JP3487711B2 - 環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、該酵素の遺伝子、組み換え体ｄｎａ及び該酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な環状イソマ
ルトオリゴ糖合成酵素、環状イソマルトオリゴ糖合成酵
素遺伝子、新規な組み換え体DNA及び環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】環状イソマルトオリゴ糖（以下、CIと略
称する。）は、デキストランから酵素的に合成される環
状オリゴ糖であり、本発明者等により土壌細菌をデキス
トラン含有培地で培養した培養液から初めて単離同定さ
れた。本発明者等は、該オリゴ糖及びその製造法（特開
平6-197783号公報）、該オリゴ糖をデキストランから合
成する環状イソマルトオリゴ糖合成酵素及びその製造法
（特開平7-8276号公報）、更に、環状イソマルトオリゴ
糖合成酵素遺伝子及びその製造法（特願平6-205631）を
既に特許出願した。最近、CIが強力な抗う蝕作用を有す
ることが判明し、特許出願した（特願平6-194264号明細
書、特願平7-273115号明細書）。中でもグルコースの７
量体であるサイクロイソマルトヘプタオースは、in vit
roに於ける評価では、極めて効果が高いものである。

【０００３】しかしながら、既知の環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素は、デキストランから３種類の環状イソマ
ルトオリゴ糖を生産する。しかし、その生成比率は、グ
ルコースの８量体であるサイクロイソマルトオクタオー
スが最も高いという問題があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者等
は、抗う蝕に極めて効果のあるサイクロイソマルトヘプ
タオースを最も高比率で生成する環状イソマルトオリゴ
糖合成酵素を含む菌株を天然界からスクリーニングし、
本酵素の性質を明らかにするとともに、更に、本酵素遺
伝子をクローニングし、本酵素を大腸菌で発現させるこ
とを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、以下
の理化学的性質を有する環状イソマルトオリゴ糖合成酵
素である。 作用 デキストラン等のα-1、6結合よりなるグルコースポリマ
ーに作用して、サイクロイソマルトヘプタオースを主成
分とする環状イソマルトオリゴ糖を生成する。 基質特異性 α-1、6結合を主鎖とするデキストランには作用するが、
アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適作用pH及び安定pH範囲 pH6.0付近で作用し、pH4.5〜9.0の範囲で安定である。
更に本発明は、下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ、
環状イソマルトオリゴ糖合成酵素をコードする遺伝子を
含有する3.86KbのDNA断片である。

【０００６】

【０００７】更に本発明は、配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列または、該アミノ酸配列において１もしくは複
数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されており、か
つ、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素活性をもたらすア
ミノ酸配列をコードする環状イソマルトオリゴ糖合成酵
素遺伝子である。

【０００８】更に本発明は、前記環状イソマルトオリゴ
糖合成酵素遺伝子または該遺伝子を含有するDNA断片を
ベクターDNAに組み込んでなる組み換え体DNAである。更
に本発明は、前記組み換え体DNAを含み、エッシェリシ
ア(Escherichia)属に属する微生物を培地に培養し、培
養物より環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を採取するこ
とを特徴とする環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造
法である。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。先
ず、本発明の新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の
理化学的性質について述べる。

【００１０】作用 デキストラン等のα-1、6結合よりなるグルコースポリマ
ーに作用して、サイクロイソマルトヘプタオースを主成
分とする環状イソマルトオリゴ糖を生成する。 基質特異性 α-1、6結合を主鎖とするデキストランには作用するが、
その構成中に一部グルコースのα-1、6結合を有するアミ
ロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適作用pH及び安定pH範囲 pH6.0付近で作用し、pH4.5〜9.0の範囲で安定である。 作用適温の範囲 15分間作用させた場合、55℃付近が最適である。 温度による失活の条件 温度60℃で15分間の熱処理により完全に失活する。 分子量 SDS PAGE法で約10万であった。

【００１１】以上詳述した如く、公知の環状イソマルト
オリゴ糖合成酵素の主生成物がサイクロイソマルトオク
タオースであるのに対して、該環状オリゴ糖合成酵素
は、主生成物がサイクロイソマルトヘプタオースである
点でその性質を異にする全く新しい酵素である。本酵素
は、抗う蝕作用の極めて強いサイクロイソマルトヘプタ
オースを効率良く製造することができるものである。

【００１２】次いで、本酵素の製造法について述べる。
本発明において使用される微生物としては、例えば、本
発明者等が土壌中から採取した野性株のU-155株等が挙
げられる。以下にこのU-155株の菌学的性質を示す。

【００１３】 菌学的性質 (1)形態 1.形態 桿菌 2.運動性 認められる 3.胞子 有 胞子嚢 膨出 形 楕円形 位置 中立〜亜端立 4.グラム染色性 ＋ (2)生育状態 1.肉汁寒天平板培養 平滑、色素産生せず 2.肉汁寒天斜面培養 平滑、周辺なめらか、色素産生せず (3)生理学的性質 1.硝酸塩の還元 − 2.脱窒反応 − 3.MRテスト − 4.VPテスト − 5.インドールの生成 − 6.硫化水素の生成 ＋ 7.デンプンの加水分解 ＋ 8.クエン酸の利用 − 9.無機窒素源の利用 − 10.ウレアーゼ − 11.オキシダーゼ − 12.カタラーゼ ＋ 13.生育の範囲 温度 15〜37℃ 14.酸素に対する態度 好気的 15.O-Fテスト − 16.糖類に対する態度 酸の生成 ガスの生成 1)L-アラビノース − − 2)D-キシロース ＋ − 3)D-グルコース ＋ − 4)D-マンノース − − 5)D-フラクトース − − 6)D-ガラクトース − − 7)麦芽糖 ＋ − 8)ショ糖 ＋ − 9)乳糖 ＋ − 10)トレハロース ＋ − 11)D-ソルビット − − 12)D-マンニット − − 13)イノシット − − 14)グリセリン ＋ − 15)デンプン ＋ −

【００１４】このU-155菌株は、胞子を形成するグラム
陽性桿菌であることからバチルス属に属する細菌である
と同定した。更に、種の同定のために、バージェイズ・
マニュアル・オブ・システィマティック・バクテリオロ
ジーに基づき、種々検討した結果、バチルス・サーキュ
ランスに属する１菌株として分類同定した。なお、この
バチルス・サーキュランスU-155は、平成８年２月29日
付けで工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-154
91として寄託されている。

【００１５】本発明に使用する微生物は、バチルス・サ
ーキュランスU-155株の他バチルス属に属し、デキスト
ランからサイクロイソマルトヘプタオースを主成分とす
る環状オリゴ糖を生成するものであれば、何れの菌株で
もよい。

【００１６】本発明の方法における菌株の培養は、原則
的には一般微生物の好気的培養で採用される方法と同じ
であるが、通常は、液体培地による振盪培養法または、
通気攪拌培養法等が用いられる。 培地としては、適当
な窒素源（例えば、ペプトン、ポリペプトン、バクト−
トリプトン等のカゼイン分解物あるいはソイトン等の大
豆タンパク質分解物等）、炭素源（例えばグルコース、
グリセリン等の糖質類）、そして必要により、酵母エキ
ス、リボフラビン等のビタミン類及びリン酸塩、マグネ
シウム塩、塩化ナトリウム、微量金属等のミネラル類、
そして本物質の原料となるデキストラン等を含んだもの
が用いられる。pHは、本菌が成育するpH域ならばいずれ
でもよいが、通常は、６〜８の範囲が好ましい。培養条
件は、例えば、通常20〜40℃で、16時間〜４日間振盪培
養または通気攪拌培養を行なう。

【００１７】以上の如くして得た培養物を用いて例え
ば、以下に示す酵素精製工程により該環状オリゴ糖合成
酵素を得る。上記培養物から該酵素の粗酵素液を得るに
は遠心分離、膜濃縮等により除菌及び濃縮するのみで良
い。更に、必要により、通常用いられる酵素の精製法に
より上記粗酵素液から精製標品を得る。本酵素の精製法
は、通常の酵素分離方法であれば如何なる方法でもよい
が、本製造法の場合、除菌液を実施例に示した精製方法
に従って処理することにより、高純度の環状オリゴ糖合
成酵素標品を得ることが出来る。なお、本製造法は、こ
れらの精製法に限定されるものではない。更に、本酵素
をデキストランに作用させ、反応液よりサイクロイソマ
ルトオリゴ糖を分離精製する。なお、本製造法の場合、
精製酵素を用いずに、先に述べた培養液の除菌濃縮液を
用いても精製酵素と同等の効率でサイクロイソマルトオ
リゴ糖を生成することができる。反応液より該オリゴ糖
を分離精製する手段としては、オリゴ糖精製法であれば
如何なる方法でもよい。例えば、冷却処理、有機溶媒添
加処理、活性炭処理、あるいは特異的に環状オリゴ糖を
吸着するカラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロ
マトグラフィー等の公知方法を単独もしくは適宜組合わ
せて分離精製することができる。

【００１８】次いで、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素
をコードする遺伝子を含有する遺伝子の調製について述
べる。本酵素をコードする遺伝子のドナー微生物として
は、本酵素を生産するものであれば、如何なるものでも
よく、例えば、前述のバチルス・サーキュランスU-155
菌株（FERM P-15491）等が挙げられる。本菌株の培養
は、上述した通りである。この様にして得られる培養物
を、例えば3,000rpm以上、好ましくは8,000〜10,000rpm
で５分以上、好ましくは10〜30分間遠心分離してバチル
ス・サーキュランスU-155株の菌体を得る。この菌体よ
り、例えば、斎藤、三浦の方法［バイオケム・バイオフ
ィズ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、第72巻、第61
9頁（1963年）］等により染色体DNAを得ることができ
る。

【００１９】次いで、この染色体DNAに突出末端を生じ
させる制限酵素、例えばSau3A1〔ベーリンガーマンハイ
ム社製〕を、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度
0.1〜10ユニット/mlで20分以上、好ましくは30分〜２時
間作用させて部分消化し、種々の鎖長の染色体DNA断片
を得る。染色体DNA断片は、必要によりフェノール抽出
処理、フェノール、クロロホルム抽出処理、エタノール
沈殿処理等の既存の精製工程により精製する。

【００２０】一方、本発明において用いることのできる
ベクターDNAとしては、如何なるものでもよく、例えば
プラスミドベクターDNA、バクテリオファージベクターD
NA等が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドpUC1
18DNA〔宝酒造社製〕等が好ましい。

【００２１】上記ベクターDNAに突出末端を生じさせる
制限酵素、例えばBamHＩを、温度30℃以上、好ましくは
37℃、酵素濃度10〜1,000ユニット/mlで１時間以上、好
ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断されたベク
ターDNAを得る。ベクターDNAは、必要によりフェノール
抽出処理、フェノール、クロロホルム抽出処理、あるい
はエタノール沈殿処理等の既存の精製工程により精製す
る。

【００２２】次いで、上記のようにして得たバチルス・
サーキュランスU-155株由来で、環状イソマルトオリゴ
糖合成酵素をコードする遺伝子を含有するDNA断片混合
物と切断されたベクターDNAを混合し、これに例えば大
腸菌DNAリガーゼ〔ニューイングランドバイオラブス社
製〕T4DNAリガーゼ〔ベーリンガーマンハイム社製〕
等、好ましくはT4DNAリガーゼを、温度４〜37℃、好ま
しくは４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニットで1時間以
上、好ましくは６〜24時間作用させて組み換え体DNAを
得る。本工程は、市販のライゲーションキット〔宝酒造
社製〕を用いて行なうことも可能である。

【００２３】この組み換え体DNAを用いて、例えば大腸
菌K-12、好ましくは大腸菌JM101（ATCC33876)、大腸菌J
M109〔宝酒造社製〕、大腸菌HB101（ATCC33694)、大腸
菌DH1(ATCC33849)、大腸菌χ1776 (ATCC31244)、大腸菌
XL1〔東洋紡社製〕等を形質転換あるいは形質導入して
夫々の菌株を得る。この形質転換は、ディー・エム・モ
ーリソン（D.M.Morrison）の方法〔メソヅ・イン・エン
ザイモロジー（Methodsin Enzymology)、第68巻、第326
〜331頁（1979年）〕により行なうことができる。また
形質導入は、ビー・ホーン（B.Hohn）の方法〔メソズ・
イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology)、第
68巻、第299〜309頁（1979年）〕によって行なうことが
できる。

【００２４】そして、上記菌株より環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素生産能を有する菌株をスクリーニングする
ことにより、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素をコード
する遺伝子を含有するDNAをベクターDNAに挿入した組み
換え体DNAを含み、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素生
産能を有するエッシェリシア属に属する菌株を得ること
ができる。

【００２５】このようにして得られた菌株より純化され
た新規な組み換え体DNAを得るには、例えば、ピー・グ
ーリー（P.Guerry）等の方法〔ジェイ．バクテリオロジ
ー（J.Bacteriology）、第116巻、第1,064〜1,066頁（1
973年）〕、ディー・ビー・クレウェル（D.B.Clewell)
の方法〔ジェイ．バクテリオロジー（J.Bacteriolog
y)、第110巻、第667〜676頁（1972年）〕等により得る
ことができる。

【００２６】更に上記環状イソマルトオリゴ糖合成酵素
遺伝子を含有するDNAを用いて、実施例２の項目(4)に示
すようにTaqポリメラーゼを用いたサンガー・ジデオキ
シ・ターミネーション（Sanger/dideoxy termination）
法によって環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子の全
塩基配列の解析を行ない（配列番号２参照）、次いで前
記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプ
チドのアミノ酸一次配列を確定する（配列番号１参
照）。

【００２７】なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列
において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もし
くは置換されており、かつ、環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素活性をもたらすアミノ酸配列をコードする環状イ
ソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子は、全て本発明に含く
まれる。

【００２８】そして、配列番号１に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失も
しくは置換されており、かつ、環状イソマルトオリゴ糖
合成酵素活性をもたらすアミノ酸配列をコードする環状
イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を得るには、如何な
る方法でもよく、例えば、点変異または欠失変異を生じ
させるために遺伝子を変異源処理する方法；遺伝子を選
択的に開裂し、次いで選択されたヌクレオチドを除去ま
たは付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチ
ド変異誘発法等が挙げられる。

【００２９】上記の様にして得られた環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素をコードする遺伝子を含有するDNAをベ
クターDNAに挿入した組み換え体DNAを含み、環状イソマ
ルトオリゴ糖合成酵素生産能を有するエッシェリシア属
に属する菌株を用いて環状イソマルトオリゴ糖合成酵素
を生産するには、培養方法は、原則的には一般微生物の
好気的培養で採用される方法と同様であるが、通常は、
液体培地による振盪培養法または、通気攪拌培養法等が
好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大
豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に
燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、
硫酸第二鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以
上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等、或
いはアンピシリン等の抗生物質を適宜添加したものが用
いられる。なお、初発pHは、７〜９に調製するのが適当
である。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４
〜24時間、好ましくは６〜24時間実施するのが好まし
い。

【００３０】培養終了後、該培養物より環状イソマルト
オリゴ糖合成酵素を採取するには、通常の酵素採取手段
を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を
超音波破砕処理、摩砕処理等で破砕するか、または、リ
ゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、ま
たは、トルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己
消化をおこなわせ本酵素を菌体外に排出させる。この溶
菌液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要に
よりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩ある
いは硫酸マンガンにより除核酸したのち、これに硫安、
アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採
取し、これを水に透析した後真空乾燥して粗酵素標品を
得る。

【００３１】更に、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の
精製標品を得るには、例えばDEAE-セファロース〔ジエ
チルアミンエチルセファロース、ファルマシア社製〕、
DEAE-セファデックス〔ファルマシア社製〕等のイオン
交換クロマトグラフィー、あるいは、例えばセファデッ
クスG−200〔ファルマシア社製〕、バイオラッドP−150
〔バイオラッド社製〕等のゲル濾過による各種クロマト
グラフィーを行ない、必要により、例えばTSK gel DEAE
-5PW〔東ソー社製〕等のイオン交換クロマトグラフィー
あるいは、例えば、TSK gel エーテル5PW〔東ソー社
製〕、TSK gel フェニル5PW〔東ソー社製〕等の疎水ク
ロマトグラフィー、あるいは、例えばTSK gel G3,000SW
〔東ソー社製〕等のHPLC（高速液体クロマトグラフィ
ー）操作を適宜組合せて実施することにより、高度に精
製された環状イソマルトオリゴ糖合成酵素標品を得るこ
とができる。

【００３２】上記遺伝子操作手段により得られる精製環
状イソマルトオリゴ糖合成酵素の理化学的性質は、親株
由来の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の性質と全く同
様である。

【００３３】

【発明の実施の形態】以下に、実施例を挙げて本発明を
更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。

【００３４】

【実施例】

〔実施例１〕1%デキストラン40（名糖産業社製）、1%ペ
プトン（極東製薬工業社製）、0.5%NaCl及び0.1%イース
トエキス（ディフコ社製）からなる液体培地（水道水使
用、pH 7.0)100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、120℃
で20分間、殺菌処理を行なった。これに、バチルス・サ
ーキュランスU-155菌株（FERM P-15491) 保存スラント
より１白金耳接種し、30℃で１日間振盪培養した。本培
養液10mlを上記と同様の培地組成と殺滅菌条件により調
製した2ｌの培地を含有する3ｌ容ミニジャーファーメン
ター８基に各々接種し、30℃、0.5vvm、300rpmの条件で
３日間通気攪拌培養を行ない、培養終了後、培養液16ｌ
を遠心分離処理により除菌し、得られた除菌液を更に分
子量6,000カットのフォロファイバーにより約200mlにま
で濃縮した。本濃縮液を用いて、新規環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素の精製を行なった。先ず、本濃縮液に対
して、終濃度1.0Mになるように硫安を加え、遠心分離に
より不溶物を除去した。上澄液を以下の操作による分取
用HPLCで精製した。上澄液を1.0M硫安含有の100mMリン
酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel Phenyl5PWカラム
にアプライし、同緩衝液で洗浄後、1.0〜0Mの硫安濃度
勾配により吸着タンパク質を溶出した。集めた活性画分
40mlを限外濾過で約1mlに濃縮した後、1mM EDTA含有の1
0mMリン酸緩衝液(pH7.0)20mlを加えて塩濃度を稀釈し、
再度限外濃縮を行なった。本溶液を1mM EDTA含有の10mM
リン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel DEAE5PWカラムに
アプライし同緩衝液で洗浄後０〜0.5MのNaCl濃度勾配に
より吸着タンパク質を溶出した。集めた活性画分8mlを
2.0mlまで限外濃縮した。200mMNaCl含有の100mMリン酸
緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel G3,000SWカラムに、
0.2mlずつ酵素溶液をアプライし、同緩衝液により溶出
した。本操作を残り1.8mlについて同様に行なった(0.2m
lずつ９回）。得られた活性画分を集めてSDS PAGEに供
したところ、シングルバンドを示したことから、他の夾
雑タンパク質は除去されたと判断し精製を終了した。本
精製酵素をデキストランとインキュベーションしたとこ
ろ、反応初期に於いてデキストランからサイクロイソマ
ルトヘプタオースが主生成物として生成されていること
が確認された。

【００３５】〔実施例２〕 (1)バチルス・サーキュランスU-155株の染色体DNA及びS
au3A1による部分消化DNA断片の調製 1%デキストラン40
〔名糖産業社製〕、1%ペプトン〔極東製薬工業社製〕、
0.5% NaCl及び0.1%酵母エキス〔ディフコ社製〕からな
る液体培地（水道水使用、pH 7.0)100mlを500ml容坂口
フラスコに入れ、120℃で20分間、滅菌処理を行なっ
た。これに、バチルス・サーキュランスU-155菌株（FER
M P-15491）保存スラントより１白金耳接種し、30℃で
１日間振盪培養した。本培養液1mlを上記と同様の培地
組成と滅菌条件により調製した100mlの培地を含有する
坂口フラスコに接種し、30℃、120rpmの条件で３日間振
盪培養を行ない、培養終了後、培養液から8,000rpmで20
分間の遠心分離処理により菌体を分離し、湿潤菌体約50
mgを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法〔バイオケ
ム．バイオフィズ．アクタ．(Biochim. Biophys. Act
a)、第72巻、第619頁（1963年）〕により染色体DNA溶液
1mlを得た。

【００３６】次いで、この染色体溶液360μl（約200μg
染色体DNA）及び制限酵素Sau3A1〔宝酒造社製〕0.2ユニ
ットを、50mMトリス−塩酸緩衝液（100mM NaCl及び10mM
MgSO4含有）（pH7.4）に混合し、37℃で１時間反応さ
せて部分消化液を得た。反応終了液を常法により、フェ
ノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理して、Sau3
A1で部分消化されたバチルス・サーキュランスU-155菌
株の染色体DNA断片160μgを得た。

【００３７】(2)プラスミドベクターpUC118DNAを利用し
たバチルス・サーキュランスU-155菌株の染色体DNAライ
ブラリーの作製及び環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺
伝子の検索 プラスミドベクターpUC118DNA〔宝酒造社製〕20μg及び
制限酵素BamHＩ〔宝酒造社製〕10ユニットを、50mMトリ
ス−塩酸緩衝液（100mM NaCl及び10mM MgSO4含有）（pH
7.4）に混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液を
得た。

【００３８】反応終了液を常法により、フェノール抽出
処理し、エタノール沈殿処理した後、このBamH1で水解
されたDNA断片が再結合することを防止するために、モ
レキュラー・クローニング（Molecular Cloning)、第13
3〜134頁記載の方法で子牛ホスファターゼ（Calf Intes
tine Alkaline Phosphatase)処理により、DNA断片の脱
リン酸化反応を行ない、常法により、フェノール抽出処
理し、更にエタノール沈殿処理して、BamHＩで消化され
たプラスミドベクターpUC118を得た。

【００３９】次いで、このBamHＩで消化されたプラスミ
ドベクターpUC118DNA断片1μg、上記項目(1)で得られた
Sau3A1で部分消化されたバチルス・サーキュランスU-15
5菌株の染色体DNA断片1μg及びDNAライゲーションキッ
ト〔宝酒造社製〕を常法に従って混合後、温度16℃で16
時間反応し、DNAを連結させた。

【００４０】このようにして得た組み換え体プラスミド
DNA含有液10μlを大腸菌コンピテントセル（XL1)〔東洋
紡社製〕100μlと混合し、氷中で20分間静置することに
より形質転換を行なった。本形質転換液110μlを前記と
同様の滅菌条件により調製した滅菌済T-Y培地［1%（W/
V）バクト−トリプトン〔ディフコ社製〕、0.5%（W/V）
イーストエキストラクト〔ディフコ社製〕及び0.5%（W/
V）NaCl（pH7.2）］3mlに接種し、37℃で30分間振盪培
養した後、培養液を200μl先ず滅菌済ブルーデキストラ
ン含有X-Galプレート［0.5%(W/V)ブルーデキストラン
〔ファルマシア社製〕、1%（W/V）バクト−トリプトン
〔ディフコ社製〕、0.5%（W/V）イーストエキストラク
ト〔ディフコ社製〕、0.5%（W/V）NaCl、1.5%寒天（pH
7.2）を前記と同様の滅菌条件により滅菌処理したもの
に、滅菌済フィルター（孔径 0.22μm)〔ミリポア社
製〕で無菌濾過したIPTG（Isopropyl-β-D-thiogalacto
pyranoside）〔ベーリンガーマンハイム社製〕、X-Gal
（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactopyranoside）
〔ベーリンガーマンハイム社製〕及びアンピシリン〔シ
グマ社製〕を無菌的に添加して夫々、50μg/ml（W/V）I
PTG、40μg/ml（W/V）X-Gal及び25μg/ml（W/V）アンピ
シリンの濃度に調製した培地を直径9cmのシャーレに20m
lずつ分注したプレート］に塗布し、37℃で24時間静地
培養した。生じたコロニーのうち、白色コロニーのもの
を染色体DNAライブラリーとし、ライブラリーの中でコ
ロニーのまわりにクリアーハローを生じる菌株を検索し
た。その結果、染色体DNAライブラリー約2000コロニー
より陽性コロニーを１株得た。該陽性株を前記と同様の
滅菌条件により調製した滅菌済T-Y培地にアンピシリン
及びIPTGを各々終濃度50μg/mlになるように、無菌的に
添加して調製した液体培地3mlに１白金耳接種後、37℃
で16時間振盪培養を行ない培養終了後、培養液を8,000r
pmで20分間遠心分離することにより菌体を分離し、湿潤
菌体約2mgを得た。

【００４１】該菌体から、〔モレキュラー・クローニン
グ・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディ
ション(Molecular Cloning a Laboratory Manual Secon
d Edition)、第25〜28頁、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press)、1989年〕記載のアルカリ法により環状
イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含んだプラスミド
DNAを抽出し、常法に従いエタノール沈殿処理により精
製した後、200μlのTE(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0)
緩衝液に溶解した。該組み換え体プラスミドDNAをpCI81
1と命名した。該プラスミドDNAを用いて〔ジェイ．バク
テリオロジー（J. Bacteriology)第119巻、第1072頁〜1
074頁 (1974年)〕記載の形質転換法により大腸菌XL1株
を形質転換し、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素活性を
検討し、形質転換株を得た。

【００４２】この様にして得られた大腸菌XL1(pCI811)
は、平成８年２月２９日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所にFERM P-15492として寄託されている。更
に、本組み換え体プラスミドDNA1μgを制限酵素HindIII
（ベーリンガーマンハイム社製）、BamHＩ（宝酒造社
製）及びEcoRＩ〔ベーリンガーマンハイム社製〕、Pst
Ｉ〔ベーリンガーマンハイム社製〕を組み合せて処理す
ることにより切断した後、常法に従い0.7%及び1.5%アガ
ロースゲル電気泳動を行ない各DNA断片の長さを調べる
ことにより、制限酵素開裂地図を作成し、更に環状イソ
マルトオリゴ糖合成酵素をコードする遺伝子を含有する
DNA断片をアガロース電気泳動にかけた結果、3.86 Kb
の大きさであった。 (3)大腸菌XL1(pCI811)の培養及び粗酵素液の調製 大腸菌XL1(pCI811)(FERM P-15492)を、T-Y培地3ml中で
温度37℃で16時間振盪培養した後、培養液を氷中で２分
間超音波処理し、12,000rpmで20分間遠心分離操作をす
ることにより、細胞残渣を取り除いて得た粗酵素液中の
環状イソマルトオリゴ糖合成酵素活性は、約3mU/mlであ
った。なお、比較の為pUC118ベクターDNAを有する大腸
菌JM109を用いて、上記と同様の処理を行なって得た細
胞抽出液中の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素活性を測
定した結果、活性は検出されなかった。

【００４３】(4)バチルス・サーキュランスU-155株（FE
RM P-15491)由来の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺
伝子の塩基配列の解析 項目(2)で得られた組み換え体プラスミドpCI811DNA10μ
gを制限酵素SacＩ〔ベーリンガーマンハイム社製〕１ユ
ニット、XbaＩ〔宝酒造社製〕１ユニット、制限酵素用
緩衝液〔ベーリンガーマンハイム社製〕２μl及び滅菌
水10μlと混合して、37℃で１時間処理することにより
切断し、反応溶液を1.5%アガロースゲル電気泳動操作に
供した。目的のDNA断片をゲルから常法に従って抽出し
た後、エタノール沈殿処理を行なって約５μgの精製DNA
断片を得た。

【００４４】次いで、SacＩ〔ベーリンガーマンハイム
社製〕１ユニット、XbaＩ〔宝酒造社製〕１ユニット、
制限酵素用緩衝液〔ベーリンガーマンハイム社製〕２μ
l及び滅菌水19μlと混合して37℃で１時間反応を行なっ
たpUC119ベクターDNA1μgと該精製DNA約2.5μg及びライ
ゲーションキット〔宝酒造社製〕を混合し、連結反応を
16℃で16時間行なった。該反応液を用いて〔ジェイ．バ
クテリオロジー（J. Bacteriology)第119巻、第1,072頁
〜1,074頁 (1974年)〕記載の形質転換法により大腸菌XL
1株を形質転換し、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素活
性を検討し、形質転換株を得た。更に、該形質転換株の
培養液10mlから、〔モレキュラー・クローニング・ア・
ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション
（Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edi
tion) 第25〜28頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laborator
y Press)、1989年〕記載のアルカリ法により組み換え体
プラスミドDNAを約20μg得、該プラスミドをpCI918と命
名した。このプラスミドは、pCI811に挿入されている環
状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有したDNA断
片が逆向きに挿入されている以外はpCI811と基本的には
全く同じである。

【００４５】次いで、組み換え体プラスミドDNApCI811
及びpCI918を用いてキロシークエンス用欠失キット〔宝
酒造社製〕を用い、ヘニコフ（Henikoff)の方法［ジー
ン（Gene)、第28巻、第351〜359頁、（1984年）］に従
い、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子に種々の欠
失が導入されたプラスミドDNAを作製し、項目(2)と同様
にして大腸菌XL1(東洋紡社製）を形質転換した。この様
にして得られた大腸菌から種々の欠失導入プラスミドを
再度調製し、得られた２本鎖DNAによるシークエンシン
グは、タックポリメラーゼシークエンシングキット（Ta
q polymerase sequencing kit) [アプライド・バイオシ
ステム・インスツルメント〔ABI社製〕］及びDNAシーク
エンサー［アプライド・バイオシステム・インスツルメ
ント〔ABI社製〕］を用いて、常法に従って行なった。

【００４６】

【発明の効果】本発明の新規な環状イソマルトオリゴ糖
合成酵素遺伝子の組み換え体DNAを含むエッシェリシア
属に属する菌株を培地に培養することにより、短時間で
新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を得ることがで
きる。この酵素を用いて抗う蝕作用の極めて強いサイク
ロイソマルトヘプタオースを効率良く製造することがで
きる。従って、本発明は産業上極めて有用なものであ
る。

【００４７】

【配列表】

１．配列番号１ (1)配列の長さ：964 (2)配列の型：アミノ酸 (3)トポロジー：直鎖状 (4)配列の種類：タンパク質 (5)配列： Met Arg Val Lys Ile Leu Pro Leu Val Phe Met Thr Leu Leu Leu 15 Ile Val Pro Ser Gln Met Leu Leu Pro Ser Gly Gln Ala Asn Ala 30 Ser Thr Pro Gly Phe Ile Glu Arg Val Tyr Thr Asp Lys Ala Arg 45 Tyr Glu Pro Gly Glu Leu Val Thr Val Thr Ala Gln Ile Asn Asn 60 Ser Gly Gly Thr Asn Trp Ser Gly Asp Val Thr Met Thr Ile Phe 75 His Leu Glu Asn Ala Val Tyr Ser Ser Val Gln His Ala Ser Ile 90 Ala Ser Gly Gln Thr Thr Asp Val Thr Phe Ser Trp Thr Ser Asp 105 Thr Thr Asp Phe Lys Gly Tyr Phe Val Ser Val Asp Ala Gly Ser 120 Leu Gly Gln Gly Tyr Ser Ser Ile Asp Val Ser Ser Asp Phe Ala 135 Lys Tyr Pro Arg Tyr Gly Tyr Ile Ser Glu Phe Ser Ser Asn Glu 150 Thr Ala Ala Glu Ser Ala Ala Lys Val Asn Glu Leu Ala Gln Asp 165 Tyr Lys Ile Asn Ala Trp Gln Phe Tyr Asp Trp Met Trp Arg His 180 Glu Thr Met Ile Lys Arg Thr Gly Gly Thr Ile Asp Pro Thr Trp 195 Ile Asp Leu Phe Asn Arg Gln Ile Ser Trp Pro Thr Ile Asn Asn 210 Gln Ile Ala Ala Ile His Asn Gln Asn Gly Ala Ala Met Ala Tyr 225 Ala Met Ile Tyr Ala Ala Arg Glu Asn Tyr Ser Gly Phe Gly Val 240 Asn Pro Glu Trp Gly Met Tyr Met Asp Pro Ala His Thr Lys Gln 255 Leu Asp Val Asp Phe Gly Asn Asn Ser Thr Tyr Met Tyr Leu Phe 270 Asp Pro Ala Asn Ala Gly Trp Gln Gln Phe Ile His Glu Gln Tyr 285 Leu Asp Ala Ile Gln Thr Ala Asn Phe Asp Gly Ile His Ile Asp 300 Gln Met Gly Gln Arg Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Ser Gly Asn Ser 315 Ile Asp Leu Ala Thr Arg Phe Thr Pro Phe Ile Lys Ala Ala Lys 330 Thr Lys Leu Thr Ala Ala Asn Ser Asn Gln Asp Phe Met Thr Phe 345 Asn Ile Val Asp Gly Thr Val Asn Gly Trp Ala Ala Asn Asp Val 360 Ser Lys Asn Ala Asn Val Asp Phe Leu Tyr Ser Glu Ile Trp His 375 Leu Ser Asn Ser Tyr Met Gln Leu Lys Asp Tyr Ile Asp Ser Leu 390 Arg Ala Asn Ser Gly Asn Lys Ala Val Val Leu Ala Ala Tyr Met 405 Asn Tyr Gly Glu Asn Ile Gly Asp Arg Tyr Glu Ala Glu Asp Ala 420 Ala Leu Gln His Thr Ala Val Asn Thr Asp His Ala Gly Tyr Thr 435 Gly Ser Gly Phe Val Asp Gln Phe Ala Asp Val Asn Asp Ser Val 450 Thr Phe Thr Ile Thr Ala Pro Glu Glu Gly Tyr Tyr Ser Leu Val 465 Phe Arg Phe Ala Asn His Ser Gly Tyr Thr Ala Thr Arg Asn Leu 480 Tyr Tyr Asp Ser Asn Phe Glu Ile Glu Leu Pro Phe Gln Asn Gln 495 Pro Asn Trp Asp Thr Trp Ser His Glu Thr Trp His Gln Val Tyr 510 Leu Thr Pro Gly Thr His Thr Ile Lys Leu Ser Tyr Asp Ser Ser 525 Asn Thr Gly Ala Ile Asn Leu Asp Ser Leu Thr Leu Gly Thr Phe 540 Asp Glu His Ser Ile Arg Leu Ala Asp Ala Met Met Ala Ala Ser 555 Gly Ala Thr His Ile Glu Leu Gly Glu Asp Ser Gln Met Leu Ala 570 His Glu Tyr Tyr Pro Asn Arg Ser Lys Ser Met Arg Ser Thr Leu 685 Lys Ser Ala Met Lys Asp His Tyr Asn Phe Ile Thr Ala Tyr Glu 600 Asn Leu Leu Phe Asp Ala Asp Val Ile Asp Asn Asp Ala Gly Lys 615 Gln Phe Ile Asn Ile Ala Gly Val Asn Thr Ser Pro Asp Gly Ala 630 Ala Asn Thr Val Trp His Met Ser Lys Arg Thr Pro Glu Tyr Asn 645 Ile Leu His Leu Ile Asn Leu Val Asn Asn Asp Gln Asn Trp Arg 660 Asn Ser Gly Asn Gln Pro Thr Ala Gln Thr Asn Leu Ala Thr Lys 675 Val Tyr Ile Gly Ala Glu Glu Thr Ile Thr Gly Val Tyr Ala Ala 690 Ser Pro Asp His Asn Gln Gly Ala Thr Gln Ser Leu Pro Phe Thr 705 Thr Gly Thr Asp Ser Ser Gly Ser Tyr Ile Ser Phe Thr Val Pro 720 Ser Leu Glu Tyr Trp Ser Met Ile Tyr Met Lys Arg Ser Thr Ala 735 Ala Pro Val Asp Asn Met Tyr Glu Ala Glu Thr Ala Ile Lys Ser 750 Asn Val Ser Val Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Gly 765 Phe Val Asp Gln Phe Ala Thr Val Asn Asp Gly Val Ser Phe Ile 780 Val His Ala Ser Ser Lys Asp Asp Tyr Val Leu Arg Phe Arg Tyr 795 Ser Asn Gly Gly Ser Asp Ala Asn Arg Asp Val Phe Leu Asn Gly 810 Lys Tyr Ala Gly Thr Val Gln Leu Lys His Thr Gly Gly Trp Asn 825 Gln Trp Ala Tyr Gly Glu Leu Thr Val Pro Leu Ala Gln Gly Ser 840 His Ser Val Val Leu Trp Tyr Asn Ser Ser Asn Ser Gly Ala Val 855 Asn Leu Asp His Leu Lys Leu Asp Lys Thr Tyr Ile Trp Gln Phe 870 Asp Arg Gln Ile Ala Ser Val Pro Ala Gly Tyr Arg Ile Thr Phe 885 Lys Ala Gly Leu Pro Gly Trp Val His Phe Gly Thr Asp Asn Trp 900 Lys Asn Val Met Asp Ile Pro Leu Ala Ser Asn Gly Ser Ser Asp 915 Ser Ser Leu Asn Tyr Glu Ala Ser Ile Gly Pro Phe Pro Ser Ala 930 Thr Thr Val Asp Val Thr Phe Leu Trp Asp Asp Asn Asn Asn Gly 945 Ile Leu Glu Asp Met Ile Asp Arg Trp Glu Gly Thr Asp Phe Gln 960 Ile Ala Ile Pro 964

【００４８】２．配列番号２ (1)配列の長さ：2,892 (2)配列の型：核酸 (3)トポロジー：直鎖状 (4)配列の種類：Genomic DNA (5)起源：バチルス・サーキュランスU-155 (6)配列： ＡＴＧＡＧＡＧＴＡＡ ＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣ ＧＣＴＡＧＴＡＴＴＣ ＡＴＧ
ＡＣＴＴＴＧＣ ＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴ ＴＣＣＡＴＣＧＣＡＡ ６０ ＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣ ＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡ ＡＧＣＡＡＡＴＧＣＴ ＴＣＡ
ＡＣＴＣＣＣＧ ＧＣＴＴＣＡＴＡＧＡ ＡＣＧＣＧＴＧＴＡＴ １２０ ＡＣＧＧＡＴＡＡＡＧ ＣＣＣＧＴＴＡＣＧＡ ＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧ ＣＴＧ
ＧＴＴＡＣＣＧ ＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡ ＡＡＴＣＡＡＴＡＡＣ １８０ ＴＣＣＧＧＧＧＧＧＡ ＣＣＡＡＣＴＧＧＡＧ ＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣ ＡＣＣ
ＡＴＧＡＣＴＡ ＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴ ＣＧＡＡＡＡＴＧＣＡ ２４０ ＧＴＡＴＡＴＴＣＴＴ ＣＣＧＴＣＣＡＡＣＡ ＴＧＣＡＡＧＴＡＴＣ ＧＣＧ
ＡＧＣＧＧＴＣ ＡＡＡＣＡＡＣＣＧＡ ＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣ ３００ ＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡ ＧＣＧＡＴＡＣＧＡＣ ＴＧＡＣＴＴＣＡＡＡ ＧＧＣ
ＴＡＣＴＴＣＧ ＴＡＡＧＴＧＴＴＧＡ ＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣ ３６０ ＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧ ＧＣＴＡＴＴＣＣＴＣ ＡＡＴＣＧＡＴＧＴＡ ＴＣＡ
ＡＧＣＧＡＣＴ ＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡ ＴＣＣＣＣＧＴＴＡＣ ４２０ ＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡ ＧＴＧＡＡＴＴＴＴＣ ＣＴＣＣＡＡＴＧＡＡ ＡＣＡ
ＧＣＧＧＣＴＧ ＡＡＡＧＣＧＣＣＧＣ ＴＡＡＧＧＴＴＡＡＣ ４８０ ＧＡＡＴＴＡＧＣＴＣ ＡＡＧＡＴＴＡＴＡＡ ＡＡＴＣＡＡＣＧＣＴ ＴＧＧ
ＣＡＧＴＴＴＴ ＡＣＧＡＴＴＧＧＡＴ ＧＴＧＧＣＧＧＣＡＴ ５４０ ＧＡＡＡＣＧＡＴＧＡ ＴＣＡＡＧＣＧＣＡＣ ＣＧＧＣＧＧＡＡＣＧ ＡＴＣ
ＧＡＣＣＣＧＡ ＣＣＴＧＧＡＴＴＧＡ ＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣ ６００ ＡＧＡＣＡＡＡＴＴＴ ＣＴＴＧＧＣＣＡＡＣ ＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴ ＣＡＧ
ＡＴＣＧＣＣＧ ＣＣＡＴＴＣＡＴＡＡ ＴＣＡＧＡＡＣＧＧＡ ６６０ ＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧ ＣＴＴＡＴＧＣＴＡＴ ＧＡＴＣＴＡＴＧＣＣ ＧＣＧ
ＡＧＡＧＡＡＡ ＡＴＴＡＴＴＣＣＧＧ ＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣ ７２０ ＡＡＴＣＣＣＧＡＧＴ ＧＧＧＧＣＡＴＧＴＡ ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣ ＧＣＴ
ＣＡＴＡＣＧＡ ＡＧＣＡＧＣＴＴＧＡ ＴＧＴＡＧＡＣＴＴＴ ７８０ ＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴ ＣＣＡＣＴＴＡＴＡＴ ＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣ ＧＡＴ
ＣＣＣＧＣＣＡ ＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧ ＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴ ８４０ ＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣ ＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡ ＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧ ＡＣＣ
ＧＣＧＡＡＴＴ ＴＴＧＡＣＧＧＣＡＴ ＴＣＡＴＡＴＴＧＡＴ ９００ ＣＡＡＡＴＧＧＧＡＣ ＡＧＣＧＣＡＡＣＡＡ ＴＡＴＴＴＡＣＧＡＴ ＴＡＴ
ＴＣＡＧＧＣＡ ＡＣＡＧＴＡＴＣＧＡ ＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣ ９６０ ＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣ ＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡ ＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡ ＡＣＣ
ＡＡＧＣＴＴＡ ＣＴＧＣＧＧＣＡＡＡ ＴＴＣＣＡＡＴＣＡＡ １０２０ ＧＡＣＴＴＴＡＴＧＡ ＣＡＴＴＴＡＡＴＡＴ ＴＧＴＡＧＡＣＧＧＣ ＡＣＴ
ＧＴＣＡＡＴＧ ＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣ ＧＡＡＴＧＡＴＧＴＧ １０８０ ＡＧＣＡＡＡＡＡＣＧ ＣＣＡＡＴＧＴＣＧＡ ＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣ ＡＧＣ
ＧＡＡＡＴＴＴ ＧＧＣＡＣＣＴＣＴＣ ＣＡＡＴＡＧＣＴＡＴ １１４０ ＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡ ＡＡＧＡＣＴＡＣＡＴ ＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧ ＡＧＡ
ＧＣＡＡＡＴＡ ＧＣＧＧＣＡＡＴＡＡ ＡＧＣＧＧＴＣＧＴＴ １２００ ＣＴＴＧＣＣＧＣＣＴ ＡＴＡＴＧＡＡＣＴＡ ＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴ ＡＴＣ
ＧＧＡＧＡＣＣ ＧＣＴＡＴＧＡＧＧＣ ＧＧＡＧＧＡＴＧＣＧ １２６０ ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣ ＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴ ＡＡＡＴＡＣＣＧＡＴ ＣＡＴ
ＧＣＣＧＧＣＴ ＡＣＡＣＡＧＧＧＴＣ ＣＧＧＡＴＴＴＧＴＡ １３２０ ＧＡＴＣＡＧＴＴＴＧ ＣＣＧＡＴＧＴＣＡＡ ＴＧＡＴＴＣＣＧＴＴ ＡＣＴ
ＴＴＴＡＣＡＡ ＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣ ＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣ １３８０ ＴＡＣＴＡＣＴＣＴＣ ＴＣＧＴＡＴＴＣＣＧ ＧＴＴＴＧＣＣＡＡＴ ＣＡＴ
ＴＣＣＧＧＣＴ ＡＴＡＣＧＧＣＣＡＣ ＡＣＧＣＡＡＴＴＴＡ １４４０ ＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡ ＧＣＡＡＣＴＴＴＧＡ ＧＡＴＴＧＡＧＣＴＧ ＣＣＴ
ＴＴＴＣＡＡＡ ＡＣＣＡＧＣＣＡＡＡ ＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡ １５００ ＴＧＧＴＣＧＣＡＴＧ ＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡ ＴＣＡＧＧＴＧＴＡＴ ＴＴＧ
ＡＣＣＣＣＣＧ ＧＣＡＣＴＣＡＴＡＣ ＡＡＴＣＡＡＧＣＴＣ １５６０ ＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡ ＧＣＡＧＣＡＡＴＡＣ ＡＧＧＣＧＣＧＡＴＣ ＡＡＴ
ＣＴＧＧＡＴＡ ＧＣＣＴＴＡＣＧＣＴ ＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣ １６２０ ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＴ ＣＣＡＴＴＣＧＣＣＴ ＴＧＣＧＧＡＣＧＣＣ ＡＴＧ
ＡＴＧＧＣＴＧ ＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣ ＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣ １６８０ ＧＡＧＣＴＴＧＧＣＧ ＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡ ＧＡＴＧＣＴＣＧＣＴ ＣＡＣ
ＧＡＧＴＡＣＴ ＡＴＣＣＡＡＡＣＣＧ ＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣ １７４０ ＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡ ＣＧＴＴＧＡＡＧＡＧ ＣＧＣＡＡＴＧＡＡＧ ＧＡＴ
ＣＡＣＴＡＴＡ ＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣ ＣＧＣＣＴＡＴＧＡＡ １８００ ＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴ ＴＣＧＡＴＧＣＧＧＡ ＴＧＴＣＡＴＣＧＡＴ ＡＡＴ
ＧＡＴＧＣＧＧ ＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴ ＴＡＴＴＡＡＣＡＴＴ １８６０ ＧＣＣＧＧＣＧＴＴＡ ＡＴＡＣＡＡＧＣＣＣ ＴＧＡＣＧＧＡＧＣＡ ＧＣＴ
ＡＡＴＡＣＧＧ ＴＡＴＧＧＣＡＴＡＴ ＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣ １９２０ ＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴ ＡＣＡＡＴＡＴＣＣＴ ＴＣＡＴＣＴＴＡＴＣ ＡＡＣ
ＣＴＡＧＴＧＡ ＡＣＡＡＴＧＡＴＣＡ ＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣ １９８０ ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＡ ＡＴＣＡＧＣＣＧＡＣ ＡＧＣＴＣＡＧＡＣＧ ＡＡＴ
ＣＴＧＧＣＡＡ ＣＴＡＡＧＧＴＡＴＡ ＴＡＴＣＧＧＣＧＣＴ ２０４０ ＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡ ＴＣＡＣＧＧＧＣＧＴ ＴＴＡＴＧＣＧＧＣＴ ＴＣＧ
ＣＣＴＧＡＴＣ ＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧ ＧＧＣＣＡＣＧＣＡＧ ２１００ ＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴ ＴＣＡＣＴＡＣＣＧＧ ＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣ ＡＧＴ
ＧＧＣＡＧＣＴ ＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴ ＣＡＣＧＧＴＴＣＣＴ ２１６０ ＴＣＣＣＴＧＧＡＡＴ ＡＴＴＧＧＡＧＣＡＴ ＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧ ＡＡＡ
ＡＧＡＴＣＧＡ ＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣ ＴＧＴＣＧＡＣＡＡＴ ２２２０ ＡＴＧＴＡＴＧＡＡＧ ＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣ ＣＡＴＣＡＡＡＴＣＣ ＡＡＴ
ＧＴＴＴＣＣＧ ＴＧＡＡＴＡＣＡＡＡ ＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣ ２２８０ ＴＡＴＡＣＡＧＧＣＡ ＧＣＧＧＡＴＴＴＧＴ ＣＧＡＴＣＡＧＴＴＣ ＧＣＣ
ＡＣＣＧＴＣＡ ＡＴＧＡＣＧＧＣＧＴ ＡＴＣＣＴＴＴＡＴＣ ２３４０ ＧＴＴＣＡＴＧＣＣＡ ＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡ ＴＧＡＴＴＡＣＧＴＣ ＣＴＧ
ＣＧＣＴＴＣＣ ＧＴＴＡＣＡＧＣＡＡ ＴＧＧＡＧＧＴＴＣＧ ２４００ ＧＡＣＧＣＡＡＡＣＡ ＧＡＧＡＴＧＴＡＴＴ ＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣ ＡＡＧ
ＴＡＴＧＣＧＧ ＧＡＡＣＴＧＴＧＣＡ ＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴ ２４６０ ＡＣＡＧＧＡＧＧＣＴ ＧＧＡＡＴＣＡＡＴＧ ＧＧＣＣＴＡＣＧＧＣ ＧＡＡ
ＣＴＣＡＣＣＧ ＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣ ＴＣＡＡＧＧＡＴＣＧ ２５２０ ＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧ ＴＣＣＴＣＴＧＧＴＡ ＴＡＡＣＡＧＣＡＧＣ ＡＡＴ
ＡＧＣＧＧＡＧ ＣＣＧＴＴＡＡＴＣＴ ＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣ ２５８０ ＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡ ＡＡＡＣＧＴＡＴＡＴ ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴ ＧＡＣ
ＣＧＣＣＡＧＡ ＴＴＧＣＡＴＣＣＧＴ ＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣ ２６４０ ＴＡＴＣＧＣＡＴＴＡ ＣＡＴＴＣＡＡＡＧＣ ＣＧＧＣＴＴＧＣＣＧ ＧＧＡ
ＴＧＧＧＴＴＣ ＡＴＴＴＴＧＧＡＡＣ ＡＧＡＴＡＡＴＴＧＧ ２７００ ＡＡＡＡＡＴＧＴＴＡ ＴＧＧＡＴＡＴＣＣＣ ＴＣＴＣＧＣＣＴＣＴ ＡＡＣ
ＧＧＣＴＣＡＡ ＧＣＧＡＴＴＣＣＡＧ ＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴ ２７６０ ＧＡＡＧＣＧＴＣＧＡ ＴＣＧＧＴＣＣＧＴＴ ＣＣＣＴＡＧＣＧＣＧ ＡＣＴ
ＡＣＴＧＴＡＧ ＡＴＧＴＴＡＣＡＴＴ ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＴ ２８２０ ＧＡＣＡＡＴＡＡＣＡ ＡＣＧＧＴＡＴＴＣＴ ＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧ ＡＴＡ
ＧＡＣＣＧＣＴ ＧＧＧＡＡＧＧＡＡＣ ＡＧＡＣＴＴＴＣＡＡ ２８８０ ＡＴＣＧＣＡＡＴＴＣ ＣＧ
２８９２

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するバチルス・
   サーキュランス由来の環状イソマルトオリゴ糖合成酵
   素。 作用 デキストラン等のα-1、6結合よりなるグルコースポリ
   マーに作用して、サイクロイソマルトヘプタオースを主
   成分とする環状イソマルトオリゴ糖を生成する。 基質特異性 α-1、6結合を主鎖とするデキストランには作用する
   が、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適作用pH及び安定pH範囲 pH6.0付近で作用し、pH4.5〜9.0の範囲で安定である。作用適温の範囲 15分間作用させた場合、55℃付近が最適である。 温度による失活の条件 温度60℃で15分間の熱処理により完全に失活する。 分子量 SDS PAGE法で約10万であった。
2. 【請求項２】 配列番号１に示されるアミノ酸配列また
   は、該アミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
   が付加、欠失もしくは置換されており、かつ、環状イソ
   マルトオリゴ糖合成酵素活性をもたらすアミノ酸配列を
   コードする環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の環状イソマルトオリゴ
   糖合成酵素遺伝子を含有し、下記の制限酵素開裂地図を
   有する3.86KbのDNA断片。
4. 【請求項４】 請求項２または請求項３記載の環状イソ
   マルトオリゴ糖合成酵素遺伝子または該遺伝子を含有す
   るDNA断片をベクターDNAに組み込んでなる組み換え体DN
   A。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組み換え体DNAを含み、
   エッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養
   物より環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を採取すること
   を特徴とする環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造
   法。