CN108884120A

CN108884120A - 用于通过使用微生物纯化3，6-脱水-l-半乳糖的新颖方法

Info

Publication number: CN108884120A
Application number: CN201780021204.5A
Authority: CN
Inventors: 金京宪; 崔仁杰; 兪素萝; 尹银珠; 赵庆纹
Original assignee: Industry Academy Collaboration Foundation of Korea University
Current assignee: Industry Academy Collaboration Foundation of Korea University
Priority date: 2016-04-04
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: US11118202B2; KR20170114379A; US20200165646A1; KR101851628B1; CN108884120B; WO2017176010A1

Abstract

本发明涉及一种用于通过使用微生物来纯化3，6‑脱水‑L‑半乳糖的新颖方法，且提供在琼脂糖或琼脂的酶水解之后的纯化期间通过使用微生物提高3，6‑脱水‑L‑半乳糖的生产产率的效果。

Description

用于通过使用微生物纯化3，6-脱水-L-半乳糖的新颖方法

技术领域

本发明涉及一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的新颖方法，其通过在琼脂糖或琼脂的酶水解之后使用微生物纯化来提高3，6-脱水-L-半乳糖的生产产率。

背景技术

构成红藻的主要多醣是琼脂糖，其为通过利用α-1，3-键和β-1，4-键使3，6-脱水-L-半乳糖(下文中称为“AHG”)与D-半乳糖交替地键连而形成的聚合物。在这些成分当中，AHG是一种具有抗龋性和结肠癌预防功能以及美化白化和保湿功能的多功能高附加值材料。因此，用于由琼脂或琼脂糖(其为红藻的主要碳水化合物)有效制备并纯化AHG的技术是非常重要的。

首先制备AHG，常规地，琼胶寡糖通过用具有低浓度的弱酸、乙酸或中性缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂(pH 7.4)预处理琼脂糖或琼脂而获得，且新琼二糖(neoagarobiose)由琼胶寡糖(agarooligosaccharides)通过与外型β-琼脂水解酶II(exo-type β-agarase II)的酶反应而制备。然而，此时，存在作为副产物联产琼胶三糖的缺点，且为了降解琼胶三糖，有必要引入额外的酶，如琼脂降解β-半乳糖苷酶(agarolytic β-galactosidase；ABG)。然后，可通过α-新琼二糖水解酶(NABH)的酶反应而获得如AHG和D-半乳糖的单糖(见图1a)。然而，当在此过程的第一步骤预处理期间使用乙酸时，在后续中和步骤中产生大量的盐，且当使用低浓度的中性缓冲剂时，在高温(170℃)下执行预处理反应，且因此针对大规模生产需要高温和高压反应器。另外，在预处理期间，AHG过度降解成5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural；5-HMF)，所述5-羟甲基糠醛具有降低AHG生产产率的缺点。具体地说，因为乙酸导致腐臭气味，所以当AHG用作美化材料时，所述腐臭气味可能会成为问题。另外，因为在预处理期间，α键优先断裂，且因此必须另外使用降解作为副产物在后续酶糖化中保留的琼胶三糖(agarotriose)的ABG酶，所述过程可能更为复杂。

其次，迄今为止，出于对AHG的纯化，已使用用于酶水解的最终产物(AHG以及D-半乳糖)的包含硅胶层析和生物凝胶p2管柱层析的两步骤层析。根据此方法，在硅胶层析期间使用有害有机溶剂(即二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇等)，且由于在纯化中丢失大量AHG，因而最终AHG产率降低。

发明内容

技术问题

本发明是针对提供一种用于使用微生物来纯化AHG，从而利用在琼脂糖或琼脂的酶水解之后的纯化来防止在AHG生产期间由纯化所导致的AHG损失的新颖方法。

本发明还针对提供一种用于制备AHG的组合物，其可使用上述方法来提高AHG的生产产率。

技术解决方案

为实现所述目标，本发明提供一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，所述方法包含：

使一组酶与作为基质的琼脂糖或琼脂反应，所述酶包含由阐述于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列所表示的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶(agarase)以及α-新琼二糖水解酶；

使用由以上反应所获得的产物作为碳源来培养具有代谢半乳糖的能力的微生物；以及

由微生物的培养物获得3，6-脱水-L-半乳糖。

本发明提供一种用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，所述组合物包含：

一组酶，包含由阐述于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列所表示的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶(agarase)以及α-新琼二糖水解酶；以及

微生物，具有代谢半乳糖的能力。

有利效果

因为在无单独常规地执行纯化过程的情况下获得AHG，所以本发明提供通过降低AHG损失来获得具有高产率的AHG的效果，其在不使用化学预处理、中和以及常规地执行对于琼脂糖或琼脂用琼胶三糖水解酶的处理的情况下，使用一组由以下组成的酶来使琼脂糖或琼脂降解成半乳糖和AHG：热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶以及α-新琼二糖水解酶。

附图说明

图1a是示出由琼脂糖通过用乙酸预处理和酶糖化以及通过根据常规技术的两步骤层析的纯化过程的AHG制备的示意图，且图1b是示出根据本发明的通过使用微生物糖化琼脂糖而不经预处理的AHG制备和AHG纯化过程的示意图。

图2是示出由琼脂糖利用三步骤酶反应和使用根据本发明的微生物的AHG纯化的AHG制备的TLC结果。

图3a示出在培养GRAS微生物、酵母前后的AHG纯化的TLC结果，且图3b示出在培养GRAS微生物、酵母前后的GC/MS分析结果。

图4a示出通过测量引入NABH基因的重组酶的NABH活性而获得的TLC分析结果，且图4b示出测量引入NABH基因的重组酶的NABH比活性的结果。对照组表示引入空载体的酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)D452-2，且NABH表示引入NABH的酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)D452-2。

图5a示出示出使用双醣、新琼二糖作为基质的时间依赖型细胞生长变化的TLC分析结果；且图5b示出示出使用双醣、新琼二糖的培养基中的时间依赖型碳源变化的TLC分析结果。对照组表示引入空载体的酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)D452-2，且NABH表示引入NABH的酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)D452-2。

图6a示出使用具有D-半乳糖代谢的大肠杆菌(E.coli)的AHG纯化结果，图6b示出使用具有D-半乳糖代谢的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的AHG纯化结果，且图6c示出使用具有D-半乳糖代谢的运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的AHG纯化结果。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明的组合物。

本发明提供一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，所述方法包含：

由微生物的培养物获得3，6-脱水-L-半乳糖。

微生物，具有代谢半乳糖的能力。

相比于用乙酸的常规已知预处理和用Tris-HCl缓冲剂(pH 7.4)的水热预处理而再进一个步骤，为解决在涉及预处理方法的高温处理期间由AHG过度降解成5-HMF所导致的在中和里产生盐以及低糖化产率的问题，本发明人研发出一种用于在利用仅通过使用热稳定β-琼脂水解酶Aga16B的酶糖化来降解琼脂糖或琼脂而不使用化学预处理的情况下，通过依次使三种类型的酶(Aga16B、Aga50D、NABH)与琼脂糖或琼脂反应的从而制备具有高产率的AHG和D-半乳糖的方法。

此类过程具有以下优点：

1)此过程不使用昂贵的乙酸且因而降低成本。另外，在最终降解产物当中，AHG是一种可用作美化功能材料的材料且不使用导致腐臭气味的乙酸，这是AHG的最大优点中的一个。

2)不产生由中和所产生的盐，如醋酸钠。

3)因为不产生如5-HMF的过度降解产物，所以可增加单醣生产产率。

4)常规化学处理过程需要如微波的设备，而酶处理是在低温下执行，且因此具有扩大规模的优点。

5)当使用三种类型的酶时，不产生琼胶三糖作为降解产物，且因此不必使用琼胶三糖水解酶。

此外，为了在常规AHG纯化过程期间防止AHG损失，将过程设计成使得仅AHG存在于水解产物中，这是因为使用对人体安全且具有代谢半乳糖的能力的一般认为是安全的(Generally-Recognized-As-Safe；GRAS)微生物来代谢半乳糖。此纯化过程不使用有害有机溶剂且在纯化期间几乎不丢失AHG。因此，可获得具有高产率的已纯化的AHG。

因此，如图1b中所示，根据本发明的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法可包含：

在未预处理的情况下酶水解琼脂糖或琼脂；使用酶水解产物作为碳源来培养具有代谢半乳糖的能力的微生物；以及

通过对微生物的培养物离心或过滤而获得AHG。

琼脂糖或琼脂的酶水解可包含：

使热稳定琼脂水解酶与琼脂糖或琼脂反应；以及

使由以上反应所获得的产物与外型琼脂水解酶和α-新琼二糖水解酶反应。

在范围介于40℃至60℃的温度下，在0rpm到300rpm的条件下以及在范围介于5到9的pH下维持30分钟到7天，热稳定琼脂水解酶可与琼脂糖或琼脂反应，进而制备新琼四糖或新琼六糖。

热稳定琼脂水解酶是内型琼脂水解酶，其在室温到50℃下维持热稳定性，且在室温到60℃下具有降解琼脂糖或琼脂的活性。更具体地说，热稳定琼脂水解酶在大约55℃下呈现理想活性。因此，在琼脂糖或琼脂维持在液态的温度范围(即大约35℃或高于35℃)下，热稳定琼脂水解酶可具有活性。

热稳定琼脂水解酶使用琼脂糖或琼脂作为基质，且将酶反应产物标识为具有4到6的聚合度(degrees of polymerization；DP)的新琼四糖和新琼六糖。

在依次处理外型琼脂水解酶(即外型琼脂水解酶和α-新琼二糖水解酶)时，与通过常规化学预处理所获得的糖化产率相比，热稳定琼脂水解酶可呈现提高的糖化产率。根据一示范性实施例，所述糖化产率比常规缓冲剂预处理高大约1.6倍(理论最大值的72.5％)。

热稳定琼脂水解酶可由与多肽的制备相关联的DNA片段(即编码基因)转录和转译，所述DNA片段不仅包含酶的编码区的上游区域和下游区域，而且包含各个编码片段之间的内含子。举例来说，热稳定琼脂水解酶可以由阐述于SEQ ID NO：2中的序列转录和转译，但本发明不受其特定限制。另外，具有如由具有一个或多个取代、缺失、易位以及添加的酶衍生的突变蛋白的新琼四糖或新琼六糖水解活性的蛋白也包含在本发明的酶的范围中，且所述蛋白优选地包含与阐述于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。

热稳定琼脂水解酶可衍生自变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T，但本发明不受其特定限制。

热稳定琼脂水解酶可由变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T培养基的上清液分离和纯化，或可使用除变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T以外的菌株通过基因工程重组技术，或通过人工、化学合成方法来制备和分离。当使用重组技术时，变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T培养物的上清液可由已转化大肠杆菌培养物的上清液替换，但本发明不受其特定限制。根据一示范性实施例，热稳定琼脂水解酶可由使用包含阐述于SEQ ID NO：2中的碱基序列的重组载体转化的大肠杆菌或其培养物而获得。

外型琼脂水解酶可以是使琼胶寡糖降解成新琼二糖(其为双醣)和琼胶三糖(D-半乳糖-β-1，4键-3，6-脱水-L-半乳糖-α-1，3键-D-半乳糖)的酶，以及使琼脂糖的D-半乳糖与AHG之间的β-1，4-糖苷键分解的酶(下文中也称作“Aga50D”)。

外型琼脂水解酶可具有阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列，且另外，具有如由具有一个或多个取代、缺失、易位以及添加的酶衍生的突变蛋白的琼胶寡糖水解活性的蛋白也包含在本发明的酶的范围中。优选地，外型琼脂水解酶包含阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。

外型琼脂水解酶可由变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T衍生，但本发明不受其特定限制。

外型琼脂水解酶可由变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T培养物的上清液分离和纯化，或由除变形菌2-40^T以外的菌株通过基因工程重组技术来分离和纯化，或可通过人工、化学合成方法来制备和分离。

当使用重组技术时，可使用用以促进常规重组蛋白表达的因子(例如抗生素抗性基因)以及可用于亲和性管柱层析中的报告蛋白或肽，且这种技术包含在本发明所属领域的普通技术人员可易于实施的范围中。举例来说，可将来自可食用、已转化菌株(如已转化酵母细胞)的培养物的上清液的外型琼脂水解酶用作替代方案。对于更特殊的制备技术，可参考韩国未审查专利申请公开案第2010-0040438号(2010年4月20日)。

琼胶寡糖与外型琼脂水解酶之间的反应可在范围介于20℃到40℃的温度下执行30分钟到7天。更具体地说，所述反应可在范围介于25℃到35℃的温度下执行1天到4天。

可以使新琼二糖降解成AHG和D-半乳糖的α-新琼二糖水解酶(称作SdNABH)可具有阐述于SEQ ID NO：4中的氨基酸序列，且另外，具有如由具有一个或多个取代、缺失、易位以及添加的酶衍生的突变蛋白的新琼二糖水解活性的蛋白也包含在本发明的酶的范围中。SdNABH优选地包含阐述于SEQ ID NO：4中的氨基酸序列，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。

α-新琼二糖水解酶可由变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T衍生，但本发明不受其特定限制。

α-新琼二糖水解酶可由变形菌(Saccharophagus degradans)2-40^T培养物的上清液分离和纯化，或由除变形菌2-40^T以外的菌株通过基因工程重组技术来分离和纯化，或可通过人工、化学合成方法来制备和分离。对于更特殊的制备技术，可参考韩国未审查专利申请公开案第2013-0085017号(2013年7月26日)。

新琼二糖与α-新琼二糖水解酶之间的反应可在范围介于20℃到40℃的温度下执行30分钟到7天。更具体地说，所述反应可在范围介于25℃到35℃的温度下执行1天到4天。

在本文中所使用的“蛋白”与“多肽”互换地使用。

在本发明中，表述“多肽与另一序列具有特定百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列一致性”意指在将两个序列进行比对时，特定百分比的氨基酸残基相同。可使用本领域中已知的适当的软件程序来测定所述比对以及同源性百分比或同一性百分比，例如在文献【现代分子生物学实验技术(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY；F.M.Ausubel等人，(eds)1987年副刊30章节7.7.18)]中所公开的方法。可在本文中使用的优选程序包含：GCG叠加程序、FASTA(皮尔逊(Pearson)等人，1988美国科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci USA)85：2444到2448)以及BLAST(BLAST手册(BLAST Manual)，阿尔丘尔(Altschul)等人，国立生物技术信息中心(Natl.Cent.Biotechnol.Inf)、国立医学图书馆(Natl Lib.Med.)(NCIB NLM NIH)，贝塞斯达(Bethesda)、MD以及阿尔丘尔等人，1997NAR25：3389到3402)。另一优选比对程序是ALIGN Plus(科学和教育软件(Scientific andEducational Software，PA)，优选地使用基本参数。另一可获得的序列软件程序是序列软件包版本6.0(Sequence Software Package Version 6.0)(遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，威斯康星大学(University of Wisconsin)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))中可获得的TFASTA数据搜索程序(TFASTA Data Searching Program)。

本文中所使用的术语“重组”意指当参考细胞、核酸、蛋白或载体使用时，所述细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或改变本征核酸或蛋白而修饰，或所述细胞由以这种方式修饰的细胞衍生。换句话说，重组细胞表达不以细胞的本征(非重组)形式存在的基因，或可替代地，表达异常表达或从不表达的本征基因。

本文中所使用的“核酸”涵盖单链或双链DNA、RNA以及其化学修饰的形式。本文中所使用的“核酸”与“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码的简并，因此一或多个密码子可用以编码特定氨基酸，且本发明涵盖编码特定氨基酸序列的多核苷酸。

在本文中用以描述将核酸序列插入到细胞中的术语“引入”是指“转染(transfection)”、“转化”或“转导(transduction)”，且包含将核酸序列并入到真核或原核细胞中的描述。此时，核酸序列并入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或粒线体DNA)中，且因此转化成自主复制子或暂时表达。

在用于使用本发明的微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法中，可使用新琼二糖的降解产物作为碳源来培养具有代谢半乳糖的能力的微生物。

具有代谢半乳糖的能力的微生物可以是选自以下的任何一个物种：乳酸菌，包含乳酸杆菌属和双歧杆菌属，如干酪乳杆菌(L.casei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、保加利亚乳酸杆菌(L.bulgaricus)、长双岐杆菌(B.longum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、双歧异杆菌(Actiregularis)等；芽孢杆菌；链霉菌；棒状杆菌；发酵单胞菌属，如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)等；大肠杆菌；以及酵母菌，如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)等。这些物种是如上文所描述且代谢半乳糖的无害GRAS微生物，且因此，仅使微生物和AHG保留在微生物培养物中。

相应地，AHG可保留在通过不使用常规纯化过程对微生物培养物离心或过滤而去除微生物或细胞碎片之后所获得的液体中，得到具有高产率的AHG。

对具有代谢半乳糖的能力的微生物的培养条件(例如培养基、培养物温度、时间等)可在无特定限制的情况下在本领域技术人员所理解的范围内测定。

实体实施方式

在下文中，将参考根据本发明的实例进一步详细描述本发明，但本发明的范围不限于以下实例。

<实例1>制备Aga16B、Aga50D以及NABH重组酶

使用pET21a载体(对于Aga50D，韩国未审查专利申请公开案第2010-0040438号(2010年4月20日)，且对于NABH，韩国未审查专利申请公开案第2013-0085017号(2013年7月26日))将变形菌(Saccharophagus degradans)2-40衍生的内型-β-琼脂水解酶的基因Aga16B基因(Sde_1175)、外型-β-琼脂水解酶的基因Aga50D基因以及新琼二糖水解酶的基因NABH基因引入到大肠杆菌BL21(DE3)中

对于Aga16B，使用可商购的DNA试剂盒(Bionia，韩国)来纯化基因组DNA，且通过PCR来放大Aga16B基因。此处，本文中所使用的引子是Aga16B-N，即5′-AAA GGATCCATGGCAGATTGGGACGGAATT-3′(Tm：59.4)；以及Aga16B-C，即5′-AAA GCGGCCGCGTTGCTAAGCGTGAACTTATCTA-3′(Tm：59.3)。在Aga16B基因的N端处，PCR产物不具有定位在氨基酸19到氨基酸20处的信号序列。作为限制酶，使用BamHI和NotI，且其定位在N端和C端的5′端和3′端处。用BamHI和NotI双重酶切PCR产物和pET21a，且使用T4 DNA接合酶接合所得DNA片段并将其转化成大肠杆菌BL21。

为了预培养(pre-culture)各引入基因重组大肠杆菌，在37℃下，在含有10mL的含有100μg/mL的安比西林(ampicillin)的LB培养液的50mL圆锥管中培养细胞9小时。然后，用10mL的预培养物接种具有相同培养基组合物的1L主培养物，且随后当细胞生长直到使用光密度分光镜(Optical density spectroscope)所检测到的光密度达到中期指数级(OD 0.4到0.6)时，添加0.1mM异丙基-β-双-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，且随后在16℃下对细胞进行诱导(induction)16小时。然后，将细胞培养物转移到500mL管并在4℃下以10,000rpm离心20分钟，进而获得细胞。为了防止蛋白的变性，使所采集细胞再悬浮于30mL Tris缓冲剂(20mM Tris-HCl，pH 7.4)中，且使用超声发生器(sonicator)破坏，导致细胞裂解(celllysis)。然后，在4℃下以16,000rpm将裂解物离心1小时。使用HisTrap管柱(5mL GEHealthcare)纯化蛋白质，且使用SDS-PAGE凝胶来测定每一已纯化蛋白的大小。使用去盐(Desalting)管柱去除用于蛋白质纯化的盐(咪唑)(imidazole)。通过BCA分析法来定量已去除盐的重组蛋白酶的浓度。

<实例2>Aga16B、Aga50D以及NABH的酶反应

在Aga16B的酶反应中，作为基质，使用5％(w/v)琼脂糖，且反应在55℃下以200rpm在20mM Tris-HCl缓冲剂(pH 7.4)中执行10小时。

在25℃和200rpm的条件下，使用Aga16B酶反应产物新琼寡糖(neoagarooligosaccharide)作为基质来执行Aga50D酶反应24小时。最后，在30℃和200rpm的条件下，使用Aga50D酶反应产物新琼二糖作为基质来执行NABH酶反应12小时。

在每一酶反应步骤之后，通过薄层层析(thin layer chromatography；TLC)分析反应产物。对于TLC分析，将1μl酶反应产物装载于使用正丁醇：乙醇：水(3∶1∶1(v/v/v))作为流动相溶剂显影的固定相硅胶板上1小时，且随后使用溶解于乙醇中的10％硫酸和溶解于乙醇中的0.2％1，3-二羟基萘显色。

如图2中所示，琼脂糖基质通过内型β-琼脂水解酶I、Aga16B的酶反应而降解成新琼寡糖，且此时，主产物是具有4到6的聚合度(DP)的新琼四糖和新琼六糖。然后，通过外型β-琼脂水解酶II、Aga50D的酶反应产生双醣、新琼二糖，且通过NABH酶反应产生AHG和D-半乳糖。

作为计算每各酶反应步骤的生产产率的结果，因为Agal6B的反应产物不是单种材料，所以其不可能定量，且作为量化Aga50D反应产物新琼二糖的结果，由10g琼脂糖(0.944gNAB/g琼脂糖；表1)获得9.44g的NAB。另外，作为NABH反应的结果，由10g琼脂糖获得的单醣产率为7.52g(0.752g单体糖/g琼脂糖；表1)。

[表1]使用酶糖化和微生物的纯化过程中的步骤的生产产率

<实例3>使用GRAS微生物、酵母的AHG纯化

在实例1和实例2中所获得的最终反应产物主要是AHG和D-半乳糖，且为了去除D-半乳糖，培养酵母细胞。本文中所使用的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)D452-2菌株，且在30℃和200rpm下，在YPD培养液中执行预培养24小时。在培养之后，通过以5,000rpm离心10分钟而获得细胞集结粒，并用Tris-HCl缓冲剂(pH 7.4)洗涤，且随后在相同条件下再次离心，进而获得细胞集结粒。

对于培养，在含有3.35g/L的酵母氮碱(yeast nitrogen base)和0.4g/L的CSM的基本培养基中，使用酶反应产物(其为AHG和D-半乳糖)作为碳源来培养酿酒酵母(S.serevisiae)D452-2的细胞集结粒。在30℃和200rpm下培育细胞24小时且随后经历GC/MS分析。

如图3a-b中所示，证实D-半乳糖已全部消耗且仅剩余AHG，且作为计算产率的结果，由10g琼脂糖(0.373g AHG/g琼脂糖)获得3.73g的已纯化AHG，且AHG纯度是61.9％(w/w)。

<实例4>测量引入NABH的重组酵母NABH的酶活性

将NABH克隆于待引入到酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)D452-2中的pRS425GPD载体(营养缺陷型标记物，Leu-)中，且通过试管内分析来测量活性。使用酵母蛋白萃取反应剂(Yeast protein extraction reagent；Y-PER)破坏具有含NABH基因的质粒的酵母细胞，且通过BCA分析来定量可溶性蛋白。在30℃和200rpm条件下，粗制蛋白经历与NAB基质的NABH酶反应。对于NABH酶的活性的定性分析，通过TLC来分析反应产物，进而检测NABH的比活性(图4a-b)。

<实例5>使用引入NABH的重组酵母的AHG纯化

通过实例4来测定引入NABH的重组酵母的NABH酶活性因此，进行实验以由双醣、新琼二糖纯化AHG，而不是由AHG和D-半乳糖。此时，在含有3.35g/L的酵母氮碱和0.4g/L的CSM(Leu-)的基本培养基中，使用Aga50D反应产物新琼二糖作为碳源来培养引入NABH的重组酵母。在30℃和200rpm下培育酵母细胞，且随时间观察细胞培养物的碳源。

如图5a-b中所示，观察到，作为对照组，引入pRS425GPD载体的重组酵母并不代谢NAB，然而不仅引入NABH的重组酵母通过降解NAB而生长，进而代谢半乳糖，而且AHG也释放到了细胞外部。

因此，使用引入NABH的重组酵母，可由NAB纯化AHG。

<实例6>确认AHG在具有D-半乳糖代谢的其它微生物中的纯化效果

在实例1和实例2中获得的最终反应产物主要是AHG和D-半乳糖，且使用具有代谢D-半乳糖的功能的大肠杆菌(E.coli)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)以及运动发酵单胞菌(Z.mobilis)来纯化AHG。

本文中所使用的大肠杆菌是大肠杆菌K12菌株，且在37℃和200rpm下，在LB培养液中执行预培养16小时。本文中所使用的酵母菌属毕赤酵母的菌株物种是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)X33，且在30℃和200rpm下，在YPD培养液中执行培养16小时。本文中所使用的革兰氏阴性属发酵单胞菌的菌株物种是运动发酵单胞菌(Z.mobilis)ATCC 31821，且在30℃和200rpm下，在含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)的RM培养基中执行预培养16小时。在培养之后，通过以6,000rpm离心20分钟而获得细胞集结粒，并用Tris-HCl缓冲剂(pH 7.4)洗涤，且随后在相同条件下再次离心，进而获得细胞集结粒。

对于培养，使用酶反应产物(其为AHG和D-半乳糖)作为碳源将大肠杆菌K12的细胞集结粒接种到含有2.5g/L的酵母氮碱和20mM Tris-HCl缓冲剂(pH 7.4)的基本培养基中。

对于培养，使用酶反应产物(其为AHG和D-半乳糖)作为碳源将巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)X33的细胞集结粒和运动发酵单胞菌(Z.mobilis)ATCC 31821的细胞集结粒中的每一个接种到含有3.35g/L酵母氮碱和0.4g/L CSM的基本培养基中。在30℃和200rpm下培育细胞24小时，且随后通过TLC定性分析。

如图6a-c中所示，证实在24小时之后，D-半乳糖被完全去除，且仅AHG剩余。

工业实用性

本发明可应用于3，6-脱水-L-半乳糖的生产领域中。

<110> 高丽大学校产学协力团

<120> 用于通过使用微生物纯化3,6-脱水-L-半乳糖的新颖方法

<130> X17U13C0020

<150> KR 10-2016-0041058

<151> 2016-04-04

<160> 4

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

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<212> PRT

<213> 变形菌 2-40（Saccharophagus degradans 2-40）

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<212> DNA

<213> 变形菌 2-40（Saccharophagus degradans 2-40）

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caattcttaa ttgactgggt gcgattctac aaacccgtgg caagcaacaa tggtggcggc 900

gacccaggca atggcggcac cccaggtaat ggtggcagtg gcgatactgt agtggtagaa 960

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<212> PRT

<213> 变形菌 2-40（Saccharophagus degradans 2-40）

<400> 3

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Leu Asn Ala Arg Ala Ser Ile Glu Thr Tyr Thr Gly Ile Asn Gly Glu

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<213> 变形菌 2-40（Saccharophagus degradans 2-40）

<400> 4

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Val Leu Asp Ala Gly Ser Tyr Gln Gln Thr Gly Asp Ser Gly Ala Val

355 360 365

Claims

1.一种用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，包括：

使组酶与作为基质的琼脂糖或琼脂进行反应，所述组酶包含由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶以及α-新琼二糖水解酶；

由所述微生物的培养物获得3，6-脱水-L-半乳糖。

2.根据权利要求1所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中在未预处理琼脂糖或琼脂的情况下执行所述组酶与所述基质之间的所述反应。

3.根据权利要求1所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述组酶与所述基质之间的所述反应包含使所述热稳定琼脂水解酶与琼脂糖或琼脂进行反应，以及使由以上反应所获得的产物与所述外型琼脂水解酶及所述α-新琼二糖水解酶进行反应。

4.根据权利要求3所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述热稳定琼脂水解酶与琼脂糖或琼脂之间的所述反应在范围介于40℃到60℃的温度下，在0rpm到300rpm以及范围介于5到9的pH的条件下执行30分钟到7天。

5.根据权利要求3所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述外型琼脂水解酶由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示。

6.根据权利要求3所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述α-新琼二糖水解酶由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示。

7.根据权利要求3所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中所述外型琼脂水解酶和所述α-新琼二糖水解酶的所述反应在范围介于20℃到40℃的温度下，在0rpm到200rpm的条件下执行30分钟到7天。

8.根据权利要求1所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中具有代谢半乳糖的能力的所述微生物是选自以下的任何一个物种：乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、棒状杆菌、发酵单胞菌属、大肠杆菌或酵母菌。

9.根据权利要求1所述的用于使用微生物来纯化3，6-脱水-L-半乳糖的方法，其中通过对所述微生物的所述培养物离心或过滤而获得所述3，6-脱水-L-半乳糖。

10.一种用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，包括：

组酶，包含由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所表示的热稳定琼脂水解酶、外型琼脂水解酶以及α-新琼二糖水解酶；以及

微生物，具有代谢半乳糖的能力。

11.根据权利要求10所述的用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，其中所述外型琼脂水解酶由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示。

12.根据权利要求10所述的用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，其中所述α-新琼二糖水解酶由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示。

13.根据权利要求10所述的用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，其中所述组酶使用琼脂糖或琼脂作为基质。

14.根据权利要求10所述的用于制备3，6-脱水-L-半乳糖的组合物，其中具有代谢半乳糖的能力的所述微生物是选自以下的任何一个物种：乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、棒状杆菌或酵母菌。