WO2014142507A1 - 3,6-안하이드로-l-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
3,6-안하이드로-l-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention comprises 3,6-anhydro-L-galactose that prevents, ameliorates, or treats colon cancer through the ability of 3,6-anhydro-L-galactose to induce apoptosis and inhibit cell proliferation of colorectal cancer cells. It relates to a composition for preventing or treating colorectal cancer.
- Colon cancer is not only a major cause of cancer-related deaths in the United States, but it is also estimated that approximately 102,900 people will be diagnosed with colorectal cancer in the United States in 2010 and 51,370 will die.
- the incidence rate is increasing in Asia due to westernized eating habits, and related factors include excessive animal fats, sugars, alcohol consumption and fiber, antioxidant vitamins, and insufficient intake of vegetables or fruits.
- eating a lot of animal fats and meat unlike intake of fiber foods such as vegetables and grains, the amount of stool is small and the contents take a long time to pass through the large intestine.
- colorectal cancer a typical solid cancer cell in which a large number of cells grow in the form of agglomerates around blood vessels is one of the cancers in which treatment methods are extremely difficult to cure. That is, it is not easy to completely remove colon cancer cells because the drug does not penetrate properly to the center of the agglomerated colon cancer cells.
- Surgical treatment such as surgery or radiation therapy is the only limited method for treating colorectal cancer, and it is difficult to cure colorectal cancer. Therefore, many researchers have been conducting a lot of research to effectively inhibit the growth of colon cancer cells as well as most cancer cells by developing a method that can effectively inhibit the growth of colon cancer cells.
- Apoptosis is an important mechanism by which most anticancer drugs exert the anti-proliferative effect of cancer cells.
- Active apoptosis is an active death caused by the regulation of the expression and activity of several genes and proteins according to signals programmed inside the cell. Apoptosis is easily observed in many normal physiological phenomena of life. Apoptosis, for example, plays an important role in the various morphological changes observed in the early development of life and in the functional self-organization of the immune or nervous system. In addition, even after becoming an adult, it functions essentially as a regulation of tissue homeostasis, removal of damaged cells, and defense against infection. Apoptosis is also deeply involved in the pathogenesis of various diseases.
- Abnormal apoptosis can be a cause of neurodegenerative diseases, immune system abnormalities, and cardiovascular disease. Abnormal inhibition of apoptosis can cause cancer. . Looking more closely at diseases in which apoptosis is abnormally issued or suppressed, outside of normal control processes, cancers induced by abnormal expression of genes such as p53, p16 and Bcl-2, HIV, Herpes and flu viruses can And autoimmune diseases such as diabetes, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and work experience. As such, cell death not only plays an important role in maintaining various physiological functions of living organisms, but is also closely related to the pathogenesis of various diseases.
- the apoptosis of each cell constituting the individual is a means of removing these abnormal cells from the individual, i.e. an irreversible genetic wound, to prevent the development of the tumor by genetically injured cells or by the induction of inappropriate differentiation by differentiation stimulants. It is a common means to remove cells with.
- This concept is supported by the fact that commonly used anticancer agents induce cancer cell death through apoptosis processes associated with cancer cell proliferation inhibition. Therefore, suppression of apoptosis plays an important role in the cancer process because disturbance of apoptosis process induces the survival and growth of damaged or injured cells.
- cancer preventive substances induce apoptosis of these abnormal cells, and the induction of apoptosis by them is associated with at least their cancer prevention activity.
- the present inventors completed the present invention by clarifying that 3,6-anhydro-L-galactose isolated and purified from the red algae-derived agar exhibits an excellent effect on inducing apoptosis of cancer cells and inhibiting the proliferation of cancer cells. .
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer comprising 3,6-anhydro-L-galactose (3,6-anhydro-L-galactose) represented by the following formula (1) do:
- the present invention also provides a food composition for preventing or improving colorectal cancer comprising 3,6-anhydro-L-galactose of the formula (1).
- the present invention also provides 3,6-anhydro-L-galactose of Formula 1, for use in treating colon cancer.
- the present invention can be useful for preventing, treating, or improving colorectal cancer since 3,6-anhydro-L-galactose exhibits excellent anticancer activity by inhibiting the growth of colorectal cancer cells and inducing apoptosis of cancer cells. .
- Figure 1 shows the effect of inhibiting colon cancer cell proliferation of 3,6- anhydro-L-galactose.
- Figure 2 shows the tumor conversion inhibitory effect of 3,6- anhydro-L-galactose
- the photograph is a visual observation of colony formation of colorectal cancer cells according to L-AHG treatment by concentration
- the graph is from the above It is shown by counting the number of colonies formed.
- Figure 3 shows the effect of apoptosis of 3,6- anhydro-L-galactose, the cell number of the sub-G1, G0 / G1, S and G2 / M phase was measured using a flow cytometer will be.
- Figure 5 shows that 3,6-anhydro-L-galactose is apoptosis related proteins, procaspase-3, procaspase-9, caspase-3, caspase-9, PARP, cleaved PARP, Bcl-2, Bcl-xL and Bax Western blotting results show the effect on expression.
- FIG. 6 is a Western blotting result showing the effect of 3,6- anhydro-L-galactose on the expression of apoptosis-related proteins, p-p38, p38, p-JNK, JNK and p53.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer, comprising 3,6-anhydro-L-galactose represented by the following Chemical Formula 1:
- the present invention also provides 3,6-anhydro-L-galactose of Formula 1 for the treatment of colorectal cancer.
- the present inventors came to pay attention to 3,6-anhydro-L-galactose (L-AHG) constituting agar (agar) derived from red algae in the process of searching for a bioactive substance having an anticancer effect.
- L-AHG 3,6-anhydro-L-galactose
- concentration-dependent inhibition of proliferation of colorectal cancer cells treated with 3,6-anhydro-L-galactose compared to the control group not treated with 3,6-anhydro-L-galactose Tumor turnover of cancer cells was suppressed in a concentration-dependent manner, and showed an excellent inhibitory effect on colony formation, particularly at a concentration of 100 ⁇ g / mL.
- the cells corresponding to the sub-G1 phase of the cell cycle was increased, in particular, induced a marked apoptosis at a high concentration of 100 ⁇ g / mL, and treated with 3,6-anhydro-L-galactose Apoptosis bodies, which are typical of apoptosis in cancer cells, have been shown.
- 3,6-Anhydro-L-galactose increased the degradation of PARP, a damaged DNA repair-related protein, increased the expression of Bax, an apoptosis-inducing protein, and the expression of Bcl-2 and Bcl-xL, apoptosis inhibitory proteins. It was confirmed to suppress the.
- 3,6-anhydro-L-galactose treatment was found to increase the activity of p38, JNK, which plays an important role in apoptosis, increased the expression of p53 protein.
- the cell cycle is stopped by 3,6-anhydro-L-galactose treatment, thereby inhibiting cell proliferation and killing, so 3,6-anhydro-L-galactose induces apoptosis of colorectal cancer cells. It is characterized by being able to prevent, improve, or treat colon cancer by inhibiting cell proliferation.
- the 3,6-anhydro-L-galactose can be used as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of colorectal cancer.
- the 3,6-anhydro-L-galactose is a constituent monosaccharide of agar, which is a representative carbohydrate component constituting the red algae biomass, using the one obtained through chemical synthesis, or preparing agarose oligosaccharides in pretreated agarose,
- the agar oligosaccharides are decomposed into 3,6-anhydro-L-galactose through enzymatic saccharification by agarose degrading enzyme and neoagarobiose hydrolase, and 3, obtained through the enzymatic saccharification process.
- 6-Anhydro-L-galactose may be obtained through separation and purification using silica gel chromatography and biogel P2 chromatography, which are adsorption chromatography, but are not particularly limited thereto.
- the pretreatment may be hydrolysis of agarose using a weak acid, but is not particularly limited thereto.
- the weak acid may include acetic acid, formic acid, succinic acid, citric acid, citric acid, malic acid, maleic acid, or oxalic acid. More than one species can be used.
- the weak acid may be used at a concentration of 0.5 to 60% (w / v) in consideration of production cost and separation of salts generated after neutralization of the weak acid. More specifically, it may be used at a concentration of 20 to 40% (w / v).
- the reaction of the agarose and the weak acid may be carried out for 30 minutes to 6 hours under conditions of 100 to 200 rpm in the temperature range of 40 to 150 °C. If it is in the above range can be minimized the degradation products of the agarose by weak acid.
- agar oligosaccharides generated after the pretreatment are reacted with exo-type agarose degrading enzymes that produce disaccharides to produce neoagarobiose, and the monosaccharides are further reacted with neoagarobiose hydrolase. Produces galactose and 3,6-anhydro-L-galactose.
- the enzyme reaction may be carried out for 30 minutes to 7 days at 0 to 200 rpm conditions in a temperature range of 20 to 40 °C.
- the enzyme reaction is described in more detail as follows.
- the agarose degrading enzyme that decomposes agao oligosaccharides to produce a disaccharide, neoagarobiose, is ⁇ -1,4-glyco between D-galactose of agarose and 3,6-anhydro-L-galactose.
- An enzyme that cleaves side bonds hereinafter referred to as 'Aga50D' can be used.
- the agarose digesting enzyme is saccharide as a wave Gus de gras thiooxidans may be isolated and purified from the water, the supernatant or the supernatant culture of the (Saccharophagus degradans), Saccharomyces par Gus de gras thiooxidans (Saccharophagus degradans) by using a genetically engineered recombinant techniques In addition, it can be produced and separated by strain or artificial chemical synthesis.
- the reaction of the agar oligosaccharide and agarose degrading enzyme may be carried out for 30 minutes to 7 days at 0 to 200 rpm conditions in a temperature range of 20 to 40 °C. More specifically, it may be carried out for 1 day to 4 days at 100 to 150 rpm conditions in a temperature range of 25 to 35 °C.
- the neoagarobiose produced through the enzymatic reaction is decomposed into D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose by neoagarobiose hydrolase.
- the neo-agar in BIOS hydrolase is Saccharomyces par Gus de Jerusalem thiooxidans separated from the water, the supernatant or the supernatant culture of the (Saccharophagus degradans) and can be purified, and genetically engineered using recombinant techniques saccharide par Gus de gras thiooxidans (Saccharophagus degradans ) can be produced and separated by strains or artificial chemical synthesis.
- neoagarobiose and neoagarobiose hydrolase may be carried out for 30 minutes to 7 days at a temperature of 0 to 200 rpm in the temperature range of 20 to 40 °C. More specifically, it may be carried out for 1 day to 4 days at 100 to 150 rpm conditions in a temperature range of 25 to 35 °C.
- the degradation product of neoagarobiose was sequentially subjected to silica gel chromatography, which is an adsorption chromatography, and biogel P2 chromatography, which is a gel permeation chromatography, to obtain 3,6-anhydro-L-galactose having a high purity of approximately 96%. Can be separated and purified.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
- Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the pharmaceutical arts, and in particular, ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (eg, Various phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (e.g., protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, hydrogen carbonate, sodium chloride and zinc salts) Silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulosic substrates, polyethylene glycols, sodium carboxymethylcellulose, polyarylates, waxes, polyethylene glycols or wool, and the like.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
- the pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared as an aqueous solution for parenteral administration, and preferably a buffered solution such as Hanks' solution, Ringer's solution or physically buffered saline. Can be used.
- Aqueous injection suspensions can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.
- compositions of the present invention can be administered systemically or topically, and can be formulated in suitable formulations by known techniques for such administration.
- it can be administered by mixing with an inert diluent or an edible carrier, sealed in a hard or soft gelatin capsule, or pressed into tablets.
- the active compounds can be mixed with excipients and used in the form of intake tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like.
- 3,6-anhydro-L-galactose is well soluble in saline or buffered solution, it is stored in a freeze-dried state, and an effective amount of 3,6-anhydro-L-galactose is injected intravenously, subcutaneously, intramuscularly, It may be administered by formulating a solution immediately before administration in saline or buffer in a form suitable for intraperitoneal infusion, transdermal administration, and the like.
- Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be.
- the dosage of the composition of the present invention may be administered to an adult in an amount of 0.1 to 1000 mg / kg, preferably in a dose of 10 to 100 mg / kg, once to several times daily.
- the present invention also relates to a composition for preventing or improving colorectal cancer comprising 3,6-anhydro-L-galactose of the formula (1).
- the food composition of the present invention is prepared by adding the 3,6-anhydro-L-galactose to food materials such as beverages, teas, spices, gums, confectionery, or the like by encapsulation, powdering, suspensions, etc. It may be to have a specific health effect.
- the food composition of the present invention can be consumed on a daily basis, an excellent colorectal cancer prevention or improvement effect can be expected and is very useful.
- the 3,6-anhydro-L-galactose When used as a food additive, the 3,6-anhydro-L-galactose may be added as it is or may be used together with other food or food ingredients, according to a conventional method. Can be used as appropriate.
- the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
- the food composition of the present invention is added in an amount of up to 15% by weight, preferably up to 10% by weight based on the raw materials in the manufacture of food or beverage. More specifically, it is added at 0.0001 to 10% by weight. More specifically, it is added at 0.001 to 1% by weight.
- the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety. .
- Examples of the food to which the substance may be added include meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, teas, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes.
- the health beverage may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in general beverages.
- the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Or sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
- sweetening agent natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
- the ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the health beverage of the present invention.
- the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols. And carbonation agents used in carbonated beverages.
- the food composition of the present invention may contain a flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination.
- the ratio of such additives is not critical but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the food composition of the present invention.
- An MTT assay was performed to measure cell viability by 3,6-anhydro-L-galactose.
- Human-derived colorectal cancer cells, HCT-116 cells (Korea Cell Line Bank, Korea) were dispensed in 100-well at 3 ⁇ 10 4 cells / mL in 96-well plates and stabilized at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 4 hours.
- 3,6-Anhydro-L-galactose was prepared in the cultured cells by concentration, and 100 ⁇ l was added thereto, followed by incubation for 3 days under the same conditions.
- MTT (3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) reagent prepared at a concentration of 5 mg / mL was added thereto, and 37 ° C. and 5% CO 2 , after incubation for 2 hours under dark conditions formazan (formazan) formation was observed.
- absorbance was measured at a wavelength of 570 nm using a Microplate (ELISA) reader.
- Cell survival of the 3,6-anhydro-L-galactose treated group was expressed as a percentage of the control group with the cell viability of the untreated control group as 100%.
- a soft agar assay was performed to determine the inhibitory effect of 3,6-anhydro-L-galactose.
- HCT-116 cells Karl Cell Line Bank, Korea
- 3,6-anhydro-L-galactose inhibited tumor turnover of cancer cells in a concentration-dependent manner, and showed an excellent inhibitory effect on colony formation, particularly at a concentration of 100 ⁇ g / mL.
- propidium iodide was determined by the number of cells corresponding to the sub-G1 phase of the cell cycle, that is, the number of apoptosis. , PI, SIGMA, MO, USA) experiments were performed as follows using a flow cytometer through staining.
- HCT-116 cells (Korea Cell Line Bank, Korea), which are human-derived colorectal cancer cells, were seeded in a 60 mm dish and cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 using RPMI 1640 medium containing FBS. It was. After 24 hours the medium was removed and replaced with medium containing 25, 50, 100 ⁇ g / mL of 3,6-anhydro-L-galactose and incubated under the same conditions until at least 80% of the cells were at the bottom of the wells. It was.
- Bcl-2 is a cancer gene protein, unlike other oncogene proteins, Bcl-2 does not participate in cell proliferation and has a function of inhibiting cell survival, ie, apoptosis.
- Bax is a protein belonging to the Bcl-2 family and promotes cell death. There is a function to let.
- HCT-116 cells (Korea Cell Line Bank, Korea), a human-derived colorectal cancer cell, were seeded in 60 mm dishes and RPMI added with FBS 1640 medium was incubated for 24 hours under the conditions of 37 °C, 5% CO 2 . After 24 hours the medium was removed and replaced with medium containing 25, 50, 100 ⁇ g / mL of 3,6-anhydro-L-galactose and incubated under the same conditions until at least 80% of the cells were at the bottom of the wells. It was.
- Each protein (20-40 ⁇ g) thus prepared was denatured by 10% gel SDS (gel sodium dodecyl sulphate) -PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred to PVDF membrane at 100 mA for 2 hours. It was then immersed in a TBS-T solution containing 5% skim milk and reacted for 2 hours to block nonspecific proteins and washed once with TBS-T. At this time, as an antibody for detecting the expression levels of procaspase-3 and caspase-3 in each cell, the expression levels of rabbi polyclonal anti-human caspase-3 Ab (Cell signaling, USA), procaspase-9 and caspase-9 were determined.
- gel SDS gel sodium dodecyl sulphate
- PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
- Antibodies to check include rabbit polyclonal anti-human caspase-9 Ab (Cell signaling, USA), and antibodies to detect the expression levels of PARP and cleaved PARP include rabbit polyclonal anti-human PARP Ab (Cell signaling, USA), Bcl Antibody to detect the expression level of -2 is rabbit polyclonal anti-human Bcl-2 Ab (Cell signaling, USA), and to detect the expression level of Bcl-xL, rabbit polyclonal anti-human Bcl-xL Ab (Cell signaling, USA), rabbit polyclonal anti-human antibody to determine the expression level of Bax Ab (Cell signaling, USA), mouse monoclonal anti-human antibody to determine the expression level of Ba-P38 Phospho-p38 Ab (BD Biosciences, USA), the antibody to determine the expression level of the mouse monoclonal anti-p38 Ab (Santacruz, USA), p-JNK Antibody to detect the amount of rabbit polyclonal anti-human phospho-SAPK / JNK
- HRP conjugated anti-rabbit IgG (Santacruz, USA) and anti-mouse IgG (Santacruz, USA) were diluted 1: 5000, and the reaction proceeded at room temperature for 2 hours. Then, washed 4 times with TBS-T again, and reacted with ECL substrate (Amersham TM , UK) for 1 to 3 minutes, and then photosensed on X-ray film to analyze the expression of apoptosis-related protein of each cell.
- caspase-3 caspase-9 (active type) enzymes that play an important role in apoptosis was increased, the expression of these precursors, procaspase-3, procaspase-9 decreased.
- 3,6-Anhydro-L-galactose increased the degradation of PARP, a damaged DNA repair-related protein, increased the expression of Bax, apoptosis-inducing protein, and the expression of Bcl-2 and Bcl-xL, apoptosis inhibitory proteins. It was confirmed to suppress the.
- 3,6-Anhydro-L-galactose according to the present invention can be used as a therapeutic agent for colorectal cancer.
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Abstract
본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 홍조류 유래의 한천으로부터 분리·정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 이용하여 대장암 세포의 세포사멸을 유도하고 대장암 세포의 성장을 저해함으로써 우수한 항암 효과를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 대장암 세포의 세포사멸 유도 및 세포증식 억제능을 통해 대장암을 예방, 개선, 또는 치료하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대장암(colon cancer)은 미국에서 암과 관련된 사망의 주된 요인일 뿐 아니라, 2010년 미국에서 약 102,900명이 대장암으로 진단되고, 51,370명이 사망할 것으로 추정되는 암이다. 최근에는 서구화된 식습관으로 인해 아시아에서도 그 발병률이 증가하고 있는 추세이며, 관련된 요인으로는 과도한 동물성 지방, 당분, 알코올 섭취와 섬유소, 항산화 비타민, 야채나 과일의 섭취 부족 등이 주요 원인으로 알려져 있다. 특히 동물성 지방과 육류를 많이 섭취하면 채소나 곡물 등의 섬유질 식품 섭취와는 달리 대변 양이 적고 내용물이 대장을 통과하여 배설되는 시간이 많이 걸린다. 또한 담즙산과 스테롤의 배설이 증가하며 대장 내에 존재하는 세균종의 구성에도 변화를 일으켜 이들 물질을 화학적으로 변화시키는 세균의 종류가 증가한다. 따라서 발암물질이 많이 생성되고 발암물질이 대장 내에 머물고 접촉하는 시간도 길어져서 대장암이 많이 발생하게 된다.
대장암의 경우 혈관을 중심으로 많은 수의 세포들이 서로 덩어리진 형태로 성장하는 대표적인 고형암 세포로서 치료방법이 극히 제한적으로 완치가 어려운 암 중 하나이다. 즉, 덩어리진 대장암 세포의 중심부까지 약물이 제대로 투과하지 못하기 때문에 대장암 세포를 완전히 제거하기란 쉬운 일이 아니다. 현재 약물로써 대장암을 치료할 수 있는 방법은 거의 없는 실정이고, 수술요법이나 방사선요법 등과 같은 외과적인 치료만이 대장암을 치료하는 제한적인 방법이며, 또한 이러한 치료법으로는 대장암의 완치가 어렵다. 따라서 많은 연구자들이 대장암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발함으로써 대장암 세포뿐만 아니라 대부분의 암세포들의 성장을 효과적으로 억제시키기 위해서 많은 연구를 수행하고 있다.
세포사멸(apoptosis)은 대부분의 항암제가 암세포의 증식억제 효과를 나타내는 중요한 작용기작으로, 세포 내부에 프로그램된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음이다. 세포사멸은 생명체의 여러 정상적인 생리적 현상에서 쉽게 관찰된다. 예를 들면 세포사멸은 생명체의 초기 발생단계에서 관찰되는 여러 형태적 변화과정과 면역계 또는 신경계의 기능적 자가 조직화과정에서 중요한 역할을 담당한다. 또한, 성인이 된 이후에도 조직 항상성 세포 수의 조절, 손상된 세포의 제거, 감염에 대한 방어 기작으로서 필수적으로 작용한다. 세포사멸은 여러 질환들의 발병과정에도 깊이 관여하는데 비정상적인 세포사멸의 발생은 퇴행성뇌신경질환, 면역계 이상, 그리고 심장 혈관계질환 등의 원인이 될 수 있으며, 세포사멸의 비정상적인 억제는 암의 원인이 될 수 있다. 세포사멸이 정상적인 조절과정에서 벗어나 비정상적으로 발행하거나 억제되어 나타나는 질병을 좀 더 자세히 살펴보면, p53, p16와 Bcl-2 등의 유전자의 이상 발현에 의해 유도되는 암들, HIV, Herpes 및 독감 바이러스들은 여러 감염증, 그리고 당뇨, 류마티스 관절염, 다발성 경화증과 근무력 등과 같은 자가면역 질환들이 있다. 이와 같이, 세포사멸은 생명체의 다양한 생리작용을 정상적으로 유지하는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 여러 질병들의 발병과정에도 밀접한 관련이 있다. 개체를 구성하는 각 세포의 세포사멸은 유전적으로 손상을 입은 세포나 분화 자극제에 의해 부적절한 분화의 유도에 의한 종양의 발달을 막기 위해 이들 비정상적인 세포를 개체에서 제거하기 여러 수단, 즉 회복 불가능한 유전적 상처를 지닌 세포들을 개체에서 제거하기 위한 일반적인 수단이다. 이 개념은 일반적으로 사용되는 항암제가 암세포의 증식억제와 연관된 세포사멸 과정을 통해 암세포의 사멸을 유도한다는 사실에 의해 뒷받침되고 있다. 따라서 세포사멸 과정의 교란은 손상되거나 손상이 시작된 세포의 생존과 그들 세포의 성장을 유도하기 때문에 세포사멸의 억제는 암화과정에서 중요한 역할을 한다. 아울러 암 예방 효과가 있는 물질들은 이러한 비정상적인 세포의 세포사멸을 유도하며, 이들에 의한 세포사멸의 유발은 최소한 그들의 암 예방 활성과 연관되어 있음이 보고되었다.
이에, 본 발명자들은 상기 홍조류 유래 한천으로부터 분리·정제한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 암세포의 세포사멸을 유도하며 암세포의 증식을 억제하는데 탁월한 효과를 나타냄을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대장암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 대장암 치료에 사용하는 상기 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제공한다.
본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 대장암 세포의 생장을 억제하고, 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 우수한 항암 활성을 나타내므로 대장암 예방, 치료, 또는 개선에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 대장암 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 종양 전환 억제 효과를 나타낸 것으로, 사진도는 농도별 L-AHG 처리에 따른 대장암 세포의 콜로니 형성을 육안으로 관찰한 것이며, 그래프는 상기에서 형성된 콜리니의 수를 카운팅 하여 나타낸 것이다.
도 3은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 발생 효과를 나타낸 것으로, 유세포 분석기를 이용하여 sub-G1기, G0/G1기, S기 및 G2/M기의 세포수를 측정한 것이다.
도 4는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 발생 효과를 나타낸 DAPI 분석 결과이다.
도 5는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 세포사멸 관련 단백질, procaspase-3, procaspase-9, caspase-3, caspase-9, PARP, cleaved PARP, Bcl-2, Bcl-xL 및 Bax의 발현에 미치는 효과를 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 6은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 세포사멸 관련 단백질, p-p38, p38, p-JNK, JNK 및 p53의 발현에 미치는 효과를 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다:
[화학식 1]
또한, 본 발명은 대장암 치료에 사용하는 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 제공한다.
본 발명자들은 항암 효과가 있는 생리활성물질을 탐색하는 과정에서 홍조류 유래의 한천(agar)을 구성하고 있는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(L-AHG)에 주목하게 되었다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리하지 않은 대조군 대비 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리한 대장암 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였고, 암세포의 종양전환을 농도 의존적으로 억제하였고, 특히 100㎍/mL의 농도에서 탁월한 콜로니 형성 억제 효과를 나타내었다. 또한, 세포주기의 sub-G1기에 해당하는 세포를 증가시키는 것을 확인할 수 있었고, 특히 100㎍/mL의 고농도에서 뚜렷한 세포사멸 발생을 유도하였고, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리한 대장암 세포에서 세포사멸에 전형적으로 보이는 아폽토시스 바디(apoptosis bodies)가 나타났다. 아울러, 세포사멸에 중요한 역할을 하는 효소인 caspase-3, caspase-9(활성형)의 발현은 증가하고, 이들 전구체인 procaspase-3, procaspase-9의 발현은 감소하였다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 손상된 DNA 복구 관련 단백질인 PARP의 분해를 증가시켰으며, 세포사멸 유발 단백질인 Bax의 발현은 증가시키고 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리 시 세포사멸에 중요한 역할을 하는 p38, JNK의 활성이 증가되고, p53 단백질의 발현이 증가됨을 알 수 있었다.
이와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리로 세포주기가 멈추게 되어 세포 증식 억제 및 사멸이 일어나므로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 대장암 세포의 세포사멸을 유도하며, 암세포의 세포증식을 억제함으로써 대장암의 예방, 개선, 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 대장암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 사용할 수 있다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 홍조류 바이오매스를 구성하는 대표적인 탄수화물 성분인 한천의 구성 단당으로, 화학적 합성을 통해 얻은 것을 사용하거나, 전처리 된 아가로오스에서 아가로올리고당을 제조하고, 상기 아가로올리고당은 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소에 의한 효소적 당화 공정을 통해 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해되며, 상기 효소적 당화 공정을 통해 얻은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 흡착크로마트그래피인 실리카젤 크로마토그래피와 바이오젤 P2 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 방법을 통해 얻을 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 효소적 당화 공정을 통해 분리 정제 하는 일 구현예로, 상기 전처리는 약산을 이용한 아가로오스의 가수분해일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 또는 옥살산(Oxalic acid) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 약산은 생산단가 및 약산 중화 후 생성되는 염의 분리를 고려하여 0.5 내지 60%(w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다. 보다 구체적으로 20 내지 40% (w/v)의 농도로 사용할 수 있다.
상기 아가로오스 및 약산의 반응은 40 내지 150℃의 온도 범위에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 6시간 동안 실시할 수 있다. 상기 범위 내일 경우 약산에 의한 아가로오스의 과분해산물을 최소화할 수 있다.
상기에서 전처리 후 생성된 아가로올리고당을 이당체를 생산하는 엑소-타입의 아가로오스 분해효소와 반응시켜 네오아가로바이오스를 생산하며, 네오아가로바이오스 가수분해효소와의 추가 반응을 통해 단당체인 갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산한다.
상기 효소 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다.
상기 효소 반응을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선, 아가로올리고당을 분해하여 이당체인 네오아가로바이오스를 생산하는 아가로오스 분해효소는 아가로오스의 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 효소(이하, 'Aga50D'라 함)를 사용할 수 있다.
상기 아가로오스 분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
상기 아가로올리고당 및 아가로오스 분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm 조건으로 30분 내지 7일간 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 25 내지 35℃의 온도 범위에서 100 내지 150 rpm 조건으로 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.
상기 효소 반응을 통해 생산된 네오아가로바이오스는 네오아가로바이오스 가수분해효소에 의해 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해된다.
상기 네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
상기 네오아가로바이오스와 네오아가로바이오스 가수분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 0 내지 200 rpm의 조건으로 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 25 내지 35℃의 온도 범위에서 100 내지 150 rpm 조건으로 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.
상기 네오아가로바이오스의 분해 산물에 대해 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피인 바이오 젤 P2 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 대략 96%의 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 분리 정제할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화 될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여 할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 식염수 또는 완충용액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 성인에게 1일에 0.1 내지 1000 mg/㎏의 양을, 바람직하게는 10 내지 100 mg/㎏의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 식품용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 것으로 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 우수한 대장암 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 더 구체적으로 0.0001 내지 10 중량%로 첨가된다. 보다 구체적으로, 0.001 내지 1 중량%로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있을 수 있다.
본 발명의 식품 조성물을 건강음료로 사용하는 경우, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 슈크로오스와 같은 이당류; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류; 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01 ∼ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 대장암 세포 증식 억제 효과 측정
3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 세포 생존율을 측정하기 위해 엠티티 분석 (MTT assay)을 수행하였다. 사람 유래의 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 96-웰 플레이트에 3×104 cells/mL로 100㎕씩 분주한 다음 37℃, CO2 incubator 에서 4시간 동안 안정화시켰다. 배양된 세포에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 농도별로 조제하여 100㎕씩 첨가한 후 동일한 조건으로 3일간 배양하였다. 여기에 5mg/mL의 농도로 제조한 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 시약을 20㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO2, 암조건 하에서 2 시간 동안 배양한 후 포마잔 (formazan) 형성을 관찰하였다. MTT 시약을 제거하고 DMSO를 200㎕ 첨가하여 생성된 포마잔을 용해시킨 후 Microplate (ELISA) reader를 이용하여 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리군의 세포 생존율을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리하지 않은 대조군 대비 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 처리한 대장암 세포의 증식이 농도 의존적으로 억제되었다.
<실시예 2> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 종양전환 억제 효과 측정
3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 종양전환 억제 효과를 측정하기 위해서 소프트 아가 분석(soft agar assay)을 수행하였다.
3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 암세포의 콜로니 형성에 미치는 영향을 평가하기 위해 사람 유래의 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 10, 50, 100㎍/mL의 L-AHG와 함께 6-웰 플레이트에 씨딩(seeding)하여 37℃에서 이주일 동안 배양하였다.
이주일 후 현미경을 이용하여 콜로니 형성 정도를 사진으로 찍은 뒤 형성된 콜리니의 수를 카운팅 하여 나타내었다. 콜로니의 수는 다음과 같은 공식으로 계산하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 암세포의 종양전환을 농도 의존적으로 억제하였고, 특히 100㎍/mL의 농도에서 탁월한 콜로니 형성 억제 효과를 나타내었다.
<실시예 3> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 발생 효과 측정
3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 암세포의 세포사멸 유발 정도를 정량적으로 알아보기 위해서, 세포주기의 sub-G1기에 해당하는 세포, 즉 세포사멸 수의 정도를 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI, SIGMA, MO, USA)염색을 통한 유세포 분석기를 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 사람 유래 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 60 mm 디쉬에 씨딩하고 FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 25, 50, 100㎍/mL의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 함유한 배지로 교체하였고 동일한 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상 찰 때까지 배양하였다.
총 4일간 배양한 후 PI를 이용하여 암세포의 DNA를 염색하였다. 이를 위해 트립신(trypsin)을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 회수하고 원심분리하여 상층액은 제거하고 차가운 인산 완충용액(PBS)으로 1회 세척한 후 70% 무수 에탄올(absolute ethanol)을 1mL 넣어 -20℃에서 24시간 이상 고정시켰다. 원심분리 후 무수 에탄올은 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 20㎍/mL RNase 및 200㎍/mL 프로피디움 요오드(propidium iodide)를 포함하는 1mL의 PBS 내에서 재현탁하였고, 37℃ 암조건에서 10분간 반응시킨 후, 유세포분석기를 사용하여 분석하였다. 각 데이터 파일에 대해 20,000 세포로부터 얻은 데이터를 수집하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 세포주기의 sub-G1기에 해당하는 세포를 증가시키는 것을 확인할 수 있었고, 특히 100㎍/mL의 고농도에서 뚜렷한 세포사멸 발생을 유도하였다. 상기 결과로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 세포주기 진행을 차단하면서 세포사멸을 유도시킨다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 도 4의 DAPI 분석 결과에서 알 수 있듯이 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 대장암 세포에 처리 시 세포사멸에 전형적으로 보이는 아폽토시스 바디(apoptosis bodies)가 나타남을 확인하였다.
<실시예 4> 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 세포사멸 관련 단백질의 발현 측정
상기 실시예의 결과를 통해서 확인된 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 의한 HCT-116 세포의 세포사멸 유발 기작을 알아보기 위하여 웨스턴 블랏팅(western blotting) 방법을 수행하였고, 세포사멸 유발 조절에 중요한 유전자들의 발현 변화를 확인하였다.
Bcl-2는 암 유전자 단백질이지만 다른 암유전자 단백질과는 달리 세포증식에 관여하지 않고 세포생존 조절, 즉 세포사멸을 억제하는 기능이 있으며, Bax는 Bcl-2 패밀리에 속하는 단백질로서, 세포사멸을 촉진시키는 기능이 있다.
3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 세포사멸 관련 단백질의 발현을 측정하기 위해 사람 유래 대장암 세포인 HCT-116세포(한국세포주은행, Korea)를 60 mm 디쉬에 씨딩하고 FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 25, 50, 100㎍/mL의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 함유한 배지로 교체하였고 동일한 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상 찰 때까지 배양하였다.
총 5일간 배양한 후 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 이를 위해 PBS로 2번 세척한 후, 세포용해액(lysis buffer)을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 회수하여 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 각각의 상층액을 취한 후 각 세포의 상층액의 단백질 농도를 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 단백질 분석 키트(protein assay kit, BIO-RAD, USA)로 그 사용방법에 따라 정량하였다.
이렇게 만들어진 각각의 단백질(20∼40㎍)을 10% 겔 SDS(gel sodium dodecyl sulphate)-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하여 PVDF 막(membrane)에 100 mA로 2 시간 동안 전이시켰다. 그 후 5% 스킴 밀크(skim milk)를 함유한 TBS-T 용액에 담궈 2 시간 동안 반응시켜 비특이적인 단백질들에 대한 블록킹(blocking)을 실시하고 TBS-T로 1회 세척하였다. 이때, 각 세포의 procaspase-3와 caspase-3의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbi polyclonal anti-human caspase-3 Ab(Cell signaling, USA), procaspase-9과 caspase-9의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human caspase-9 Ab(Cell signaling, USA), PARP와 cleaved PARP의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human PARP Ab(Cell signaling, USA), Bcl-2의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bcl-2 Ab(Cell signaling, USA), Bcl-xL의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bcl-xL Ab(Cell signaling, USA), Bax의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human Bax Ab(Cell signaling, USA), p-p38의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 mouse monoclonal anti-human phospho-p38 Ab(BD Biosciences, USA), p38의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 mouse monoclonal anti-p38 Ab(Santacruz, USA), p-JNK의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human phospho-SAPK/JNK Ab(Cell signaling, USA), JNK의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit polyclonal anti-human JNK(Santacruz, USA), p53의 발현량을 알아보기 위한 항체로는 rabbit monoclonal anti-human p53 Ab(Cell signaling, USA)를 TBS-T 용액에서 1:1000 으로 희석하여 사용하였으며, 반응은 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 2차 항체로는 HRP가 결합된 anti-rabbit IgG(Santacruz, USA)와 anti-mouse IgG(Santacruz, USA)를 1:5000으로 희석하여 이용하였으며, 반응은 상온에서 2 시간 동안 진행하였다. 그 후 다시 TBS-T로 4 회 세척하여 ECL 기질(AmershamTM, UK)과 1∼3분 동안 반응 시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각 세포의 세포사멸 관련 단백질의 발현 변화를 분석하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 세포사멸에 중요한 역할을 하는 효소인 caspase-3, caspase-9(활성형)의 발현은 증가하고, 이들 전구체인 procaspase-3, procaspase-9의 발현은 감소하였다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 손상된 DNA 복구 관련 단백질인 PARP의 분해를 증가시켰으며, 세포사멸 유발 단백질인 Bax의 발현은 증가시키고 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 처리 시 세포사멸에 중요한 역할을 하는 p38, JNK의 활성이 증가되고, p53 단백질의 발현이 증가됨을 알 수 있었다.
따라서, 세포주기가 멈추게 되어 세포 증식 억제 및 사멸이 일어남을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 대장암 치료제로 사용할 수 있다.
Claims (8)
- 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물:[화학식 1]
- 제1항에 있어서,3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 홍조류 유래의 한천에서 분리 및 정제한 것인 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제2항에 있어서,3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 전처리 된 아가로오스에서 아가로올리고당을 제조하고, 상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소적 당화 과정을 거쳐 분리 정제한 것인 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,약학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물:[화학식 1]
- 제5항에 있어서,3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 홍조류 유래의 한천에서 분리 및 정제한 것인 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 전처리 된 아가로오스에서 아가로올리고당을 제조하고, 상기 아가로올리고당과 아가로오스 분해효소 및 네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소적 당화 과정을 거쳐 분리 정제한 것인 대장암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 대장암 치료에 사용하는 하기 화학식 1로 표시되는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose):[화학식 1]
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