DE4204476A1 - Cyclodextrinase-gene und verfahren zur herstellung von cyclodextrinase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Cyclodextrinase-Gen enthaltende neue rekombinante DNA und ein Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinase unter Verwendung der rekombinanten DNA.

Cyclodextrinase ist ein Enzym, das unter spezifischer Spal­ tung von α(1<4) Bindungen des Cyclodextrins dieses hydroly­ siert und zu linearen Maltooligosacchariden führt, die den gleichen Glucose-Polymerisationsgrad wie das ursprüngliche Cyclodextrin aufweisen. Daher ist die Cyclodextrinase ge­ eignet zur Herstellung von Maltooligosacchariden, wie Malto­ heptaose. Lineare Maltooligosaccharide mit dem gleichen Glu­ cose-Polymerisationsgrad wie Cyclodextrin werden nach be­ kanntem Verfahren effizient unter Verwendung von Cyclodex­ trinase hergestellt.

In diesem Verfahren wird Cyclodextri­ nase durch Reinigen einer aus Zellen des kultivierten Bacillus sphaericus E 244 (JP-OS Nr. 1 52 257/1989) isolierten ungereinigten Gyclodextrinase hergestellt.

In dem vorgenannten Verfahren ist jedoch die Ausbeute an Cyclodextrinase sehr gering.

Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen an Cyclodextrinase aus der JP-OS Nr. 22 405/1991 bekannt. In diesem Verfahren wird ein ein Cyclodextrinase-Gen enthaltendes DNA-Fragment in eine Vektor-DNA inseriert. Anschließend werden Bakterien der Gattung Escherichia mit der rekombinanten DNA transformiert. Erfolgreich transformierte Bakterien werden zur Herstellung des Enzyms gezüchtet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinase auf mikrobio­ logischem Weg bereitzustellen. Die Lösung dieser Aufgabe er­ gibt sich aus der nachstehenden Beschreibung und den Pa­ tentansprüchen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der erfolgreichen Iso­ lierung eines Cyclodextrinase-Gens von Bacillus sphaericus E-244 und der Aufklärung seiner Struktur (Sequenz).

Somit betrifft die Erfindung ein Cyclodextrinase-Gen, das für die in SEQ ID Nr. 1 beschriebene Aminosäuresequenz co­ diert.

Die Erfindung betrifft ferner ein Cyclodextrinase-Gen mit der in SEQ ID Nr. 4 beschriebenen Nukleotidsequenz.

Die Erfindung betrifft ferner eine rekombinante DNA, die das Cyclodextrinase-Gen enthält.

Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Her­ stellung von Cyclodextrinase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Gattung Escherichia gehörende Mikroorganis­ men, die eine rekombinante DNA mit dem Cyclodextrinase-Gen enthalten, in einem Kulturmedium züchtet und die gebildete Cyclodextrinase aus der Kultur isoliert.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend näher erläutert.

Zunächst wird die Gewinnung des Cyclodextrinase-Gens erläu­ tert. Jeder zur Gattung Bacillus gehörende Mikroorganismus, der ein Cyclodextrinase-Gen aufweist, kann als Spender ver­ wendet werden. Bevorzugt ist Bacillus sphaericus E-244 (der unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2458 am 8.06.1989 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt wurde). Das Bakterium wird unter den gleichen aeroben Bedingungen wie es für typische Mikroorganismen verwendet wird kultiviert, beispielsweise durch Schüttelkultur oder durch Belüften und Rühren eines flüssigen Mediums. Das Kulturmedium kann eine Stickstoffquelle, Kohlenstoffquelle, Vitamine, Mineralstoffe und Cyclodextrin als Enzym induzierendes Substrat enthalten. Der pH-Bereich des Kulturmediums kann dem für das Wachstum der Bakterien geeigneten Bereich entsprechen, vorzugsweise 6-8. Die Kultivierung kann in einem Schüttler oder in einem Belüftungsrührfermenter während 16 bis 96 Stunden bei 20 bis 40°C durchgeführt werden. Nach beendetem Wachstum wird die Kultur mindestens 5 Minuten, vorzugsweise 10 bis 15 Minuten, bei 700× g, vorzugsweise 5000 bis 8000× g, zen­ trifugiert. Aus den erhaltenen Bacillus sphaericus E-244- Zellen wird die chromosomale DNA nach dem von Saito und Miura in Biochem. Biophys. Acta., Bd. 72 (1963), 619 be­ schriebenen Verfahren extrahiert. Die chromosomale DNA wird anschließend zur Erzeugung adhäsiver Enden mit einem Restriktionsenzym, wie BamHI (1-10 Einheiten/ml) während 20 Minuten, vorzugsweise 30 bis 120 Minuten, bei 30°C, vorzugs­ weise 37°C gespalten. Verschiedene so erhaltene Restrik­ tionsfragmente werden in an sich bekannter Weise gereinigt. Die Restriktionsfragmente werden mit Phenol und sodann mit Phenol/Chloroform extrahiert und gegebenenfalls mit Ethanol präzipiziert.

Als Vektor-DNA kann jeder beliebige Vektor einschließlich Plasmid- und Bakteriophagen-Vektoren, insbesondere das Plas­ mid pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.), verwendet werden. Die Vektor-DNA wird anschließend zur Erzeugung adhäsiver Enden mit einem Restriktionsenzym, wie BamHI (10-1000 Einhei­ ten/ml) während 60 Minuten oder mehr, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden, bei 30°C, vorzugsweise 37°C, gespalten. Die so er­ haltenen gespaltenen Vektoren werden in an sich bekannter Weise gereinigt. Die gespaltenen Vektoren werden mit Phenol und sodann mit Phenol/Chloroform extrahiert und gegebenen­ falls mit Ethanol präzipiziert.

Die das Cyclodextrinase-Gen enthaltenden Restriktionsfrag­ mente von Bacillus sphaericus E-244 werden mit der gespalte­ nen Vektor-DNA gemischt. Zu dem DNA-Gemisch wird DNA-Ligase (1-100 Einheiten) E. coli DNA-Ligase (New England Biolabs) oder T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim), vorzugsweise T4 DNA-Ligase) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann 1 Stunde oder länger, vorzugsweise 6 bis 24 Stunden, bei 4 bis 37°C, vorzugsweise 4 bis 16°C, inkubiert. Ein kommerziell erhält­ licher Ligasekit (Takara Shuzo Co., Ltd.) kann in diesem Li­ gaseverfahren verwendet werden. Die so erhaltene rekom­ binante DNA wird zur Transformation oder Transduktion von E. coli HB101 (ATCC 33694), JM101 (ATCC 33876), JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.), Dill (ATCC 33849) oder χ-1776 (ATCC 31244) nach dem von Morrison, D.A. in Methods in Enzymology, Bd. 68 (1979), 326-331, beschriebenen Transformationsverfahren oder nach dem von Hohn B., in Methods in Enzymology, Bd. 68 (1979), 299-309, beschriebenen Transduktionsverfahren ver­ wendet. Transformierte oder transduzierte Zellen werden auf das Cyclodextrinase codierende Gen hin untersucht und posi­ tive E. coli-Clone mit der Fähigkeit zur Herstellung von Cyclodextrinase werden erhalten.

Rekombinante DNA kann aus den positiven Clonen isoliert wer­ den und nach den Methoden von Guerry, P., J. Bacteriology, Bd. 116 (1973), 1064-1066, oder Clewell, D.B., J. Bacteriology, Bd. 110 (1972), 667-676, gereinigt werden. Das Cyclodextrinase-Gen wird unter Verwendung der Taq-Polymerase nach der Sanger/Didesoxyterminationsmethode sequenziert (SEQ ID Nr. 4). Die primäre Aminosäuresequenz des durch das Gen codierten Peptids wird anschließend bestimmt (SEQ ID Nr. 1).

Rekombinante DNA enthaltende positive E. coli-Transformanten werden zur Herstellung von Cyclodextrinase verwendet. Die Kultivierung wird nach dem gleichen aeroben Kultivierungs­ verfahren durchgeführt wie es für typische Mikroorganismen verwendet wird, vorzugsweise mittels eines Schüttelkultur­ verfahrens und eines Belüftungsrührkulturverfahrens unter Verwendung eines flüssigen Mediums. Das Kulturmedium kann einen oder mehrere Stickstoffquellen ausgewählt aus der Gruppe Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser oder Exsudat von Sojabohnen oder Weizen koji, eines oder mehrere anorganische Salze, ausgewählt aus der Gruppe Kali­ umdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesium­ sulfat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder Magnesiumsulfat und gegebenenfalls Kohlenhydrate oder Vita­ mine enthalten. Der pH-Wert des Kulturmediums liegt zu Be­ ginn vorzugsweise bei 7-9. Die Kultivierung wird für 4 bis 24 Stunden, vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 42° C, vorzugsweise bei 37°C, durchgeführt.

Nach beendetem Wachstum wird die Cyclodextrinase aus der Kultur nach dem üblichen Verfahren zum Gewinnen von Enzymen isoliert. Beispielsweise werden die Bakterienzellen zum Freisetzen des Enzyms physikalisch mittels Ultraschallbe­ handlung oder mit einem Mörser/Pistill aufgebrochen, oder sie werden chemisch unter Verwendung eines Enzyms, wie Lyso­ zym, oder von Toluol (Bakterienzellen werden mit diesen Reagentien entweder mit oder ohne Schütteln inkubiert) ly­ siert. Die Lysate werden filtriert, unlösliche Bestandteile werden abzentrifugiert. Wenn nötig, wird die Nukleinsäure unter Verwendung von Streptomycinsulfat, Protaminsulfat oder Magnesiumsulfat entfernt. Die erhaltene Lösung wird an­ schließend unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Alkohol und Aceton fraktioniert und die Fällung aufbewahrt. Die Fällung wird in Wasser aufgenommen und gegen Wasser dialysiert. Der Rückstand wird zum Gewinnen von rohem Enzym gefriergetrock­ net. Das rohe Enzym wird mittels verschiedener chromatogra­ phischer Methoden einschließlich Ionenaustauschchromatogra­ phie, wie DEAE-Sepharose (Diethylaminoethyl-Sepharose, Pharmacia K.K.) und DEAE-Sephadex (Pharmacia K.K.), oder mittels Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-200 (Pharmacia K.K.) und Biorad P-150 (Biorad) gereinigt. Wenn nötig, kann zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Rei­ nigungstechniken Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie (TSK-Gel DEAE-5PW, Tosoh Corporation) von hydrophober Chromatographie (TSK-Gel Phenyl 5PW, Tosoh Corporation) und Gelfiltration (TSK-Gel G3000SW, Tosoh Corporation) verwendet werden. Nach der Reinigung wird hochgereinigte Cyclodextrinase erhalten.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der gerei­ nigten Cyclodextrinase entsprechen denen der in Biochem. Biophys. Acta. Bd. 1036 (1990), 1-5, beschriebenen Cyclodex­ trinase.

Die vorliegende Erfindung stellt somit ein industriell sehr brauchbares Verfahren zur Herstellung großer Mengen Cyclo­ dextrinase bereit, wobei zu der Gattung Escherichia gehö­ rende Bakterien mit rekombinanter DNA, die ein Cyclodextri­ nasegen enthaltendes DNA-Fragment enthält, transformiert und die Transformanten in einem Kulturmedium gezüchtet werden. Das Enzym wird aus dem Kulturmedium gewonnen.

Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert.

Herstellung von chromosomaler DNA von Bacillus sphaericus E-244

100 ml eines Flüssigmediums (1% β-Cyclodextrin, 1% Pepton, 0,5% Natriumchlorid, 0,1% Hefeextrakt, Leitungswasser/pH 7,0) wurden in einem 500 ml Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Mit einer Impföse wurde aus einer Schrägkultur von Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458) das Kulturmedium angeimpft und die Kultur für einen Tag bei 30°C unter Schütteln inkubiert. 1 ml der Eintageskultur wurde zu 10 ml eines in einem großen Versuchsgefäß befindli­ chen Kulturmediums (das wie vorstehend beschrieben die glei­ chen Nährstoffe enthielt und in der gleichen Art und Weise sterilisiert wurde) gegeben. Das Gemisch wurde unter Schüt­ teln (bei 120 Upm) 2 Tage bei 30°C inkubiert. Nach dem Wachstum wurde die Kultur 20 min bei 5000× g zentrifugiert. Etwa 50 mg der so erhaltenen Bakterienzellen wurden zur Ex­ traktion chromosomaler DNA nach dem Verfahren von Saito und Miura, Biochem. Biophys. Acta. Bd. 72 (1963), 619, verwen­ det. 60 µg der chromosomalen DNA, 10 Einheiten BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 40 µl 50 mM Tris-HCl/pH 7,4 mit 100 mM Natriumchlorid und 10 mM Magnesiumsulfat wurden gemischt und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Reaktion wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und der Ex­ trakt mit Ethanol gefällt. Die Fällung wurde resuspendiert und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm versetzt, um Selbstligation des DNA-Fragmentes zu verhindern. Die Dephos­ phorylierungsreaktion wurde nach dem in Maniatis et al., Molecular Cloning, 2. Auflage (1989), 133-134, beschriebenen Verfahren ausgeführt. Die DNA-Lösung wurde mit Phenol extra­ hiert und der Extrakt mit Ethanol gefällt. Es wurden 50 mg BamHI gespaltener chromosomaler DNA-Fragmente von Bacillus sphaericus E-244 erhalten.

Chromosomale DNA-Bibliothek von Bacillus sphaericus E-244 im Plasmidvektor pUC 118

20 mg von pUC118 DNA (Takara Shuzo Co., Ltd.), 10 Einheiten von BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 20 ml 50 mM Tris- HCl/pH 7,4 mit 100 mM Natriumchlorid sowie 10 mM Magnesium­ sulfat wurden gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Reaktion wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und der Extrakt mit Ethanol gefällt.

1 µg der BamHI gespaltenen pUC118 DNA, 1 µg der BamHI ge­ spaltenen chromosomalen DNA-Fragmente von Bacillus sphaericus E-244 und Reagentien eines DNA-Ligasekits (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden gemischt und 16 Stunden bei 16°C in­ kubiert. 10 µl der rekombinante DNA enthaltenden Lösung wur­ den zu 100 gl kompetenter Zellen von E. coli JM 109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) gegeben. Das Gemisch wurde für 20 Minuten auf Eis gestellt. 110 µl des Gemisches wurden zu 3 ml eines sterilen T-Y-Mediums [1% (Gew./Vol.) Bacto-trypton (Difco), 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt (Difco), 0,5% (Gew./Vol.) Na­ triumchlorid, pH 7,2] gegeben und unter Schütteln 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 200 µl jeder Kultur auf sterilen X-Gal-Platten (9 cm Durchmesser) ausge­ strichen, die 20 ml eines Kulturmediums [1% (Gew./Vol.) Bacto-trypton (Difco), 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt (Difco), 0,5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid, 1,5% Agar (pH 7,2% und 50 µg/ml (Gew./Vol.) filtersterilisiertes (Poren­ größe 0,22 µm) IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (Boehringer), 40 µg/ml (Gew./Vol.) X-Gal (5-Brom-4-chlor-3- indolyl-galactopyranosid (Boehringer)], und 25 µg/ml (Gew./Vol.) Ampicillin (Sigma) enthielt. Die Platte wurde ohne Schütteln 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Auf der Platte wachsende weiße Kolonien wurden abgenommen und auf sterile X-Gal-Platten transferiert. Nach der Inkubation wurden etwa 3000 Transformanten auf der Platte erhalten (chromosomale DNA-Bibliothek).

Beispiel 3 Herstellung der DNA-Sondenmoleküle

100 ml eines Flüssigmediums (1% β-Cyclodextrin, 1% Pepton, 0,5% Natriumchlorid, 0,1% Hefeextrakt, Leitungswasser/pH 7,0) wurden in einem 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Mit einer Impföse einer Schrägkultur von Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458) wurde das Kulturmedium angeimpft und 1 Tag unter Schütteln bei 30°C inkubiert. 100 ml dieser Eintageskultur wurde zu 20 l eines Kulturmediums (das wie vorstehend beschrieben die gleichen Nährstoffe enthielt und in der gleichen Weise ste­ rilisiert wurde) in ein 30 l-Kulturgefäß gegeben. Das Kul­ turgefäß wurde unter Rühren und Belüftung (bei 0,5 vvm, 220 Upm) 2 Tage bei 30°C inkubiert. Nach dem Wachstum wurde die Kultur bei 17000× g zentrifugiert und ergab so etwa 230 g Bakterienzellen. Die Bakterienzellen wurden extrahiert und etwa 20 mg des gereinigten Enzyms wurden nach dem in Biochem. Biophys. Acta. Bd. 1036 (1990), 1-5, beschriebenen Verfahren erhalten. 1 mg des gereinigten Enzyms wurde lyophilisiert. Nach der Lyophilisation wurde das Enzym in 100 µl 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) aufgelöst. Die Lö­ sung wurde zur Proteinsequenzierung [Applied Biosystem Inc. (ABI)] verwendet und die N-terminale primäre Aminosäurese­ quenz des Enzyms bestimmt. 1 mg gereinigtes Enzym, 30 mg Cyanobromimid, 2,1 ml Ameisensäure und 0,9 ml vollentsalztes Wasser wurden in einen Rundkolben gegeben und die Öffnung des Kolbens wurde verstopft. Der Kolben wurde im Dunkeln 24 Stunden bei 25°C inkubiert und geschüttelt, um das Enzym in Peptidfragmente zu zerlegen. Die entstehende Peptidlösung wurde in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck getrocknet. Die getrockneten Peptidfragmente wurden in 0,4 ml einer 0,2 N Essigsäure gelöst. Die Peptidlösung wurde einer HPLC unter Verwendung einer mit 0,1% Trifluoressig­ säure äquilibrierten gepackten Säule [5C₄-300, Durchmesser 4,6 mm×250 mm, (Nacalai Tesque Co.)] unterworfen. Nachdem die Peptide adsorbiert hatten, wurde 80%ige Acetonitril-Gra­ dientenlösung auf die Säule gegeben. Jede Peptidfraktion wurde gesammelt, unter vermindertem Druck getrocknet und in 100 ml einer 0,1%igen Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Jede Peptidlösung wurde mittels des Proteinsequenzierers unter­ sucht und die primäre Aminosäuresequenz jedes Peptides be­ stimmt.

Die N-terminale Aminosäuresequenz der Cyclodextrinase ist in SEQ Nr. 2 und die primäre Aminosäuresequenz eines Peptids in SEQ Nr. 3 angegeben.

Einem Teil der N-terminalen Aminosäuresequenz entsprechend wurden 20 Nukleotidreste mittels einer DNA-Synthesemaschine (Beckman) für einen DNA-Primer (i) synthetisiert. Ahnlich wurden 27 Nukleotidreste für einen DNA-Primer (ii) syntheti­ siert, die komplementär zu der von einem Teil der Aminosäu­ resequenz eines Peptidfragmentes abgeleiteten Nukleotidse­ quenz sind. Die DNA-Sequenz zwischen den Primern (i) und (ii) wurde unter Verwendung einer thermocyclischen PCR-Ma­ schine (Perkin Elmer Cetus) mittels der Primer (i) und (ii), der in Beispiel 1 hergestellten chromosomalen DNA von Bacillus sphaericus E-244 ("template") und eines "Polymerase chain reaction"-Kits (Perkin Elmer Cetus) amplifiziert.

Das amplifizierte DNA-Fragmente enthaltene Reaktionsgemisch wurde auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufge­ trennt. Die amplifizierte DNA wurde aus dem Gel ausgeschnit­ ten, die DNA wurde extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Nicht-radio­ aktive DNA-Sondenmoleküle wurden aus der DNA-Lösung unter Verwendung eines nicht-radioaktiven DNA-Markierungs- und Nachweiskits (Boehringer) hergestellt.

Beispiel 4 Nachweis von Cyclodextrinase-Genen

Die in Beispiel 2 hergestellte chromosomale DNA-Bibliothek wurde unter Verwendung nicht radioaktiver DNA-Sondenmoleküle nach dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, (1989), 90-99), untersucht. Die Hybridisierung wurde mittels eines nicht-radioaktiven DNA-Markierungs- und Nachweiskits (Boehringer) nachgewiesen. Unter 3000 Kolonien in der chro­ mosomalen DNA-Bibliothek wurde ein einziger positiver Clon gefunden. Der Positive Clon wurde mittels einer Impföse in 3 ml steriles T-Y-Medium überimpft, das wie vorstehend be­ schrieben hergestellt wurde, und 16 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach dem Wachstum wurde die Kultur 20 Minuten bei 5000× g zentrifugiert und ergab 2 mg Bakterien­ zellen. Die das Cyclodextrinase-Gen enthaltende Plasmid-DNA wurde aus den Bakterienzellen nach dem Alkaliverfahren (Maniatis T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage (1989), 25-28) extrahiert. Die Plas­ mid-DNA wurde mit Ethanol gefällt und die Fällung in 200 µl TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. 10 µl der DNA-Suspension, 1 Einheit SacI (Boehringer), 1 Einheit BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), 2 µl Reaktionspuffer (Boehringer) und 10 µl sterilisierten Wassers wurden gemischt und das Re­ aktionsgemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert. 1 µg pUC118-Vek­ tor-DNA, 1 Einheit SacI (Boehringer), 1 Einheit BamHI (Takara Shuzo Co. Ltd.), 2 µl Reaktionspuffer (Boehringer) und 10 µl sterilisiertes Wasser wurden gemischt und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Spal­ tung wurde das Insert und die Vektor-DNA unter Verwendung eines Ligasekits 16 Stunden bei 16°C ligiert. Das Ligasege­ misch wurde dann dazu verwendet, E. coli JM 109 nach dem in J. of Bacteriology, Bd. 119 (1974), 1072-1074, beschriebenen Verfahren zu transformieren. Die Transformanten wurden auf Cyclodextrinaseaktivität hin untersucht. Es wurde eine posi­ tive Transformante erhalten.

Die so erhaltene Transformante E. coli JM109 (pCD722) wurde am 4.02.1991 beim Fermentation Research Institute, Agency of Science and Industrial Technology, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-3263.

Aus 10 ml einer E. coli JM109 (pCD722)-Kultur wurde nach dem Alkaliverfahren (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), 25-28), 20 g Plasmid- DNA erhalten. Die Plasmid-DNA wurde als pCD722 bezeichnet. 1 µg pCD722-DNA wurde mit einer Kombination von SacI, EcoRI (Boehringer) und BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten. Nach der Spaltung wurde das Spaltungsgemisch auf einem 0,7 oder 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Größe der DNA-Bande wurde bestimmt und eine Re­ striktionskarte erstellt.

Beispiel 5 E. coli JM109 (pCD722) Kultur und Herstellung des rohen Enzyms

E. coli JM109 (pCD722) (FERM BP 3263) wurde unter Schütteln 16 Stunden bei 37°C in 3 ml eines T-Y-Mediums inkubiert. Die Kultur wurde auf Eis 2 Minuten ultraschallbehandelt und das Gemisch aus aufgebrochenen Bakterienzellen 20 Minuten bei 10 000× g zentrifugiert. Nach Entfernen der Zellreste wurde ermittelt, daß der ungereinigte Enzymextrakt 3 Einheiten pro ml Cyclodextrinaseaktivität aufwies. Vergleichsweise wurde pUC118 enthaltender E. coli JM109 wie vorstehend beschrieben kultiviert und die Cyclodectrinaseaktivität des Extraktes untersucht. In dem Extrakt wurde keine Enzymaktivität gefun­ den.

Beispiel 6 Analyse der Nukleotidsequenz des aus Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458) stammenden Cyclodextrinase-Gens

10 µg der in Beispiel 4 erhaltenen pCD722 DNA, 1 Einheit SacI (Boehringer), 1 Einheit BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), 2 µl Reaktionspuffer (Boehringer) und 10 µl sterilisiertes Wasser wurden gemischt und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Spaltung wurde das Spaltungsgemisch auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Ein interessierendes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extra­ hiert und die DNA mit Ethanol gefällt. Es wurden 5 µg gerei­ nigte DNA erhalten.

1 µg Vektor-DNA von pUC119, 1 Einheit SacI (Boehringer), 1 Einheit BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), 2 µl Reaktionspuffer (Boehringer) und 19 µl sterilisiertes Wasser wurden ge­ mischt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inku­ biert. Nach der Spaltung wurde das Vektor-DNA-Gemisch und etwa 2,5 µg der gereinigten DNA 16 Stunden bei 16°C ligiert. Das Ligasegemisch wurde anschließend dazu verwendet, E. coli JM109 nach dem in J. of Bacteriology, Bd. 119 (1974), 1072-1074, beschriebenen Verfahren zu transformieren. Die Trans­ formanten wurden auf Cyclodextrinaseaktivität hin unter­ sucht. Es wurde eine positive Transformante erhalten. Etwa 20 µg Plasmid-DNA wurde nach dem Alkaliverfahren (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage (1989), 25-28), aus 10 ml einer Kultur des transformierten E. coli JM109 erhalten. Die Plasmid-DNA wurde als pCD722′ bezeichnet. pCD722′ enthielt das gleiche DNA-Fragment wie pCD722, jedoch war das Cyclodextrinase-Gen­ fragment der pCD722′-DNA umgekehrt orientiert.

Nach der Methode von Henikoff, Gene, Bd. 28 (1984), 351-359, wurden unter Verwendung eines "kilosequence" Deletionskits (Takara Shuzo Co., Ltd.) in die rekombinanten Plasmide pCD722 und pCD722′ unterschiedliche Deletionen ausgeführt. Die rekombinanten Plasmide wurden wie in Beispiel 4 be­ schrieben zur Transformation von E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet. Nach der Methode von Messing (Methods in Enzymology, Bd. 101 (1983), 20-78, wurden zur Herstellung einzelsträngiger DNA die Transformanten mit Helferphagen M13K07 (Takara Shuzo Co., Ltd.) infiziert. Die einzelsträn­ gige DNA wurde unter Verwendung eines Taq Polymerasesequen­ zierkits [(Applied Biosystem Instrument (ABI)] und einer DNA-Sequenziermaschine [(Applied Biosystem Instrument (ABI)] sequenziert.

Die gesamte aus Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458) stammende Nukleotidsequenz des Cyclodextrinasegens ist in SEQ ID Nr. 4 gezeigt. Die aus der Nukleotidsequenz abgelei­ tete primäre Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt.

Claims (4)

1. Cyclodextrinase-Gen, das für eine in SEQ ID Nr. 1 ge­ zeigte Aminosäuresequenz codiert.

2. Cyclodextrinase-Gen, das die in SEQ ID Nr. 4 gezeigte Nukleotidsequenz umfaßt.

3. Rekombinante DNA, die die Nukleotidsequenz des Cyclodex­ trinasegens nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt.

4. Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinase, dadurch gekennzeichnet, daß ein zur Gattung Escherichia gehören­ der Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA mit dem Cyclodextrinase-Gen enthält, in einem Kulturmedium kulti­ viert wird und daß Cyclodextrinase aus der Kultur gewon­ nen wird.