JP2980746B2

JP2980746B2 - サイクロデキストリナーゼ遺伝子及びサイクロデキストリナーゼの製造法

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Publication number: JP2980746B2
Application number: JP25001291A
Authority: JP
Inventors: 哲哉小熊; 旭松山; 衛一中野; 護菊地
Original assignee: KITSUKOOMAN KK; NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: KITSUKOOMAN KK; NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 1999-11-22
Anticipated expiration: 2014-11-22
Also published as: JPH0568568A; DE4204476A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な組み換え体ＤＮ
Ａサイクロデキストリナーゼ遺伝子及びそれを用いたサ
イクロデキストリナーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】サイクロデキストリナーゼは、サイクロ
デキストリンのα−1,４−結合を１箇所のみ水解する反
応を触媒する酵素であり、結果としてサイクロデキスト
リンからサイクロデキストリンと同じグルコース重合度
を持つ直鎖マルトオリゴ糖を生成する。そのため、サイ
クロデキストリナーゼは、マルトヘプタオース等のマル
トオリゴ糖の製造等に極めて有用な酵素である。

【０００３】従来、サイクロデキストリンから効果的
に、サイクロデキストリンのグルコース重合度と同じグ
ルコース重合度を持つ直鎖マルトオリゴ糖を生成させる
サイクロデキストリナーゼは例えば、バチルス・スフェ
リカスＥ-244を培養し、菌体よりサイクロデキストリナ
ーゼを分離精製することにより製造されている特願平
1-152257 。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
サイクロデキストリナーゼの製造法によるときは、該酵
素の生産量が著しく低い等の問題点があった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、先に本発明者等
は、上記問題点を解決すべく種々検討した結果、サイク
ロデキストリナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮ
ＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、
この組み換え体をエッシェリシア(Escherichia) 属に属
する菌株に含ませたサイクロデキストリナーゼ生産能を
有する菌株を培地に培養すると、高収率でサイクロデキ
ストリナーゼが生産できること等の知見を得、先の出願
特願平3-22405号を行った。

【０００６】その後、本発明者等は、バチルス・スフェ
リカスＥ-244菌株由来のサイクロデキストリナーゼ遺伝
子について更に検討した結果、バチルス・スフェリカス
Ｅ-244菌株由来のサイクロデキストリナーゼ遺伝子を初
めて単離及び構造決定することに成功し、本発明を完成
させた。すなわち、本発明の第１は、配列番号１に示さ
れるアミノ酸配列をコードするサイクロデキストリナー
ゼ遺伝子である。

【０００７】

【０００８】本発明の第２は、配列番号４に示される塩
基配列を有するサイクロデキストリナーゼ遺伝子であ
る。本発明の第３は、上記のサイクロデキストリナーゼ
遺伝子を組み込んでなる組み換えＤＮＡである。

【０００９】本発明の第４は、上記組み換え体ＤＮＡを
含むエッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養
し、培養物よりサイクロデキストリナーゼを採取するこ
とを特徴とするサイクロデキストリナーゼの製造法であ
る。以下、本発明について詳細に説明する。先ず、サイ
クロデキストリナーゼをコードする遺伝子を含有する遺
伝子の調製について述べる。

【００１０】本酵素をコードする遺伝子のドナー微生物
としては、バチルス属に属し、本酵素を生産するもので
あれば如何なるものでもよく、例えば、バチルス・スフ
ェリカスE-244菌株 (FERM BP-2458) 等が挙げられる。
上記菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培養
で採用される方法と同じであり、通常は、液体培地によ
る振盪培養法または、通気攪拌培養法等が用いられる。
培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタミン、ミネ
ラル及び本酵素の誘導基質であるサイクロデキストリン
等を含んだものが用いられる。pHは、本菌が成育するpH
領域であればいずれでもよく、通常は、６〜８の範囲が
好ましい。

【００１１】培養条件は、例えば、通常20〜40℃で、16
時間〜４日間振盪培養または通気攪拌培養を行なう。こ
のようにして得られる培養物を、例えば3000rpm 以上、
好ましくは8000〜10000rpmで５分以上、好ましくは10〜
15分間遠心分離してバチルス・スフェリカスE-244の菌
体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法〔バ
イオケム. バイオフィズ. アクタ.(Biochem. Biophys.
Acta)、第72巻、第619頁 (1963年)〕の方法等により染
色体ＤＮＡを得ることができる。

【００１２】次いで、この染色体ＤＮＡに突出末端を生
じさせる制限酵素、例えばBamHI(宝酒造社製) を、温度
30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度１〜10ユニット／
mlで20分以上、好ましくは30分〜２時間作用させて消化
し、種々の染色体ＤＮＡ断片を得る。染色体ＤＮＡ断片
は、必要に応じてフェノール抽出処理、フェノール、ク
ロロホルム抽出処理、エタノール沈殿処理等の既存の精
製方法により精製する。

【００１３】一方、本発明において用いることのできる
このベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、
例えばプラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージ
ベクターＤＮＡ等が挙げられ、具体的には例えばプラス
ミドpUC118ＤＮＡ (宝酒造社製) 等が好ましい。上記ベ
クターＤＮＡに突出末端を生じさせる制限酵素、例えば
BamHIを、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度10
〜1000ユニット／mlで１時間以上、好ましくは１〜３時
間作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得
る。ベクターＤＮＡは、必要に応じてフェノール抽出処
理、フェノール、クロロホルム抽出処理、あるいはエタ
ノール沈殿処理等の既存の精製方法により精製する。

【００１４】次いで、上記のようにして得たバチルス・
スフェリカスE-244 由来で、サイクロデキストリナーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物と切断
されたベクターＤＮＡを混合し、これに例えば大腸菌Ｄ
ＮＡリガーゼ (ニューイングランドバイオラブス社製)
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ (ベーリンガーマンハイム社製)
等、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜37
℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜100 ユニットで
１時間以上、好ましくは６〜24時間作用させて組み換え
体ＤＮＡを得る。本工程は市販のライゲーションキット
(宝酒造社製) を用いて行なうことも可能である。

【００１５】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌K-12、好ましくは大腸菌HB101(ATCC33694)、大腸菌
JM101(ATCC33876)、大腸菌JM109(宝酒造社製) 、大腸菌
DHＩ(ATCC33849)、大腸菌χ-1776(ATCC31244)、等を形
質転換あるいは形質導入して夫々の菌株を得る。この形
質転換は、ディー・エイ・モーリソン(D. A. Morrison)
の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー (Methods in
Enzymology)、第68巻、第 326〜331 頁 (1979年) 〕に
より行なうことができる。また形質導入は、ビー・ホー
ン(B. Hohn) の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー
(Methods inEnzymology)、第68巻、第 299〜309 頁 (1
979年) 〕によって行なうことができる。

【００１６】そして、上記菌株群から、サイクロデキス
トリナーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングするこ
とにより、サイクロデキストリナーゼをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを含み、サイクロデキストリナーゼ生産能を
有するエッシェリシア属に属する菌株を得ることができ
る。

【００１７】このようにして得られた菌株より純化され
た新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、ピー・
グーリー(P. Guerry) 等の方法〔ジェイ. バクテリオロ
ジー(J. Bacteriology) 第116巻、第1064〜1066頁 (197
3年) 〕、デー・ビー・クレウェル (D. B. Clewell)の
方法〔ジェイ. バクテリオロジー (J. Bacteriology)第
110巻、第 667〜676 頁 (1972年)〕等により得ることが
できる。

【００１８】更に上記サイクロデキストリナーゼ遺伝子
を含有するＤＮＡを用いて、実施例の項目６に示すよう
に Taqポリメラーゼを用いたサンガー・ジデオキシ・タ
ーミネーション(Sanger/dideoxy termination)によって
サイクロデキストリナーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を
行ない（配列番号４参照）、次いで前記塩基配列を有す
る遺伝子によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一
次配列を確定する（配列番号１参照）。

【００１９】上記の様にして得られたサイクロデキスト
リナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクタ
ーＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、サイクロ
デキストリナーゼ生産能を有するエッシェリシア属に属
する菌株を用いてサイクロデキストリナーゼを生産する
には、培養方法は、原則的には一般微生物の好気的培養
で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地に
よる振盪培養法または、通気攪拌培養法等が好ましい。
また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉
エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆もしくは
小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に燐酸第一カ
リウム、燐酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄
あるいは硫酸マンガン等の無機塩類等の１種以上を添加
し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加し
たものが用いられる。なお、初発pHは、７〜９に調製す
るのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましくは37
℃前後で４〜24時間、好ましくは６〜24時間実施するの
が好ましい。

【００２０】培養終了後、該培養物よりサイクロデキス
トリナーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用い
て得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波
破砕処理、摩砕処理等で破砕するか、または、リゾチー
ム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、または、
トルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化を
おこなわせ本酵素を菌体外に排出させる。この溶菌液を
濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりス
トレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸あるいは硫酸
マンガンにより除核酸したのち、これに硫安、アルコー
ル、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、こ
れを水に透析した後真空乾燥して粗酵素標品を得る。

【００２１】更に、サイクロデキストリナーゼの精製標
品を得るには、例えば DEAE-セファロース (ジエチルア
ミンエチルセファロース、ファルマシア社製) 、 DEAE-
セファデックス (ファルマシア社製) 等のイオン交換ク
ロマトグラフィー、あるいは、例えばセファデックスG-
200(ファルマシア社製) 、バイオラッドP-150(バイオラ
ッド社製) 等のゲル濾過による各種クロマトグラフィー
を行ない、必要により、例えばTSK gel DEAE-5PW (東ソ
ー社製) 等のイオン交換クロマトグラフィーあるいは、
例えばTSK gel エーテル5PW(東ソー社製) 、TSK gel フ
ェニル5PW(東ソー社製) 等の疎水クロマトグラフィー、
あるいは、例えばTSK gel G3000SW(東ソー社製) 等のゲ
ル濾過等、HPLC〔高速液体クロマトグラフィー〕操作を
適宜組合せて実施することにより、高度に精製されたサ
イクロデキストリナーゼ標品を得ることができる。

【００２２】上記手段により得られる精製サイクロデキ
ストリナーゼの理化学的性質は、〔バイオケム、バイオ
フィズ、アクタ (Biochem. Biophys. Acta）、第1036
巻、第１〜５頁 (1990年) 〕記載のサイクロデキストリ
ナーゼの性質と全く同様である。

【００２３】

【発明の効果】上述したことから明らかな如く、本発明
のサイクロデキストリナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片の組み込まれた組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシ
ア属に属する菌株を培地に培養することにより、サイク
ロデキストリナーゼを高収率で得ることができるので、
本発明は産業上極めて有用なものである。

【００２４】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。 (1) バチルス・スフェリカスE-244菌株の染色体ＤＮＡ
の調製１％ベータサイクロデキストリン、１％ペプトン、0.５
％ NaCl 及び0.１％イーストエキスからなる液体培地
(水道水使用、pH7.0) 100mlを 500ml容坂口フラスコに
入れ、 120℃で20分間、滅菌処理を行なった。これに、
バチルス・スフェリカス E-244菌株 (FERM BP-2458) 保
存スラントより１白金耳接種し、30℃で１日間振盪培養
した。本培養液１mlを上記と同様の培地組成と滅菌条件
により調製した10mlの培地を含有する大型試験管に接種
し、30℃、120rpmの条件で２日間振盪培養を行ない、培
養終了後、培養液から8000rpm で20分間の遠心分離処理
により菌体を分離し、湿潤菌体約50mgを得た後、該菌体
から斎藤、三浦の方法〔バイオケム. バイオフィズ. ア
クタ. (Biochem. Biophys. Acta.) 、第72巻、第619頁
(1963年) 〕により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この
染色体60μg 及び制限酵素BamHI (宝酒造社製) 10ユニ
ットを、50mMトリス−塩酸緩衝液 (100mM NaCl及び10mM
MgSO₄含有)(pH7.4)に混合し、37℃で１時間反応させ
て消化液を得た。反応終了液を常法により、フェノール
抽出処理し、エタノール沈殿処理した後、このBamHIで
消化されたＤＮＡ断片が再結合することを防止するため
に、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)
、第133〜134項記載の方法で子牛フォスファターゼ (C
alf Intestine Alkaline Phosphatase)処理により、Ｄ
ＮＡ断片の脱燐酸化反応を行ない、常法によりフェノー
ル抽出処理し、更にエタノール沈殿処理して、BamHIで
消化されたバチルス・スフェリカス E-244菌株の染色体
ＤＮＡ断片を50μg を得た。 (2) プラスミドベクターpUC118ＤＮＡを利用したバチル
ス・スフェリカス E-244菌株の染色体ＤＮＡライブラリ
ーの作製プラスミドベクター pUC118 ＤＮＡ〔宝酒造社製〕20μ
g及び制限酵素BamHI (宝酒造社製) 10ユニットを、50mM
トリス−塩酸緩衝液 (100mM NaCl及び10mM MgSO₄含有)
(pH7.4)に混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液
を得た。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理
し、エタノール沈殿処理して、BamHIで消化されたプラ
スミドベクターpUC118を得た。

【００２５】次いで、このBamHIで消化されたプラスミ
ドベクターpUC118ＤＮＡ断片１μg、上記項目(1) で得
られたBamHIで消化されたバチルス・スフェリカス E-24
4菌株の染色体ＤＮＡ断片１μg 及びＤＮＡライゲーシ
ョンキット (宝酒造社製) を常法に従って混合後、温度
16℃で16時間反応し、ＤＮＡを連結させた。このように
して得た組み換え体プラスミドＤＮＡ含有液10μl を大
腸菌コンピテントセル（JM109)（宝酒造社製） 100μl
と混合し、氷中で20分間静置することにより形質転換を
行なった。本形質転換液 110μl を前記と同様の滅菌条
件により調製した滅菌済 T-Y培地［１％(W/V) バクトー
トリプトン (Bacto-trypton)〔ディフコ社製〕、0.５％
(W/V) イーストエキストラクト (Yeast extract)〔ディ
フコ社製〕及び0.５％(W/V) NaCl (pH7.2)］３mlに接種
し、37℃で30分間振盪培養した後、培養液を 200μl ず
つ滅菌済 X-Galプレート［１％(W/V) バクトートリプト
ン (Bacto-trypton)〔ディフコ社製〕、0.５％(W/V) イ
ーストエキストラクト (Yeast extract)〔ディフコ社
製〕及び0.５％(W/V) NaCl、1.５％寒天(pH7.2) を前記
と同様の滅菌条件により滅菌処理したものに、滅菌済フ
ィルター (孔径0.22μm)〔ミリポア社製〕で無菌濾過し
たIPTG(Isopropyl−β−Ｄ−thiogalactopyranoside)
〔ベーリンガー社製〕、X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-in
dolyil-galactopyranside)〔ベーリンガー社製〕及びア
ンピシリン〔シグマ社製〕を無菌的に添加してそれぞ
れ、50μg/ml(W/V) IPTG、40μg/ml(W/V) X-Gal 及び25
μg/ml(W/V) アンピシリンの濃度に調製した培地を直径
９cmのシャーレに20mlずつ分注したプレート］に塗布
し、37℃で24時間静置培養した。次いで、生じた白色コ
ロニーのみを選択して滅菌済X-Gal プレートに点植する
ことにより、約3000個の形質転換体を得、これを染色体
ＤＮＡライブラリーとして使用した。 (3) プローブＤＮＡの作製１％βサイクロデキストリン、１％ペプトン、0.５％ N
aCl 及び0.１％イーストエキスからなる液体培地 (水道
水使用、pH7.0) 100mlを 500ml容坂口フラスコに入れ、
120℃で20分間、殺菌処理を行なった。これに、バチル
ス・スフェリカス E-244菌株 (FERM BP-2458) を保存ス
ラントより１白金耳接種し、30℃で１日間振盪培養し
た。本培養液 100mlを上記と同様の培地組成と殺滅菌条
件により調製した20Ｌの培地を含有する30Ｌ容ジャーに
接種し、30℃、0.5vvm、220rpmの条件で２日間通気攪拌
培養を行ない、培養終了後、培養液を15000rpmで連続遠
心分離処理することにより230gの湿潤菌体を得た。本菌
体から〔バイオケム、バイオフィズ、アクタ (Biochem.
Biophys. Acta）、第1036巻、第１〜５頁 (1990年)〕
記載に従った精製法により、約20mgの精製酵素を得た。
精製酵素約１mgを凍結乾燥後、 100μl の0.１％トリフ
ルオロ酢酸 (TFA)溶液に再溶解した。本酵素溶液をプロ
テインシークエンサー〔アプライドバイオシステム(AB
I) 社製〕で分析することによりＮ末端側のアミノ酸１
次配列を決定した。更に、精製酵素約１mgを30mg臭化シ
アン、蟻酸2.１ml脱イオン水0.９mlと混合後、常法に従
い密栓、斜光した梨型フラスコ中で25℃で24時間振盪す
ることによりペプチドに分解した。本処理液をロータリ
ーエバポレーターで吸引乾燥した後、0.４mlの0.２Ｎ酢
酸溶液に溶解し、ペプチド混合液を得た。本ペプチド混
液を0.１％トリフルオロ酢酸(TFA) 溶液で平衡化した5C
₄-300 HPLC 用パックドカラム (φ4.６mm×250mm) (ナ
カライテスク社製) に吸着させた後80％アセトニトリル
のグラジエント勾配により溶出を行なった。各ペプチド
画分を分取し、吸引乾燥後、 100μl の0.１％トリフル
オロ酢酸(TFA) 溶液に再溶解した。本ペプチド溶液をプ
ロテインシークエンサーで分析することにより各ペプチ
ド断片のアミノ酸１次配列を決定した。サイクロデキス
トリナーゼのＮ末端側及びペプチド断片のアミノ酸１次
配列を配列表の配列番号２及び配列番号３に夫々示し
た。

【００２６】Ｎ末端アミノ酸１次配列の一部をコードす
る20残基からなるＤＮＡ断片をＤＮＡシンセサイザー
〔ベックマン (Beckman)社製〕により合成した。同様に
して、ペプチド断片のアミノ酸１次配列をコードする27
残基からなる塩基配列に相補したＤＮＡ断片を合成し
た。合成ＤＮＡ断片及びをプライマー、項目１で調
製したバチルス・スフェリカスE-244の染色体ＤＮＡを
鋳型としてシータス社製のポリメラーゼチェインリアク
ション(PCR) 用キットを用いて、 PCR用サーマルサイク
ラー (シータス社製) によりプライマーとプライマー
間のＤＮＡ配列を増幅させた。

【００２７】増幅されたＤＮＡ断片を含んだ反応溶液を
1.５％アガロースゲル電気泳動操作に供し、目的のＤＮ
Ａ断片をゲルから常法に従って抽出し、エタノール沈殿
処理後、TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0) 緩衝液に溶
解した。該ＤＮＡ溶液を、ＤＮＡラベリング＆ディテク
ションキット〔NonradioactiveDNA labeling and detec
tion kit 、 (ベーリンガー社製) 〕を用いてラベリン
グし、非放射性プローブＤＮＡを作製した。 (4) サイクロデキストリナーゼ遺伝子の検索項目(3) で調製した非放射性プローブＤＮＡを用いて、
項目(2) で作製した染色体ＤＮＡライブラリーに対して
コロニーハイブリダイゼーション処理を〔モレキュラー
・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル・セカ
ンド・エディション (Molecular Cloning a Laboratory
Manual Second Edition) 第90〜99頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring
HarborLaboratory Press)、1989年〕記載の方法により
行なった。対合した非放射性プローブＤＮＡの検出は、
ＤＮＡラベリング＆ディテクションキット〔Nonradioac
tive DNA labeling and detection kit 、 (ベーリンガ
ー社製) 〕を用いて行なった。その結果、染色体ＤＮＡ
ライブラリー約3000コロニーより陽性コロニーを１株得
た。該陽性株を前記と同様の滅菌条件により調製した滅
菌済 T-Y培地３mlに１白金耳接種後、37℃で16時間振盪
培養を行ない培養終了後、培養液を8000rpm で20分間遠
心分離することにより菌体を分離し、湿潤菌体約２mgを
得た。該菌体から、〔モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリー・マニュアル・セカンド・エディション
(Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edi
tion) 第25〜28頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス (ColdSpring Harbor Laboratory
Press)、1989年〕記載のアルカリ法によりサイクロデ
キストリナーゼ遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡを抽出
し、常法に従いエタノール沈殿処理により精製した後、
200μl のTE (10mM Tris,１mM EDTA, pH8.0)緩衝液に
溶解した。該組み換え体プラスミドＤＮＡ溶液10μl を
制限酵素SacI(ベーリンガー社製) １ユニット、BamHI
(宝酒造社製)１ユニット、制限酵素用緩衝液 (ベーリン
ガー社製) ２μl 及び滅菌水10μl と混合して、37℃で
１時間処理することにより切断した。この処理液と同じ
くSacI(ベーリンガー社製)１ユニット、BamHI (宝酒造
社製)１ユニット、制限酵素用緩衝液 (ベーリンガー社
製)２μl 及び滅菌水19μl と混合して37℃で１時間反
応を行なったpUC118ベクターＤＮＡ１μg とを混合し、
ライゲーションキットにより連結反応を16℃で16時間行
なった。該反応液を用いて〔ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー (Journalof Bacteriology)第 119巻、第107
2頁〜1074頁 (1974年) 〕記載の形質転換法により大腸
菌JM109株を形質転換し、サイクロデキストリナーゼ活
性を検討した後、形質転換株の湿潤菌体を得た。この様
にして得られた大腸菌JM109(pCD722) は、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研条寄第3263号(FERM BP-326
3) として寄託されている。更に、該菌株の培養液10ml
から、〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ
ー・マニュアル・セカンド・エディション (Molecular
Cloning a Laboratory Manual Second Edition) 第25〜
28頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス (Cold Spring Harbor Laboratory Press)、19
89年〕記載のアルカリ法により組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを約20μg 得、このプラスミドをpCD722と命名し
た。本プラスミド１μg を制限酵素SacＩ (ベーリンガ
ー社製) 、BamHI (宝酒造社製) 及びEcoRI (ベーリンガ
ー社製) を組み合せて処理することにより切断した後、
常法に従い、0.７％及び1.５％アガロースゲル電気泳動
を行ない各ＤＮＡ断片の長さを調べることにより、制限
酵素開裂地図を作成した。 (5) 大腸菌JM109 (pCD722)の培養及び粗酵素液の調製大腸菌JM109 (pCD722)(FERM BP-3263)を、 T-Y培地３ml
中で37℃で16時間振盪培養した後、培養液を氷中で２分
間超音波処理し、12000rpmで20分間遠心分離操作をする
ことにより、細胞残渣を取り除いて得た粗酵素液中のサ
イクロデキストリナーゼ活性は、3.０U/mlであった。
尚、比較の為pUC118ベクターＤＮＡを有する大腸菌JM10
9 を用いて、上記の同様の処理を行なって得た細胞抽出
液中のサイクロデキストリナーゼ活性を測定した結果、
活性は検出されなかった。 (6) バチルス・スフェリカスE-244 菌株（FERM BP-245
8) 由来のサイクロデキストリナーゼ遺伝子の塩基配列
の解析項目(4)で得られた組み換え体プラスミドpCD722ＤＮＡ1
0μｇを制限酵素SacＩ( ベーリンガー社製）１ユニッ
ト、BamH Ｉ( 宝酒造社製) １ユニット、制限酵素用緩
衝液( ベーリンガー社製）２μｌ及び滅菌水10μｌと混
合して、37℃で１時間処理することにより切断し、反応
溶液を1.5％アガロースゲル電気泳動操作に供した。目
的のＤＮＡ断片をゲルから常法にしたがって抽出した
後、エタノール沈澱処理を行って約５μｇの精製ＤＮＡ
断片を得た。

【００２８】SacＩ( ベーリンガー社製）１ユニット、B
amH Ｉ( 宝酒造社製) １ユニット、制限酵素用緩衝液
(ベーリンガー社製）２μｌ及び滅菌水19μｌと混合し
て37℃で１時間反応を行ったpUC119ベクターＤＮＡ１μ
ｇと該精製ＤＮＡ約2.5μｇ及びライゲーションキット
( 宝酒造社製) を混合し、連結反応を16℃で16時間行っ
た。該反応液を用いて〔ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー(Journal of Bacteriology) 第119巻、第1072頁
〜1074頁(1974年) 〕記載の形質転換法により大腸菌JM1
09株を形質転換し、サイクロデキストリナーゼ活性を検
討し、形質転換株を得た。さらに、該形質転換株の培養
液10mlから、〔モレキュラー・クローニング・ア・ラボ
ラトリー・マニュアル・セカンド．エディション（Mole
cular Cloning a Laboratory Manual Sacond Edition)
第25〜28頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s) 、1989年〕記載のアルカリ法により組み換え体プラ
スミドＤＮＡを約20μｇ得、該プラスミドをpCD722'と
命名した。このプラスミドは、pCD722に挿入されている
サイクロデキストリナーゼ遺伝子を含有したＤＮＡ断片
が逆向きに挿入されている以外はpCD722と基本的には全
く同じである。

【００２９】次いで、組み換え体プラスミドＤＮＡpCD7
22及びpCD722'を用いてキロシークエンス用欠失キット
( 宝酒造社製) を用い、ヘニコフ(Henikoff)の方法〔ジ
ーン(Gene)、第28巻、第351 〜359 頁、(1984年) 〕に
従い、サイクロデキストリナーゼ遺伝子に種々の欠失が
導入されたプラスミドＤＮＡを作製し、項目(4)と同様
にして大腸菌JM109（宝酒造社製) を形質転換した。こ
の様にして得られた大腸菌にヘルパーファージM13K07(
宝酒造社製) を感染させることにより、メッシング(Mes
sing) の方法〔メソズ・エンザイモロジー(Methods in
Enzymology) 、第101巻、第20〜78頁、(1983年) 〕に従
って１本鎖ＤＮＡを調整した。得られた１本鎖ＤＮＡに
よるシークエンシングはタックポリメラーゼシークエン
シングキット(Taq polymerase sequencing kit）〔アプ
ライド・バイオシステム・インスツルメント(ABI社
製)〕及びＤＮＡシークエンサー〔アプライド・バイオ
システム・インスツルメント(ABI社製) 〕を用いて、常
法に従って行った。

【００３０】得られたバチルス・スフェリカスE-244菌
株（FERMBP-2458) 由来のサイクロデキストリナーゼ遺
伝子の全塩基配列を配列表の配列番号４に、また該塩基
配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を
配列表の配列番号１に夫々示した。

【００３１】

【配列表】

１．配列番号１ (1) 配列の長さ：５９１ (2) 配列の型：アミノ酸 (3) トポロジー：直鎖状 (4) 配列の種類：ペプチド (5) 配列： MetIleMetLeuGluAlaValTyrHisArgMetGlyGlnAsnTrpSerTyrAlaTyrAsn 20 AspSerThrLeuHisIleArgIleArgThrLysArgAspAsnValProArgIleAspLeu 40 HisCysGlyGluLysTyrAspProGluLysTyrLysGluThrIleProMetGluArgMet 60 AlaSerAspGlyLeuPheAspTyrTrpGlnAlaAlaValGlnProArgTyrArgArgLeu 80 ValTyrTyrPheAlaLeuHisSerAspAsnGlyAspAlaValTyrPheMetGluLysGly 100 PhePheAspGlnProProLysValMetTyrGluGlyLeuPheAspPheProTyrLeuAsn 120 ArgGlnAspValHisThrProProAlaTrpValLysGluAlaIlePheTyrGlnIlePhe 140 ProGluArgPheAlaAsnGlyAspProSerAsnAspProGluGlyValGlnGluTrpGly 160 GlyThrProSerAlaGlyAsnPhePheGlyGlyAspLeuGlnGlyValIleAspHisLeu 180 AspTyrLeuSerAspLeuGlyValAsnAlaLeuTyrPheAsnProLeuPheAlaAlaThr 200 ThrAsnHisLysTyrAspThrAlaAspTyrMetLysIleAspProGlnPheGlyThrAsn 220 GluLysLeuLysGluLeuValAspAlaCysHisAlaArgGlyMetArgValLeuLeuAsp 240 AlaValPheAsnHisCysGlyHisThrPheProProPheValAspValLeuAsnAsnGly 260 LeuAsnSerArgTyrAlaAspTrpPheHisValArgGluTrpProLeuArgValValAsp 280 GlyIleProThrTyrAspThrPheAlaPheGluProIleMetProLysLeuAsnThrGly 300 AsnGluGluValLysAlaTyrLeuLeuAsnValGlyArgTyrTrpLeuGluGluMetGly 320 LeuAspGlyTrpArgLeuAspValAlaAsnGluValAspHisGlnPheTrpArgGluPhe 340 ArgSerGluIleLysArgIleAsnProSerAlaTyrIleLeuGlyGluIleMetHisAsp 360 SerMetProTrpLeuGlnGlyAspGlnPheAspAlaValMetAsnTyrProPheThrAsn 380 IleLeuLeuAsnPhePheAlaArgArgLeuThrAsnAlaAlaGluPheAlaGlnAlaIle 400 GlyThrGlnLeuAlaGlyTyrProGlnGlnValThrGluValSerPheAsnLeuLeuGly 420 SerHisAspThrThrArgLeuLeuThrLeuCysSerGlyAsnValGluArgMetLysLeu 440 AlaThrLeuPheGlnLeuThrTyrGlnGlyThrProCysIleTyrTyrGlyAspGluIle 460 GlyMetAspGlyGluTyrAspProLeuAsnArgLysCysMetGluTrpAspLysSerLys 480 GlnAsnThrGluLeuLeuAlaPhePheArgSerMetIleSerLeuArgLysAlaHisPro 500 AlaLeuArgGlySerGlyLeuArgPheLeuProValLeuGluHisProGlnLeuLeuVal 520 TyrGluArgTrpAspAspAsnGluArgPheLeuIleMetLeuAsnAsnGluAspAlaPro 540 ValAsnValValIleProAlaAlaGlnProGlyAlaSerTrpArgThrValAsnGlyGlu 560 ProCysAlaValValGluGluSerSerIleGlnAlaAlaLeuProProTyrGlyTyrAla 580 IleLeuHisAlaProIleAlaGlyThrAlaGlu 591 ２．配列番号２ (1) 配列の長さ：２４ (2) 配列の型：アミノ酸 (3) トポロジー：直鎖状 (4) 配列の種類：ペプチド (5) フラグメント型：Ｎ末端フラグメント (6) 配列： Met Ile Met Leu Glu Ala Val Try His Arg Met Gly Gln Asn Trp 15 Ser Tyr Ala Tyr Asn Asp Ser Thr Leu 24 3 ．配列番号３ (1) 配列の長さ：１１ (2) 配列の型：アミノ酸 (3) トポロジー：直鎖状 (4) 配列の種類：ペプチド (5) フラグメント型：中間部フラグメント (6) 配列： Pro Trp Leu Gln Gly Asp Gln Phe Asp Ala Val 11 ４．配列番号４ (1) 配列の長さ：1773 (2) 配列の型：核酸 (3) 鎖の数：一本鎖 (4) トポロジー：直鎖状 (5) 配列の種類：染色体ＤＮＡ (6) 配列の特徴： (7) 起源 (a) 生物名：バチルス・スフェリカス (b) 株名：E-244 (8) 配列： ATGATTATGC TGGAAGCCGT TTACCACCGG ATGGGACAAA ACTGGTCCTA TGCCTACAAT 60 GATTCGACCT TGCATATCCG CATCCGCACC AAGCGGGACA ATGTCCCGCG CATCGACCTG 120 CACTGCGGCG AGAAGTACGA TCCGGAGAAG TACAAGGAAA CCATTCCCAT GGAGCGTATG 180 GCTTCTGACG GACTGTTTGA TTATTGGCAA GCCGCCGTGC AGCCCAGATA CCGTAGATTA 240 GTTTATTACT TCGCGCTGCA TTCCGACAAC GGCGATGCCG TTTACTTTAT GGAGAAGGGA 300 TTCTTTGATC AGCCGCCCAA GGTGATGTAT GAAGGATTGT TCGACTTCCC TTATCTGAAT 360 CGGCAGGATG TGCACACGCC TCCGGCATGG GTTAAGGAAG CGATATTCTA TCAGATTTTC 420 CCCGAGCGCT TCGCGAACGG CGATCCGTCC AACGATCCCG AAGGCGTGCA GGAATGGGGA 480 GGTACGCCCA GCGCCGGCAA TTTCTTCGGC GGGGATTTGC AAGGCGTGAT CGATCATCTG 540 GACTATCTAA GCGATCTGGG CGTTAATGCT TTGTATTTCA ACCCCCTATT CGCGGCCACC 600 ACCAACCATA AATACGATAC GGCGGACTAT ATGAAGATCG ACCCCCAATT CGGCACGAAC 660 GAAAAGCTCA AGGAGCTGGT CGATGCCTGC CATGCCCGGG GCATGCGCGT GCTGCTGGAC 720 GCCGTGTTCA ACCACTGCGG CCATACGTTT CCGCCGTTCG TGGACGTGTT GAACAACGGT 780 CTGAATTCGC GTTACGCGGA TTGGTTCCAT GTTCGGGAAT GGCCTCTGCG GGTCGTTGAC 840 GGGATTCCGA CCTACGATAC GTTCGCATTC GAACCAATCA TGCCCAAGCT CAATACCGGC 900 AATGAAGAAG TGAAGGCTTA CCTGTTGAAT GTCGGCCGTT ACTGGCTGGA GGAGATGGGG 960 CTGGACGGCT GGCGGCTGGA TGTCGCCAAT GAGGTGGACC ATCAATTCTG GCGGGAATTC 1020 CGGAGCGAGA TCAAACGGAT CAATCCTTCG GCCTATATCT TAGGCGAGAT TATGCATGAT 1080 TCCATGCCGT GGCTGCAAGG CGACCAATTC GACGCGGTCA TGAATTATCC CTTCACGAAC 1140 ATCCTGCTGA ACTTCTTCGC CCGCAGGCTG ACGAACGCGG CCGAATTCGC CCAGGCGATC 1200 GGCACGCAGC TCGCCGGTTA TCCGCAGCAG GTTACGGAAG TGTCATTCAA TCTGCTCGGC 1260 AGCCATGACA CGACGAGGCT ATTGACGTTG TGCAGCGGCA ATGTGGAGCG CATGAAGCTG 1260 GCGACCTTAT TCCAGCTGAC CTATCAGGGG ACGCCATGCA TCTATTACGG CGACGAGATC 1380 GGCATGGACG GCGAGTATGA CCCCCTCAAC CGCAAGTGCA TGGAATGGGA CAAGAGCAAG 1440 CAGAATACGG AGCTGCTTGC GTTCTTCCGG AGCATGATCA GCCTGCGCAA GGCTCACCCT 1500 GCGCTGCGCG GAAGCGGACT GCGCTTCCTG CCGGTGCTGG AGCACCCGCA GTTGCTGGTC 1560 TATGAGCGCT GGGACGATAA TGAGCGATTC CTCATCATGC TGAATAATGA GGATGCTCCC 1620 GTGAACGTTG TTATCCCGGC AGCTCAGCCC GGCGCTTCTT GGCGCACCGT GAACGGCGAG 1680 CCATGCGCAG TAGTCGAGGA AAGTTCGATA CAGGCGGCTC TCCCTCCTTA CGGTTATGCC 1740 ATACTGCATG CGCCTATAGC AGGAACGGCT GAG 1773

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (72)発明者中野衛一千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内 (72)発明者菊地護千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示されるアミノ酸配列をコ
ードするサイクロデキストリナーゼ遺伝子。
【請求項２】配列番号４に示される塩基配列を有する
サイクロデキストリナーゼ遺伝子。
【請求項３】請求項１乃至請求項２のいずれかの項記
載のサイクロデキストリナーゼ遺伝子を組み込んでなる
組み換え体ＤＮＡ。
【請求項４】請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含む
エッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養し、培
養物よりサイクロデキストリナーゼを採取することを特
徴とするサイクロデキストリナーゼの製造法。