DE4204476A1 - Cyclodextrinase-gene und verfahren zur herstellung von cyclodextrinase - Google Patents
Cyclodextrinase-gene und verfahren zur herstellung von cyclodextrinaseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Cyclodextrinase-Gen enthaltende
neue rekombinante DNA und ein Verfahren zur Herstellung von
Cyclodextrinase unter Verwendung der rekombinanten DNA.
Cyclodextrinase ist ein Enzym, das unter spezifischer Spal
tung von α(1<4) Bindungen des Cyclodextrins dieses hydroly
siert und zu linearen Maltooligosacchariden führt, die den
gleichen Glucose-Polymerisationsgrad wie das ursprüngliche
Cyclodextrin aufweisen. Daher ist die Cyclodextrinase ge
eignet zur Herstellung von Maltooligosacchariden, wie Malto
heptaose. Lineare Maltooligosaccharide mit dem gleichen Glu
cose-Polymerisationsgrad wie Cyclodextrin werden nach be
kanntem Verfahren effizient unter Verwendung von Cyclodex
trinase hergestellt.
In diesem Verfahren wird Cyclodextri
nase durch Reinigen einer aus Zellen des kultivierten
Bacillus sphaericus E 244 (JP-OS Nr. 1 52 257/1989) isolierten
ungereinigten Gyclodextrinase hergestellt.
In dem vorgenannten Verfahren ist jedoch die Ausbeute an
Cyclodextrinase sehr gering.
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen
an Cyclodextrinase aus der JP-OS Nr. 22 405/1991 bekannt. In
diesem Verfahren wird ein ein Cyclodextrinase-Gen
enthaltendes DNA-Fragment in eine Vektor-DNA inseriert.
Anschließend werden Bakterien der Gattung Escherichia mit
der rekombinanten DNA transformiert. Erfolgreich
transformierte Bakterien werden zur Herstellung des Enzyms
gezüchtet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes
Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinase auf mikrobio
logischem Weg bereitzustellen. Die Lösung dieser Aufgabe er
gibt sich aus der nachstehenden Beschreibung und den Pa
tentansprüchen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der erfolgreichen Iso
lierung eines Cyclodextrinase-Gens von Bacillus sphaericus
E-244 und der Aufklärung seiner Struktur (Sequenz).
Somit betrifft die Erfindung ein Cyclodextrinase-Gen, das
für die in SEQ ID Nr. 1 beschriebene Aminosäuresequenz co
diert.
Die Erfindung betrifft ferner ein Cyclodextrinase-Gen mit
der in SEQ ID Nr. 4 beschriebenen Nukleotidsequenz.
Die Erfindung betrifft ferner eine rekombinante DNA, die das
Cyclodextrinase-Gen enthält.
Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Her
stellung von Cyclodextrinase, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man zur Gattung Escherichia gehörende Mikroorganis
men, die eine rekombinante DNA mit dem Cyclodextrinase-Gen
enthalten, in einem Kulturmedium züchtet und die gebildete
Cyclodextrinase aus der Kultur isoliert.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend näher erläutert.
Zunächst wird die Gewinnung des Cyclodextrinase-Gens erläu
tert. Jeder zur Gattung Bacillus gehörende Mikroorganismus,
der ein Cyclodextrinase-Gen aufweist, kann als Spender ver
wendet werden. Bevorzugt ist Bacillus sphaericus E-244 (der
unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2458 am 8.06.1989 beim
Fermentation Research Institute, Agency of Industrial
Science and Technology hinterlegt wurde). Das Bakterium wird
unter den gleichen aeroben Bedingungen wie es für typische
Mikroorganismen verwendet wird kultiviert, beispielsweise
durch Schüttelkultur oder durch Belüften und Rühren eines
flüssigen Mediums. Das Kulturmedium kann eine
Stickstoffquelle, Kohlenstoffquelle, Vitamine, Mineralstoffe
und Cyclodextrin als Enzym induzierendes Substrat enthalten.
Der pH-Bereich des Kulturmediums kann dem für das Wachstum
der Bakterien geeigneten Bereich entsprechen, vorzugsweise
6-8. Die Kultivierung kann in einem Schüttler oder in
einem Belüftungsrührfermenter während 16 bis 96 Stunden bei
20 bis 40°C durchgeführt werden. Nach beendetem Wachstum
wird die Kultur mindestens 5 Minuten, vorzugsweise 10 bis 15
Minuten, bei 700× g, vorzugsweise 5000 bis 8000× g, zen
trifugiert. Aus den erhaltenen Bacillus sphaericus E-244-
Zellen wird die chromosomale DNA nach dem von Saito und
Miura in Biochem. Biophys. Acta., Bd. 72 (1963), 619 be
schriebenen Verfahren extrahiert. Die chromosomale DNA wird
anschließend zur Erzeugung adhäsiver Enden mit einem
Restriktionsenzym, wie BamHI (1-10 Einheiten/ml) während 20
Minuten, vorzugsweise 30 bis 120 Minuten, bei 30°C, vorzugs
weise 37°C gespalten. Verschiedene so erhaltene Restrik
tionsfragmente werden in an sich bekannter Weise gereinigt.
Die Restriktionsfragmente werden mit Phenol und sodann mit
Phenol/Chloroform extrahiert und gegebenenfalls mit Ethanol
präzipiziert.
Als Vektor-DNA kann jeder beliebige Vektor einschließlich
Plasmid- und Bakteriophagen-Vektoren, insbesondere das Plas
mid pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.), verwendet werden. Die
Vektor-DNA wird anschließend zur Erzeugung adhäsiver Enden
mit einem Restriktionsenzym, wie BamHI (10-1000 Einhei
ten/ml) während 60 Minuten oder mehr, vorzugsweise 1 bis 3
Stunden, bei 30°C, vorzugsweise 37°C, gespalten. Die so er
haltenen gespaltenen Vektoren werden in an sich bekannter
Weise gereinigt. Die gespaltenen Vektoren werden mit Phenol
und sodann mit Phenol/Chloroform extrahiert und gegebenen
falls mit Ethanol präzipiziert.
Die das Cyclodextrinase-Gen enthaltenden Restriktionsfrag
mente von Bacillus sphaericus E-244 werden mit der gespalte
nen Vektor-DNA gemischt. Zu dem DNA-Gemisch wird DNA-Ligase
(1-100 Einheiten) E. coli DNA-Ligase (New England Biolabs)
oder T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim), vorzugsweise T4
DNA-Ligase) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann 1 Stunde
oder länger, vorzugsweise 6 bis 24 Stunden, bei 4 bis 37°C,
vorzugsweise 4 bis 16°C, inkubiert. Ein kommerziell erhält
licher Ligasekit (Takara Shuzo Co., Ltd.) kann in diesem Li
gaseverfahren verwendet werden. Die so erhaltene rekom
binante DNA wird zur Transformation oder Transduktion von E.
coli HB101 (ATCC 33694), JM101 (ATCC 33876), JM109 (Takara
Shuzo Co., Ltd.), Dill (ATCC 33849) oder χ-1776 (ATCC 31244)
nach dem von Morrison, D.A. in Methods in Enzymology, Bd. 68
(1979), 326-331, beschriebenen Transformationsverfahren oder
nach dem von Hohn B., in Methods in Enzymology, Bd. 68
(1979), 299-309, beschriebenen Transduktionsverfahren ver
wendet. Transformierte oder transduzierte Zellen werden auf
das Cyclodextrinase codierende Gen hin untersucht und posi
tive E. coli-Clone mit der Fähigkeit zur Herstellung von
Cyclodextrinase werden erhalten.
Rekombinante DNA kann aus den positiven Clonen isoliert wer
den und nach den Methoden von Guerry, P., J. Bacteriology,
Bd. 116 (1973), 1064-1066, oder Clewell, D.B., J.
Bacteriology, Bd. 110 (1972), 667-676, gereinigt werden. Das
Cyclodextrinase-Gen wird unter Verwendung der Taq-Polymerase
nach der Sanger/Didesoxyterminationsmethode sequenziert (SEQ
ID Nr. 4). Die primäre Aminosäuresequenz des durch das Gen
codierten Peptids wird anschließend bestimmt (SEQ ID Nr. 1).
Rekombinante DNA enthaltende positive E. coli-Transformanten
werden zur Herstellung von Cyclodextrinase verwendet. Die
Kultivierung wird nach dem gleichen aeroben Kultivierungs
verfahren durchgeführt wie es für typische Mikroorganismen
verwendet wird, vorzugsweise mittels eines Schüttelkultur
verfahrens und eines Belüftungsrührkulturverfahrens unter
Verwendung eines flüssigen Mediums. Das Kulturmedium kann
einen oder mehrere Stickstoffquellen ausgewählt aus der
Gruppe Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser
oder Exsudat von Sojabohnen oder Weizen koji, eines oder
mehrere anorganische Salze, ausgewählt aus der Gruppe Kali
umdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesium
sulfat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisensulfat oder
Magnesiumsulfat und gegebenenfalls Kohlenhydrate oder Vita
mine enthalten. Der pH-Wert des Kulturmediums liegt zu Be
ginn vorzugsweise bei 7-9. Die Kultivierung wird für 4 bis
24 Stunden, vorzugsweise für 6 bis 24 Stunden bei 30 bis
42° C, vorzugsweise bei 37°C, durchgeführt.
Nach beendetem Wachstum wird die Cyclodextrinase aus der
Kultur nach dem üblichen Verfahren zum Gewinnen von Enzymen
isoliert. Beispielsweise werden die Bakterienzellen zum
Freisetzen des Enzyms physikalisch mittels Ultraschallbe
handlung oder mit einem Mörser/Pistill aufgebrochen, oder
sie werden chemisch unter Verwendung eines Enzyms, wie Lyso
zym, oder von Toluol (Bakterienzellen werden mit diesen
Reagentien entweder mit oder ohne Schütteln inkubiert) ly
siert. Die Lysate werden filtriert, unlösliche Bestandteile
werden abzentrifugiert. Wenn nötig, wird die Nukleinsäure
unter Verwendung von Streptomycinsulfat, Protaminsulfat oder
Magnesiumsulfat entfernt. Die erhaltene Lösung wird an
schließend unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Alkohol und
Aceton fraktioniert und die Fällung aufbewahrt. Die Fällung
wird in Wasser aufgenommen und gegen Wasser dialysiert. Der
Rückstand wird zum Gewinnen von rohem Enzym gefriergetrock
net. Das rohe Enzym wird mittels verschiedener chromatogra
phischer Methoden einschließlich Ionenaustauschchromatogra
phie, wie DEAE-Sepharose (Diethylaminoethyl-Sepharose,
Pharmacia K.K.) und DEAE-Sephadex (Pharmacia K.K.), oder
mittels Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-200
(Pharmacia K.K.) und Biorad P-150 (Biorad) gereinigt. Wenn
nötig, kann zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Rei
nigungstechniken Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie (TSK-Gel
DEAE-5PW, Tosoh Corporation) von hydrophober Chromatographie
(TSK-Gel Phenyl 5PW, Tosoh Corporation) und Gelfiltration
(TSK-Gel G3000SW, Tosoh Corporation) verwendet werden. Nach
der Reinigung wird hochgereinigte Cyclodextrinase erhalten.
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der gerei
nigten Cyclodextrinase entsprechen denen der in Biochem.
Biophys. Acta. Bd. 1036 (1990), 1-5, beschriebenen Cyclodex
trinase.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein industriell sehr
brauchbares Verfahren zur Herstellung großer Mengen Cyclo
dextrinase bereit, wobei zu der Gattung Escherichia gehö
rende Bakterien mit rekombinanter DNA, die ein Cyclodextri
nasegen enthaltendes DNA-Fragment enthält, transformiert und
die Transformanten in einem Kulturmedium gezüchtet werden.
Das Enzym wird aus dem Kulturmedium gewonnen.
Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert.
100 ml eines Flüssigmediums (1% β-Cyclodextrin, 1% Pepton,
0,5% Natriumchlorid, 0,1% Hefeextrakt, Leitungswasser/pH
7,0) wurden in einem 500 ml Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei
120°C sterilisiert. Mit einer Impföse wurde aus einer
Schrägkultur von Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458)
das Kulturmedium angeimpft und die Kultur für einen Tag bei
30°C unter Schütteln inkubiert. 1 ml der Eintageskultur
wurde zu 10 ml eines in einem großen Versuchsgefäß befindli
chen Kulturmediums (das wie vorstehend beschrieben die glei
chen Nährstoffe enthielt und in der gleichen Art und Weise
sterilisiert wurde) gegeben. Das Gemisch wurde unter Schüt
teln (bei 120 Upm) 2 Tage bei 30°C inkubiert. Nach dem
Wachstum wurde die Kultur 20 min bei 5000× g zentrifugiert.
Etwa 50 mg der so erhaltenen Bakterienzellen wurden zur Ex
traktion chromosomaler DNA nach dem Verfahren von Saito und
Miura, Biochem. Biophys. Acta. Bd. 72 (1963), 619, verwen
det. 60 µg der chromosomalen DNA, 10 Einheiten BamHI (Takara
Shuzo Co., Ltd.) und 40 µl 50 mM Tris-HCl/pH 7,4 mit 100 mM
Natriumchlorid und 10 mM Magnesiumsulfat wurden gemischt und
das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der
Reaktion wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und der Ex
trakt mit Ethanol gefällt. Die Fällung wurde resuspendiert
und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm versetzt, um
Selbstligation des DNA-Fragmentes zu verhindern. Die Dephos
phorylierungsreaktion wurde nach dem in Maniatis et al.,
Molecular Cloning, 2. Auflage (1989), 133-134, beschriebenen
Verfahren ausgeführt. Die DNA-Lösung wurde mit Phenol extra
hiert und der Extrakt mit Ethanol gefällt. Es wurden 50 mg
BamHI gespaltener chromosomaler DNA-Fragmente von Bacillus
sphaericus E-244 erhalten.
20 mg von pUC118 DNA (Takara Shuzo Co., Ltd.), 10 Einheiten
von BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 20 ml 50 mM Tris-
HCl/pH 7,4 mit 100 mM Natriumchlorid sowie 10 mM Magnesium
sulfat wurden gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden
bei 37°C inkubiert. Nach der Reaktion wurde das Gemisch mit
Phenol extrahiert und der Extrakt mit Ethanol gefällt.
1 µg der BamHI gespaltenen pUC118 DNA, 1 µg der BamHI ge
spaltenen chromosomalen DNA-Fragmente von Bacillus
sphaericus E-244 und Reagentien eines DNA-Ligasekits (Takara
Shuzo Co., Ltd.) wurden gemischt und 16 Stunden bei 16°C in
kubiert. 10 µl der rekombinante DNA enthaltenden Lösung wur
den zu 100 gl kompetenter Zellen von E. coli JM 109 (Takara
Shuzo Co., Ltd.) gegeben. Das Gemisch wurde für 20 Minuten
auf Eis gestellt. 110 µl des Gemisches wurden zu 3 ml eines
sterilen T-Y-Mediums [1% (Gew./Vol.) Bacto-trypton (Difco),
0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt (Difco), 0,5% (Gew./Vol.) Na
triumchlorid, pH 7,2] gegeben und unter Schütteln 30 Minuten
bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 200 µl jeder
Kultur auf sterilen X-Gal-Platten (9 cm Durchmesser) ausge
strichen, die 20 ml eines Kulturmediums [1% (Gew./Vol.)
Bacto-trypton (Difco), 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt
(Difco), 0,5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid, 1,5% Agar (pH
7,2% und 50 µg/ml (Gew./Vol.) filtersterilisiertes (Poren
größe 0,22 µm) IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
(Boehringer), 40 µg/ml (Gew./Vol.) X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-
indolyl-galactopyranosid (Boehringer)], und 25 µg/ml
(Gew./Vol.) Ampicillin (Sigma) enthielt. Die Platte wurde
ohne Schütteln 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Auf der Platte
wachsende weiße Kolonien wurden abgenommen und auf sterile
X-Gal-Platten transferiert. Nach der Inkubation wurden etwa
3000 Transformanten auf der Platte erhalten (chromosomale
DNA-Bibliothek).
100 ml eines Flüssigmediums (1% β-Cyclodextrin, 1% Pepton,
0,5% Natriumchlorid, 0,1% Hefeextrakt, Leitungswasser/pH
7,0) wurden in einem 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20
Minuten bei 120°C sterilisiert. Mit einer Impföse einer
Schrägkultur von Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458)
wurde das Kulturmedium angeimpft und 1 Tag unter Schütteln
bei 30°C inkubiert. 100 ml dieser Eintageskultur wurde zu
20 l eines Kulturmediums (das wie vorstehend beschrieben die
gleichen Nährstoffe enthielt und in der gleichen Weise ste
rilisiert wurde) in ein 30 l-Kulturgefäß gegeben. Das Kul
turgefäß wurde unter Rühren und Belüftung (bei 0,5 vvm, 220
Upm) 2 Tage bei 30°C inkubiert. Nach dem Wachstum wurde die
Kultur bei 17000× g zentrifugiert und ergab so etwa 230 g
Bakterienzellen. Die Bakterienzellen wurden extrahiert und
etwa 20 mg des gereinigten Enzyms wurden nach dem in
Biochem. Biophys. Acta. Bd. 1036 (1990), 1-5, beschriebenen
Verfahren erhalten. 1 mg des gereinigten Enzyms wurde
lyophilisiert. Nach der Lyophilisation wurde das Enzym in
100 µl 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) aufgelöst. Die Lö
sung wurde zur Proteinsequenzierung [Applied Biosystem Inc.
(ABI)] verwendet und die N-terminale primäre Aminosäurese
quenz des Enzyms bestimmt. 1 mg gereinigtes Enzym, 30 mg
Cyanobromimid, 2,1 ml Ameisensäure und 0,9 ml vollentsalztes
Wasser wurden in einen Rundkolben gegeben und die Öffnung
des Kolbens wurde verstopft. Der Kolben wurde im Dunkeln 24
Stunden bei 25°C inkubiert und geschüttelt, um das Enzym in
Peptidfragmente zu zerlegen. Die entstehende Peptidlösung
wurde in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck
getrocknet. Die getrockneten Peptidfragmente wurden in
0,4 ml einer 0,2 N Essigsäure gelöst. Die Peptidlösung wurde
einer HPLC unter Verwendung einer mit 0,1% Trifluoressig
säure äquilibrierten gepackten Säule [5C4-300, Durchmesser
4,6 mm×250 mm, (Nacalai Tesque Co.)] unterworfen. Nachdem
die Peptide adsorbiert hatten, wurde 80%ige Acetonitril-Gra
dientenlösung auf die Säule gegeben. Jede Peptidfraktion
wurde gesammelt, unter vermindertem Druck getrocknet und in
100 ml einer 0,1%igen Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Jede
Peptidlösung wurde mittels des Proteinsequenzierers unter
sucht und die primäre Aminosäuresequenz jedes Peptides be
stimmt.
Die N-terminale Aminosäuresequenz der Cyclodextrinase ist in
SEQ Nr. 2 und die primäre Aminosäuresequenz eines Peptids in
SEQ Nr. 3 angegeben.
Einem Teil der N-terminalen Aminosäuresequenz entsprechend
wurden 20 Nukleotidreste mittels einer DNA-Synthesemaschine
(Beckman) für einen DNA-Primer (i) synthetisiert. Ahnlich
wurden 27 Nukleotidreste für einen DNA-Primer (ii) syntheti
siert, die komplementär zu der von einem Teil der Aminosäu
resequenz eines Peptidfragmentes abgeleiteten Nukleotidse
quenz sind. Die DNA-Sequenz zwischen den Primern (i) und
(ii) wurde unter Verwendung einer thermocyclischen PCR-Ma
schine (Perkin Elmer Cetus) mittels der Primer (i) und (ii),
der in Beispiel 1 hergestellten chromosomalen DNA von
Bacillus sphaericus E-244 ("template") und eines "Polymerase
chain reaction"-Kits (Perkin Elmer Cetus) amplifiziert.
Das amplifizierte DNA-Fragmente enthaltene Reaktionsgemisch
wurde auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufge
trennt. Die amplifizierte DNA wurde aus dem Gel ausgeschnit
ten, die DNA wurde extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE
(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Nicht-radio
aktive DNA-Sondenmoleküle wurden aus der DNA-Lösung unter
Verwendung eines nicht-radioaktiven DNA-Markierungs- und
Nachweiskits (Boehringer) hergestellt.
Die in Beispiel 2 hergestellte chromosomale DNA-Bibliothek
wurde unter Verwendung nicht radioaktiver DNA-Sondenmoleküle
nach dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren (Maniatis, T. et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage,
(1989), 90-99), untersucht. Die Hybridisierung wurde mittels
eines nicht-radioaktiven DNA-Markierungs- und Nachweiskits
(Boehringer) nachgewiesen. Unter 3000 Kolonien in der chro
mosomalen DNA-Bibliothek wurde ein einziger positiver Clon
gefunden. Der Positive Clon wurde mittels einer Impföse in 3
ml steriles T-Y-Medium überimpft, das wie vorstehend be
schrieben hergestellt wurde, und 16 Stunden bei 37°C unter
Schütteln inkubiert. Nach dem Wachstum wurde die Kultur 20
Minuten bei 5000× g zentrifugiert und ergab 2 mg Bakterien
zellen. Die das Cyclodextrinase-Gen enthaltende Plasmid-DNA
wurde aus den Bakterienzellen nach dem Alkaliverfahren
(Maniatis T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, zweite Auflage (1989), 25-28) extrahiert. Die Plas
mid-DNA wurde mit Ethanol gefällt und die Fällung in 200 µl
TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. 10 µl der
DNA-Suspension, 1 Einheit SacI (Boehringer), 1 Einheit BamHI
(Takara Shuzo Co., Ltd.), 2 µl Reaktionspuffer (Boehringer)
und 10 µl sterilisierten Wassers wurden gemischt und das Re
aktionsgemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert. 1 µg pUC118-Vek
tor-DNA, 1 Einheit SacI (Boehringer), 1 Einheit BamHI
(Takara Shuzo Co. Ltd.), 2 µl Reaktionspuffer (Boehringer)
und 10 µl sterilisiertes Wasser wurden gemischt und das
Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Spal
tung wurde das Insert und die Vektor-DNA unter Verwendung
eines Ligasekits 16 Stunden bei 16°C ligiert. Das Ligasege
misch wurde dann dazu verwendet, E. coli JM 109 nach dem in
J. of Bacteriology, Bd. 119 (1974), 1072-1074, beschriebenen
Verfahren zu transformieren. Die Transformanten wurden auf
Cyclodextrinaseaktivität hin untersucht. Es wurde eine posi
tive Transformante erhalten.
Die so erhaltene Transformante E. coli JM109 (pCD722) wurde
am 4.02.1991 beim Fermentation Research Institute, Agency of
Science and Industrial Technology, hinterlegt und erhielt
die Hinterlegungsnummer FERM BP-3263.
Aus 10 ml einer E. coli JM109 (pCD722)-Kultur wurde nach dem
Alkaliverfahren (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), 25-28), 20 g Plasmid-
DNA erhalten. Die Plasmid-DNA wurde als pCD722 bezeichnet.
1 µg pCD722-DNA wurde mit einer Kombination von SacI, EcoRI
(Boehringer) und BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten.
Nach der Spaltung wurde das Spaltungsgemisch auf einem 0,7
oder 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die
Größe der DNA-Bande wurde bestimmt und eine Re
striktionskarte erstellt.
E. coli JM109 (pCD722) (FERM BP 3263) wurde unter Schütteln
16 Stunden bei 37°C in 3 ml eines T-Y-Mediums inkubiert. Die
Kultur wurde auf Eis 2 Minuten ultraschallbehandelt und das
Gemisch aus aufgebrochenen Bakterienzellen 20 Minuten bei
10 000× g zentrifugiert. Nach Entfernen der Zellreste wurde
ermittelt, daß der ungereinigte Enzymextrakt 3 Einheiten pro
ml Cyclodextrinaseaktivität aufwies. Vergleichsweise wurde
pUC118 enthaltender E. coli JM109 wie vorstehend beschrieben
kultiviert und die Cyclodectrinaseaktivität des Extraktes
untersucht. In dem Extrakt wurde keine Enzymaktivität gefun
den.
10 µg der in Beispiel 4 erhaltenen pCD722 DNA, 1 Einheit
SacI (Boehringer), 1 Einheit BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.),
2 µl Reaktionspuffer (Boehringer) und 10 µl sterilisiertes
Wasser wurden gemischt und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei
37°C inkubiert. Nach der Spaltung wurde das Spaltungsgemisch
auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt.
Ein interessierendes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extra
hiert und die DNA mit Ethanol gefällt. Es wurden 5 µg gerei
nigte DNA erhalten.
1 µg Vektor-DNA von pUC119, 1 Einheit SacI (Boehringer), 1
Einheit BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), 2 µl Reaktionspuffer
(Boehringer) und 19 µl sterilisiertes Wasser wurden ge
mischt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inku
biert. Nach der Spaltung wurde das Vektor-DNA-Gemisch und
etwa 2,5 µg der gereinigten DNA 16 Stunden bei 16°C ligiert.
Das Ligasegemisch wurde anschließend dazu verwendet, E. coli
JM109 nach dem in J. of Bacteriology, Bd. 119 (1974), 1072-1074,
beschriebenen Verfahren zu transformieren. Die Trans
formanten wurden auf Cyclodextrinaseaktivität hin unter
sucht. Es wurde eine positive Transformante erhalten. Etwa
20 µg Plasmid-DNA wurde nach dem Alkaliverfahren (Maniatis,
T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite
Auflage (1989), 25-28), aus 10 ml einer Kultur des
transformierten E. coli JM109 erhalten. Die Plasmid-DNA
wurde als pCD722′ bezeichnet. pCD722′ enthielt das gleiche
DNA-Fragment wie pCD722, jedoch war das Cyclodextrinase-Gen
fragment der pCD722′-DNA umgekehrt orientiert.
Nach der Methode von Henikoff, Gene, Bd. 28 (1984), 351-359,
wurden unter Verwendung eines "kilosequence" Deletionskits
(Takara Shuzo Co., Ltd.) in die rekombinanten Plasmide
pCD722 und pCD722′ unterschiedliche Deletionen ausgeführt.
Die rekombinanten Plasmide wurden wie in Beispiel 4 be
schrieben zur Transformation von E. coli JM109 (Takara Shuzo
Co., Ltd.) verwendet. Nach der Methode von Messing (Methods
in Enzymology, Bd. 101 (1983), 20-78, wurden zur Herstellung
einzelsträngiger DNA die Transformanten mit Helferphagen
M13K07 (Takara Shuzo Co., Ltd.) infiziert. Die einzelsträn
gige DNA wurde unter Verwendung eines Taq Polymerasesequen
zierkits [(Applied Biosystem Instrument (ABI)] und einer
DNA-Sequenziermaschine [(Applied Biosystem Instrument (ABI)]
sequenziert.
Die gesamte aus Bacillus sphaericus E-244 (FERM BP-2458)
stammende Nukleotidsequenz des Cyclodextrinasegens ist in
SEQ ID Nr. 4 gezeigt. Die aus der Nukleotidsequenz abgelei
tete primäre Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt.
Claims (4)
1. Cyclodextrinase-Gen, das für eine in SEQ ID Nr. 1 ge
zeigte Aminosäuresequenz codiert.
2. Cyclodextrinase-Gen, das die in SEQ ID Nr. 4 gezeigte
Nukleotidsequenz umfaßt.
3. Rekombinante DNA, die die Nukleotidsequenz des Cyclodex
trinasegens nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
4. Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinase, dadurch
gekennzeichnet, daß ein zur Gattung Escherichia gehören
der Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA mit dem
Cyclodextrinase-Gen enthält, in einem Kulturmedium kulti
viert wird und daß Cyclodextrinase aus der Kultur gewon
nen wird.
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Cited By (2)
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