JPH0353883A - 耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド及び形質転換体と耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はβ−１．３−グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ、該Ｄ
ＮＡをヘクタープラスミドに連結した組換え体プラス１
ド及び組換え体プラスミドで形質転換された大腸菌並び
に酵素反応の至適ｐｌ＋を弱酸性側に有する耐熱性β−
１，３−グルカナーゼおよびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

β−１，３−グルカナーゼは分子内にβ−Ｌ　３−Ｄ−
グルコシド結合を持つラξナリン、パキマンなどの主要
骨格であるβ−Ｌ　３−Ｄ−グルコシド結合を任意に加
水分解し、グルコース、ラミナリビオース、ラξナリト
リオースなどのラ旦ナリオリゴ絋を生成する酵素である
。

これらβ−Ｌ　３−［１−グルコシド結合を有するβ−
１３−グルカンを含むものとしては、褐藻類ことにコン
ブ属にある貯蔵性多糖がよく知られており、またその他
β−１，３−グルカンを含有ずるものとしては、ザルノ
コシ力ケ目の萩苓、パン酵母やかびの細胞壁の構威多糖
等が知られているが、これら天然界に再生可能な資源と
して大量に存在するβ−１，３−グルカンはあまり有効
利用されていない。このβ−１，３−グルカンを有効利
用するためには、これを効率よく加水分解し得る酵素（
β−１，３−グルカナーゼ）の開発が必要となる。即ち
、β−Ｌ　３−グルカンを高効率で加水分解し得る酵素
を得ることは、これを分解して有用なグルコース、ラミ
ナリビオースなどの糖類とし、これを回収、利用したり
、あるいはβ−１，３−グルカン自体として使用した後
にこれを分解・除去するなどの目的のために重要である
。

このような用途において、β−１．３−グルカナーゼは
高温安定性を有し、しかも広いｐＨ領域で安定性を有す
るものであることが、工業的応用という観点から極めて
望ましい。

そして、このためβ一】，３−グルカナーゼは、多数の
研究者の研究対象とされており、動物、植物、微生物等
の様々な起源のβ−１，３−グルカナーゼが検刺されて
きた。例えば、節足動物［コンポハイオケム　フイジイ
オル（Ｃｏｍｐ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ
．）１９８７，　８８．　１０５〜１１０コ特に、糸状
菌［エンザイムマイクロブ　テクノル（Ｅｎｚｙｍｅ　
Ｍｉｃｒｏｂ．　Ｔｅｃｈｎｏｌ．）ｑ １９８７，　９．　８９〜９３］、放線菌［アップル　
マイクロハイオル　バイオテクノル（＾ｐｐ．．　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）　１９８４
，　２０，　２０７〜２１２］、細菌［アグリ　バイオ
ノレ　ケエム（八ｇｒ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）　
１９７３＋３７．　１４４９〜１４５６　］等の酵素が
良く研究されている。

しかしながら、これらの酵素はいずれも温度安定性に劣
る場合や、培養に長時間必要なものが多く、該酵素を工
業的に安価に使用する場合に難点を残していた。

（発明が解決しようとする課題〕 天然界に再生可能な資源として大量に存在するβ−１，
３−グルカンの有効利用、特に該物質の酵素的加水分解
によるグルコース、ラ短ナリビオース、などのＩ．ｌ！
類を効率良く回収利用するためには耐熱安定性に優れて
いることが好ましい。

さらに、高温度下で酵素反応を行なうことにより腐敗を
防止したり、酵素反応速度を増大し、生威物の利用産生
を高めるなどが期待できることから、至適温度も高温で
あることが望ましい。

しかしながら、既に述べたように、従来のβ−１１０ ３−グルカナーゼはいずれも温度安定性の点で不十分で
あったり、該酵素の生威のためには長い培養時間が必要
である等の欠点を有しており、従ってこれら酵素を工業
的規模で、β−１．３−グルカンの加水分解生戒物を得
るために利用することは困難であるか、コストの点で不
満であった。

本発明の課題は、上記のような酵素反応における各種用
件を満足し、β−１，３−グルカンの加水分解を、経済
的かつ工業的規模で実施することを可能にする新規なβ
−１．３−グルカナーゼを提供することにある。また、
上記の新規なβ−１，３−グルカナーゼを大腸菌に上記
パチルス属に属する微生物由来のβ−１．３−グルカナ
ーゼの遺伝情報を担うＤＮＡをベクターを介して導入さ
せることにより得られた大腸菌を培養して得られた菌体
から上記新規β−１，３−グルカナーゼの製造方法を提
供することにある。

更に、上記新規なβ−１，３−グルカナーゼを製造する
ために使用する該β−１，３−グルカナーゼの遺伝子Ｄ
ＮＡ、これを含む組換えプラス〔ド及び該ｌ１ プラスミドで形質転換された大腸菌を提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者らは、工業的に使用可能な従来のβ−１３−グ
ルカナーゼが有する欠点のないβ−１，３−グルカナー
ゼを提供すべく、研究の結果、まず先にハチルス属に属
する好アルカリ性微生物が耐熱性が極めて高く、アルカ
リ性領域で酵素活性の強いβ１，３−グルカナーゼを生
産することを見いだし、該β−１，３−グルカナーゼに
ついて特許出願している（特許出願番号６３−２２０３
７５）が、その後、更に研究を進め、該微生物は、上記
アルカリ性領域で酵素活性の強いβ−１，３−グルカナ
ーゼのみでなく耐熱性が極めて高く、弱酸性領域で酵素
活性の強い極めて有用なβ−１，３−グルカナーゼも生
産することを見い出すとともに、該酵素のみを単一にか
つ大量に製造する困難性を遺伝子組換え技術を用いるこ
とにより解決し、本発明を完或するに至ったものである
。

即ち、本発明は、好アルカリ性細菌ハチルス属１２ 菌（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ．）に由来し、制限酵素Ｂａｍｌｌ　Ｉ認識部位を２
箇所、制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉ認識部位を２箇所、制限酵
素Ｐｓｔｌ認識部位を３箇所、制限酵素ＰｖｕＩ認識部
位を２箇所、制限酵素Ｓａｉｌ認識部位を１箇所、制限
酵素Ｘｂａ　Ｉ認識部位を１箇所、制限酵素ＸｈｏＩ認
識部位を１箇所所有するβ−１，３グルカナーゼ遺伝子
ＤＮＡに関する。

さらに本発明は、好アルカリ性細菌ハチルス属（ａｌｋ
ａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）に由
来し、制限酵素Ｂａｍｌｌ１認識部位を２箇所、制限酵
素ＩＥｃｏＲ　Ｉ認識部位を２箇所、制限酵素Ｐｓｔｌ
認識部位を３箇所、制限酵素ＰνｕＩ認識部位を２箇所
、制限酵素Ｓａｌ１認識部位を１箇所、制限酵素Ｘｂａ
　［認識部位をｌ箇所、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を１
箇所所有するβ−１．３グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡをベ
クタープラスミドに連結した組換え体プラスミドで形質
転換された大腸菌に関する。

さらに本発明は、次式 Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
　　Ｖａｌ　　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＧｌｕ　　Ｐｈ
ｅ　　Ａｓｎ　　Ｇａｙ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅ
ｕ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　＾Ｉａ１３ Ａｓｎ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ　　ＡｌａＧｌｙ　Ｇｌｙ
　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　ＡｓｎＡｒｇ　Ｇｌｕ
　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　　Ｉｌｅ Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ ｌｉｅ　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　ＴｒｐＳｅｒ　Ｓｅｒ
　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ １１ｅ　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　ＬｅｕＰｒｏ　　Ｇｉ
ｎ　　Ａｓｎ　　ＬｅｕＬｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　
　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　Ａｓｎ Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ Ｍｅｔ　　ｌ．ｅｕ　　Ｇｌｙ　　ＧｌｕＴｒｐ　Ｐｒ
ｏ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　　Ａｓｎ Ｇａｙ　Ｓｅｒ Ｇｌｎ　　Ｔｙｒ Ｇｌｎ　　Ｖａｌ Ａｌａ　　Ｇｌｎ Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ Ａｌａ　　Ａｒｇ Ｌｅｕ　　Ｔｒｐ 八ｓｐ　　Ｐｈｅ Ｇａｙ　Ｇｌｕ 八ｓｎ　　Ａｓｎ Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　｝Ｉｉｓ　　Ａｌａ　
　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　ＴｈｒＳ
ｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　ＨｉｓＩｃｅ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　
Ｐｈｅ　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　
ＴｙｒＡｓｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　　ｌｉｅ　Ａ
ｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙｌｉｅ　　Ｉｌ
ｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｖａ
ｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　ＡｓｎＴｒｐ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｈａ　Ｓｅｒ　Ｔｈ
ｒ　Ｐｒｏ１４ Ｐｂｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｍｅｔ　　
ＬｅｕＶａｌ 八ｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ １１ｅ　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＧｌｙＶａｌ　Ｇｌｎ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｙ　Ａｒｇｃ＋ｙ に記載のアミノ酸配列をコードするβ−１，３−グルカ
ナーゼ遺伝子ＤＮＡに関する。

さらに本発明は、次式 ｌ ５ ＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧ　　ＴＧＧ八八ＴＧＧＧＡ　　Ｃ
ＣＣＧ八八ＴＴＡＴ　　ＡＴＴＣＧＣＴＧＧＴに記載の
β １ ３ グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡに関 する。

さらに本発明は新規β １ ３ グルカナーゼを提 供するものであり、 これは以下の理化学的諸特性 を有する。

（１）作 用： β ｌ， ３ グルカンのβ １， ３ グルコシド結 合を分解し、 グルコース、 ラミナリビオース、 を生戒する。

（２）基質特異性： １６ ラ旦ナリトリオース以上のβ−１，３−グルカンに作用
する。

（３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは４．５〜６．０であり、４分間１３０分間の
加熱条件下ではｐＨ４〜１１の範囲内で安定である。

（４）温度に対する安定性： 加熱条件下ではｐＨ４〜、１０分間の加熱では安定であ
る。

（５）作用適温の範囲： ６５℃近傍に至適作用温度を有する。

（６）失活条件： ｐＨ７、１０分間の加熱では５０分間で完全に失活する
。

（７）ゲルろ過法による分子量： ２３，０００〜２９，０００ （８）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀により阻害を受ける。

さらに本発明は、上記の新規β−１．３−グルカナーゼ
の製法にも関わり、この方法によれば該β−１ｌ７ ３−グルカナーゼは、好アルカリ性細菌バチルス属（ａ
ｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）
に由来し、制限酵素ＢａｍＨ　Ｉ認識部位を２箇所、制
限酵素ＥｃｏＲ　Ｉ認識部位を２箇所、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉ認識部位を３箇所、制限酵素Ｐｖｕ　Ｉ認識部位を２
箇所、制限酵素ＳａｌＴ認識部位を１箇所、制限酵素Ｘ
ｂａＴ認識部位を１箇所、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を
１箇所所有するβ−１．３グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡを
ベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミドで形
質転換された大腸菌を培養し、該β−１，３−グルカナ
ーゼを菌体中に生威・蓄積させ、これを採取することを
特徴とする上記新規β−Ｌ　３−グルカナーゼの製造方
法である。

以下本発明を詳細に説明する。

β−１，３−グルカナーゼの遺伝子情報を担うＩ）ＮＡ
（以下染色体ＤＮＡと称する）は、好アルカリ性ハチル
ス属に属する微生物から単離精製する。

好アルカリ性バチルス属に属する微生物としては、例え
ばｓｐ，ｓｔｒａｉｎ　ＡＧ−４３０（ＦＥＲＭ　Ｐ−
１０２５６）を用いることができる。上記バヂルス屈に
属する微生物か１８ らのβ−１，３−グルカナーゼの遺伝子情報を担うＤＮ
Ａの単離精製は情報、例えば［サイ１・ウ、砧ウラ（Ｓ
ａｉｔｏ　＆　Ｍｉｕｒａ）の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．
　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　７２，　ｐ６１９−６２
９（１９６３）］により行うことができる。即ち、リゾ
チーム（生化学工業社製品）により菌体を溶菌後、ＳＤ
Ｓ含有アルカリ性緩衝液とフェノールでＤＮＡを抽出す
る。更にＲＮＡをＲＮアーゼで分解して染色体ＤＮＡを
単離精製することができる。

得られた染色体ＤＮＡのヘクターＤＮＡの組み込みは以
下のように行うことができる。染色体ＤＮＡ及びヘクタ
ーＤＮＡを制限酵素で切断して染色体ＤＮＡ断片及びヘ
クターＤＮＡ断片を調製する。次いで両者の混合物をＤ
ＮＡリガーゼ（東洋紡社製品）で処理する。用いられる
ヘクターＤＮ八としては、ｐＢＲ３２２　（宝酒造■製
Ｎｏ．３０５０）　，　ｐＵｃ１８（全酒造■製Ｎｏ．
３２１８），　ｐＵｃ１９（宝酒造■製Ｎｏ．３２１９
），ｐＨＳＧ２９８　（宝酒造■製Ｎｏ．３２９８）　
，　ｐｌｌｓＧ２９９宝酒造■製Ｎｏ．３２９９），　
ｐ１｛ＳＧ３９８（宝酒造■製Ｎｏ．３３９８），　ｐ
ＨＳＧ３９９　（宝酒造■製Ｎｏ．３３９９），　ｐＤ
Ｒ５４０（７　ｙ　／ｌ／マシ１９ ア社製Ｎｏ．２７−４９２３−０１），　ｐＫＫ２２３
−３（ファルマシア社製Ｎｏ．２７−４９３５−Ｏｆ）
，　ｐＢｌ？３２９が上げられる。とりわけｐＢＲ３２
９が好適に用いられる。また制限酵素としては旧ｎｄＩ
ＩＩ，　ＥｃｏＲＴ，　ＢａｍＨ　Ｉ等（東洋紡社製品
）があげられる。さら６こＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ
４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（東洋紡社製品ＬＧＡ
−１０１）が好適に用いられる。

得られた組換え体の大腸菌への導入は、例えばＰｒｏｃ
．　　Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＬＩ
ＳＡ．　　６９．　　ｐ２１１０−２１１４（１９７２
）に記載のカルシウムイオン処理により行うことができ
る。即ち３０ｍＭ　ＣａＣ］２存在下で大腸菌１１Ｂ１
０１株のコンビテント細胞に組換え体ＤＮＡを混合し、
氷上に１時間置いたのち４２℃で６０〜７５秒間ヒート
ショックを行うことで外来ＤＮＡを大腸菌に導入するこ
とができる。又このコンビテント細胞は市販の物も用い
ることができる。

β−１，３−グルカナーゼの遺伝子情報を担うＤＮＡを
組み込んだベクターＤＮＡを有する菌株の選択方法は、
当該組換え体ＤＮＡを調製するのに際して使用した制限
酵素やヘクターＤＮＡの種類に２０ よっても異なるが例えば制限酵素としてｌＩｉｎｄｌＩ
Ｉ（東洋紡社製品ＨＮＤ−３０２）を用い、ベクターＤ
ＮＡとしてｐＢＲ３２９を用いた場合には次のようにし
て行うことができる。即ち、大腸菌Ｋ−１２株例えば１
１Ｂ１０１株を宿主とした形質転換株を、トリプトン、
イーストエキストラクト、ＮａＣｌ，パキマン、クロラ
ムフェニコール、寒天を含む培地（以下ＬＢｐａｃｈｙ
ｍａｎ寒天培地という）に培養し、平板上に出現したク
ロラムフェニコール耐性コロニーのウチＬＢ−　ｐａｃ
ｈｙｍａｎ寒天培地上にハローを形威するβ−１．３−
グルカナーゼ生産株を選択する。

上記方法で得られた組換え体ＤＮＡ含有菌株より、組換
え体ＤＮＡを単離する。

単離された組換え体ＤＮＡの挿入フラグメントについて
ベクタープラスミドｐＵｃ１１８またはｐＵｃ１１９（
宝酒造■製Ｎｏ．３　３１８又はＮｏ．３　３１９　）
にサブクローニング後、各々大腸菌ＭＶ１１８４　（宝
酒造■製）株に形質転換した。得られた形質転換菌をも
とに、単鎖ＤＮＡを調製し、ｄｉｄｅｏｘｙ法（Ｓａｎ
ｇｅｒ，　Ｆ，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），　２１
４．　１２０５）により、塩基配列２１ を決定した。

以下に、本発明のβ−１，３−グルヵナーゼの好ましい
精製法の一例につき説明する。

まず、上記のようにして得られた新規な遺伝子組み替え
大腸菌をクロラムフｌニコール５０μｇ７ｍｌ含有Ｌ−
ブロースを用い、３７℃にて１６−２４時間好気的に培
養して得られる培養菌体を５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に懸濁させ、、超音波破砕あるいは、リゾチ
ームで溶菌し遠心分離する。上澄液を市販のイオン交換
樹脂例えば、同上緩衝液で平衡化したｌ）ＥＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＬ　６５０Ｍ　（東洋ソーダ社製品）に吸着
させ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ　５．６）で不用
の蛋白を溶出後０．１　〜０．５ＭのＮａＣｌを含む５
０ｍＭリン酸緩衝液（’ｐＨ５．６）の濃度勾配法によ
って酵素を溶出する。

溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００
の限外濾過膜を用いて濃縮する。濃縮酵素は、Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ　Ｓ−２００に充填し、１０ｍＭリン酸緩衝
液０．１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いて溶出する
。溶出した活性画分を集め、平均分画分子１１０，００
０の限外濾過欣を用いて濃縮する。かくして得られた活
性画分を２２ 濃縮し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度
１４．０％）において均一な酵素標品が得られた。

なお、β−１，３−グルカナーゼ活性の測定法並びに活
性表示法は以下の通りである。即ち、５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）に溶解さ一已た１％（Ｗ／Ｖ）ラミナ
ラン溶液０　．　２　ｍｆｌに適当に希釈した酵素液０
．０１ｍＮを混合し、４分間で１０分間反応させた後、
ＤＮＳ試液［ジェイ．アール．サマー，ジー．イー．ソ
マーズ．　“′ラボラトリー　イクスペリメンツイン　
バイオロジカル　ケくストリー　，アカデミックプレス
，ニューヨーク（Ｊ．Ｒ．　Ｓｕｍｍｅｒ，　Ｇ．Ｅ．
　ＳＯＭＥＲＳ，”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，”　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ）、３４３５頁、１９４４年１　　１．Ｏ
ｍｌを添加して酵素反応を停止させる。

沸騰水浴中で５分間加熱した後急冷し、４　ｍｌの水を
加え十分に撹拌する。同様に処理した、０．２ｄ／ｍｆ
ｌグルコース溶液を標準とし、着色度を分光光度計（波
長５１０ｎｍ）を用いて測定する。酵素活性の単位は前
述の条件下でｌ分間に１　ｍｇのグルコースに２３ 単位として表示する。

本発明の方法によって得られるβ−１．３−グルカナー
ゼおよび従来公知の微生物由来のβ−１，３−グルカナ
ーゼの理化学的性質および酵素化学的性質を比較して第
１表に示す。

（木頁以下余白） ２４ 第１表 β一ｌ ３−グルカナーゼ ２５ ２６ 〔実施例〕 以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例ｌ　耐熱性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子の分
離 好アルカリ性細菌バチルスＡＧ−４３０株（ＦＥＲＭ　
Ｐ１０２５６）の染色体ＤＮＡはサイトウ、ごウラ（Ｓ
ａｉｔｏＭｉｕｒａ）の方法［Ｂｉｏｃｈｌｍ．　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ．７２＋　１１６１９−６２９
　（１９６３）］に準して調製した。得られた染色体Ｄ
ＮＡの内１００μｇを制限酵素旧ｎｄＩＩＴで分解して
染色体ＤＮＡ断片８０μｇを得た。それとは別にヘクタ
ーｐＢＲ３２９　１μｇを制限酵素旧ｎｄＨＩで分解し
、細菌由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製Ｂ
ＡＰ−１０１）処理してヘクターＤＮＡ断片０．８μｇ
を得た。

得られた染色体ＤＮＡ断片０．４μｇとベクターＤＮＡ
断片０．１μｇとを、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造社製２０１１Ａ）を用いｌ６℃、３０分連紬
反応を行い、組換え体ＤＮＡを得た。得られた組換え体
ＤＮＡを大腸菌ＨＢ　１０１コンピテントセ２７ ル（東洋紡社製）２００μｌに混合し、分間下で１時間
静置する。さらに、４２℃、７０秒間加温し、形質転換
を行った。

得られた形質転換体を３　ｍｌのＩ７−ブロスに植菌し
３７℃下で３時間培養後、培養液をＬＢ−ｐａｃｈｙｍ
ａｎ寒天平板に塗抹したところハローを形或するクロラ
ムフェニコール耐性菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩ（
ｐＮＡＧ２４）（微工研菌寄第１０８４８（ＦＥＩＩＭ
　Ｐ−１０８４８））が得られた。

これらの菌株をクロラムフエニコール５０μｇ７ｍｌを
含むＬ〜ブロス植菌後一晩培養し、集菌後生理的食塩水
で洗浄した。同量の５０ｍＭ　｝　’）スー塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁後超音波処理し、遠心上清につい
てβ−１．３−グルカナーゼ活性測定を行ったところ１
５単位／　ｍ９．を示し、形質転換されていることを確
認した。

得られた形質転換株からプラスミドをアルカリＳＤＳ法
により調製し、このプラスミドをｐＮＡＧ２４と命名し
た（第１図に示す）。

ｐＮＡＧ２４をＩｌｉｎｄｌｌｌで切断後アガ１１　−
　スゲル電気泳動にかけヘクターに挿入されている断片
を回収２８ しこれを二ックトランスレーションによりビオチンでラ
ベルしたサザンハイブリダイゼーションを行った（ＢＲ
Ｌ社製品）。その結果、プラスミドｐＮＡＧ２４に挿入
されたＤＮＡ断片は確かに好アルカリ性バチルス属菌ｓ
ｐ．　ｓｔｒａｉｉ＋　ＡＧ−４３０の染色体ＤＮＡに
由来することが示された。

又、純化された耐熱性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子
は、制限酵素ＢａｍＨ　Ｉ認識部位を２箇所、制限酵素
ＥｃｏＲ　Ｉ認識部位を２箇所、制限酵素ＰｓｔＩ認識
部位を３箇所、制限酵素Ｐｖｕ　Ｉ認識部位を２箇所、
制限酵素ＳａｌＩ認識部位を１箇所、制限酵素ＸｂａＩ
認識部位を１箇所、制限酵素ＸｈｏＴ認識部位を１箇所
所有していた（制限酵素は市販品を用いた）。

実施例２　耐熱性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子の解
析 実施例１に準して調製されたプラスミドｐＮＡＧ２４の
挿入フラグメントについて、ｄｉｄｅｏｘｙ法により全
塩基配列を決定した。即ち、ｐＮＡＧ２４を各種制限酵
素で切断後、同一の制限酵素で切断したｐＵｃ１１８ま
たはｐｌｌｃ１ｉ９（宝酒造社製品）に組換えた後、実
２９ 施例１で示した方法で各々大腸菌ＭＶ１１８４株に形質
転換（アンピシリン耐性株）した。得られた形質転換株
をアンピシリン５０ｔｔｇ／ｍＬ　０．０２％のＸ−Ｇ
ａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−　ｉｍ
ｄｏｎｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）および
１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈ
ｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｓ　ｉｄｅ）を含むＴＹ寒天培地
上にて培養した。このプレート上で白色のコロニーを作
る菌の中で、目的のＤＮＡ断片が挿入された菌株を選択
するため、プラスミトをミニスクリーニング法［ＩＩｏ
１ｍｅｓ　Ｄ．Ｓ．ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ　Ｍ．，　
Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１４，１９３（１９
８１）］により調製し、制限酵素による解析を行った。

この様にして得られた各種形質転換株から、宝酒造社製
のマニュアルに従って（Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ．　ａｎｄ　
Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ．　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ＋　ｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）単鎖．
ＤＮＡを調製後、アプライドバイオシステムズ社製蛍光
プライマーを用いたジデオキシ法により塩基配列を決定
するに至った。なお、塩基配列の決定にあたっては、モ
デル３７０ＡＸＤＮＡンーケンサーシステム（アブライ
トハイオシステムズ社製）を用いた。決定された耐熱性
β−１，３−グル３０ カナーゼ構造遺伝子の全塩基配列を第２図に示す。

実施例３　大腸菌でのｉ′４熱性β−１，３−グルカナ
ゼ製造法 実施例１に準して調製されたプラスミドｐＮＡＧＨ２４
をＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに導入し得られた形質転換
株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ（ｐＮＡＧ２４）　（微工
研菌寄第１０８４８　（ＦＥＲＭＰ−１０８４８））を
クロラムフェニコール５０７／ｇ／ｒａ＊有Ｌ−ブロー
ス培地１０ｍｌに植菌後一晩培養を行った。

前培養液をクロラムフェニコール５０μｇ／　ｍｌ　含
有Ｌブロース培地５００成に植菌後３７℃にて２４時間
好気的に培養した。得られた培養菌体は生理的食塩水で
洗浄し１０ｈ＋ｊ！の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に懸濁させ、リゾチームで溶菌した後、超音波処理
をした。遠心分離により、菌対破砕物を除いた上清のβ
−１，３−グルカナーゼ活性を測定した。その結果、活
性は７６．６単位／　ｍｌであった。

上澄液を同上緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰ
ＥＡＬ６５０Ｍ　（東洋ソーダ社製品）に吸着させ、５
０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ５．６）で不用の蛋白を溶
出後０．１〜０．５ＮのＮａＣＩを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ５．６）の濃度３１ 勾配法によって酵素を溶出する。溶出した活性画分を集
め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて
ｉ縮する。濃縮酵素は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２０
０に充填し、１０ｍＭリン酸緩衝液０．１Ｍ　ＮａＣ１
　（ｐＨ７．０）を用いて溶出する。溶出した活性画分
を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用
いて濃縮する。更にもう１回ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯｌ’ｎ
八ｌ．　６５０Ｍに吸着させ、５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）で不用の蛋白を溶出後０．１　〜０．５Ｍ
のＮａＣＩを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
の濃度勾配法によって酵素を溶出する。

溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００
の限外濾過膜を用いて濃縮する。濃縮酵素は、Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ　Ｓ−２００に充填し、１　０ｍＭリン酸緩
衝液０．１Ｍ　ＮａＣＩ（ｐＨ７．０）を用いて溶出す
る。かくして得られた活性画分を濃縮し、酵素標品１３
０ｎ＋ｇを得た。

活性収率は５０％、β−１，３−グルカナーゼ活性は、
１１９単位／成であった。

〔発明の効果〕

以上詳しく述べたように、本発明の新規なβ−１，３−
−グルカナーゼ゛は弱酸性側に酵素反応の至適ｐｏ３２ を有し、また広い　Ｈ　ｊＵ域で安定性を有しかつ高温
安定性にも優れている。従って、β−１，３−グルカナ
ーゼを失活させずに長期保存が可能になる。

更に、高温度下で酵素反応を実施し得ることから反応速
度を大幅に高めることが出来る。

かくして、本発明のβ−１．３−グルカナーゼによれば
、工業的に有利に、β−１．３−グルカンの分解生威物
の製造を行うことができ、高い分解効率、分解生成物の
生産性を達或でき、しかも製造コストの節減を図ること
が可能となった。

また、本発明のβ−１，３−グルカナーゼはこれを形質
転換した大腸菌から菌体内に大量に生産することが出来
るので、分離・精製が容易であり、従って安価に量産で
きるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はベクターとして用いたｐＢＲ３２９とプラスミ
ドｐＢＩ？３２９に組み込まれたβ−１，３−グルカナ
ーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＮＡＧ２４を示す。図中
黒太線は好アルカリ性バチルス属菌ＡＧ−４３０　（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ１０２５６）由来のＤＮＡである。 ３３ 第２図番よβ １ ３〜グルカナーゼ構造遺伝子の令 塩基配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、好アルカリ性細菌バチルス属菌（ａｌｋａｌｏｐｈ
   ｉｌｉｃＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）に由来し、制限酵
   素ＢａｍＨ I 認識部位を２箇所、制限酵素ＥｃｏＲ I
   認識部位を２箇所、制限酵素Ｐｓｔ I 認識部位を３箇
   所、制限酵素Ｐｖｕ I 認識部位を２箇所、制限酵素Ｓ
   ａｌ I 認識部位を１箇所、制限酵素Ｘｂａ I 認識部位
   を１箇所、制限酵素Ｘｈｏ I 認識部位を１箇所所有す
   るβ−１、３−グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ。 ２、好アルカリ性細菌バチルス属（ａｌｋａｌｏｐｈｉ
   ｌｉｃＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）がＦＥＲＭ　Ｐ−１
   ０２５６である請求項１記載のＤＮＡ。 ３、好アルカリ性細菌バチルス属（ａｌｋａｌｏｐｈｉ
   ｌｉｃＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）に由来し、制限酵素
   ＢａｍＨ I 認識部位を２箇所、制限酵素ＥｃｏＲ I 認
   識部位を２箇所、制限酵素Ｐｓｔ I 認識部位を３箇所
   、制限酵素Ｐｖｕ I 認識部位を２箇所、制限酵素Ｓａ
   ｌ I 認識部位を１箇所、制限酵素Ｘｂａ I 認識部位を
   １箇所、制限酵素Ｘｈｏ I 認識部位を１箇所所有する
   β−１，３−グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡをベクタープラ
   スミドに連結した組換え体プラスミド。 ４、ベクタープラスミドが大腸菌ベクタープラスミドで
   ある請求項３記載の組換え体プラスミド。 ５、ベクタープラスミドがｐＤＲ５４０，ｐＵＣ１８，
   ｐＵＣ１９，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２９，ｐＨＳＧ２
   ９８，ｐＨＳＧ２９９，ｐＨＳＧ３９８，ｐＨＳＧ３９
   ９，ｐＫＫ２２３−３又はλファージである請求項３記
   載の組換え体プラスミド。 ６、好アルカリ性細菌バチルス属（ａｌｋａｌｏｐｈｉ
   ｌｉｃＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）に由来し、制限酵素
   ＢａｍＨ I 認識部位を２箇所、制限酵素ＥｃｏＲ I 認
   識部位を２箇所、制限酵素Ｐｓｔ I 認識部位を３箇所
   、制限酵素Ｐｖｕ I 認識部位を２箇所、制限酵素Ｓａ
   ｌ I 認識部位を１箇所、制限酵素Ｘｂａ I 認識部位を
   １箇所、制限酵素Ｘｈｏ I 認識部位を１箇所所有する
   β−１，３−グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡをベクタープラ
   スミドに連結した組換え体プラスミドで形質転換された
   大腸菌。 ７、次式 に記載のアミノ酸配列をコードするβ−１，３−グルカ
   ナーゼ遺伝子ＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 ８、次式 に記載のβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 ９、以下の理化学的性質を有する新規β−１，３−グル
   カナーゼ。 （１）作用： β−１，３−グルカンのβ−１，３−グルコシド結合を
   分解し、グルコース、ラミナリビオース、を生成する。 （２）基質特異性： ラミナリトリオース以上のβ−１，３−グルカンに作用
   する。 （３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは４．５〜６．０であり、４０℃、３０分間の
   加熱条件下ではｐＨ４〜１１の範囲内で安定である。 （４）温度に対する安定性： ｐＨ７、９０℃、１０分間の加熱では安定である。 （５）作用適温の範囲： ６５℃近傍に至適作用温度を有する。 （６）失活条件： ｐＨ７、１００℃の処理条件では５０分間で完全に失活
   する。 （７）ゲルろ過法による分子量： ２３，０００〜２９，０００ （８）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀により阻害を受ける。 １０、好アルカリ性細菌バチルス属（ａｌｋａｌ　ｏｐ
   ｈｉｌｉｃＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）に由来し、制限
   酵素ＢａｍＨ I 認識部位を２箇所、制限酵素ＥｃｏＲ
   I 認識部位を２箇所、制限酵素Ｐｓｔ I 認識部位を３
   箇所、制限酵素Ｐｖｕ I 認識部位を２箇所、制限酵素
   Ｓａｌ I 認識部位を１箇所、制限酵素Ｘｂａ I 認識部
   位を１箇所、制限酵素Ｘｈｏ I 認識部位を１箇所所有
   するβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡをベクター
   プラスミドに連結した組換え体プラスミドで形質転換さ
   れた大腸菌を培養し、請求項９記載のβ−１，３−グル
   カナーゼを菌体中に生成・蓄積させ、これを採取するこ
   とを特徴とする請求項９記載の新規β−１，３−グルカ
   ナーゼの製造方法。 １１、上記培養を２５〜４０℃の範囲内の温度下で好気
   的に行うことを特徴とする請求項１０記載のβ−１，３
   −グルカナーゼの製造方法。