KR102235635B1 - 토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 개선용 조성물로, 토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액 또는 또는 상기 발효 배양액으로부터 분리한 활성 물질을 포함하여, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과가 우수하다.
본 발명은 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과가 우수한 화장료 조성물, 약학 조성물 및 식품 조성물로 제공될 수 있다.

Description

토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 개선용 조성물{Fusidium coccineum spp., isolated from soil and composition for improving skin comprising a culture solution of the strain}
본 발명은 토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
최근 화학 원료, 곤충 및 동물성 원료를 지양하게 됨에 따라 환경 유래 친 바이오 효능 소재를 찾을 필요가 대두되고 있다. 미생물 자원은 석유, 물 등과는 달리 재생산할 수 있다는 점에서 지속 가능한 자원으로 분류되고, 다양한 환경에 적응한 미생물 고유의 특성을 이용하므로 연구 및 산업적 적용 가능성이 매우 높다.
피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다.
하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투까지 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선이나 오염물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부 자극 및 염증 반응을 유발하게 된다.
이러한 환경유해인자에 의한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증 반응 과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 피부의 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름 증가에까지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
피부의 최외각층에 존재하는 각질세포(각질형성세포, Keratinocyte)는 섬유아세포, 내피세포 및 진피세포에 주로 있는 면역세포들과 상호작용하여 피부자극반응의 개시, 조정, 조절에 중요한 역할을 한다.
피하의 염증반응과 관련하여 피부자극은 가장 일반적인 유해효과이며 임상적으로 접촉성 피부염의 70%는 피부자극으로 설명될 수 있다. 홍반, 부종, 균열, 수분손실, 표피탈락, 간지럼증 및 통증은 자극성 또는 알러지성 접촉성 피부염의 대표적 증상들이다.
이것은 세포의 항상성에 이상이 오고 염증반응이 일어나 생기는 증상들이다. 다시말해, 이러한 증상들은 피부자극에 의해 생겨나는 복잡한 생화학적, 신경과 혈관 세포의 반응들의 연쇄작용에 의한 궁극적 생리학적 소견인 것이다.
최근 기능성 화장품에 대한 개발이 다수 진행되고 있으나, 합성 화합물에 대한 소비자들의 낮은 기호도로 인해, 최근 천연물 소재로 하는 제품에 대한 개발 필요성이 증대되고 있다.
(특허 문헌 1) KR 10-2020-0002008 A1
본 발명의 목적은 토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP) 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액을 포함하며, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염 및 가려움증 완화 효과가 우수한 피부 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발효 배양액의 분획물 또는 상기 발효 배양액의 분획물로부터 분리한 활성 물질을 포함하여, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염 및 가려움증 완화 효과가 우수한 피부 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발효 배양액의 분획물 또는 상기 발효 배양액의 분획물로부터 분리한 활성물질을 포함하여, 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과를 가질 수 있는 피부 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염 및 가려움증 완화 효과가 우수하고, 유기성 또는 무기성 오염원에 대한 피부 항오염 효과를 가지는 화장료 조성물, 약학 조성물 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)는 토양에서 분리되며, 필라그린(Filaggrin) 및 HAS-3의 발현 증가능 및 IL-4/폴리(I:C)-유도 케모카인 및 염증성 사이토카인의 발현 억제능을 갖는다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 피부 개선 및 피부 안티폴루션용 조성물은 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액을 포함하며, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 피부 항오염 효과가 우수하다.
상기 조성물은 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액의 에틸아세테이트(Etyl acetate) 분획물을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제되며, 핵자기공명(NMR) 13C 스펙트럼 상에서 166 내지 167ppm에서 나타나는 제1 피크; 154 내지 153ppm에서 나타나는 제2 피크; 및 143 내지 142ppm에서 나타나는 제3 피크를 포함하는 활성물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 피부 안티폴루션용 화장료 조성물은 상기 피부 개선용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 피부 안티폴루션용 약학 조성물은 상기 피부 개선용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 피부 안티폴루션용 식품 조성물은 상기 피부 개선용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명은 피부 개선용 조성물로, 토양에서 분리한 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액 또는 상기 발효 배양액으로부터 분리한 활성 물질을 포함하며, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과가 우수하다.
본 발명은 피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 유기성 또는 무기성 오염원 등에 대한 피부 항오염 효과가 우수한 화장료 조성물, 약학 조성물 및 식품 조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 후시디움 코씨네움 균주 발효 배양액의 분획물에 대한 보습 효능 평가 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 후시디움 코씨네움 균주 발효 배양액의 분획물에 대한 보습 효능 평가 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 후시디움 코씨네움 균주 발효 배양액의 분획물에 대한 가려움증 억제 효능 평가 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 후시디움 코씨네움 균주 발효 배양액의 분획물에 대한 염증 억제 효능 평가 결과이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 FC 및 FA의 피부 장벽 강화 및 피부 보습 효과에 대한 실험 결과이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 FC 및 FA의 사이토카인 저해능에 대한 효과를 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 FC 및 FA의 Hs68 섬유아세포를 사용한 세포 이동 분석 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "피부 장벽 강화"란 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "피부 재생"이란 피부의 일부분이 소실되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "피부 활력 증가"란 피부의 세포 내 미토콘드리아의 활성이 증가하여 피부의 생기 또는 활력을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "항염증"이란"염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "항아토피"란 "아토피 억제, 개선 또는 완화"과 혼용될 수 있으며, 아토피 피부염(atopic dermatitis)의 증상인 가려움증(소양증), 피부건조증, 습진 등을 억제, 개선 또는 완화시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "개선"이란 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 “피부 안티폴루션(Anti-pollution)”은 미세먼지, 유기오염원 또는 무기오염원 등의 오염물질에 의한 피부 오염, 피부 세포 사멸 또는 피부 세포 증식 저해, 또는 피부상태 저하를 개선하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “오염물질”은 미세먼지, 다환 방향족 탄화수소, 알데하이드류 및 질소산화물류를 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
상기 "후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)"은 곰팡이의 일종으로서, 토양으로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 균주는 미황색 집락을 형성하며 생장하는 것일 수 있다. 상기 균주는 감자한천배지에서 생장하는 것일 수 있다.
다른 양상은 후시디움 코씨네움(Fusidium coccineum) 균주 발효 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
상기 후시디움 코씨네움(Fusidium coccineum) 균주 발효 배양액은 구체적으로 발효용 배지를 사용하여 발효시킨 배양액으로, 상기 후시디움 코씨네움(Fusidium coccineum) 균주를 배지의 총 부피에 대하여 0.1(v/v) 내지는 10(v/v)%, 바람직하게는 0.6(v/v) 내지는 2(v/v)%를 접종함으로서 발효할 수 있다.
발효의 조건은 15℃ 내지 45℃에서 24시간 내지 360시간으로, 바람직하게는 21℃ 내지 36℃에서, 48시간 내지 300시간 동안 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양액을 정치한 상태에서도 발효가 진행될 수 있기는 하나, 진탕(Shaking)으로 배양하는 것이 바람직하다. 진탕 배양시 80 내지 400rpm으로, 바람직하게는 140 내지 280rpm으로 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 피부 개선은 피부 장벽 강화, 피부 재생, 피부 활력 증가, 항산화, 항염증, 또는 항 아토피일 수 있다. 후시디움 코씨네움 균주 발효 배양액은 줄기세포 배양액에 비해 피부 장벽 강화 효과, 피부 재생 효과, 피부 활력 증가 효과, 항산화 효과, 항염증 효과, 또는 항아토피 효과가 우수하므로, 상기 후시디움 코씨네움 균주 배양액을 포함하는 조성물은 피부 장벽 강화, 피부 재생, 피부 활력 증가, 항산화, 항염증, 항아토피용 또는 항오염 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 균주는 후시디움 코씨네움(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP) 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물에서, 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액의 에틸아세테이트(Etyl acetate) 분획물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물에서, 상기 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제되며, 핵자기공명(NMR) 13C 스펙트럼 상에서 166 내지 167ppm에서 나타나는 제1 피크; 154 내지 153ppm에서 나타나는 제2 피크; 및 143 내지 142ppm에서 나타나는 제3 피크를 포함하는 활성물질을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 3 중량%, 0.1 중량% 내지 2중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 필라그린(Filaggrin)의 발현을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 필라그린의 발현을 증가시켜 피부 장벽 강화 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 HAS3의 발현을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 히알루론산을 생성하는 효소인 HAS3의 발현을 유의하게 증가시켜, 피부 수화 및 피부 장벽 강화 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 IL-1α의 억제능이 우수하며, 구체적으로 IL-4/Poly(I:C)의 처리에 의해 IL-1α을 포함한 사이토카인의 유의하게 증가할 수 있으나, 본 발명의 조성물을 처리하면, IL-1α을 포함한 사이토카인의 억제 효과가 나타나게 되며, TSLP와 같은 가려움증 관련 케모카인의 억제 효과도 나타날 수 있어, 항염증 및 항 가려움증에 우수한 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 우수한 상처 치유 효과를 나타낼 수 있고, 구체적으로 Hs68 세포에서 세포 이동에 의해 피부 재생능을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로 필라그린 및 HAS3 발현 증가능을 나타내며, IL-4/poly(I:C)-유발 케모카인 및 염증성 사이토카인의 억제능을 나타내고, 섬유아세포(Fibroblast) 및 Hs 68세포에서의 세포 이동에 의해 치유 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 상기 배양액을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 추출물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 피부 개선용 조성물을 포함하는 형태인 것이다. 상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 피부 개선용 조성물을 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로션 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약제학적 조성물은 상기 피부 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.
상기 약제학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등 이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 면역치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 피부 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.
구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 피부 장벽 강화, 피부 보습, 항염 및 가려움증 완화 효과를 증강시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예를 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성 이온음료, 기능성이온 음료, 주스(예를 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 주스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림 (예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
제조예 1
후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC) 발효 배양액(FC)의 제조
0.05 내지 1%(v/v)의 전분, 1 내지 4%(v/v)의 포도당을 포함할 수 있게 만든 30ml의 발효용 배지에 -80℃에서 30% Glycerin Sol.에 보존하던 균을 첨가하여 180 내지 260rpm으로 종균 배양을 실시하였고, 상기 발효용 배지와 동일한 조성을 가진 배지 300mL에 후시디움 코씨네움의 종균 배양액을 배지의 1.0(v/v)%인 3 mL를 접종하고 24 내지 32℃의 배양온도에서 60 내지 180시간 동안 150 내지 240rpm으로 배양하여 후시디움 코씨네움의 발효물을 수득할 수 있다.
상기에서 수득한 발효물을 수용성 부분만을 취한 후, 이를 제균하는 과정을 거친다. 수용성 성분만을 취하기 위하여 원심 분리하는 과정을 포함하며, 이에 제한되지는 않으나 상기 원심분리는 2℃ 내지 10℃의 온도에서 15 내지 25분간 4,000 내지는 15,000rpm으로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 5℃에서 20분간 8,000rpm으로 원심분리 하여 수용성 부분을 취했다. 제균하는 과정은 일반적인 제균 과정에 따라 수행하며, 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 일 실시예에서는 상기의 발효물을 PES재질의 0.22㎛의 Pore Size를 갖는 Membrane Filter를 이용하여 제균하였다.
제조예 2
후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC) 발효 배양액의 분획물 및 활성성분(FA)의 분리 정제
상기 제조예 2의 발효 배양액은 45℃에서 감압농축하고, 이 농축물을 물과 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol로 분배 추출하였다. 각 층을 감압농축하여 EtOAc(4.5g), n-BuOH(19g) 및 H2O(630g) 분획을 제조하였다.
EtOAc분획에 대하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column(
Figure 112020091360410-pat00001
5×22㎝) chromatography)(n-헥산-EtOAc = 10:1 → 5:1 → 3:1→ 1:1 → CHCl3:MeOH = 10:1 → 7:1 → 5:1 → 3:1 → 2:1 → 1:1)를 실시하여 19개의 분획물 (HGE-1～HGE-19)을 수득하였다. 이 중에서 HGE-12(57 mg) 분획에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-헥산-EtOAc = 10:1 → 7:1 → 5:1 → 3:1 → 2:1 → 1:1,
Figure 112020091360410-pat00002
3×15㎝)를 실시하여, 8개의 분획물(HGE12-1~HGE12-8)을 수득하였다. TLC를 확인하고, HGE12-4(49mg)번 소분획을 분리 정제하였다. HGE12-4(49mg)번 소분획을 Sephdex LH-20 컬럼크로마토그래피(MeOH:H2O = 3:1,
Figure 112020091360410-pat00003
Figure 112020091360410-pat00004
2.5×14㎝)로 정제하여 화합물 1 (FA, 10 mg)을 분리하였다.
실험방법
세포 배양
불멸화된 피부각질형성세포(immortalized human keratinocytes, HaCaT) 및 인간 섬유아세포(Hs68)는 American Type Culture Collection(ATCC; 미국 버지니아 주 매너 서스)으로부터 입수하여 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Hyclone Laboratories, Inc., 미국 유타주 로간)에서 배양하였다. 37℃, 5% CO2 조건에서 1% 항생제-항진균제 용액 및 10 % 태아 소 혈청으로 보충하였다. HaCaT 및 Hs68 세포를 80 % 합류까지 유지한 다음, 다양한 농도의 후시디움 코씨네움 균주(1, 10%), 발효 배양액의 분획물 및 분리 정제된 활성성분(1, 10ppm)으로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다.
실시간 RT-PCR
제조사의 지시에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 HaCaT 세포로부터 총 RNA를 분리하였다 (TaKaRa, Shiga, Japan). cDNA는 역전사 프리믹스(Elpis-biotech, Daejeon, Korea)를 사용하여 1μg의 전체 RNA로부터 다음 반응 조건 하에서 45℃에서 45분 및 95 ℃에서 5분 조건에서 합성하였다.
유전자 발현 신호를 실시간 PCR로 정량하고, 데이터를 StepOne PlusTM 시스템 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 사전 혼합된 ROX(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 실시간 PCR 증폭 반응을 수행하였다. 다음의 프라이머 쌍 (Bioneer, 대전, 한국)을 제조사의 프로토콜에 따라 ABI 7300에서 수행된 반응에 사용하였다:
β- 액틴
정방향: 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GT-3'
역방향: 5' -GAC ACC TTC AAC ACC CCA GC-3'
필라 그린
정방향: 5'-AGT GCA CTC AGG GGG CTC ACA-3'
역방향: 5'-CCG GCT TGG CCG TAA TGT GT-3 '
HAS3
정방향: 5'-CTT AAG GGT TGC TTG CTT GC-3'
역방향: 5'-GTT CGT GGG AGA TGA AGG AA-3'
IL-1β
정방향: 5'-GTC ATT CGC TCC CAC ATT CT- 3'
역방향: 5'-ACT TCT TGC CCC CTT TGA AT-3'
TSLP
정방향: 5'-GCT ATC TGG TGC CCA GGC TAT-3'
역방향: 5'-CGA CGC CAC AAT CCT TGT AAT-3'
실시간 PCR을 Applied Biosystems 7300 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 사용하여 수행하였다. 반응 조건은 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분, 이후 95℃에서 10초 및 60℃에서 1분을 1 사이클로 40회 반복하였으며, β- 액틴의 발현을 내부 대조군으로 사용하였다.
세포 이동 분석
세포 이동은 개별 세포의 실제 이동으로 정의하였다. 상대 상처 합류 (RWC)는 Hs68 세포 이동을 측정하는데 사용될 수 있다. 세포 중간에 WoundMaker ™로 상처를 만들었다. 살아있는 Hs68 세포 이미지는 IncuCyte ZOOM 시스템 (Essen BioScience, Ann Arbor, MI)에 의해 포착하였다. 또한 IncuCyte ZOOM 시스템을 이용하여, 각 시점에서 상처 부위의 공간 세포 합류점에 대한 상처 부위의 공간 세포 밀도의 백분율을 측정하였다.
자료분석 및 통계처리
모든 실험은 적어도 3회 반복하고, 각 실험을 3회 수행하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하였다. 통계 분석은 T-검정으로 수행하였다. *p <0.05 및 **p <0.01는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예 1
후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC) 발효 배양액의 분획물로부터 분리 정제된 활성성분의 분석
상기 제조예 3에서 분리 정제된 FA에 대한 분석을 진행하였으며, 분석 방법으로 IR 분광법, 1H-NMR 및 13C-NMR분석을 통해 활성 성분에 대한 분석을 진행하였다.
황색 비정질 분말(CH3OH); positive FAB-MS m/z 333 [M+H]+; IR(KBr, v) 3400, 1660, 1605, 1500cm-1;
1H-NMR (600 MHz, CD3OD, δH, δ in ppm, J in Hz) 8.31 (br. s, H-2), 8.18 (br. s, H-6), 5.97 (d, 7.2, H-1'), 4.74 (dd, 7.2, 7.2, H-2'), 4.46 (m, H-5'), 4.32 (dd, 7.2, 7.2, H-4'), 3.88 (dd, 12.0, 2.4, H -6'a), 3.74 (overlapped, H-6'b), 3.66 (overlapped, H-3');
13C-NMR (100MHz, CD3OD, δC) 166.4 (C-7), 153.6 (C-3, 5), 142.2 (C-4), 121.2 (C-1), 103.9 (C-2), 102.8 (C-6), 91.4 (C-1'), 79.5 (C-3'), 78.2 (C-5'), 74.0 (C-2'), 72.7 (C-4'), 63.6 (C-6')
실험예 2
후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC) 발효 배양액의 분획물에 대한 피부 강화 효과
발효 배양액의 분획물에 대한 피부 강화 효과를 확인하기 위해, 분핵 용매를 n-헥산, H20, 에틸아세테이트(EtOAc) 및 n-부탄올(n-BuOH)를 사용하여 각각의 분획물에 대한 실험을 진행하였다.
각질 세포 분화 마커의 mRNA 수준을 조사하여 FC 및 FA가 각질 세포막(cornified envelope, CE)을 형성하는 효과를 확인하였다.
도 1과 같이 분획 용매에 따라, HAS의 mRNA 발현 정도에 차이가 나타남이 확인되었으며, 에틸아세테이트 분획물에서 가장 우수한 효과가 나타남을 확인하였다. 즉, 에틸아세테이트 분획물에서 보습 효능이 가장 우수함이 확인되었다.
도 2는 보습 효과를 확인하기 위한, 수분통로단백질인 aquaporin 3 (AQP3) 효능 확인을 진행한 것으로, n-BuOH에서 발현 정도가 거의 없고, 에틸아세테이트 분획물에서 가장 우수한 효과가 나타남을 확인하였다.
도 3 및 도 4은 가려움증 및 염증 억제 평가를 진행한 것으로, 염증 및 피부 장벽 파괴를 위한 유도제로서 IL-4 및 Poly(I:C) 혼합물을 사용하였다. 실험 결과는 도 3과 같다.
구체적으로, 가려움증 관련 케모카인, 예컨대 TSLP는 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물에서 우수한 효과가 나타났으나, 특히 물 분획물에서 가장 우수한 효과가 나타남을 확인하였다. 도 4의 염증 억제 효과에서는 물 분획물에 비해 에틸아세테이트 분획물에서 우수한 효과가 나타남을 확인하였다.
종합적으로, 4종의 용매를 사용하여 분획하고, 상기 분획물에 대한 효능 확인을 진행한 결과, 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC) 발효 배양액의 에틸아세테이트 분획물에서 가장 우수한 효과가 나타남을 확인하였다.
실험예 3
피부 장벽 강화 및 피부 보습 효과
각질 세포 분화 마커의 mRNA 수준을 조사하여 FC 및 FA가 각질 세포막(cornified envelope, CE)을 형성하는 효과를 확인하였다.
종래 연구 결과에 따르면, 피부 보습의 주요 인자로 작용하는 필라그린은 프로필라그린의 단백질 분해에 의해 생성되고 카스파제 14에 의해 분해되어 NMF 생성을 초래한다.
도 5과 같이, 필라그린의 mRNA 수준은 FC 및 분리정제된 활성성분의 처리에 의해 상승하였다. 비처리 대조군과 비교하여, 각각 10%의 FC 및 10 ppm의 FA로 처리함으로써 약 8 배 및 2 배 증가하였다(p <0.05).
또한, FC 및 FA의 처리는 히알루론산을 생성하는 효소인 HAS3의 mRNA 발현을 유의하게 증가시켰다.
피부 질환 치료에 널리 사용되는 센텔라 아시아티카(Centella asiatica, CA)를 비교예로 사용하고, 동일한 조건에서 평가했을 때, FC의 재생 및 진정 효과는 CA보다 우수한 효과를 나타냈다. 상기 실험 결과는 HAS3의 발현 변화를 통한 표피 히알루로난(epidermal hyaluronan) 합성이 표피 분화와 상관 관계가 있음을 의미한다. 결과적으로, 본 발명의 FC 및 FA는 피부 보습 및 피부 장벽 기능을 개선하는 효과가 있다.
실험예 4
사이토카인 저해능에 대한 효과
염증 및 피부 장벽 파괴를 위한 유도제로서 IL-4 및 Poly(I:C) 혼합물을 사용하였다. 실험 결과는 도 6과 같다.
구체적으로, IL-1α를 포함한 사이토카인은 IL-4 및 Poly(I:C) 혼합물의 처리 후 유의하게 증가하였지만, FC 및 FA의 처리 후 용량 의존적으로 유의하게 억제되었다.
또한 가려움증 관련 케모카인, 예컨대 TSLP는 FC 및 FA에 의해 억제되었다.
따라서, FC 및 FA는 항 염증 및 항 가려움증 효과가 확인되었으며, 이는 본 발명의 FC 및 FA가 건강한 피부 장벽의 형성에 기여함을 의미한다고 할 것이다.
실험예 5
상처 치유 대한 효과
본 발명의 FC 및 FA의 상처 치유 효과는 Hs68 섬유아세포를 사용한 세포 이동 분석으로 확인하였다.
실험 결과는 도 7와 같고, 본 발명의 FC 및 FA는 Hs68 세포에서 세포 이동에 의해 피부 재생 능력을 나타냈다.
실험예 6
벤조피렌에 대한 저항활성 평가
일반적으로 공해물질과 직접적으로 맞닿게 되는 피부의 각질세포를 사용하여 공해물질에 의한 세포 손상정도를 측정하고, FC 및 FA를 처리하고, 피부 세포 손상 억제효과를 확인하였다. 사람 각질 세포 HaCaT를 1×10⁴cells/ml 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 배양시킨 후, 벤조피렌(2.5 ㎍/mL)과 FC(10ppm) 또는 FA(10ppm)를 각각 처리하고, 21시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 5mg/mL 농도의 MTT solution을 넣고 3시간 배양한 다음 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 150㎕씩 각 well에 넣어주고 10분간 shaking 하고 570nm(reference 655nm) 조건으로 흡광도를 측정하였다. 실험 결과는 하기 표 1과 같다.
Control FC
(10ppm)		 FA
(10ppm)
Blank Negative
Benzo[a]pyrene
(2.5 ㎍/mL)		 - + + +
1st 100 68.37 100.45 78.43
2nd 100 66.99 90.91 80.02
3rd 100 51.16 75.79 60.82
Mean 100 62.17 89.05 73.06
SD 0 9.56 12.44 10.64
생존율 개선(%) 26.9 10.9
생존율 개선은 샘플(농도별) 처리군과 샘플 미처리군(Negative)의 차이값으로 계산되었다. 상기 실험 결과 본 발명의 FC 및 FA는 벤조피렌에 대한 안티폴루션 효과를 가짐을 확인하였다.
실험예 7
벤조피렌에 대한 저항활성 평가
상기 실험예 6에서 벤조피렌 대신, 질산암모늄(500 ㎍/mL)을 사용한 것을 제외하고 동일한 조건 하에서 실험을 진행하였으며, 그 결과는 하기 표 2와 같다.
Control FC
(10ppm)		 FA
(10ppm)
Blank Negative
질산암모늄
(500 ㎍/mL)		 - + + +
1st 100 70.77 84.05 79.55
2nd 100 70.57 82.30 79.77
3rd 100 58.86 79.03 71.93
Mean 100 66.74 81.79 77.04
SD 0 6.82 2.54 4.46
생존율 개선(%) 15.1 10.4
생존율 개선은 샘플(농도별) 처리군과 샘플 미처리군(Negative)의 차이값으로 계산되었다. 상기 실험 결과 본 발명의 FC 및 FA는 질산암모늄에 대한 안티폴루션 효과를 가짐을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (7)

  1. 후시디움 코씨네움 균주(Fusidium coccineum SA-1FC)(수탁번호: KCTC 14229BP)를 접종하고 발효시켜 수득한 발효 배양액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제된 활성 물질을 포함하며,
    상기 활성 물질은 핵자기공명(NMR) 13C 스펙트럼 상에서 166 내지 167ppm에서 나타나는 제1 피크; 154 내지 153ppm에서 나타나는 제2 피크; 및 143 내지 142ppm에서 나타나는 제3 피크를 포함하는
    피부 개선 및 피부 안티폴루션용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 따른 조성물을 포함하는
    피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 피부 안티폴루션용 화장료 조성물.
  6. 제1항에 따른 조성물을 포함하는
    피부 항염 및 가려움증 완화용 약학 조성물.
  7. 제1항에 따른 조성물을 포함하는
    피부 장벽 강화, 피부 재생, 항염, 가려움증 완화 및 피부 안티폴루션용 식품 조성물.
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KR101718323B1 (ko) 발효옻 추출물을 포함하는 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위암 및 위점막 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR102208751B1 (ko) 녹차 추출물 및 유산균, 그 배양물, 그 파쇄물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 개선용 조성물
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Kazemi et al. Evaluation the effect of royal jelly on the growth of two members of gut microbiota; Bacteroides fragillis and Bacteroides thetaiotaomicron.
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