JPH05317056A - コリンオキシダーゼをコードするｄｎａおよびその用途 - Google Patents
コリンオキシダーゼをコードするｄｎａおよびその用途Info
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- JPH05317056A JPH05317056A JP5008835A JP883593A JPH05317056A JP H05317056 A JPH05317056 A JP H05317056A JP 5008835 A JP5008835 A JP 5008835A JP 883593 A JP883593 A JP 883593A JP H05317056 A JPH05317056 A JP H05317056A
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- Japan
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- choline oxidase
- choline
- dna
- dna fragment
- oxidase
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】発酵法による工業的に有利なコリンオキシダー
ゼの製造法を提供する。 【構成】コリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片。
該ＤＮＡ断片を用い形質転換したコリンオキシダーゼ生
産能を有する微生物。該微生物を用いたコリンオキシダ
ーゼの生産方法。 【効果】本発明によると、コリンオキシダーゼを高収
率、高純度かつ容易に製造することができる。得られた
コリンオキシダーゼは、コリンの定量分析等の化学分
析、血清中のコリンエステラーゼの測定やリン脂質の測
定等の臨床検査などに有用に使用される。
ゼの製造法を提供する。 【構成】コリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片。
該ＤＮＡ断片を用い形質転換したコリンオキシダーゼ生
産能を有する微生物。該微生物を用いたコリンオキシダ
ーゼの生産方法。 【効果】本発明によると、コリンオキシダーゼを高収
率、高純度かつ容易に製造することができる。得られた
コリンオキシダーゼは、コリンの定量分析等の化学分
析、血清中のコリンエステラーゼの測定やリン脂質の測
定等の臨床検査などに有用に使用される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるコリンオ
キシダーゼの製造法、その製造法に用いられる新規微生
物および該微生物を作出するのに有用な新規ＤＮＡ断片
に関する。
キシダーゼの製造法、その製造法に用いられる新規微生
物および該微生物を作出するのに有用な新規ＤＮＡ断片
に関する。
【０００２】
【従来の技術】コリンオキシダーゼは、化学分析や臨床
検査などに用いられる。たとえば化学分析においてはコ
リンの定量分析、臨床検査においては、血清中のコリン
エステラーゼの測定、また、ホスホリパーゼＤと組み合
わせて使用することにより、リン脂質の測定などに広く
用いられる。コリンオキシダーゼ（Ｅ.Ｃ. １．１．
３．１７）は、アースロバクター属細菌（特公昭６０−
４７１６号、特公昭６０−４６９５３号）、アルカリゲ
ネス属細菌（特開昭５４−１７１８２号）、ブレビバク
テリウム属細菌（特開昭５３−６６４９２号）、コリネ
バクテリウム属細菌（特開昭５４−２３１９１号）、ア
スペルギルス属糸状菌（特開昭５３−５２６８７号）、
シリンドロカーボン属、フザリウム属、ジベラ属糸状菌
（特開昭５４−３５２８４号）、ペニシリウム属糸状菌
（特開昭５６−９２７８７号）、ストレプトマイセス属
放線菌（特開昭５７−１３２８８０号）等により、生産
されることが知られている。これらの菌によって生産さ
れるコリンオキシダーゼの熱安定性は、アースロバクタ
ー属細菌では、４０℃付近まで安定、アルカリゲネス属
細菌は、３７℃で失活、ブレビバクテリウム属細菌で
は、４５℃、３０分で安定であるが、５０℃では失活す
る。アスペルギルス属糸状菌では、３５℃まで安定であ
るが、４０℃で急速に失活する。ペニシリウム属糸状菌
では、２５℃、６０分で安定である。また、ストレプト
マイセス属放線菌では、４０℃で失活する。コリネバク
テリウム属細菌およびシリンドロカーボン属、フザリウ
ム属、ジベラ属糸状菌などについては熱安定性の記載は
ないが、それらの反応至適温度はいずれも低い。上述の
コリンオキシダーゼの熱安定性は、せいぜい４０℃まで
である。ブレビバクテリウム属細菌のみ４５℃では３０
分まで安定であるが、５０℃では急速に失活する。つま
り、該酵素の反応至適温度はすべて４０℃以下である。
すなわち、従来のコリンオキシダーゼは熱安定性に劣る
という欠点を有していた。このため、たとえば酵素を長
期間使用したり、あるいは酵素を固定化して繰り返し再
使用することはできなかった。また、高温状態で酵素を
使用し得なかった。
検査などに用いられる。たとえば化学分析においてはコ
リンの定量分析、臨床検査においては、血清中のコリン
エステラーゼの測定、また、ホスホリパーゼＤと組み合
わせて使用することにより、リン脂質の測定などに広く
用いられる。コリンオキシダーゼ（Ｅ.Ｃ. １．１．
３．１７）は、アースロバクター属細菌（特公昭６０−
４７１６号、特公昭６０−４６９５３号）、アルカリゲ
ネス属細菌（特開昭５４−１７１８２号）、ブレビバク
テリウム属細菌（特開昭５３−６６４９２号）、コリネ
バクテリウム属細菌（特開昭５４−２３１９１号）、ア
スペルギルス属糸状菌（特開昭５３−５２６８７号）、
シリンドロカーボン属、フザリウム属、ジベラ属糸状菌
（特開昭５４−３５２８４号）、ペニシリウム属糸状菌
（特開昭５６−９２７８７号）、ストレプトマイセス属
放線菌（特開昭５７−１３２８８０号）等により、生産
されることが知られている。これらの菌によって生産さ
れるコリンオキシダーゼの熱安定性は、アースロバクタ
ー属細菌では、４０℃付近まで安定、アルカリゲネス属
細菌は、３７℃で失活、ブレビバクテリウム属細菌で
は、４５℃、３０分で安定であるが、５０℃では失活す
る。アスペルギルス属糸状菌では、３５℃まで安定であ
るが、４０℃で急速に失活する。ペニシリウム属糸状菌
では、２５℃、６０分で安定である。また、ストレプト
マイセス属放線菌では、４０℃で失活する。コリネバク
テリウム属細菌およびシリンドロカーボン属、フザリウ
ム属、ジベラ属糸状菌などについては熱安定性の記載は
ないが、それらの反応至適温度はいずれも低い。上述の
コリンオキシダーゼの熱安定性は、せいぜい４０℃まで
である。ブレビバクテリウム属細菌のみ４５℃では３０
分まで安定であるが、５０℃では急速に失活する。つま
り、該酵素の反応至適温度はすべて４０℃以下である。
すなわち、従来のコリンオキシダーゼは熱安定性に劣る
という欠点を有していた。このため、たとえば酵素を長
期間使用したり、あるいは酵素を固定化して繰り返し再
使用することはできなかった。また、高温状態で酵素を
使用し得なかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、コリン
オキシダーゼは、化学分析やリン脂質測定等の臨床検査
などに用いられる有用な酵素である。そこで、熱に安定
かつ反応至適温度の高い該酵素を安価に効率よく製造す
る方法が望まれていた。
オキシダーゼは、化学分析やリン脂質測定等の臨床検査
などに用いられる有用な酵素である。そこで、熱に安定
かつ反応至適温度の高い該酵素を安価に効率よく製造す
る方法が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な現状に鑑み、研究を重ね、熱安定性のすぐれたコリン
オキシダーゼについて報告した（特開平２−２２７０７
２号）。さらに、該コリンオキシダーゼを効率よく得る
ため、新たに、上述のコリンオキシダーゼを生産し得る
サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦＯ １４０
５０（Thermoactinomyces monosporusＩＦＯ １４０５
０）より、該コリンオキシダーゼをコードするＤＮＡを
クローニングし、ストレプトマイセス・リビダンス Ｔ
Ｋ６４（Streptomyces lividans ＴＫ６４）で発現させ
ることに成功した。本発明者らは、これらの知見に基づ
いて、さらに鋭意研究した結果、本発明を完成した。す
なわち、本発明は（１）コリンオキシダーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片、（２）コリンオキシダーゼ
が耐熱性を有する上記（１）記載のＤＮＡ断片、（３）
遺伝子が放線菌由来である上記（１）または（２）記載
のＤＮＡ断片、（４）放線菌がサーモアクチノマイセス
属菌である上記（３）記載のＤＮＡ断片、（５）式 -G
lu-Phe-Asp-Tyr-Val-Val-Val-Gly-Gly- で表されるア
ミノ 酸配列をＮ末端近傍にコードする上記（１）記載
のＤＮＡ断片、（６）上記（１）ないし（５）記載のＤ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミド、（７）上記（６）記
載のプラスミドで形質転換した微生物および（８）上記
（７）記載の微生物を培養し、培養液中にコリンオキシ
ダーゼを生成蓄積させることを特徴とするコリンオキシ
ダーゼの製造法である。
な現状に鑑み、研究を重ね、熱安定性のすぐれたコリン
オキシダーゼについて報告した（特開平２−２２７０７
２号）。さらに、該コリンオキシダーゼを効率よく得る
ため、新たに、上述のコリンオキシダーゼを生産し得る
サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦＯ １４０
５０（Thermoactinomyces monosporusＩＦＯ １４０５
０）より、該コリンオキシダーゼをコードするＤＮＡを
クローニングし、ストレプトマイセス・リビダンス Ｔ
Ｋ６４（Streptomyces lividans ＴＫ６４）で発現させ
ることに成功した。本発明者らは、これらの知見に基づ
いて、さらに鋭意研究した結果、本発明を完成した。す
なわち、本発明は（１）コリンオキシダーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片、（２）コリンオキシダーゼ
が耐熱性を有する上記（１）記載のＤＮＡ断片、（３）
遺伝子が放線菌由来である上記（１）または（２）記載
のＤＮＡ断片、（４）放線菌がサーモアクチノマイセス
属菌である上記（３）記載のＤＮＡ断片、（５）式 -G
lu-Phe-Asp-Tyr-Val-Val-Val-Gly-Gly- で表されるア
ミノ 酸配列をＮ末端近傍にコードする上記（１）記載
のＤＮＡ断片、（６）上記（１）ないし（５）記載のＤ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミド、（７）上記（６）記
載のプラスミドで形質転換した微生物および（８）上記
（７）記載の微生物を培養し、培養液中にコリンオキシ
ダーゼを生成蓄積させることを特徴とするコリンオキシ
ダーゼの製造法である。
【０００５】本発明のコリンオキシダーゼは耐熱性を有
するものが好ましい。ｐＨ７〜９（トリス・塩酸緩衝
液）において５０℃で安定なものがさらに好ましい。遺
伝子は放線菌由来であるのが好ましく、該放線菌は好熱
性であるのが好ましい。さらに、サーモアクチノマイセ
ス属菌が好ましい。サーモアクチノマイセス属菌の具体
例として、サーモアクチノマイセス・モノスポラス Ｉ
ＦＯ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus Ｉ
ＦＯ １４０５０）等があげられる。上記のＩＦＯ番号
は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）における受託番号を
示す。サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦＯ
１４０５０については、ＩＦＯ発行リスト・オブ・カル
チャーズ（LIST OF CULTURES）第１８版，第１巻，１９
８８年に記載されている公知株である。本発明のコリン
オキシダーゼをコードするＤＮＡを製造する方法を以下
に述べる。本発明におけるコリンオキシダーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、コリンオキシダー
ゼをコードするＤＮＡまたは単にコリンオキシダーゼＤ
ＮＡと称することもある）は、例えば（ｉ）好熱性放線
菌、サーモアクチノマイセス・モノスポラス ＩＦＯ
１４０５０（Thermoactinomyces monosporus ＩＦＯ
１４０５０）からＤＮＡを分離し、（ii）該ＤＮＡをプ
ラスミドまたはファージ・ベクターに組み込み、（ii
i）得られた組み換えプラスミドまたは組み換えファー
ジで宿主を形質転換し、（iv）得られた形質転換体を培
養後、形質転換体から適当な方法、たとえば４−アミノ
アンチピリンを用いた発色による活性発現アッセイ、ま
たはＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼー
ション法により、目的とするＤＮＡを含有するプラスミ
ドを単離し、（v）そのプラスミドから目的とするクロ
ーン化ＤＮＡを切り出し、必要に応じ該クローン化ＤＮ
Ａを適当なプラスミドにサブクローニングして得られた
形質転換体によっても製造することができる。
するものが好ましい。ｐＨ７〜９（トリス・塩酸緩衝
液）において５０℃で安定なものがさらに好ましい。遺
伝子は放線菌由来であるのが好ましく、該放線菌は好熱
性であるのが好ましい。さらに、サーモアクチノマイセ
ス属菌が好ましい。サーモアクチノマイセス属菌の具体
例として、サーモアクチノマイセス・モノスポラス Ｉ
ＦＯ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus Ｉ
ＦＯ １４０５０）等があげられる。上記のＩＦＯ番号
は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）における受託番号を
示す。サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦＯ
１４０５０については、ＩＦＯ発行リスト・オブ・カル
チャーズ（LIST OF CULTURES）第１８版，第１巻，１９
８８年に記載されている公知株である。本発明のコリン
オキシダーゼをコードするＤＮＡを製造する方法を以下
に述べる。本発明におけるコリンオキシダーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、コリンオキシダー
ゼをコードするＤＮＡまたは単にコリンオキシダーゼＤ
ＮＡと称することもある）は、例えば（ｉ）好熱性放線
菌、サーモアクチノマイセス・モノスポラス ＩＦＯ
１４０５０（Thermoactinomyces monosporus ＩＦＯ
１４０５０）からＤＮＡを分離し、（ii）該ＤＮＡをプ
ラスミドまたはファージ・ベクターに組み込み、（ii
i）得られた組み換えプラスミドまたは組み換えファー
ジで宿主を形質転換し、（iv）得られた形質転換体を培
養後、形質転換体から適当な方法、たとえば４−アミノ
アンチピリンを用いた発色による活性発現アッセイ、ま
たはＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼー
ション法により、目的とするＤＮＡを含有するプラスミ
ドを単離し、（v）そのプラスミドから目的とするクロ
ーン化ＤＮＡを切り出し、必要に応じ該クローン化ＤＮ
Ａを適当なプラスミドにサブクローニングして得られた
形質転換体によっても製造することができる。
【０００６】さらに、具体的にはコリンオキシダーゼＤ
ＮＡは次の方法により製造することができる。まず、コ
リンオキシダーゼをコードする遺伝子を有する微生物、
例えば、サーモアクチノマイセス・モノスポラス ＩＦ
Ｏ １４０５０（Thermoactinomycesmonosporus ＩＦＯ
１４０５０）等から自体公知の方法に従いＤＮＡを分
離する。得られたＤＮＡをプラスミド又はファージ・ベ
クター、好ましくはプラスミドに組み込み、例えば放線
菌、大腸菌または酵母のライブラリーを調製する。該Ｄ
ＮＡを組み込むプラスミドは、宿主内で複製保持される
ものであれば、いずれも用いることができる。大腸菌、
放線菌等のプラスミドが好ましく、放線菌のプラスミド
がさらに好ましい。具体例として大腸菌のｐＢＲ３２２
〔ジーン（Gene），２，９５（１９７７）〕、ｐＢＲ３
２５〔ジーン（Gene），４，１２１（１９７８）〕、ｐ
ＵＣ１３〔ジーン（Gene），１９，２５９（１９８
２）〕等、放線菌のｐＩＪ６１〔ジーン（Gene），２
０，５１（１９８２）〕、ｐＩＪ７０２〔ジャーナル
ジェネラル マイクロバイオロジー（J. Gen. Microbio
l.），１２９，２７０３（１９８３）〕等が挙げられ
る。目的ＤＮＡをプラスミドベクターに組み込む方法と
しては、自体公知の方法、例えばManiatis, T.,らモレ
キュラークローニング（Molecular Cloning），コール
ド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory）, ２３９，１９８２、Hopwood,
D.A.らジェネティック・マニプレイション・オブ・スト
レプトマイセス、ア・ラボラトリー・マニュアル（Gene
tic Manipulation of Streptomyces, a Laboratory Man
ual）に記載の方法などが挙げられる。
ＮＡは次の方法により製造することができる。まず、コ
リンオキシダーゼをコードする遺伝子を有する微生物、
例えば、サーモアクチノマイセス・モノスポラス ＩＦ
Ｏ １４０５０（Thermoactinomycesmonosporus ＩＦＯ
１４０５０）等から自体公知の方法に従いＤＮＡを分
離する。得られたＤＮＡをプラスミド又はファージ・ベ
クター、好ましくはプラスミドに組み込み、例えば放線
菌、大腸菌または酵母のライブラリーを調製する。該Ｄ
ＮＡを組み込むプラスミドは、宿主内で複製保持される
ものであれば、いずれも用いることができる。大腸菌、
放線菌等のプラスミドが好ましく、放線菌のプラスミド
がさらに好ましい。具体例として大腸菌のｐＢＲ３２２
〔ジーン（Gene），２，９５（１９７７）〕、ｐＢＲ３
２５〔ジーン（Gene），４，１２１（１９７８）〕、ｐ
ＵＣ１３〔ジーン（Gene），１９，２５９（１９８
２）〕等、放線菌のｐＩＪ６１〔ジーン（Gene），２
０，５１（１９８２）〕、ｐＩＪ７０２〔ジャーナル
ジェネラル マイクロバイオロジー（J. Gen. Microbio
l.），１２９，２７０３（１９８３）〕等が挙げられ
る。目的ＤＮＡをプラスミドベクターに組み込む方法と
しては、自体公知の方法、例えばManiatis, T.,らモレ
キュラークローニング（Molecular Cloning），コール
ド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory）, ２３９，１９８２、Hopwood,
D.A.らジェネティック・マニプレイション・オブ・スト
レプトマイセス、ア・ラボラトリー・マニュアル（Gene
tic Manipulation of Streptomyces, a Laboratory Man
ual）に記載の方法などが挙げられる。
【０００７】次に、このようにして得られたプラスミド
ベクターを宿主に導入する。宿主としては、例えば大腸
菌、放線菌、枯草菌、酵母等があげられる。好ましく
は、大腸菌、放線菌である。上記大腸菌の例としては、
エシェリヒア・コリＫ１２ ＤＨ１（Esherichia coli
Ｋ１２ ＤＨ１）〔プロシージング オブ ナショナル
アカデミー オブサイエンス（Pro., Natl. Acad. Sc
i., U.S.A.）６０，１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３
〔ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucl. Acids. R
es.），９，３０９（１９８１）〕、ＪＡ２２１〔ジャ
ーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J. Mol.
Biol.），１２０，５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１
〔ジャ ーナル オブ モレキュラー バイオロジー
（J. Mol. Biol.），４１，４５９ （１９６９）〕及び
Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９，４４
０（１９５４）〕等が挙げられる。放線菌の例として
は、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ６４（Stre
ptomyces lividans ＴＫ６４）及びその誘導体〔ジェネ
テックス・マニプレイション・オブ・ストレプトマイセ
ス・ア・ラボラトリー・マニュアル(Genetics Manipula
tion of Streptomyces, a Laboratory Manual)〕等が挙
げられる。これらのうち、ストレプトマイセス・リビダ
ンス ＴＫ６４、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１が好
ましい。
ベクターを宿主に導入する。宿主としては、例えば大腸
菌、放線菌、枯草菌、酵母等があげられる。好ましく
は、大腸菌、放線菌である。上記大腸菌の例としては、
エシェリヒア・コリＫ１２ ＤＨ１（Esherichia coli
Ｋ１２ ＤＨ１）〔プロシージング オブ ナショナル
アカデミー オブサイエンス（Pro., Natl. Acad. Sc
i., U.S.A.）６０，１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３
〔ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucl. Acids. R
es.），９，３０９（１９８１）〕、ＪＡ２２１〔ジャ
ーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J. Mol.
Biol.），１２０，５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１
〔ジャ ーナル オブ モレキュラー バイオロジー
（J. Mol. Biol.），４１，４５９ （１９６９）〕及び
Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９，４４
０（１９５４）〕等が挙げられる。放線菌の例として
は、ストレプトマイセス・リビダンス ＴＫ６４（Stre
ptomyces lividans ＴＫ６４）及びその誘導体〔ジェネ
テックス・マニプレイション・オブ・ストレプトマイセ
ス・ア・ラボラトリー・マニュアル(Genetics Manipula
tion of Streptomyces, a Laboratory Manual)〕等が挙
げられる。これらのうち、ストレプトマイセス・リビダ
ンス ＴＫ６４、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１が好
ましい。
【０００８】プラスミドで宿主を形質転換する方法とし
ては、自体公知の方法に従えばよい。例えば、大腸菌を
用いる場合は、Maniatis, T.,らモレキュラークローニ
ング(Molecular Cloning）、〔コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborat
ory）, ２３９（１９８２）〕等に記載のカルシュウム
クロライド法、あるいはカルシュウムクロライド／ルビ
ジュウムクロライド法などが挙げられる。例えば、放線
菌を用いる場合は、Hopwood, D.A.らジェネティック・
マニプレイション・オブ・ストレプトマイセス、ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Genetics Manipulation of S
treptomyces, a Laboratory Manual）に記載のプロトプ
ラスト法等によって行われる。上述のようにして得られ
た大腸菌または放線菌ＤＮＡライブラリーからコリンオ
キシダーゼＤＮＡをクローニングする方法としては、自
体公知の方法、例えば、４−アミノアンチピリン、フェ
ノール及びペルオキシダーゼを用い、過酸化水素存在下
において発色させる機能発現を用いる方法、アミノ酸配
列にもとづいて化学合成したオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法
〔Maniatis, T.,らモレキュラークローニング（Molecul
ar Cloning），Cold Spring Harbor Laboratory,（１９
８２）〕等が挙げられる。このようにしてクローン化さ
れたコリンオキシダーゼＤＮＡは、必要に応じ、プラス
ミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、
ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１
９、ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ６１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ
４８６又はｐＩＪ４２５等にサブクローニングしてもよ
い。このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、自体
公知の方法、例えばマキサム・ギルバート（Maxam-Gilb
ert）法〔Maxam, A.M. and Gilbert, W., プロシージン
グ オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
（Pro. Natl. Acad.Sci., U.S.A.） ７４，５６０（１
９７７）〕あるいはジデオキシ法〔Messing,J.ら、ヌク
レイ ック アシッズ リサーチ（Nucl. Acids. Re
s.），９，３０９（１９８１）〕、あるいはデアザ法
〔Mizusawa, S., ら、ヌクレイック アシッズ リサー
チ（Nucl. Acids. Res.），１４，１３１９（１９８
６）〕などによって決定する。
ては、自体公知の方法に従えばよい。例えば、大腸菌を
用いる場合は、Maniatis, T.,らモレキュラークローニ
ング(Molecular Cloning）、〔コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborat
ory）, ２３９（１９８２）〕等に記載のカルシュウム
クロライド法、あるいはカルシュウムクロライド／ルビ
ジュウムクロライド法などが挙げられる。例えば、放線
菌を用いる場合は、Hopwood, D.A.らジェネティック・
マニプレイション・オブ・ストレプトマイセス、ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Genetics Manipulation of S
treptomyces, a Laboratory Manual）に記載のプロトプ
ラスト法等によって行われる。上述のようにして得られ
た大腸菌または放線菌ＤＮＡライブラリーからコリンオ
キシダーゼＤＮＡをクローニングする方法としては、自
体公知の方法、例えば、４−アミノアンチピリン、フェ
ノール及びペルオキシダーゼを用い、過酸化水素存在下
において発色させる機能発現を用いる方法、アミノ酸配
列にもとづいて化学合成したオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法
〔Maniatis, T.,らモレキュラークローニング（Molecul
ar Cloning），Cold Spring Harbor Laboratory,（１９
８２）〕等が挙げられる。このようにしてクローン化さ
れたコリンオキシダーゼＤＮＡは、必要に応じ、プラス
ミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、
ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１
９、ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ６１、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ
４８６又はｐＩＪ４２５等にサブクローニングしてもよ
い。このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、自体
公知の方法、例えばマキサム・ギルバート（Maxam-Gilb
ert）法〔Maxam, A.M. and Gilbert, W., プロシージン
グ オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
（Pro. Natl. Acad.Sci., U.S.A.） ７４，５６０（１
９７７）〕あるいはジデオキシ法〔Messing,J.ら、ヌク
レイ ック アシッズ リサーチ（Nucl. Acids. Re
s.），９，３０９（１９８１）〕、あるいはデアザ法
〔Mizusawa, S., ら、ヌクレイック アシッズ リサー
チ（Nucl. Acids. Res.），１４，１３１９（１９８
６）〕などによって決定する。
【０００９】例えば、コリンオキシダーゼＤＮＡの供与
株であるサーモアクチノマイセス・モノスポラス ＩＦ
Ｏ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus ＩＦ
Ｏ１４０５０）を培養してコリンオキシダーゼを生成
し、該コリンオキシダーゼを精製後、アミノ酸シークエ
ンサー（アプライド・バイオシステムズ社，４７１Ａ，
ＵＳＡ）によりそのアミノ酸配列を決定する。該アミノ
酸配列と得られたクローン化されたコリンオキシダーゼ
ＤＮＡのアミノ酸部分配列とを比較することにより、コ
リンオキシダーゼＤＮＡの存在を確認する。その結果、
コリンオキシダーゼの全領域がカバーされていない場合
には、ＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイ
ブリダイゼーションによってコリンオキシダーゼＤＮＡ
の再クローニングを行い、カバーされていない領域を得
る。以上のようにして、コリンオキシダーゼをコードす
るＤＮＡが得られる。本発明のコリンオキシダーゼをコ
ードするＤＮＡの代表例として、後述の実施例２で得ら
れたコリンオキシダーゼをコードするＤＮＡが挙げられ
る。その制限酵素切断地図を〔図１〕に示す。上記のク
ローン化されたコリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ
は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で切
断して断片を小さくすると、その発現量を高めることが
出来る。また、部位特異的変異法〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１００，
４６８ （１９８３）〕などを用いて該プラスミドを改
良することにより上記目的を達成できる。
株であるサーモアクチノマイセス・モノスポラス ＩＦ
Ｏ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus ＩＦ
Ｏ１４０５０）を培養してコリンオキシダーゼを生成
し、該コリンオキシダーゼを精製後、アミノ酸シークエ
ンサー（アプライド・バイオシステムズ社，４７１Ａ，
ＵＳＡ）によりそのアミノ酸配列を決定する。該アミノ
酸配列と得られたクローン化されたコリンオキシダーゼ
ＤＮＡのアミノ酸部分配列とを比較することにより、コ
リンオキシダーゼＤＮＡの存在を確認する。その結果、
コリンオキシダーゼの全領域がカバーされていない場合
には、ＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイ
ブリダイゼーションによってコリンオキシダーゼＤＮＡ
の再クローニングを行い、カバーされていない領域を得
る。以上のようにして、コリンオキシダーゼをコードす
るＤＮＡが得られる。本発明のコリンオキシダーゼをコ
ードするＤＮＡの代表例として、後述の実施例２で得ら
れたコリンオキシダーゼをコードするＤＮＡが挙げられ
る。その制限酵素切断地図を〔図１〕に示す。上記のク
ローン化されたコリンオキシダーゼをコードするＤＮＡ
は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で切
断して断片を小さくすると、その発現量を高めることが
出来る。また、部位特異的変異法〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１００，
４６８ （１９８３）〕などを用いて該プラスミドを改
良することにより上記目的を達成できる。
【００１０】本発明のコリンオキシダーゼの製造法とし
ては、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミドにより形質転換した微
生物を、自体公知の方法に従って培養し、培養液中にコ
リンオキシダーゼを生成蓄積する方法があげられる。該
微生物としては、前記の、放線菌や大腸菌等を宿主とし
た形質転換体等が挙げられる。好ましくは、ストレプト
マイセス・リビダンス ＴＫ６４（Streptomyces livid
ans ＴＫ６４）又はエシェリヒア・コリ ＨＢ １０１
（Esherichiacoli ＨＢ１０１）等を宿主とした形質転
換体等である。例えば、放線菌を用いる場合は、Hopwoo
d, D.A.らジェネティック・マニプレイション・オブ・
ストレプトマイセス、ア・ラボラトリー・マニュアル
（Genetics Manipulation of Streptomyces, a Laborat
ory Manual）に記載の方法等によって行う。例えば、大
腸菌を用いる場合は、Maniatis, T.,らモレキュラーク
ローニング（Molecular Cloning）、〔コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）, ２３９（１９８２）〕等に記載のカル
シュウムクロライド法、あるいはカルシュウムクロライ
ド／ルビジュウムクロライド法などに従って行う。上述
の形質転換体を、自体公知の方法により培養する。例え
ば、炭素源として、グルコース、グリセリン、デキスト
リン、シュクロース、デンプン、糖蜜などを用い、窒素
源としては、コーン・スチープ・リカー、綿実粉（例え
ば、プロフリ（商品名，トレーダー・オイル社製）
等）、生大豆粉、ペプトン、酵母エキス、その他、各種
アンモニュウム塩、硝酸塩などの無機の窒素化合物を用
い、必要に応じリン酸、マグネシウム、ナトリウム、カ
リウム、塩素または硫酸イオンなどを放出し得る種々の
無機塩化合物、さらに生育に必要な微量元素、各種消泡
剤などを加えたものを用いる。培養温度は、通常約１５
〜４０℃、好ましくは約２４〜３０℃である。培養時間
は約１０〜９６時間、好ましくは約２４〜７２時間であ
る。必要に応じて通気や撹拌を加えて培養してもよい。
ては、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミドにより形質転換した微
生物を、自体公知の方法に従って培養し、培養液中にコ
リンオキシダーゼを生成蓄積する方法があげられる。該
微生物としては、前記の、放線菌や大腸菌等を宿主とし
た形質転換体等が挙げられる。好ましくは、ストレプト
マイセス・リビダンス ＴＫ６４（Streptomyces livid
ans ＴＫ６４）又はエシェリヒア・コリ ＨＢ １０１
（Esherichiacoli ＨＢ１０１）等を宿主とした形質転
換体等である。例えば、放線菌を用いる場合は、Hopwoo
d, D.A.らジェネティック・マニプレイション・オブ・
ストレプトマイセス、ア・ラボラトリー・マニュアル
（Genetics Manipulation of Streptomyces, a Laborat
ory Manual）に記載の方法等によって行う。例えば、大
腸菌を用いる場合は、Maniatis, T.,らモレキュラーク
ローニング（Molecular Cloning）、〔コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）, ２３９（１９８２）〕等に記載のカル
シュウムクロライド法、あるいはカルシュウムクロライ
ド／ルビジュウムクロライド法などに従って行う。上述
の形質転換体を、自体公知の方法により培養する。例え
ば、炭素源として、グルコース、グリセリン、デキスト
リン、シュクロース、デンプン、糖蜜などを用い、窒素
源としては、コーン・スチープ・リカー、綿実粉（例え
ば、プロフリ（商品名，トレーダー・オイル社製）
等）、生大豆粉、ペプトン、酵母エキス、その他、各種
アンモニュウム塩、硝酸塩などの無機の窒素化合物を用
い、必要に応じリン酸、マグネシウム、ナトリウム、カ
リウム、塩素または硫酸イオンなどを放出し得る種々の
無機塩化合物、さらに生育に必要な微量元素、各種消泡
剤などを加えたものを用いる。培養温度は、通常約１５
〜４０℃、好ましくは約２４〜３０℃である。培養時間
は約１０〜９６時間、好ましくは約２４〜７２時間であ
る。必要に応じて通気や撹拌を加えて培養してもよい。
【００１１】培養終了後、自体公知の方法で細胞と上清
とを分離する。細胞内に残存するコリンオキシダーゼ
は、常法により、例えば、超音波破砕法、フレンチプレ
スなどを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細
胞溶解酵素による破砕法などにより細胞を破砕し抽出す
る。このようにして得られた抽出液中に含まれるコリン
オキシダーゼは熱処理（６０℃、３０分）を施した後、
通常の蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈殿、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィーなどにしたがって
精製され、目的とするコリンオキシダーゼが得られる。
本発明で得られるコリンオキシターゼは、コリンの定量
分析等の化学分析、血清中のコリンエステラーゼの測定
やリン脂質の測定等の臨床検査などに有用に使用され
る。得られたコリンオキシダーゼの活性は、公知の方法
（特開平２−２２７０７２号）により測定する。０.１
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８.０）１００mlに２.１
ｇの塩化コリンを溶解して得られた２.１％塩化コリン
溶液９７ml、１.０％４−アミノアンチピリン水溶液１.
０ml、および１.０％フェノール水溶液２.１mlを混合す
る。これに、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ製、１００
単位／mg、タイプI、シグマ社、米国）５.０mgを溶解さ
せて反応混液とし、この反応混液３.０mlをキュベット
（ｄ＝１.０cm）にとり、３７℃で５分間予備加温した
後、測定すべきサンプル酵素溶液０.０５mlを添加し、
直記分光光度形（ＵＶ−２６０型、島津製作所）を用い
て、３７℃中、５００nmの吸光度変化を記録し、初期直
線部分から１分間当たりの吸光度変化（△Ａ／min）を
求め酵素活性を下式により求める。 酵素活性（Ｕ／ml）＝△Ａ／min×１０.１７×希釈倍数
とを分離する。細胞内に残存するコリンオキシダーゼ
は、常法により、例えば、超音波破砕法、フレンチプレ
スなどを利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細
胞溶解酵素による破砕法などにより細胞を破砕し抽出す
る。このようにして得られた抽出液中に含まれるコリン
オキシダーゼは熱処理（６０℃、３０分）を施した後、
通常の蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈殿、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィーなどにしたがって
精製され、目的とするコリンオキシダーゼが得られる。
本発明で得られるコリンオキシターゼは、コリンの定量
分析等の化学分析、血清中のコリンエステラーゼの測定
やリン脂質の測定等の臨床検査などに有用に使用され
る。得られたコリンオキシダーゼの活性は、公知の方法
（特開平２−２２７０７２号）により測定する。０.１
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８.０）１００mlに２.１
ｇの塩化コリンを溶解して得られた２.１％塩化コリン
溶液９７ml、１.０％４−アミノアンチピリン水溶液１.
０ml、および１.０％フェノール水溶液２.１mlを混合す
る。これに、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ製、１００
単位／mg、タイプI、シグマ社、米国）５.０mgを溶解さ
せて反応混液とし、この反応混液３.０mlをキュベット
（ｄ＝１.０cm）にとり、３７℃で５分間予備加温した
後、測定すべきサンプル酵素溶液０.０５mlを添加し、
直記分光光度形（ＵＶ−２６０型、島津製作所）を用い
て、３７℃中、５００nmの吸光度変化を記録し、初期直
線部分から１分間当たりの吸光度変化（△Ａ／min）を
求め酵素活性を下式により求める。 酵素活性（Ｕ／ml）＝△Ａ／min×１０.１７×希釈倍数
【００１２】なお、本明細書において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Comm
ission on Biochemical Nomenclature による略号ある
いは、当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体
がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａｌａ アラニン Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｇｌｙ グリシン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｔｙｒ チロシン Ｖａｌ バリン
などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Comm
ission on Biochemical Nomenclature による略号ある
いは、当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体
がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａｌａ アラニン Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｇｌｙ グリシン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｔｙｒ チロシン Ｖａｌ バリン
【００１３】
【実施例】以下に、参考例及び実施例を挙げて、本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れることはない。パーセント（％）は、特記のない限
り、重量／重量パーセントを表示する。なお、以下の実
施例１で得られた形質転換体 ストレプトマイセス・リ
ビダンス ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１（Streptomyces l
ividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１，ＩＦＯ １５２５
５，ＦＥＲＭ ＢＰ−３７１４）は、平成４年１月９日
から財団法人発行研究所（ＩＦＯ）に、ＩＦＯ １５２
５５として、また平成４年１月１８日から通商産業省微
生物工業技術院研究所（ＦＲＩ）に、ＦＥＲＭＢＰ−３
７１４として寄託されている。 参考例１ サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦ
Ｏ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus ＩＦ
Ｏ １４０５０）の染色体ＤＮＡの調製 サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦＯ １４０
５０をトリプトース・ソイ・ブロス（ベクトン・ディキ
ンソン社）２０mlを含む２００ml容三角フラスコ内で２
８℃、４２時間振盪培養した。得られた湿菌体（４ｇ）
を２０mlのバッファーＡ液〔（０.３Ｍ シュクロー
ス、２５mＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、２５mＭ トリス・
塩酸バッファー（ｐＨ８））〕に懸濁し、これに卵白リ
ゾチームを２mg／mlの濃度になるように添加し、３７℃
で１時間穏やかに振盪した。これに、８mlの２％ＳＤＳ
を添加し、２〜３回穏やかに混合した。この溶液にクロ
ロホルム５ml、バッファーＡで飽和したフェノール５ml
を添加し撹拌後、遠心分離機にかけ（３０００rpm，２
０分）ＤＮＡを抽出した。このフェノール抽出を、２〜
３回繰り返した後に、ＤＮＡ溶液の１／１０量の３Ｍ酢
酸カリウム溶液および２倍量の氷冷エタノールを加えＤ
ＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離により集
めた後、７０％エタノールで洗浄し、真空中で乾燥し保
存した。
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れることはない。パーセント（％）は、特記のない限
り、重量／重量パーセントを表示する。なお、以下の実
施例１で得られた形質転換体 ストレプトマイセス・リ
ビダンス ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１（Streptomyces l
ividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１，ＩＦＯ １５２５
５，ＦＥＲＭ ＢＰ−３７１４）は、平成４年１月９日
から財団法人発行研究所（ＩＦＯ）に、ＩＦＯ １５２
５５として、また平成４年１月１８日から通商産業省微
生物工業技術院研究所（ＦＲＩ）に、ＦＥＲＭＢＰ−３
７１４として寄託されている。 参考例１ サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦ
Ｏ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus ＩＦ
Ｏ １４０５０）の染色体ＤＮＡの調製 サーモアクチノマイセス・モノスポラスＩＦＯ １４０
５０をトリプトース・ソイ・ブロス（ベクトン・ディキ
ンソン社）２０mlを含む２００ml容三角フラスコ内で２
８℃、４２時間振盪培養した。得られた湿菌体（４ｇ）
を２０mlのバッファーＡ液〔（０.３Ｍ シュクロー
ス、２５mＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、２５mＭ トリス・
塩酸バッファー（ｐＨ８））〕に懸濁し、これに卵白リ
ゾチームを２mg／mlの濃度になるように添加し、３７℃
で１時間穏やかに振盪した。これに、８mlの２％ＳＤＳ
を添加し、２〜３回穏やかに混合した。この溶液にクロ
ロホルム５ml、バッファーＡで飽和したフェノール５ml
を添加し撹拌後、遠心分離機にかけ（３０００rpm，２
０分）ＤＮＡを抽出した。このフェノール抽出を、２〜
３回繰り返した後に、ＤＮＡ溶液の１／１０量の３Ｍ酢
酸カリウム溶液および２倍量の氷冷エタノールを加えＤ
ＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離により集
めた後、７０％エタノールで洗浄し、真空中で乾燥し保
存した。
【００１４】実施例１ コリンオキシダーゼをコードす
るＤＮＡを含有する組換えプラスミド及びそれを導入し
た形質転換体の作製 参考例１で得たサーモアクチノマイセス・モノスポラス
ＩＦＯ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus
ＩＦＯ １４０５０）の全ＤＮＡを６塩基認識の制限酵
素ＳphＩで完全消化した。ｐＩＪ７０２をベクターとし
て用い、これを同じ制限酵素で切断したのち、ＣＩＰ
（Calf intestine phosphatase）処理を施した。これら
を混合後、ライゲーションキット（宝酒造、日本）を用
いてライゲーションした。次いでストレプトマイセス・
リビダンス ＴＫ６４（Streptomyceslividans ＴＫ６
４）にトランスフォーメイションした（効率、約８×１
０5／μgＤＮＡ）。再生してきたコロニーを、ＣＯＤレ
プリカ用培地〔ＩＳＰ−２培地（ディフコ・ラボラトリ
ーズ、米国）に、培地用寒天粉末（和光純薬，日本）を
２.０％濃度となるように加えたもの〕にレプリカし、
２８℃で４日間培養した。コリンオキシダーゼのクロー
ニング株の検出は、生育してきたコロニーを、６０℃、
３時間の熱処理を施し、宿主ストレプトマイセス・リビ
ダンス由来の酵素を失活させた後、その上からＣＯＤ検
出用ソフトアガー〔０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８.０）１００mlに、２.１ｇの塩化コリンを溶解して得
られた２.１％塩化コリン溶液９７ml、１.０％４−アミ
ノアンチピリン水溶液１.０ml、および１.０％フェノー
ル水溶液２.１mlの混合液に、培地用寒天粉末（和光純
薬、日本）水溶液を最終０.４％濃度となるように等容
量加え、これにペルオキシダーゼ（西洋ワサビ製、１０
０単位／mg、タイプＩ、シグマ社、米国）１０.０mgお
よび卵白リゾチーム（和光純薬、日本）０.８ｇを溶解
させたもの〕１０mlを注入、固化した後、３７℃で５時
間培養し、赤く発色してくるコロニーを選択した。約２
２,０００コロニーの中から１コロニーのみ発色するも
のが見出され、これより形質転換体が、ストレプトマイ
セス・リビダンス ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１（Strept
omyces lividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１，ＩＦＯ
１５２５５，ＦＥＲＭ ＢＰ−３７１４）が得られた。
この形質転換体より、常法（Maniatis, T.ら；Molecula
r Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory p.９０
（１９８２））により組換えプラスミドを抽出し、Ｓph
Ｉで切断し、分子量をアガロースゲル電気泳動により調
べたところ、プラスミドベクターpＩＪ７０２に約５.６
kbのＤＮＡ断片が挿入されていることがわかった。この
約５.６kbのＳphＩ断片は、常法に従い数種の制限酵素
により特徴づ けられた（図１参照）。上記のように得
られた組換えプラスミド（pＴＢＣ１０１と命名）は
（生物学的に）活性をもつコリンオキシダーゼをコード
している。
るＤＮＡを含有する組換えプラスミド及びそれを導入し
た形質転換体の作製 参考例１で得たサーモアクチノマイセス・モノスポラス
ＩＦＯ １４０５０（Thermoactinomyces monosporus
ＩＦＯ １４０５０）の全ＤＮＡを６塩基認識の制限酵
素ＳphＩで完全消化した。ｐＩＪ７０２をベクターとし
て用い、これを同じ制限酵素で切断したのち、ＣＩＰ
（Calf intestine phosphatase）処理を施した。これら
を混合後、ライゲーションキット（宝酒造、日本）を用
いてライゲーションした。次いでストレプトマイセス・
リビダンス ＴＫ６４（Streptomyceslividans ＴＫ６
４）にトランスフォーメイションした（効率、約８×１
０5／μgＤＮＡ）。再生してきたコロニーを、ＣＯＤレ
プリカ用培地〔ＩＳＰ−２培地（ディフコ・ラボラトリ
ーズ、米国）に、培地用寒天粉末（和光純薬，日本）を
２.０％濃度となるように加えたもの〕にレプリカし、
２８℃で４日間培養した。コリンオキシダーゼのクロー
ニング株の検出は、生育してきたコロニーを、６０℃、
３時間の熱処理を施し、宿主ストレプトマイセス・リビ
ダンス由来の酵素を失活させた後、その上からＣＯＤ検
出用ソフトアガー〔０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８.０）１００mlに、２.１ｇの塩化コリンを溶解して得
られた２.１％塩化コリン溶液９７ml、１.０％４−アミ
ノアンチピリン水溶液１.０ml、および１.０％フェノー
ル水溶液２.１mlの混合液に、培地用寒天粉末（和光純
薬、日本）水溶液を最終０.４％濃度となるように等容
量加え、これにペルオキシダーゼ（西洋ワサビ製、１０
０単位／mg、タイプＩ、シグマ社、米国）１０.０mgお
よび卵白リゾチーム（和光純薬、日本）０.８ｇを溶解
させたもの〕１０mlを注入、固化した後、３７℃で５時
間培養し、赤く発色してくるコロニーを選択した。約２
２,０００コロニーの中から１コロニーのみ発色するも
のが見出され、これより形質転換体が、ストレプトマイ
セス・リビダンス ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１（Strept
omyces lividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１，ＩＦＯ
１５２５５，ＦＥＲＭ ＢＰ−３７１４）が得られた。
この形質転換体より、常法（Maniatis, T.ら；Molecula
r Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory p.９０
（１９８２））により組換えプラスミドを抽出し、Ｓph
Ｉで切断し、分子量をアガロースゲル電気泳動により調
べたところ、プラスミドベクターpＩＪ７０２に約５.６
kbのＤＮＡ断片が挿入されていることがわかった。この
約５.６kbのＳphＩ断片は、常法に従い数種の制限酵素
により特徴づ けられた（図１参照）。上記のように得
られた組換えプラスミド（pＴＢＣ１０１と命名）は
（生物学的に）活性をもつコリンオキシダーゼをコード
している。
【００１５】実施例２ コリンオキシダーゼの生産 実施例１で得られた形質転換体 ストレプトマイセス・
リビダンス ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１（Streptomyces
lividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１）を、フラスコ
培養し、コリンオキシダーゼの生産性を調べた。２００
ml容三角フラスコに分注滅菌（１２０℃，２０分）した
種培地〔酵母エキス（日本製薬（株））４％、麦芽エキ
ス（ディフコ・ラボラトリーズ、米国）１.０％、デキ
ストリン１.０％、コーン・スティープ・リカー１.０
％、塩化コリ ン１.０％、炭酸カルシウム０.５％、
（ｐＨ６.５）〕２０mlに、実施例１で得 られたコリン
オキシダーゼ遺伝子を保有した形質転換体の斜面培養物
を接種し、２８℃で４８時間回転振盪機上（２００回転
／分）で培養した。その培養物１mlを、２００ml容三角
フラスコに２５ml分注滅菌（１２０℃，２０分）した生
産培地〔デキストリン５％、プロフロ（綿実粉)(商品
名、トレーダー・オイル社、米国）１％、コーン・ステ
ィープ・リカー２％、カゼイン１％、塩化コリン２％、
リン酸二カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０２
％、アクトコール（商品名、武田薬品、日本）０.２
％、（ｐＨ６.５）〕に移植し、回転振盪機上（２００
回転／分）で、２８℃、９０時間培養した。かくして得
られた培養液１０mlを遠心分離（３０００回転／分，１
０分）に付し、培養菌体を集め、蒸留水で２回洗浄後、
得られた洗菌体に２mg／mlの卵白リゾチームを含む０.
０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）２mlを加え十
分に撹拌して菌体を懸濁させた。この懸濁液を３７℃、
１２０分間反応させ菌体を溶解し、コリンオキシダーゼ
を抽出した。菌体溶解液を遠心分離（１５０００回転／
分，１０分）に付し、上清液を得た。 これを無細胞抽
出液とし、先に述べた方法を用いてそのコリンオキシダ
ーゼ活性を測定し、培養液中の酵素生産量を算出した。
対照の菌株として、ＤＮＡ供与株であるサーモアクチノ
マイセス・モノスポラス ＩＦＯ １４０５０のコリン
オキシダーゼの生産量についても同様の方法で算出し
た。その結果を〔表１〕に示す。
リビダンス ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１（Streptomyces
lividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１）を、フラスコ
培養し、コリンオキシダーゼの生産性を調べた。２００
ml容三角フラスコに分注滅菌（１２０℃，２０分）した
種培地〔酵母エキス（日本製薬（株））４％、麦芽エキ
ス（ディフコ・ラボラトリーズ、米国）１.０％、デキ
ストリン１.０％、コーン・スティープ・リカー１.０
％、塩化コリ ン１.０％、炭酸カルシウム０.５％、
（ｐＨ６.５）〕２０mlに、実施例１で得 られたコリン
オキシダーゼ遺伝子を保有した形質転換体の斜面培養物
を接種し、２８℃で４８時間回転振盪機上（２００回転
／分）で培養した。その培養物１mlを、２００ml容三角
フラスコに２５ml分注滅菌（１２０℃，２０分）した生
産培地〔デキストリン５％、プロフロ（綿実粉)(商品
名、トレーダー・オイル社、米国）１％、コーン・ステ
ィープ・リカー２％、カゼイン１％、塩化コリン２％、
リン酸二カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０２
％、アクトコール（商品名、武田薬品、日本）０.２
％、（ｐＨ６.５）〕に移植し、回転振盪機上（２００
回転／分）で、２８℃、９０時間培養した。かくして得
られた培養液１０mlを遠心分離（３０００回転／分，１
０分）に付し、培養菌体を集め、蒸留水で２回洗浄後、
得られた洗菌体に２mg／mlの卵白リゾチームを含む０.
０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）２mlを加え十
分に撹拌して菌体を懸濁させた。この懸濁液を３７℃、
１２０分間反応させ菌体を溶解し、コリンオキシダーゼ
を抽出した。菌体溶解液を遠心分離（１５０００回転／
分，１０分）に付し、上清液を得た。 これを無細胞抽
出液とし、先に述べた方法を用いてそのコリンオキシダ
ーゼ活性を測定し、培養液中の酵素生産量を算出した。
対照の菌株として、ＤＮＡ供与株であるサーモアクチノ
マイセス・モノスポラス ＩＦＯ １４０５０のコリン
オキシダーゼの生産量についても同様の方法で算出し
た。その結果を〔表１〕に示す。
【表１】 これより、本発明の組換え体の生産量は、対照菌株のそ
れの２０３倍であることがわかる。なお、この形質転換
体より得られたコリンオキシダーゼは５５℃の加熱処理
で安定であり、親株（ＤＮＡ供与株）であるサーモアク
チノマイセス・モノスポラス ＩＦＯ １４０５０（Th
ermoactinomyces monosporus ＩＦＯ １４０５０）と
同等の耐熱性を有していた。コリンオキシダーゼの活性
は、前述の公知の方法（前述の特開平２−２２７０７２
号）により測定した。
れの２０３倍であることがわかる。なお、この形質転換
体より得られたコリンオキシダーゼは５５℃の加熱処理
で安定であり、親株（ＤＮＡ供与株）であるサーモアク
チノマイセス・モノスポラス ＩＦＯ １４０５０（Th
ermoactinomyces monosporus ＩＦＯ １４０５０）と
同等の耐熱性を有していた。コリンオキシダーゼの活性
は、前述の公知の方法（前述の特開平２−２２７０７２
号）により測定した。
【００１６】実施例３ １）酵母エキス（日本新薬）０.４％、麦芽エキス（デ
ィフコ・ラボラ トリーズ社、米国）１.０％、デキスト
リン１.０％、コーン・スティープ・リカー１.０％、塩
化コリン１.０％（百分率、重量／容量）からなる培地
５００mlを２０％苛性ソーダ水溶液を滴下してｐＨ６.
５に調整した。これに炭酸カルシウ ム２.５ｇを加えて
混合した後、２リットル容坂口フラスコに注入して、１
２０ ℃、２０分の条件で蒸気滅菌をした。これにスト
レプトマイセス・リビダンスＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１
（Streptomyces lividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１）
の斜面培養物を接種したのち、２８℃、４８時間往復振
盪培養機上（８０回転／分）で培養した。２００リット
ル容発酵槽に８０リットルの水道水を入れ、デキストリ
ン１.２kg、プロフロ（商品名、トレーダー・オイル
社、米国）１.２kg、コーン・スティープ・リカー２.４
kg、塩化コリン２.４kg、リン酸二カリウム１２０ｇ、
硫酸マグネシウム２４ｇおよびアクトコール２４０ｇを
仕込み、よく混合して仕込み成分を溶解したのち、２０
％苛性ソーダ水溶液を滴下して、ｐＨを６.５に調整し
た。つぎに１００回転／分の条件で撹拌しながら、１２
０℃、２ ０分の条件で蒸気滅菌をした。滅菌水を加え
て、この培地の液量を１２０リットルになるように調整
し、３７℃まで冷却した。この培地に前記の坂口フラス
コ培養物（５００ml）を接種し、通気２／３ＶＶＭ（単
位容量当たりの毎分の通気容量）、内圧１.０kg／cm2ゲ
ージ、撹拌回転数１９０rpmで、３７℃、３０時間培 養
した。かくして得られた培養液（約１０５リットル）を
シャープレス超遠心分離機（ＡＳ−１６Ｖ型、シャープ
レス・コーポレーション、米国）を用い、１３０００×
ｇの条件で遠心分離し、４.２８kgの湿菌体を得た。こ
れに３０リットルの０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）を加え十分に撹拌をして菌体を懸濁させた
後、ホモジナイザー（ＬＡＢ１６.５１型ラニー（ＲＡ
ＮＮＩＥ）社、デンマーク）を用いて、７５０バール、
１２分、最高温度３８.５℃の条件で菌体を破砕した。
得られた菌体破砕液を再び連続遠心分離機を用いて、１
３０００×ｇの条件で遠心分離して固形分を除去して遠
心上清液を得た。固形分は前記の緩衝液１５リットルに
懸濁し、よく混合したのち遠心分離して上清液を得た。
この上清液と前記の遠心上清液を合わせて、３４リット
ルの菌体抽出液を得た。この菌体抽出液３４リットルに
１３５リットルのエタノールを加えよく撹拌したのち、
２４時間５℃の条件で静置し、タンパク質沈殿物を得
た。この沈殿物は上記の遠心分離機により、１３０００
×ｇの条件で分離し、凍結乾燥機（ＦＤ−１型、東京理
化器械（株））で５０Ｐａ、２４時間の条件で乾燥し、
４００ｇの乾燥標品を得た。この乾燥標品を４リットル
の前記の緩衝液に溶解させた。冷却遠心分離機（ＣＲ２
６Ｈ型、日立製作所）を用い、５０００×ｇ、５℃、２
０分の条件でこの溶解液を遠心分離して不溶物を除き、
上清液３９６０mlを得た。これに硫酸アンモニウム２５
０８ｇを徐々に溶解させる方法により、酵素タンパク質
を塩析した。５℃、１４時間の条件で静置した後、再び
冷却遠心分離機により、５０００×ｇ、５℃、３０分の
条件で遠心分離し、塩析物２６７ｇを得た。塩析物を５
００mlの前記緩衝液に溶解し、これをセファデックスＧ
−２５カラム（内径３３mm×３００cm、ファルマシア
社、米国）に通液して、前記緩衝液により溶出し、脱塩
を目的としたゲルろ過を行った。活性画分９００mlを得
て、これをＤＥＡＥセルロファインＡ−５００カラム
（内径３０mm×５０cm、生化学工業（株））に吸着さ
せ、前記緩衝液３リットルで洗浄したのち、０.１Ｍ
ＮaＣl、および０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.
５）で溶出した。活性画分５００mlを集め、 これに硫
酸アンモニウム１２０ｇを溶解させ、前記緩衝液を加え
て液量を６０ ０mlに合わせた。これを疎水クロマトグ
ラフィー（ブチルトヨパール６５０Ｃ、内径３０mm×５
０cm、東ソー（株））に吸着させ、２０％から０％まで
硫酸アンモニウムを含有する０.０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液によるイオン濃度勾配クロマ トグラフィーを実施
した。活性画分３００mlを集め、これに硫酸アンモニウ
ム９０ｇを溶解させて塩析をした。冷却遠心分離機によ
り、５０００×ｇ、２０分、５℃の条件で遠心分離をし
て塩析物を得た。これをさらに、セファデックスＧ−２
５カラムで脱塩をした。このようにして得られた活性画
分をＤＥＡＥセルロファインＡ−５００カラム（内径３
０mm×５０cm、生化学工業（株））に吸着させ、０.１
Ｍ ＮaＣl、および０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）で溶出 した。活性画分（３６０ml）を１０リ
ットルの蒸留水に５℃で透析し、透析液を凍結乾燥機
（ＦＤ−１型、東京理化器械（株））により３０Ｐａの
条件で凍結乾燥をしてコリンオキシダーゼの乾燥標品２
６０mgを得た。各精製工程におけるコリンオキシダーゼ
の全活性、全タンパク質量、比活性を〔表２〕に示し
た。活性の測定方法は前記の方法に従い、タンパク質の
測定はＢＣＡタンパク質測定法（アナリティカル・バイ
オケミストリー、第１５０巻、７６−８５頁、１９８５
年）に従って実施した。得られた酵素精製標品は、前記
の電気泳動法により、単一タンパク質のバンドを示すも
のであった。以上より、高純度のコリンオキシダーゼが
得られたことがわかる。
ィフコ・ラボラ トリーズ社、米国）１.０％、デキスト
リン１.０％、コーン・スティープ・リカー１.０％、塩
化コリン１.０％（百分率、重量／容量）からなる培地
５００mlを２０％苛性ソーダ水溶液を滴下してｐＨ６.
５に調整した。これに炭酸カルシウ ム２.５ｇを加えて
混合した後、２リットル容坂口フラスコに注入して、１
２０ ℃、２０分の条件で蒸気滅菌をした。これにスト
レプトマイセス・リビダンスＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１
（Streptomyces lividans ＴＫ６４／ｐＴＢＣ１０１）
の斜面培養物を接種したのち、２８℃、４８時間往復振
盪培養機上（８０回転／分）で培養した。２００リット
ル容発酵槽に８０リットルの水道水を入れ、デキストリ
ン１.２kg、プロフロ（商品名、トレーダー・オイル
社、米国）１.２kg、コーン・スティープ・リカー２.４
kg、塩化コリン２.４kg、リン酸二カリウム１２０ｇ、
硫酸マグネシウム２４ｇおよびアクトコール２４０ｇを
仕込み、よく混合して仕込み成分を溶解したのち、２０
％苛性ソーダ水溶液を滴下して、ｐＨを６.５に調整し
た。つぎに１００回転／分の条件で撹拌しながら、１２
０℃、２ ０分の条件で蒸気滅菌をした。滅菌水を加え
て、この培地の液量を１２０リットルになるように調整
し、３７℃まで冷却した。この培地に前記の坂口フラス
コ培養物（５００ml）を接種し、通気２／３ＶＶＭ（単
位容量当たりの毎分の通気容量）、内圧１.０kg／cm2ゲ
ージ、撹拌回転数１９０rpmで、３７℃、３０時間培 養
した。かくして得られた培養液（約１０５リットル）を
シャープレス超遠心分離機（ＡＳ−１６Ｖ型、シャープ
レス・コーポレーション、米国）を用い、１３０００×
ｇの条件で遠心分離し、４.２８kgの湿菌体を得た。こ
れに３０リットルの０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）を加え十分に撹拌をして菌体を懸濁させた
後、ホモジナイザー（ＬＡＢ１６.５１型ラニー（ＲＡ
ＮＮＩＥ）社、デンマーク）を用いて、７５０バール、
１２分、最高温度３８.５℃の条件で菌体を破砕した。
得られた菌体破砕液を再び連続遠心分離機を用いて、１
３０００×ｇの条件で遠心分離して固形分を除去して遠
心上清液を得た。固形分は前記の緩衝液１５リットルに
懸濁し、よく混合したのち遠心分離して上清液を得た。
この上清液と前記の遠心上清液を合わせて、３４リット
ルの菌体抽出液を得た。この菌体抽出液３４リットルに
１３５リットルのエタノールを加えよく撹拌したのち、
２４時間５℃の条件で静置し、タンパク質沈殿物を得
た。この沈殿物は上記の遠心分離機により、１３０００
×ｇの条件で分離し、凍結乾燥機（ＦＤ−１型、東京理
化器械（株））で５０Ｐａ、２４時間の条件で乾燥し、
４００ｇの乾燥標品を得た。この乾燥標品を４リットル
の前記の緩衝液に溶解させた。冷却遠心分離機（ＣＲ２
６Ｈ型、日立製作所）を用い、５０００×ｇ、５℃、２
０分の条件でこの溶解液を遠心分離して不溶物を除き、
上清液３９６０mlを得た。これに硫酸アンモニウム２５
０８ｇを徐々に溶解させる方法により、酵素タンパク質
を塩析した。５℃、１４時間の条件で静置した後、再び
冷却遠心分離機により、５０００×ｇ、５℃、３０分の
条件で遠心分離し、塩析物２６７ｇを得た。塩析物を５
００mlの前記緩衝液に溶解し、これをセファデックスＧ
−２５カラム（内径３３mm×３００cm、ファルマシア
社、米国）に通液して、前記緩衝液により溶出し、脱塩
を目的としたゲルろ過を行った。活性画分９００mlを得
て、これをＤＥＡＥセルロファインＡ−５００カラム
（内径３０mm×５０cm、生化学工業（株））に吸着さ
せ、前記緩衝液３リットルで洗浄したのち、０.１Ｍ
ＮaＣl、および０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.
５）で溶出した。活性画分５００mlを集め、 これに硫
酸アンモニウム１２０ｇを溶解させ、前記緩衝液を加え
て液量を６０ ０mlに合わせた。これを疎水クロマトグ
ラフィー（ブチルトヨパール６５０Ｃ、内径３０mm×５
０cm、東ソー（株））に吸着させ、２０％から０％まで
硫酸アンモニウムを含有する０.０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液によるイオン濃度勾配クロマ トグラフィーを実施
した。活性画分３００mlを集め、これに硫酸アンモニウ
ム９０ｇを溶解させて塩析をした。冷却遠心分離機によ
り、５０００×ｇ、２０分、５℃の条件で遠心分離をし
て塩析物を得た。これをさらに、セファデックスＧ−２
５カラムで脱塩をした。このようにして得られた活性画
分をＤＥＡＥセルロファインＡ−５００カラム（内径３
０mm×５０cm、生化学工業（株））に吸着させ、０.１
Ｍ ＮaＣl、および０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）で溶出 した。活性画分（３６０ml）を１０リ
ットルの蒸留水に５℃で透析し、透析液を凍結乾燥機
（ＦＤ−１型、東京理化器械（株））により３０Ｐａの
条件で凍結乾燥をしてコリンオキシダーゼの乾燥標品２
６０mgを得た。各精製工程におけるコリンオキシダーゼ
の全活性、全タンパク質量、比活性を〔表２〕に示し
た。活性の測定方法は前記の方法に従い、タンパク質の
測定はＢＣＡタンパク質測定法（アナリティカル・バイ
オケミストリー、第１５０巻、７６−８５頁、１９８５
年）に従って実施した。得られた酵素精製標品は、前記
の電気泳動法により、単一タンパク質のバンドを示すも
のであった。以上より、高純度のコリンオキシダーゼが
得られたことがわかる。
【表２】
【００１７】２）上記１）で得られた精製コリンオキシ
ダーゼを、イナートシル３００Ｃ８カラム（４.６×１
００mm，ガスクロ工業（株））を用いて逆相クロマトグ
ラフィー（移動相：０.１％のトリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリル／水、溶出条件：アセトニトリル濃度を
20％から80％まで直線的に変化させた）により、さらに
精製した。得られたコリンオキシダーゼの２００ pmole
を気相プロテインシークエンサー（モデル４７０Ａ，
アプライド バイオシステム社）を用いて分析した。本
酵素のＮ末端近傍アミノ酸配列は 式 -Glu-Phe-Asp-Ty
r-Val-Val-Val-Gly-Gly-で表された。また、この配列
は、実施例２で用いたサーモアクチノマイセス・モノス
ポラス ＩＦＯ １４０５０により生産されたコリンオ
キシダーゼを同様に分析したところ、そのＮ末端近傍ア
ミノ酸配列と同一であった。
ダーゼを、イナートシル３００Ｃ８カラム（４.６×１
００mm，ガスクロ工業（株））を用いて逆相クロマトグ
ラフィー（移動相：０.１％のトリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリル／水、溶出条件：アセトニトリル濃度を
20％から80％まで直線的に変化させた）により、さらに
精製した。得られたコリンオキシダーゼの２００ pmole
を気相プロテインシークエンサー（モデル４７０Ａ，
アプライド バイオシステム社）を用いて分析した。本
酵素のＮ末端近傍アミノ酸配列は 式 -Glu-Phe-Asp-Ty
r-Val-Val-Val-Gly-Gly-で表された。また、この配列
は、実施例２で用いたサーモアクチノマイセス・モノス
ポラス ＩＦＯ １４０５０により生産されたコリンオ
キシダーゼを同様に分析したところ、そのＮ末端近傍ア
ミノ酸配列と同一であった。
【００１８】
【発明の効果】本発明によると、コリンオキシダーゼを
高収率、高純度かつ容易に製造することができる。従っ
て、得られたコリンオキシターゼは、コリンの定量分析
等の化学分析、血清中のコリンエステラーゼの測定やリ
ン脂質の測定等の臨床検査などに有用に使用される。
高収率、高純度かつ容易に製造することができる。従っ
て、得られたコリンオキシターゼは、コリンの定量分析
等の化学分析、血清中のコリンエステラーゼの測定やリ
ン脂質の測定等の臨床検査などに有用に使用される。
【図１】実施例２で得られたＤＮＡの制限酵素切断地図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (8)
- 【請求項１】コリンオキシダーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片。 - 【請求項２】コリンオキシダーゼが耐熱性を有する請求
項１のＤＮＡ断片。 - 【請求項３】遺伝子が放線菌由来である請求項１または
２のＤＮＡ断片。 - 【請求項４】放線菌がサーモアクチノマイセス属菌であ
る請求項３のＤＮＡ断片。 - 【請求項５】式 -Glu-Phe-Asp-Tyr-Val-Val-Val-Gly-G
ly- で表されるアミノ酸配列をＮ末端近傍にコードす
る請求項１のＤＮＡ断片。 - 【請求項６】請求項１ないし５のＤＮＡ断片を組み込ん
だプラスミド。 - 【請求項７】請求項６のプラスミドで形質転換した微生
物。 - 【請求項８】請求項７の微生物を培養し、培養液中にコ
リンオキシダーゼを生成蓄積させることを特徴とするコ
リンオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5008835A JPH05317056A (ja) | 1992-01-22 | 1993-01-22 | コリンオキシダーゼをコードするｄｎａおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP925692 | 1992-01-22 | ||
| JP4-9256 | 1992-01-22 | ||
| JP5008835A JPH05317056A (ja) | 1992-01-22 | 1993-01-22 | コリンオキシダーゼをコードするｄｎａおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317056A true JPH05317056A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=11715341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5008835A Withdrawn JPH05317056A (ja) | 1992-01-22 | 1993-01-22 | コリンオキシダーゼをコードするｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05317056A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6063607A (en) * | 1998-11-24 | 2000-05-16 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Polypeptides having choline oxidase activity and nucleic acids encoding same |
| JP2006512068A (ja) * | 2002-12-20 | 2006-04-13 | ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト・アウフ・アクチエン | 新規なコリンオキシダーゼ |
| WO2008051491A3 (en) * | 2006-10-20 | 2008-11-06 | Danisco Us Inc Genencor Div | Polyol oxidases |
| US7919295B2 (en) | 2005-10-21 | 2011-04-05 | Danisco Us Inc. | Polyol oxidases |
| DE112017003142T5 (de) | 2016-06-22 | 2019-03-21 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Messung der Aktivität der LP-PLA2 |
-
1993
- 1993-01-22 JP JP5008835A patent/JPH05317056A/ja not_active Withdrawn
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6063607A (en) * | 1998-11-24 | 2000-05-16 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Polypeptides having choline oxidase activity and nucleic acids encoding same |
| US6146864A (en) * | 1998-11-24 | 2000-11-14 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Polypeptides having choline oxidase activity and nucleic acids encoding same |
| US6320103B1 (en) | 1998-11-24 | 2001-11-20 | Novozymes Biotech, Inc. | Polypeptides having choline oxidase activity and nucleic acids encoding same |
| JP2006512068A (ja) * | 2002-12-20 | 2006-04-13 | ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト・アウフ・アクチエン | 新規なコリンオキシダーゼ |
| US7919295B2 (en) | 2005-10-21 | 2011-04-05 | Danisco Us Inc. | Polyol oxidases |
| US8383568B2 (en) | 2005-10-21 | 2013-02-26 | Danisco Us Inc. | Polyol oxidases |
| WO2008051491A3 (en) * | 2006-10-20 | 2008-11-06 | Danisco Us Inc Genencor Div | Polyol oxidases |
| EP2426199A3 (en) * | 2006-10-20 | 2012-08-22 | Danisco US Inc. | Polyol oxidases |
| DE112017003142T5 (de) | 2016-06-22 | 2019-03-21 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Messung der Aktivität der LP-PLA2 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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