(触媒活性ドメイン)が結合されてなるポリペプチドである。即ち、当該
配列番号8のアミノ酸配列の第6〜86位のアミノ酸配列、第87〜156位のアミノ酸配列、及び第157〜445位のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号4で示されるアミノ酸配列、配列番号7で示されるアミノ酸配列、及び配列番号3で示されるアミノ酸配列に相当する。
上記キチナーゼをコードしているDNAは、通常の遺伝子工学的手法により、又はこれに化学合成による手法を組み合わせることにより、得ることができる。
る方法)により行なうことができる。
たゲノムDNAを適当な制限酵素で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムDNAライブラリーを作製する。次いで、例えば、触媒活性ドメインの部分アミノ酸配列に対応した合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法、触媒活性ドメインに対する抗体を用いた免疫学的方法等によって、上記触媒活性ドメインをコードしている遺伝子を取得することができる。
ダイゼーション溶液中であれば42℃で行う条件が挙げられる。詳しくは、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第2版第2巻に記載のサザンハイブリダイゼーションに用いられる条件が挙げられる。
る。得られたゲノムDNAを適当な制限酵素で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムDNAライブラリーを作製する。次いで、例えば、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域の部分アミノ酸配列に対応した合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域に対する抗体を用いた免疫学的方法、キチンに対する結合能を測定する方法等によって、上記キチン結合ドメイン又は上記連結領域をコードしているDNAを取得することができる。
直接得ることもできる。具体的には、Pyrococcus furiosusのゲノムDNAを適当な制限
酵素(例えば、NheI及びXhoI)で切断し、同一の制限酵素又は共通の切断末端を与える制限酵素で切断したプラスミド又はファージにリガーゼ等を用いて連結することによりゲノムDNAライブラリーを作製する。次いで、例えば、上記キチナーゼの部分アミノ酸配列に対応した合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法、上記キチナーゼに対する抗体を用いた免疫学的方法等によって、上記キチナーゼをコードしているDNAを取得することができる。
基配列(配列番号1)の第1846〜3228位に存する塩基配列であり、配列番号8に示すアミノ酸配列をコードしているものである。当該DNAには、5’末端にDNA翻訳
開始部分(例えば、ATGGCTAGC等)が付与されたものも包含する。
上記キチナーゼをコードする遺伝子を適当なベクターに連結することによって、該遺伝子を含有する組換えベクターを得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主においてキチナーゼを発現させ得るものであれば、特に制限されない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等のベクターを用いることができる。具体的には、大腸菌ベクターのpBR322、pUC19、pKK233-2、pET11a等、バチルス属細菌ベクターのpUB110
、pC194、pE194、pTHT15、pBD16等、酵母用ベクターYip5、Yrp17、Yep24等、動物細胞用
ベクターのpcDNA、pBAC等を例示できる。
上記組換えベクターを用いて、宿主を形質転換することによって、該組換えベクターを含む形質転換体を得ることができる。宿主としては、上記キチナーゼを生産可能なものであれば、真核生物及び原核生物のいずれを用いることもできる。例えば、大腸菌等の細菌、酵母、糸状菌、動物細胞等を挙げることができる。形質転換は、宿主の種類に応じて、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主として細菌を使用する場合であれば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いることができる。
上記形質転換体を培養し、培養物からキチナーゼを採取することによって、上記キチナーゼを取得することができる。
サミンの2量体として存在する。
実施例1 キチナーゼの製造
<Pyrpcoccus furiosusの培養>
13.5gの食塩、4gのNa2SO4、0.7gのKCl、0.2gのNaHCO3、0.1gのKBr、30mgのH3BO3、10g
のMgCl2・6H2O、1.5gのCaCl2、25mgのSrCl2、1.0mlのレザスリン溶液(0.2g/L)、1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプトンを1Lの超純水に溶かし、この溶液のpHを6.8に調整し、
加圧殺菌することにより培地を作成した。
嫌気性となったか否かはNa2S溶液を加えて、培養液中でNa2Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を95℃で2〜4日培養し、その後、遠心分離により集菌した。
培養終了後、5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌し、菌体を10mM Tris(pH 7.5)-1mM EDTA溶液で2回洗浄した後、InCert Agarose(FMC社製)ブロック中に封入した
。このブロックを1%N-lauroylsarcosine-1mg/ml プロテアーゼK溶液中で処理することに
より、ゲノムDNAがAgaroseブロック中に分離調製された。
Pyrpcoccus furiosusのゲノムDNAを鋳型として、プライマーGG GCT AGC ACT ACC CCT GTC CCA GTC TCA GG及びプライマーGG CTC GAG TTA TGT TGG AAC ACT AGC TTC GCを使
用して、PCR反応により配列番号14に示す塩基配列からなるDNAを増幅させた。PCR反応後、DNAを制限酵素NdeI及びXhoIで完全分解(37℃で2時間)した。
発現ベクターのpET21d(Novagen社製)を制限酵素NdeI及びXhoIで切断し、精製した。
次いで、上記のキチナーゼ遺伝子を含むDNA断片をT4DNAリガーゼ(宝酒造社製)を用
いて16℃で、16時間反応させることにより上記発現ベクターに連結した。得られたベクターを用いて、大腸菌(E. coli JM109株)(東洋紡績社製)を形質転換した。形質転換
体は、(0.05 mg/ml アンピシリン)を含むLB寒天プレート上でのコロニー形成を指標
に選択した。得られた形質転換体からキチナーゼをコードするDNAを含むプラスミドをアルカリ法で抽出した。
本キチナーゼをコードするDNAが組み込まれたプラスミドを保持している大腸菌をLB培地(1L中にポリペプトン10g、酵母エキストラクト5g、塩化ナトリウム10gを含む)を用いて37℃で振とう培養し、対数増殖期中(600nmにおける光学密度0.2〜0.4)にイソプロピルβチオガラクトピラノシド(IPTG)を培地中の最終濃度が0.2mMになるように添加した。そのまま培養を一晩継続し、その後遠心分離(6000×gで7分間)によって大腸菌の細胞を回収した。
3000×gで15分間)によって上清を回収した。
硫酸アンモニウムを除去した。キチナーゼタンパク質が溶出した画分を回収し、CentriPrep YM-10(アミコン社製)で濃縮した。得られた画分には、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれており、均一標品は、配列番号8で示されるアミノ酸配列のN末端側にMet-Ala-Serが付与されているポリペプチドからな
るキチナーゼであった。
上記実施例で得られたキチナーゼの他、下記キチナーゼをそれぞれ常法に従って調製し、これらのキチナーゼについて結晶性キチン及びコロイダルキチンに対するキチナーゼ活性を前記方法に従って測定した。
比較例2)、AD1単独からなるキチナーゼ(比較例3)、及びAD2単独からなるキチナーゼ(比較例4)では、結晶性キチン及びコロイダルキチンに対する分解作用が低かったが、AD2にキチン結合ドメインを連結させてなる本発明のキチナーゼは、結晶性キチン及びコロイダルキチンに対する優れた加水分解作用を示した。この結果から、AD2にキチン結合ドメインを連結させることにより、AD2のキチナーゼ触媒活性を顕著に向上させることができることが明らかとなった。
Claims (12)
- 触媒活性ドメインが(1)配列番号3に示すアミノ酸配列、又は(2)配列番号3に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるキチナーゼであって、該触媒活性ドメインに直接又は連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されていることを特徴とする、キチナーゼ。
- 触媒活性ドメインに連結領域を介してキチン結合ドメインが連結されている、請求項1に記載のキチナーゼ。
- キチン結合ドメインが、(3)配列番号4又は5に示すアミノ酸配列、又は(4)配列番号4又は5に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、請求項1又は2に記載のキチナーゼ。
- 連結領域が、(5)配列番号6又は7に示すアミノ酸配列、又は(6)配列番号6又は7に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む配列からなる、請求項1乃至3のいずれかに記載のキチナーゼ。
- 下記(7)又は(8)のアミノ酸配列からなる、請求項1乃至4のいずれかに記載キチナーゼ:
(7)配列番号8に示すアミノ酸配列、又は
(8)配列番号8に示すアミノ酸配列の1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されているアミノ酸配列。 - 請求項1乃至5のいずれかに記載のキチナーゼをコードするDNA。
- 触媒活性ドメインをコードするDNA領域が、
(9)配列番号3に示す塩基配列からなるDNA、又は
(10)配列番号3に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
を含む、請求項6に記載のDNA。 - キチン結合ドメインをコードするDNA領域が、(11)配列番号10又は11に示す塩基配列からなるDNA、又は(12)配列番号10又は11に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、キチンと結合するポリペプチドをコードするDNAを含む、請求項6又は7に記載のDNA。
- 以下の(13)又は(14)のDNAである、請求項6乃至8のいずれかに記載のDNA:
(13)配列番号14に示す塩基配列からなるDNA、
(14)配列番号14に示す塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、キチナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAからなるDNA。 - 請求項6乃至9のいずれかに記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項10に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項11に記載の形質転換体を培養し、培養物からキチナーゼを採取することを特徴とする、キチナーゼの製造方法。
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