JP2006262702A - キチン結合ドメインの結晶と構造情報 - Google Patents
キチン結合ドメインの結晶と構造情報 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006262702A JP2006262702A JP2005080788A JP2005080788A JP2006262702A JP 2006262702 A JP2006262702 A JP 2006262702A JP 2005080788 A JP2005080788 A JP 2005080788A JP 2005080788 A JP2005080788 A JP 2005080788A JP 2006262702 A JP2006262702 A JP 2006262702A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chitin
- crystal
- trp
- binding domain
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】キチン結合ドメインの結晶であって、単位格子定数が、a=b=48.8Å、c=85.0Åであるキチン結合ドメインの結晶。
【選択図】図1
Description
メイン(以下ChBDと略すことがある)を単離、精製し、結晶化に成功した。さらに、溶液中での立体構造をNMRで、結晶中での立体構造をX線結晶解析で決定し、結晶中と溶液中で立体構造が同一であること、すなわち、その立体構造が溶液中でのキチン認識に重要である事を明らかにした。さらに、キチン結合に重要なアミノ酸残基を特定し、その立体配置を明らかにした。
1. キチン結合ドメインの結晶であって、単位格子定数が、a=b=48.8Å、c=85.0Åであるキチン結合ドメインの結晶。
2. 下記のいずれかのポリペプチド
(1) 配列番号1のSer266からIle358位の93アミノ酸からなるポリペプチド
(2) 配列番号1のSer266からIle358位の93アミノ酸において、1または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、Trp274、Trp308、Trp326に対応するアミノ酸は不変であり、かつ、キチン結合ドメイン活性を有するポリペプチド、
3. 以下のいずれかを含むDNA:
(1) 配列番号2の1〜279番目の核酸配列に対応するDNA;
(2)上記(1)の相補鎖、
(3) 配列番号2の1〜279に対応するDNAにストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ、Trp274、Trp308、Trp326に対応するヌクレオチドがトリプトファンをコードするDNA。
ゼのキチン結合ドメインである。本発明で得られたキチン結合ドメインの結晶構造などの構造情報は、Pyrococcus furiosusなどの耐熱性古細菌由来のキチナーゼのキチン結合ド
メインに好適に適用できるが、他の微生物、植物、動物由来のキチナーゼにも有用である。
下した。従って、キチン結合能を向上した変異型ドメインを製造する場合、Trp274、Trp308、Trp326は維持するのが望ましい。変異型キチン結合ドメインの固体キチンに対する結合能が向上すると、固体キチンをそのまま分解することができ、キトサン等の有用物質の製造に非常に有利である。
Acids Res., 12, 9441 (1984))などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段(例えばDNA合成機を使用する)(J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967);同 91, 3350 (1969);Science, 150, 178 (1968);Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981))などが挙げられる。コドンの選択は、宿主のコドンユーセージを考慮して決定できる。
実施例1
(1)実験方法
サンプル調整
・ChBDに対応する遺伝子の増幅
キチン結合ドメインと推定されるポリペプチド(当該遺伝子中アミノ酸番号では258番
のスレオニンから358番のイソロイシンに対応)を大腸菌内で大量に発現させるために、PreScission Protease認識配列をコードする塩基配列を含む合成DNAを用いPCR法により増幅した。発現ベクターへの組み込みはLICクローニングキット(NOVAGEN社)を用い大腸菌(XL-1Blue)(NOVAGEN社)に形質転換し、ChBD発現ベクターを作成した。
形質転換体は、(0.05 mg/ml アンピシリン)を含むLB寒天プレート上でのコロニー形成
を指標に選択した。形質転換体からChBD遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
・ChBD遺伝子を含有する形質転換体の作製
1.5ml容チューブ内に、大腸菌(E. coli )Rosetta (DE3)株( Novagen社製)のコンピテントセル0.04ml(2,000,0000cfu/mg)と、上記調製したChBD遺伝子含有プラスミドDNA溶液0.003ml(プラスミドDNA 8.4ng)を加え氷中に30分間放置した後、42℃で30秒間ヒ
ートショックを与えた。次いで、チューブ内にSOCmedium を0.25ml加え、37℃で1時
間振とう培養した。次いで、アンピシリンを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
・ChBDの精製
得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地に接種し、600nmにおける吸光度が0.5に達するまで、37℃で培養した後、ChBDの発現量を高めるためにIPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を加えさらに19時間培養した。培養液を8,000rpmで10min遠心分離することにより集菌した。集菌した菌体10gに、BugBuster溶液(NOVAGEN社
)100mlを加え、菌体を90Wの出力で30分間超音波破砕した。破砕した菌液を 15,000rpmで30分間遠心分離し、上清を採取した。同緩衝液で平衡化した金属キレートカラムHiTrap−Cleating(アマシャム バイオサイエンス社製)カラム(事前に100mM NiCl2を添加しNiを結合)を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。溶出は0.5Mイミダゾールを含む25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、 500mM NaCl(pH8.5)の直
線グラジエントを用いた。得られた目的分画にPreScission Protease (アマシャム
バイオサイエンス社)を添加し、透析チューブ(分画サイズMw.3500)に入れ、25mMトリスヒドロキシメチルアミン、25mM NaCl (pH8.5)溶液で4℃、16時間、透析をおこなった。
透析終了後、再び、25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、25mM NaCl(pH8.5)溶液で平衡化した金属キレートカラムHiTrap−Cleating(アマシャム バイオサイエ
ンス社)カラム(事前に100mM NiCl2を添加しNiを結合)に添加し、カラムを素通りした分画を回収し、25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン, 25mM NaCl(pH8.5)緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂のHiTrapQ(アマシャム バイオサイエンス社)カラムに回収した分画を添加し、イオン交換クロマトグラフィーを行った。目的タンパク質を含む分画にはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一
標品が含まれていた。
結晶化条件の検索
クリスタルスクリーニングKit(Hampton research社)に含まれている各種の結晶化剤のスクリーニングを行った。サンプル溶液1.5μl(1mM以上の蛋白質を含む25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、25mM NaCl (pH8.5))と結晶化剤1.5μlを混合
し、ハンギングドロップ法で結晶化条件を検索した。
NMRを用いた溶液中での立体構造
・多核多次元NMR測定のための安定同位体標識ChBDの調製
大腸菌(E. coli )BL21-pLys (DE3)株(Novagen社製)を用いた以外は「ChBD遺伝子を含有する形質転換体の作製」において記述した方法で形質転換体を作製した。また培養は液体培地を15N標識された塩化アンモニウム(1g/L)あるいは15N標識された塩化アンモニウム(1g/L)と13C標識されたグルコース(1g/L)を唯一の窒素源、あるいは炭素元とするM9最小培地を用いた。「ChBDの精製」の項で述べた同様の方法で発現と精製を行った。
・NMRを用いた溶液状態での構造解析
NMRの測定は20mMカリウムリン酸塩、25mM NaCl(pH5.6)の緩衝液で蛋白質濃度がおよそ1mMの溶液を用いた。
Bruker 社製DRX500, DRX600を用い1H-15N HSQC, 1H-13C HSQC, 3D 1H-15N TOCSY-HSQC、CBCACOHN, CBCANH, HNCO, CCONH, HCCONH, HCCH-TOCSY、同種核2次元NOESY, three-dimensional 、異種核1H-15N NOESY-HSQC, 1H-13C NOESY-HSQCの測定を行い、構造解析を行っ
た。スペクトルの解析にはSPARKYプログラムを用い、NMRスペクトルの解析から得られた2600の距離制限および120の角度制限の情報を用いXPLORプログラムを用い構造計算を行っ
た。
X線結晶解析を用いた結晶中での構造解析
X線回折データは播磨SPring-8のJupiter CCD detector を有するBL38B1ビームラインを使用した。回折像はHKL2000プログラムを用い解析を行った。上記NMRによって得られた
構造をモデルとし、MolRepプログラムを用いて分子置換法を行い、初期位相をつけた。
CNSプログラムによる構造精密化により結晶中でのChBDの構造を決定した。
NMRを用いた基質認識に関与するアミノ酸の同定
「多核多次元NMR測定のための安定同位体標識ChBDの調整」の項で述べた方法により調整
した15N安定同位体標識したChBD溶液(0.4mM蛋白質濃度、20mMカリウムリン酸塩、25mM
NaCl、pH 6.0)にhexa - N - acetylchitohexaose(6糖からなるキチン)を順次添加
し、15N-1H HSQCスペクトルを測定し、このスペクトル中に観測されるNMRシグナルの変
化を解析した。
部位特異的変異体の作成
「・ChBDに対応する遺伝子の増幅」で述べたChBD発現ベクターを鋳型としてQUICK-CHANGE MUTAGENESIS KIT(STARTAGENE社)を用い部位特異的変異体の作成を行った。プロトコールはキットに添付されているマニュアルに従った。作成した変異体はトリプトファン274番、トリプトファン308番、トリプトファン326番をそれぞれアラニン変換したものを作
製した(以下W274A、W308A、W326Aと略す)。変異体蛋白質の発現及び精製は「サンプル
調製」の項で述べた方法に準じて行った。
キチン粉末と変異体蛋白質の相互作用の解析
蟹の甲羅の微粉末(水に不溶性)1mgを20mMカリウムリン酸塩、25mM NaCl、pH 6.8、数μM〜数十μMの各変異体蛋白質を含む溶液に加え、1時間、室温で放置した。その後
、10000gで10分遠心することで、不溶性キチン及び不溶性キチンに結合した蛋白質を除
き、上澄みに残った蛋白質を定量し、上清に残った蛋白質濃度に対し、結合した蛋白質の量をプロットした。
結果と考察
蛋白質結晶化条件の検索と結晶学的パラメーターの解析
結晶化条件の検討を行ったところ、20%PEG8000,0.1M カコジル酸、pH6.5、0.2M
酢酸マグネシウム溶液を結晶化剤として用いたときに図-1に示す棒状の結晶を得た。
得られた結晶を用いX線結晶解析を行い、その結晶学的パラメーターを決定した(表1)
。
溶液中での構造決定にはNMRを用い、計算に用いたパラメーター、および得られた溶液中での構造の物理化学的パラメーターを表2に示す。
れた最も確からしい構造の内の一つ(図-2a)とX線構造解析から得られた結晶中での構造(図-2b)の比較図を示す。簡略化のため主鎖(N,Cα、CO原子)および、溶液
構造に立体構造を保持するために必要と思われるアミノ酸のみを示す。これらの立体構造を保持するために必要と思われるアミノ酸は全て疎水的な性質を持ち、実際、本蛋白質内部で疎水性コアを形成している。溶液中、結晶中にかかわらず、本蛋白質の大まかな構造(グローバルフォールド)は4本のβストランドからなるβシートと5本のβストランドからなるβシートが向き合う、βサンドイッチ構造である。また、溶液中の構造ではN末
端から7番目のプロリンまで、構造の収束が悪く、溶液中ではフレキシブルであることが予想されたが、X線結晶解析においてもこの部分の電子密度が薄く、解析することができ
なかった。このことから、N末端部分についても溶液中と結晶中でも同様の性質(大きな揺らぎを有する)をもつことがわかった。したがって、立体構造解析により本ドメインの構
造形成に必須の領域は266番目のセリンから358番のイソロイシンの92アミノ酸領域と考えられる。これはアミノ酸配列から予想されていた結合ドメインと異なり、更に小さいすなわち、この構造は溶液においてもキチンを認識できる機能的かつ有用な構造になる新たな知見である。溶液中と結晶中の構造の類似性を示す主鎖間のrmsd値は1.34Åであり、蛋白質の揺らぎ等を考慮に入れると、溶液状態と結晶状態でのその立体構造は同一であると結論づけられる。
キチン認識に重要なアミノ酸
まず、NMRを用い、hexa - N - acetylchitohexaoseとの相互作用を調べた。本実験は基質(hexa - N - acetylchitohexaose)と結合することで特定のアミノ酸周辺の環境が変
化するため引き起こされるアミド水素由来のNMRシグナル(化学シフト)の変化を追跡し
、相互作用に関与するアミノ酸残基を推定することができる。図-3aは基質と結合することにより引き起こされるアミド水素の化学シフトの変化量をまとめたものである。また図-3bは大きなケミカルシフト変化を示したアミノ酸を立体構造上どこに位置しているかを
示したものである。これらの図からわかるように大きな変化(すなわち、基質が結合することにより周りの環境が大きく変化)を示したアミノ酸は蛋白質の立体構造上特定の面に集中していることが明らかとなった。すなわち基質の認識にはこの面にあるアミノ酸の空間配置が重要であると考えることができる。この基質認識面には図-3bに示すように3つのトリプトファン残基がおよそ11.7と18.5Åの間隔(α炭素原子間)でほぼ一直線に並んでいるのが最大の特徴である。
図-4は基質を添加したときのトリプトファン側鎖の窒素原子と窒素原子に結合する水素のケミカルシフトの変化の様子を示している。上述したように基質結合面に位置する3つの
トリプトファンが非常に大きな変化を示し、この3つのトリプトファンの基質結合に対す
る重要性を示唆した。
ている。この図から明らかなように野生型に比べ変異体W326Aでは全く結合が見られない
、またW274A、W308Aにおいても大きく結合力が落ちていることが判った。NMRの解析結果
とともに本実験結果は予想される結合面に位置する3つのトリプトファンが基質結合に大
きな役割を担っていることを示す重要なデータである。基質結合面を構成するアミノ酸とともに、特に、3つのトリプトファンを本蛋白質で見られるような空間配置に置くことができれば、キチンを基質として認識できる分子を設計することができることを示唆している。
て見られるキチン分子間の水素結合を破壊することで触媒効率を上げているとも考えられだしている。したがって、産業的にキチナーゼを利用しようとするならば、触媒活性の向上だけでなく、キチンに対する結合力を増強する方法も有効なアプローチと言える。本発明はこのように廃棄されたキチンの有効利用につながるキチンの処理に重要な材料かつ構造情報を提供するものである。
Claims (3)
- キチン結合ドメインの結晶であって、単位格子定数が、a=b=48.8Å、c=85.0Åであるキチン結合ドメインの結晶。
- 下記のいずれかのポリペプチド
(1) 配列番号1のSer266からIle358位の93アミノ酸からなるポリペプチド
(2) 配列番号1のSer266からIle358位の93アミノ酸において、1または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、Trp274、Trp308、Trp326に対応するアミノ酸は不変であり、かつ、キチン結合ドメイン活性を有するポリペプチド、 - 以下のいずれかを含むDNA:
(1) 配列番号2の1〜279番目の核酸配列に対応するDNA;
(2)上記(1)の相補鎖、
(3) 配列番号2の1〜279に対応するDNAにストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ、Trp274、Trp308、Trp326に対応するヌクレオチドがトリプトファンをコードするDNA。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005080788A JP2006262702A (ja) | 2005-03-22 | 2005-03-22 | キチン結合ドメインの結晶と構造情報 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005080788A JP2006262702A (ja) | 2005-03-22 | 2005-03-22 | キチン結合ドメインの結晶と構造情報 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006262702A true JP2006262702A (ja) | 2006-10-05 |
Family
ID=37199290
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005080788A Pending JP2006262702A (ja) | 2005-03-22 | 2005-03-22 | キチン結合ドメインの結晶と構造情報 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2006262702A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007075046A (ja) * | 2005-09-16 | 2007-03-29 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 耐熱性セルロース結合ドメイン |
JP2007312687A (ja) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 結晶性キチンを分解するキチナーゼの触媒ドメインの結晶 |
JP2008193990A (ja) * | 2007-02-15 | 2008-08-28 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 改良耐熱性セルラーゼ |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11313688A (ja) * | 1998-02-20 | 1999-11-16 | Tadayuki Imanaka | 超耐熱性キチナ―ゼ |
JP2001054381A (ja) * | 1999-08-13 | 2001-02-27 | Tadayuki Imanaka | 超耐熱性キチナーゼ |
JP2004344160A (ja) * | 2003-02-27 | 2004-12-09 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | パイロコッカス属に属する超好熱性細菌由来の耐熱性キチナーゼ及びそれをコードする遺伝子 |
JP2006025701A (ja) * | 2004-07-16 | 2006-02-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 高活性耐熱性キチナーゼ及びそれをコードする遺伝子 |
-
2005
- 2005-03-22 JP JP2005080788A patent/JP2006262702A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11313688A (ja) * | 1998-02-20 | 1999-11-16 | Tadayuki Imanaka | 超耐熱性キチナ―ゼ |
JP2001054381A (ja) * | 1999-08-13 | 2001-02-27 | Tadayuki Imanaka | 超耐熱性キチナーゼ |
JP2004344160A (ja) * | 2003-02-27 | 2004-12-09 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | パイロコッカス属に属する超好熱性細菌由来の耐熱性キチナーゼ及びそれをコードする遺伝子 |
JP2006025701A (ja) * | 2004-07-16 | 2006-02-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 高活性耐熱性キチナーゼ及びそれをコードする遺伝子 |
Non-Patent Citations (11)
Title |
---|
JPN6010006463; 日本農芸化学会大会講演要旨集,Vol.2005(2005.Mar.5)p.197 * |
JPN6010006465; Appl.Environ.Microbiol.,Vol.69,No.6(2003)p.3119-3128 * |
JPN6010006466; Appl.Environ.Microbiol.,Vol.65,No.12(1999)p.5338-5344 * |
JPN6010006468; Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.97,No.11(2000)p.5842-5847 * |
JPN6010006469; 日本農芸化学会大会講演要旨集,Vol.2004(2004)p.15 * |
JPN6010006470; 日本農芸化学会大会講演要旨集,Vol.2003(2003)p.26 * |
JPN6010006472; J.Biol.Chem.,Vol.276,No.38(2001)p.35629-35635 * |
JPN6013014338; Biosci. Biotech. Biochem. 57(2), 1993, 260-264 |
JPN6013014339; Journal of Virology 65(12), 1991, 6998-7003 |
JPN6013014340; he Journal of Biological Chemistry 279(17), 20040423, 17738-17749 |
JPN6013014341; Biochem. J. 386, 20050315, 423-431 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007075046A (ja) * | 2005-09-16 | 2007-03-29 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 耐熱性セルロース結合ドメイン |
JP4604185B2 (ja) * | 2005-09-16 | 2010-12-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 耐熱性セルロース結合ドメイン |
JP2007312687A (ja) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 結晶性キチンを分解するキチナーゼの触媒ドメインの結晶 |
JP2008193990A (ja) * | 2007-02-15 | 2008-08-28 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 改良耐熱性セルラーゼ |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lloyd et al. | The mechanism of aconitase: 1.8 Å resolution crystal structure of the S642A: citrate complex | |
Hennig et al. | 2.0 Å structure of indole-3-glycerol phosphate synthase from the hyperthermophile Sulfolobus solfataricus: possible determinants of protein stability | |
CN112553178B (zh) | 热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用 | |
Kanaya et al. | Overproduction and preliminary crystallographic study of ribonuclease H from Escherichia coli | |
CN108913671B (zh) | 一种ω-转氨酶突变体及其应用 | |
CN108623652B (zh) | 一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用 | |
CN115717137B (zh) | 赖氨酰特异性内切酶突变体及其制备方法和应用 | |
CN111172129A (zh) | 一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用 | |
CN114317507A (zh) | 腈水合酶突变体及其应用 | |
CN110846291A (zh) | 热稳定性提高的胺脱氢酶突变体及其基因工程菌的构建和应用 | |
CN112877307A (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
Sosa-Peinado et al. | Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 β-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods | |
JP6853549B2 (ja) | 改変型meso−ジアミノピメリン酸脱水素酵素 | |
CN113637654B (zh) | 一种重组磷脂酶d突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用 | |
JP2006262702A (ja) | キチン結合ドメインの結晶と構造情報 | |
JPS5832896A (ja) | 複合プラスミド及びそれを含有する微生物 | |
JP5296537B2 (ja) | 改変コンドロイチン合成酵素ポリペプチド及びその結晶 | |
CN110951705B (zh) | 胺脱氢酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用 | |
Roret et al. | X-ray structures of Nfs2, the plastidial cysteine desulfurase from Arabidopsis thaliana | |
WO2018082030A1 (zh) | 脯氨酸羟化酶及其应用 | |
CN112359032A (zh) | 突变型酯酶及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用 | |
JP6675519B2 (ja) | D型アミノ酸脱水素酵素 | |
CN116676280A (zh) | 一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其应用 | |
JP6675520B2 (ja) | D型アミノ酸脱水素酵素 | |
EP4230723A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070628 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100209 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100315 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100406 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130522 |