KR102571503B1 - 암질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암세포 내 HSPA1L-METTL21A 결합을 억제시켜 암질환을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 METTL21A와 HSPA1L이 직접 결합함으로써 HSPA1L가 모노-메틸화되고, 모노-메틸화된 HSPA1L의 발현이 증가된 대장암 세포에서 암세포의 증식, 이동 및 전이능이 증가되는 것을 확인하였으며, 상기 METTL21A와 HSPA1L의 결합을 억제시키는 효과를 나타내는 화합물이 암세포의 증식, 이동 및 전이능을 억제시키는 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 METTL21A와 HSPA1L의 결합 억제제극 암질환 예방 또는 치료제로 제공하고자 한다.
Description
본 발명은 암세포 내 METTL21A-HSPA1L 결합을 억제시켜 암질환을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
암이란 일반적으로 제어되지 않는 세포성장으로 특징지어진다. 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료하더라도 많은 경우 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다.
이러한 암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 거의 신체의 모든 부위에서 발생한다. 국가 암 발생 통계결과, 1996년 대비 사망율이 가장 많이 증가한 암은 폐암이며, 그 다음이 대장암, 전립선암, 췌장암이다. 특히 대장암은 전 세계적으로 가장 흔한 암 중 하나로, 우리나라에서의 대장암 발생도 전체 암 발생의 12.0%로 장기별 암 발생률과 사망률에서 각각 3, 4위를 차지하였고 점차 증가 추세이다. 남자의 경우 위암, 폐암, 간암에 이어 4위를 차지고 있으며, 여성의 경우도 이와 유사하다. 대장암의 발병 빈도는 남성이 여성보다 많은 것으로 조사되고 있으며, 연령별로는 50대가 가장 많고, 60대가 그 뒤를 있다.
대장암에 대한 일차적 치료 원칙은 수술 절제이지만, 수술 절제 후에도 재발률이 40~60%에 이르기 때문에, 생존 기간을 연장시키며 증상을 완화시키고 삶의 질 유지와 향상을 위해 방사선 치료 또는 항암화학적요법 등의 보조치료가 필요하다.
그러나 방사선 치료 또는 항암화학적요법은 암세포의 세포사멸을 통한 치료법으로, 암세포 이외 정상세포에 세포독성을 나타내는 부작용이 나타나는 실정이며, 항암화학요법의 경우 약물의 종류와 투여 경로에 대해서는 절대적인 원칙이 없는 상태이며, 그 효과 또한 만족할 정도는 아니다.
또한, 같은 대장암 환자들 중에도 항암화학적요법에 대한 반응률과 생존율의 차이가 크게 나타나기도 한다. 현재까지 대장암을 포함한 고형암 환자의 치료제 개발을 위해 종양의 유전적 성향, 특히 성장 신호의 전달과 종양 세포의 미세환경을 목표로 하는 약제의 연구가 활발히 진행되고 있으나, 만족할 만한 치료제가 개발되지 못하고 있는 실정이다.
본 발명은 METTL21A-HSPA1L 결합에 의해 암세포의 증식, 이동 및 전이능이 활성화되는 것으로 확인됨에 따라, METTL21A-HSPA1L 결합 억제 효과를 나타내는 화합물을 암질환 예방 또는 치료용 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
[화학식 1]
화학식 1에 있어서,
상기 R1은 수소, 페닐, 벤질, (C1 내지 C4)사이클로헥센, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 트리플루오로메틸페닐로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
상기 R2 및 R3 은 각각 다르며, 수소, (C1 내지 C4)페닐, (C1 내지 C4)인다졸, 벤조티아졸, 페닐티아졸, (C1 내지 C4)피페리딘 및 피리딘으로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는, R2 와 R3 가 서로 결합하여 5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H) 고리를 형성하는 것이고,
상기 R4는 벤조[c][1,2,5]티아디아졸, 벤조[c][1,2,5]옥사디아졸, (C1 내지 C4)알킬-1H-인다졸, 벤조[d][1,3]디옥솔, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 (C1 내지 C4)알킬페닐으로 이루어진 군에서 선택되며, *는 카이랄 센터를 의미함.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, METTL21A와 HSPA1L이 직접 결합함으로써 HSPA1L가 모노-메틸화되고, 모노-메틸화된 HSPA1L의 발현이 증가된 대장암 세포에서 암세포의 증식, 이동 및 전이능이 증가되는 것을 확인하였으며, 상기 METTL21A와 HSPA1L의 결합을 억제시키는 효과를 나타내는 화합물이 암세포의 증식, 이동 및 전이능을 억제시키는 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 METTL21A와 HSPA1L의 결합 억제제는 암질환 예방 또는 치료제로 제공될 수 있다.
도 1A는 인간 대장암 세포주 DLD1과 HCT8에 siRNA 형질주입을 통하여 HSPA1L의 발현을 감소시킨 결과이며, 도 1B는 siRNA 형질주입된 DLD1과 HCT8의 이동능을 확인한 결과이며, 도 1C는 HCT116 세포에 CRISPR-Cas9을 이용하여 HSPA1L의 발현을 감소시킨 결과이며, 도 1D는 HSPA1L의 발현감소된 HCT116 세포의 이동능을 확인한 결과이며, 도 1E는 HSPA1L의 발현감소된 HCT116 세포의 전이능을 확인한 결과이며, 도 1F는 HSPA1L 발현이 높은 환자의 전체 생존율을 확인한 결과이다.
도 2A는 다른 종과 사람 HSPA1L의 consensus한 모노-메칠화 부위를 비교한 결과이며, 도 2B는 공발현후 면역침강과 웨스턴 블롯으로 HSPA1L와 METTL21 isoform들과의 결합 및 모노-메틸화 정도를 확인한 결과이며, 도 2C는 LC-LC/MS 분석을 통해 HSPA1L 내의 561번 lysine (K561)이 METTL21A에 의해 모노-메틸화되는 아미노산 부위임을 확인한 결과이며, 도 2D는 공발현후 면역침강과 웨스턴 블롯으로 HSPA1L 돌연변이형(HSPA1L/K561R) 특이적 모노-메틸화를 확인한 결과이며, 도 2E는 사람 대장암세포에서 HSPA1L 단백질과 METTL21A 단백질이 내생수준에서 상호결합을 확인한 결과이며, 도 2F는 METTL21A 단백질이 넉다운(knock-down)된 사람 대장암 세포에서 HSPA1L의 모노-메틸화가 일어나지 않는 겻을 확인한 결과이며, 도 2G는 HSPA1L의 과발현에 의해 증가하는 사람 대장암 세포의 이동능이 METTL21A가 넉다운된 대장암세포에서는 일어나지 않는 것을 확인한 결과이다.
도 3A는 CRISPR-Cas9으로 HSPA1L의 발현을 감소시킨 인간 대장암 세포 HCT116에 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)을 회복시킨 안정화 세포를 확인한 결과이며, 도 3B는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 세포 증식율을 확인한 결과이며, 도 3C는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 콜로니 형성능을 확인한 결과이며, 도 3D는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 상처 회복(wound healing)능을 확인한 결과이며, 도 3E는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 이동능 및 전이능을 확인한 결과이다.
도 4A는 HSPA1L 가상 구조이며, 도 4B는 HSPA1L와 METTL21A 결정 구조에서 docking pose를 확인한 결과이며, 도 4C는 HSPA1L와 METTL21A 결합에 관여하는 아미노산을 확인한 결과이며, 도 4D는 MYC 태그한 HSPA1L의 결손 돌연변이들을 제작하여 FLAG 태그한 METTL21A과 HEK293T 세포에 co-transfection하고 48시간 후 FLAG으로 IP하여 웨스턴 블롯으로 METTL21A와 HSPA1L 결손 돌연변이들 간의 결합을 확인한 결과이며, 도 4E는 HSPA1L와 METTL21A 결정 구조에서 docking 에너지 값을 확인한 결과이다.
도 5A는 METTL21A와 HSPA1L 돌연변이들 간의 결합을 확인한 결과이며, 도 5B는 METTL21A와 HSPA1L 돌연변이들 간의 모노-메칠화 정도를 확인한 결과이며, 도 5C는 HSPA1L/F430A 돌연변이를 과발현 인간 대장암 세포 HCT116의 이동능을 확인한 결과이며, 도 5D는 HSPA1L/F430A 돌연변이를 과발현 인간 대장암 세포 HCT116의 전이능을 확인한 결과이며, 도 5E는 HSPA1L의 발현을 감소시킨 인간 대장암 세포 HCT116에 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/F430A)을 회복시킨 stable 세포를 확인한 결과이며, 도 5F는 회복된 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/F430A) 세포의 이동능을 확인한 결과이다.
도 6A는 METTL21A와 HSPA1L 가상 결합 모델(virtual docking modeling)을 확인한 결과이며, 도 6B는 METTL21A의 돌연변이 (E71K, E71Q, D94A, R176D, R176K, R179D, R179K)들을 제작하여 FLAG 태그한 HSPA1L과 HEK293T 세포에 co-transfection하고 48시간 후 세포 용해물을 면역침강하여 웨스턴 블롯으로 HSPA1L와 METTL21A 돌연변이들 간의 결합 및 METTL21A의 메칠화 활성능을 확인한 결과이며, 도 6C는 METTL21A의 돌연변이 (E71K, E71Q, D94A)들의 HSP70 트리-메칠화 활성을 확인한 결과이며, 도 6D는 Lenti viral infection을 수행하여 METTL21A/WT, METTL21A/D94A 및 METTL21A/R176K를 안정적으로 과발현하는 stable 대장암 세포를 확인한 결과이며, 도 6E는 METTL21A/WT, METTL21A/D94A 및 METTL21A/R176K 과발현 대장암 세포의 이동능 및 전이능을 확인한 결과이다.
도 7A는 HSPA1L의 C-말단의 SBD의 430번 phenylalanine을 포함하는 가상 구조의 활성포켓에 가장 좋은 결합 친화성과 안정적인 docking pose를 나타내는 화합물을 선별한 결과이며, 도 7B 및 도7C는 선별된 화합물의 METTL21A와 HSPA1L 결합 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 8는 선별된 화합물과 HSPA1L의 docking 에너지 값 및 docking pose를 확인한 결과로, 도 8A는 화합물 20 (화학식 2, ZINC08596440)의 구조이며, 도 8B는 화합물 20-3 (화학식 3, ZINC20235608)의 구조이다.
도 9A는 CCD841, HEK293, HCT116, DLD1 및 대장 CSC 세포에서 선별된 화합물의 화합물의 세포독성을 확인한 MTS 분석 결과이며, 도 9B는 선별된 화합물이 25μM 농도로 처리된 HCT116 세포 및 SW480 세포의 이동능 및 전이능을 확인한 결과이다.
도 10은 화합물 20-3 (화학식 3)이 처리된 SW480 세포 및 HCT116 세포의 이동능과 종양 형성능을 확인한 결과이다.
도 11은 이종 이식 마우스 모델에 화합물 20-3 (화학식 3)을 50 mg/kg 농도로 주 3회 (총 24회) 주사하고 암세포 성장 및 종양 형성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 화합물 20-3의 유도체이다.
도 2A는 다른 종과 사람 HSPA1L의 consensus한 모노-메칠화 부위를 비교한 결과이며, 도 2B는 공발현후 면역침강과 웨스턴 블롯으로 HSPA1L와 METTL21 isoform들과의 결합 및 모노-메틸화 정도를 확인한 결과이며, 도 2C는 LC-LC/MS 분석을 통해 HSPA1L 내의 561번 lysine (K561)이 METTL21A에 의해 모노-메틸화되는 아미노산 부위임을 확인한 결과이며, 도 2D는 공발현후 면역침강과 웨스턴 블롯으로 HSPA1L 돌연변이형(HSPA1L/K561R) 특이적 모노-메틸화를 확인한 결과이며, 도 2E는 사람 대장암세포에서 HSPA1L 단백질과 METTL21A 단백질이 내생수준에서 상호결합을 확인한 결과이며, 도 2F는 METTL21A 단백질이 넉다운(knock-down)된 사람 대장암 세포에서 HSPA1L의 모노-메틸화가 일어나지 않는 겻을 확인한 결과이며, 도 2G는 HSPA1L의 과발현에 의해 증가하는 사람 대장암 세포의 이동능이 METTL21A가 넉다운된 대장암세포에서는 일어나지 않는 것을 확인한 결과이다.
도 3A는 CRISPR-Cas9으로 HSPA1L의 발현을 감소시킨 인간 대장암 세포 HCT116에 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)을 회복시킨 안정화 세포를 확인한 결과이며, 도 3B는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 세포 증식율을 확인한 결과이며, 도 3C는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 콜로니 형성능을 확인한 결과이며, 도 3D는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 상처 회복(wound healing)능을 확인한 결과이며, 도 3E는 회복된 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)의 이동능 및 전이능을 확인한 결과이다.
도 4A는 HSPA1L 가상 구조이며, 도 4B는 HSPA1L와 METTL21A 결정 구조에서 docking pose를 확인한 결과이며, 도 4C는 HSPA1L와 METTL21A 결합에 관여하는 아미노산을 확인한 결과이며, 도 4D는 MYC 태그한 HSPA1L의 결손 돌연변이들을 제작하여 FLAG 태그한 METTL21A과 HEK293T 세포에 co-transfection하고 48시간 후 FLAG으로 IP하여 웨스턴 블롯으로 METTL21A와 HSPA1L 결손 돌연변이들 간의 결합을 확인한 결과이며, 도 4E는 HSPA1L와 METTL21A 결정 구조에서 docking 에너지 값을 확인한 결과이다.
도 5A는 METTL21A와 HSPA1L 돌연변이들 간의 결합을 확인한 결과이며, 도 5B는 METTL21A와 HSPA1L 돌연변이들 간의 모노-메칠화 정도를 확인한 결과이며, 도 5C는 HSPA1L/F430A 돌연변이를 과발현 인간 대장암 세포 HCT116의 이동능을 확인한 결과이며, 도 5D는 HSPA1L/F430A 돌연변이를 과발현 인간 대장암 세포 HCT116의 전이능을 확인한 결과이며, 도 5E는 HSPA1L의 발현을 감소시킨 인간 대장암 세포 HCT116에 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/F430A)을 회복시킨 stable 세포를 확인한 결과이며, 도 5F는 회복된 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/F430A) 세포의 이동능을 확인한 결과이다.
도 6A는 METTL21A와 HSPA1L 가상 결합 모델(virtual docking modeling)을 확인한 결과이며, 도 6B는 METTL21A의 돌연변이 (E71K, E71Q, D94A, R176D, R176K, R179D, R179K)들을 제작하여 FLAG 태그한 HSPA1L과 HEK293T 세포에 co-transfection하고 48시간 후 세포 용해물을 면역침강하여 웨스턴 블롯으로 HSPA1L와 METTL21A 돌연변이들 간의 결합 및 METTL21A의 메칠화 활성능을 확인한 결과이며, 도 6C는 METTL21A의 돌연변이 (E71K, E71Q, D94A)들의 HSP70 트리-메칠화 활성을 확인한 결과이며, 도 6D는 Lenti viral infection을 수행하여 METTL21A/WT, METTL21A/D94A 및 METTL21A/R176K를 안정적으로 과발현하는 stable 대장암 세포를 확인한 결과이며, 도 6E는 METTL21A/WT, METTL21A/D94A 및 METTL21A/R176K 과발현 대장암 세포의 이동능 및 전이능을 확인한 결과이다.
도 7A는 HSPA1L의 C-말단의 SBD의 430번 phenylalanine을 포함하는 가상 구조의 활성포켓에 가장 좋은 결합 친화성과 안정적인 docking pose를 나타내는 화합물을 선별한 결과이며, 도 7B 및 도7C는 선별된 화합물의 METTL21A와 HSPA1L 결합 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 8는 선별된 화합물과 HSPA1L의 docking 에너지 값 및 docking pose를 확인한 결과로, 도 8A는 화합물 20 (화학식 2, ZINC08596440)의 구조이며, 도 8B는 화합물 20-3 (화학식 3, ZINC20235608)의 구조이다.
도 9A는 CCD841, HEK293, HCT116, DLD1 및 대장 CSC 세포에서 선별된 화합물의 화합물의 세포독성을 확인한 MTS 분석 결과이며, 도 9B는 선별된 화합물이 25μM 농도로 처리된 HCT116 세포 및 SW480 세포의 이동능 및 전이능을 확인한 결과이다.
도 10은 화합물 20-3 (화학식 3)이 처리된 SW480 세포 및 HCT116 세포의 이동능과 종양 형성능을 확인한 결과이다.
도 11은 이종 이식 마우스 모델에 화합물 20-3 (화학식 3)을 50 mg/kg 농도로 주 3회 (총 24회) 주사하고 암세포 성장 및 종양 형성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 화합물 20-3의 유도체이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
종양 진행과정에서의 번역 후 조절은 비정상적인 세포의 증식, 부착 및 형태를 조절하는 데 영향을 끼친다. 번역 후 조절 과정 중 하나인 메틸화는 단백질의 항상성과 같은 특성을 조절함으로써 종양형성 과정에서 중요한 역할을 한다. 본 발명의 발명자들은 메틸화효소인 METTL21A가 암세포에서 발현이 증가되며, 암세포주의 증식능, 이동능 및 전이능에 관여한다는 것을 확인하였다. 특히, METTL21A 의해 모노-메칠화되는 HSPA1L 이라는 새로운 열 충격 단백질(Heat Shock Protein, HSP)을 확인하였으며, 모노-메칠화된 HSPA1L이 암세포에서 발현이 증가되어 있음을 확인하고 METTL21A-HSPA1L 결합을 억제시킬 경우, 암세포의 증식, 이동 및 전이능이 억제되는 것을 확인함에 따라, METTL21A-HSPA1L 결합 억제제를 신규한 항암제로 제공하기 위해 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
화학식 1에 있어서,
상기 R1은 수소, 페닐, 벤질, (C1 내지 C4)사이클로헥센, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 트리플루오로메틸페닐로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
상기 R2 및 R3 은 각각 다르며, 수소, (C1 내지 C4)페닐, (C1 내지 C4)인다졸, 벤조티아졸, 페닐티아졸, (C1 내지 C4)피페리딘 및 피리딘으로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는, R2 와 R3 가 서로 결합하여 5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H) 고리를 형성하는 것이고,
상기 R4는 벤조[c][1,2,5]티아디아졸, 벤조[c][1,2,5]옥사디아졸, (C1 내지 C4)알킬-1H-인다졸, 벤조[d][1,3]디옥솔, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 (C1 내지 C4)알킬페닐으로 이루어진 군에서 선택되며, *는 카이랄 센터를 의미하는 것일 수 있다.
보다 상세하게 상기 화학식 1에서 R1은 페닐, 벤질, 디메틸사이클로헥센, 메톡시페닐 또는 (트리플루오로메틸)페닐이고,
R2 및 R3 은 각각 동일하거나 다르며, 수소, 디메틸페닐, 에틸페닐, 메틸-1H-인다졸-4-일, 벤조[d]티아졸-2-일, 페닐티아졸-2-일, 메틸피페리딘-4-일 또는 피리딘-4-일이고, 또는 R2 와 R3 가 서로 결합하여 5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H)인 것이고,
R4는 벤조[c][1,2,5]티아디아졸, 벤조[c][1,2,5]옥사디아졸, 메틸-1H-인다졸, 벤조[d][1,3]디옥솔, 메톡시페닐 또는 메틸페틸인 것일 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 α-[(2,1,3-벤조티아디아졸-4-일설포닐)아미노]-N-(3,5-디메틸페닐)-벤젠아세트아미드{α-[(2,1,3-benzothiadiazol-4-ylsulfonyl)amino]-N-(3,5-dimethylphenyl)-benzeneacetamide}, α-[(2,1,3-벤조티아디아졸-4-일설포닐)아미노]-N-(3-에틸페닐)-벤젠아세트아미드{α-[(2,1,3-benzothiadiazol-4-ylsulfonyl)amino]-N-(3-ethylphenyl)-benzeneacetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]티아디아졸-4-설폰아미도)-N-(1-메틸-1H-인다졸-4-일)-2-페닐아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]thiadiazole-4-sulfonamido)-N-(1-methyl-1H-indazol-4-yl)-2-phenylacetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-설폰아미도)-N-(1-메틸-1H-인다졸-4-일)-2-페닐아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]oxadiazole-4-sulfonamido)-N-(1-methyl-1H-indazol-4-yl)-2-phenylacetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]티아디아졸-4-설폰아미도)-N-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-페닐아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]thiadiazole-4-sulfonamido)-N-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2-phenylacetamide}, 2-(1-메틸-1H-인다졸-7-설폰아미도)-2-페닐-N-(4-페닐티아졸-2-일)아세트아미드{2-(1-methyl-1H-indazol-7-sulfonamido)-2-phenyl-N-(4-phenylthiazol-2-yl)acetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-설폰아미도)-2-(3,3-디메틸사이클로헥-1-엔-1-일)-N-(1-메틸피페리딘-4-일)아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]oxadiazole-4-sulfonamido)-2-(3,3-dimethylcyclohex-1-en-1-yl)-N-(1-methylpiperidin-4-yl)acetamide}, 2-(벤조[c][1,3]디옥솔-5-설폰아미도)-2-(4-메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)아세트아미드{2-(benzo[d][1,3]dioxole-5-sulfonamido)-2-(4-methoxyphenyl)-N-(pyridin-4-yl)acetamide}, 2-(4-메톡시페닐설폰아미도)-N-(피리딘-4-일)-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)아세트아미드{2-(4-methoxyphenylsulfonamido)-N-(pyridin-4-yl)-2-(4-(trifluoromethyl)phenyl)acetamide}, N-(2-(3-메틸-5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-2-옥소-1-페닐에틸)벤조[c][1,2,5]티아디아졸-4-설폰아미드{N-(2-(3-methyl-5,6-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl)-2-oxo-1-phenylethyl)benzo[c][1,2,5]thiadiazole-4-sulfonamide}, 4-메틸-N-(2-(3-메틸-5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-2-옥소-1-(4-(트리플루오로메틸)페닐)에틸)벤젠설폰아미드{4-methyl-N-(2-(3-methyl-5,6-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl)-2-oxo-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)benzenesulfonamide} 및 N-(1-(3-메틸-5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-설폰아미드{N-(1-(3-methyl-5,6-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazole-4-sulfonamide}로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 암세포 내 METTL21A-HSPA1L 결합을 억제시키는 것일 수 있다.
상기 암질환은 대장암, 췌장암, 삼중유방암, 폐암, 간암, 위암, 갑상선암, 전립선암 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
화학식 1에 있어서,
상기 R1은 수소, 페닐, 벤질, (C1 내지 C4)사이클로헥센, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 트리플루오로메틸페닐로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
상기 R2 및 R3 은 각각 다르며, 수소, (C1 내지 C4)페닐, (C1 내지 C4)인다졸, 벤조티아졸, 페닐티아졸, (C1 내지 C4)피페리딘 및 피리딘으로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는, R2 와 R3 가 서로 결합하여 5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H) 고리를 형성하는 것이고,
상기 R4는 벤조[c][1,2,5]티아디아졸, 벤조[c][1,2,5]옥사디아졸, (C1 내지 C4)알킬-1H-인다졸, 벤조[d][1,3]디옥솔, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 (C1 내지 C4)알킬페닐으로 이루어진 군에서 선택되며, *는 카이랄 센터를 의미하는 것일 수 있다.
상기 건강식품은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 배양
사람 대장암 세포주 HCT8, DLD1, HCT116, SW480 및 SW620를 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였다. HEK293T, LVX293T 및 HCT116 세포를 10% 태아소혈청 (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle medium (Welgene, Daegu, Korea) 배지에서 배양하였으며, HCT8, DLD1, SW480 및 SW620 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2 배양기에서 37℃로 배양되었다.
2. 형질주입 (transfection)
제조사의 설명서 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 따라, 리포펙타민 3000을 이용하여 HEK293T 세포를 형질주입하였다.
siRNA 형질주입을 이용하여 일시적으로 유전자를 감소시키기 위해, HCT8, DLD1 및 HCT116 세포를 80% 합류되도록 배양한 후 제조사의 설명서에 따라, RNAi MAX 시약을 이용하여 HSPA1L siRNA 또는 METTL21A siRNA (50 nM, Ambion, Foster City, CA, USA)을 24시간 동안 형질주입하였다.
3. CRISPR/CAS9 knock-out 세포 주 발생
HSPA1L knock-out 세포주를 생성하기 위해, pRGEN-human HSPA1L-sgRNA (ToolGen, Seoul, Korea) 및 Cas9-CMV-Puro plasmid로 형질 감염된 HCT116 세포를 이용하였다. puromycin을 이용하여 목적 세포를 선택하고, 단일세포로 분리한 후 T7E1 assay를 수행하여 각 클론의 knockout 효율을 확인하였다.
4. 면역침강법 (co-immunoprecipitation, IP)
면역침강을 위해, 형질 주입된 HEK293T 또는 CRC 세포를 IP 용해 버퍼 (lysis buffer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 용해시켰다.
사전 세척된 세포 용해물을 개시된 항체와 4℃에서 하룻밤동안 인큐베이션한 후 프로테인 A/G 아가로스 비드 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 또는 FLAG-M2 비드(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 면역침강물을 수거하고 SDS-PAGE 분리 후 웨스턴 블롯을 수행하였다.
5. 세포 증식 분석 및 콜로니 형성 분석
CCK cell viability assay kit (Dongin LS, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라, 세포 증식 분석을 수행하였다. 콜로니 형성 분석을 위해, CRC 세포 (1 × 103 cells/well)를 6-웰 배양 플레이트에 분주하고 7-10일간 배양하였다. 콜로니들을 차가운 메탄올로 고정시키고, 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 확인하였다.
6. 이동 및 전이 분석
마트리겔(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)이 사전 코팅된 8-μm polycarbonate Transwell chamber (Corning, Inc., Corning, NY, USA)을 이용하여 트랜스웰 이동 및 전이 분석을 수행하였다.
간략하게, 5 × 104 내지 2 × 105 사이의 세포를 FBS가 없는 상층 챔버에 접종하였으며, 하층 챔버에는 완전 배지 700 μL를 채웠다. 24-48 시간 후 하부 막의 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
스크래치 상처 회복 이동 분석을 위해, 세포를 6-웰 플레이트에서 성장시키고, 1-mm 스크래쳐 팁(SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)으로 스크래치를 제작하였다. 상처 봉합은 0, 48 및 72시간째에 확인하였다.
<실시예 1> 대장암 세포에서 HSPA1L의 영향 확인
암세포에 대한 HSPA1L의 영향을 확인하기 위해, 인간 대장암 세포주 DLD1과 HCT8에 si-RNA을 형질주입시켰으며, HCT116 세포에 CRISPR-Cas9 방법을 이용하여 HSPA1L의 발현을 감소시켰다.
그 결과, 도 1B와 같이 DLD1와 HCT8세포의 이동 능력이 감소하였으며, 도 1D 및 도 1E와 같이 HCT116세포의 콜로니 형성 능력과 이동(migration) 및 전이(invasion) 능력 모두 감소한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 1F와 같이 대장암 환자 코호트를 분석한 결과, HSPA1L의 발현이 높은 환자군은 전체 생존율(overall survival)이 낮은 것으로 확인되었다.
상기 결과들로부터 HSPA1L은 대장암 세포의 성장, 이동 및 전이를 조절하는 것으로 확인되었다.
<실시예 2> HSPA1L의 결합 단백질 확인
앞서 확인된 HSPA1L의 세포내 결합 단백질을 확인하기 위해, FLAG 태그된 HSPA1L를 발현시킨 HEK293T 세포의 세포용해물에 항 FLAG M2 친화성(affinity) 젤(gel)(Sigma)을 이용하여 면역침강(immunoprecipitation, IP)한 후, HSPA1L과 결합한 침강 단백질들을 SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질들은 트립신(trypsin)을 이용하여 in-gel digestion 방법으로 펩타이드로 분해한 후 분해된 펩타이드들을 LC-mass spectrometry 장비로 분석하였다.
그 결과, HSPA1L 단백질에 METTL21A이 우세하게 결합하는 것을 확인할 수 있었다. METTL21A는 METTL21의 4종류 중의 한 종류의 동형 단백질(isoform)로, METTL21A는 HSP70 단백질을 트리메틸화(Tri-methylation)하는 인간 단백질 메틸 트랜스퍼라제로써, 클라이언트 단백질과의 상호작용 능력을 변경시킨다.
FLAG 태그된 HSPA1L와 4종류의 MYC 태그된 METTL21A, B, C 및 D 동형 단백질을 각각 HEK293T 세포에 co-transfection하여 공발현시킨 후 RIPA 용해버퍼 (25mM Tris-HCl (pH7.6), 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS; Thermo)로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 항 FLAG M2 affinity gel로 IP 후 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 HSPA1L와 METTL21 동형 단백질들과의 결합 및 메틸화 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 2B와 같이 HSPA1L은 METTL21A와 강하게 결합하고, METTL21A가 특이적으로 HSPA1L을 메틸(methyl)화 시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, FLAG 태그된 HSPA1L와 MYC 태그된 METTL21A을 HEK293T 세포에 co-transfection하여 공발현시킨 후 RIPA 용해버퍼로 용해시킨 세포용해물을 항 FLAG M2 affinity gel로 IP 후 SDS-PAGE 후 HSPA1L의 메틸화 정도를 LC-MS로 분석하였다.
그 결과, 도 2C와 같이 HSPA1L은 METTL21A에 의해 HSPA1L 내의 561번 라이신 (K561)이 모노-메틸화(mono-methylation)되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 확인하기 위해, HSPA1L의 561번 라이신(lysine)을 아르기닌 (arginine)으로 치환한 돌연변이 (HSPA1L/K561R)를 만들고 METTL21A와 함께 발현 시켜 IP 후, METTL21A와의 결합과 메틸화 정도를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
그 결과, 도 2D와 같이 HSPA1L의 K561이 METTL21A에 의해 모노-메틸화되는 아미노산이라는 것을 새롭게 확인할 수 있었다.
대장암세포의 용해물을 HSPA1L 항체로 IP한 후 METTL21A 단백질을 확인하였다. 그 결과, 도 2E와 같이 HSPA1L 단백질은 METTL21A 단백질과 내생수준(Endogenous level)에서 결합하였으며, 도 2F와 같이 METTL21A 단백질이 넉다운(knock-down)된 세포에서는 FLAG 태그된 HSPA1L을 과발현시켜도 HSPA1L의 모노-메틸화가 나타나지 않았으며, 도 2G와 같이 HSPA1L의 과발현에 의해 증가하는 대장암 세포의 이동 능력이 METTL21A가 넉다운된 대장암세포에서는 확인되지 않았다.
한편, 실시예 1에서 CRISPR-Cas9으로 HSPA1L의 발현을 감소시킨 인간 대장암 세포 HCT116에 도 3A와 같은 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/K561R)을 회복(recovery) 시킨 stable 세포를 구축한 후 세포의 기능 및 능력을 확인하였다.
그 결과, 도 3B와 같이 HSPA1L KO 세포의 감소된 증식능력이 HSPA1L/WT으로 회복되면서 증가한 반면, HSPA1L/K561R의 경우에는 증식 증가효과가 나타나지 않았다. 상기 결과와 동일하게 도 3C 내지 도 3E와 같이 HSPA1L/K561R은 WT과 비교하여 콜로니 형성능, 상처 회복(wound healing), 이동 및 전이 능력이 회복되지 못하였다.
<실시예 3> HSPA1L 단백질과 METTL21A 단백질간의 결합에 관여하는 아미노산 확인
HSPA1L 단백질과 METTL21A 단백질간의 결합에 관여하는 아미노산을 분석하기 위해 HSPA1L 뉴클레오티드 결합 도메인 (nucelotide binding domain, NBD)의 결정 구조와 (3GDQ)(PLoS ONE. (2010) 5:e8625) 및 상동성 모델링 (homology modeling) 방법으로 만든 HSPA1L C-말단의 기질 결합 도메인 (substrate binding domain, SBD)과 연결(linker)을 통하여 융합(fusion)된 HSPA1L의 가상 구조를 도 4A와 같이 만들었으며, 리모델링한 HSPA1L와 METTL21A 결정 구조 (4LEC)를 가상 시뮬레이션(virtual simulation)으로 결합시켰다.
그 결과, 도 4B와 같이 HSPA1L C-말단의 SBD와 METTL21A가 안정적으로 결합하는 docking pose가 확인되었으며, 도 4C와 같이 HSPA1L C-말단의 SBD 내 T427, I429, F430, Q475 및 E477 등의 아미노산들이 METTL21A와의 결합에 관여하는 것으로 예측되었다.
다양한 MYC 태그된 HSPA1L의 결손돌연변이(deletion mutant)들을 제작하여 FLAG 태그한 METTL21A와 HEK293T 세포에 co-transfection하고 48시간 후 FLAG으로 IP하여 웨스턴 블롯으로 METTL21A와 HSPA1L 결손 돌연변이들간의 결합을 확인하였다.
그 결과, 도 4D와 같이 HSPA1L의 426번 아미노산부터 497번 아미노산 사이의 영역이 METTL21와의 결합에 관여하는 사실을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 도 4C의 가상 시뮬레이션 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
가상 결합 모델을 통하여 예측된 HSPA1L SBD 내의 아미노산들의 돌연변이들(T427A, I429A, F430A, Q475A, E477A)을 METTL21A와 가상 결합한 결과, 도 4E와 같이 HSPA1L의 430번 페닐알라닌 (phenylalanine)이 알라닌 (F430A)으로 치환 되었을 때 docking 에너지 값이 높고 불안정한 docking pose를 나타내었다.
앞선 실험에서 예측된 HSPA1L SBD 내 아미노산 돌연변이(T427A, I429A, F430A, Q475A, E477A)들과 METTL21A의 결합 및 모노-메틸화 정도를 생화학적으로 확인하기 위해, FLAG 태그한 HSPA1L 돌연변이 (T427A, I429A, F430A, Q475A, E477A)들을 제작하여 MYC 태그한 METTL21A 야생형과 HEK293T 세포에 co-transfection하고 48시간 후 FLAG으로 IP하여 웨스턴 블롯으로 METTL21A와 HSPA1L mutant들 간의 결합을 확인하였으며, 항 모노-메칠 라이신을 인식하는 항체를 사용해 모노-메칠화 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5A 및 도 5B와 같이 HSPA1L/F430A 돌연변이는 METTL21A와 결합과 모노-메칠화가 나타나지 않았다.
상기 결과는 도 4B의 virtual docking modeling 결과와 일치하며, HSPA1L의 430번 페닐알라닌이 METTL21A와의 결합에 가장 필수적인 아미노산임을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 HSPA1L/F430A 돌연변이의 기능을 확인하기 위해, 인간 대장암 세포 HCT116에 HSPA1L/F430A 돌연변이를 과발현시켰다.
그 결과, 도 5C 및 도 5D와 같이 HSPA1L/WT와 비교하여 HSPA1L/F430A 돌연변이는 세포의 이동 및 전이능을 증가시키지 못하였다.
또한, CRISPR-Cas9 방법을 이용하여 HSPA1L의 발현을 감소시킨 인간 대장암 세포 HCT116에 HSPA1L 야생형(HSPA1L/WT)과 돌연변이형(HSPA1L/F430A)을 회복시킨 stable 세포를 구축한 후, 세포의 기능 및 능력을 확인하였다.
그 결과, 도 5E 및 도 5F와 같이 HSPA1L/WT와 비교하여 HSPA1L/F430A가 회복된 HCT116 세포에서는 이동능 회복이 나타나지 않았다.
한편, 도 4B의 virtual docking modeling에서 METTL21A의 R174, R176, Y177, R179 등의 아미노산들이 도 6A와 같이 HSPA1L C-말단의 SBD와의 결합에 관여할 것으로 예측됨에 따라, 다양한 MYC 태그된 METTL21A의 돌연변이 (E71K, E71Q, D94A, R176D, R176K, R179D 및 R179K)들을 제작하여 FLAG 태그된 HSPA1L과 HEK293T 세포에 co-transfection하고 48시간 후 세포 용해물을 FLAG으로 IP하여 웨스턴 블롯으로 HSPA1L와 METTL21A 돌연변이들 간의 결합 및 METTL21A의 메칠화 활성능을 확인하였다.
그 결과, 도 6B와 같이 METTL21A의 돌연변이들과 HSPA1L간의 결합에 영향을 주지 않았지만 HSPA1L의 모노-메칠화 활성능이 억제되었다. 또한, 도 6C와 같이 3 종류의 METTL21A의 돌연변이 (E71K, E71Q, D94A)들은 HSP70의 트리-메칠화 활성을 억제시켰다. 반면, 4 종류의 METTL21A의 돌연변이(R176D, R176K, R179D, R179K)들은 HSPA1L 특이적으로 모노-메칠화능이 억제되었다.
상기 결과로부터 METTL21A의 R176 및 R179 두 종류의 아미노산이 HSPA1L 특이적으로 모노-메칠화를 유도하는 필수 아미노산인 것이 확인되었다. HSPA1L 특이적 METTL21A 돌연변이의 기능을 확인하기 위해 Lenti viral infection 기법을 이용하여 도 6D와 같이 대장암 세포에 METTL21A/WT, METTL21A/D94A 및 METTL21A/R176K를 안정적으로 과발현하는 stable 세포를 제작하였다.
그 결과, 도 6E와 같이 METTL21A/WT 과발현 세포의 이동 및 전이능의 증가가 확인된 반면 METTL21A/D94A와 METTL21A/R176K 과발현 세포의 이동 및 전이능은 감소된 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4> HSPA1L와 METTL21A 결합 억제 효과를 나타내는 화합물 선별
앞선 Virtual docking modeling 및 생화학적 결과를 기반으로, HSPA1L C-말단의 SBD 내 430번 페닐알라닌을 포함하는 가상 구조의 활성포켓에 결합하는 저분자 화합물들을 Zinc database의 화합물 라이브러리(10,292,210개 화합물)를 활용하여 virtual 스크리닝하였다. 최종 스크리닝을 통해, 가장 좋은 결합 친화성(affinity)과 안정적인 docking pose를 나타내는 22종류의 후보 화합물을 선별하였다.
선별된 22개의 화합물들의 활성을 확인하기 위해, 바이오에세이 (bioassay) 시스템을 구축하였으며, NanoBit protein-protein interaction (NanoBit PPI) 시스템을 활용하여 HSPA1L와 METTL21A의 결합을 정량화할 수 있는 최적 조합을 확인하였다.
그 결과, 도 7A와 같이 HSPA1L와 METTL21 각각의 N-말단에 NanoBiT protein이 융합되었을 때 최적 결합 활성이 확인되었다.
상기 결과를 바탕으로 유전공학적 방법을 이용하여 HSPA1L와 METTL21 각각의 N-말단에 SmBiT 및 LgBiT가 융합된 HSPA1L와 METTL21를 안정적으로 발현하는 HEK293 stable 세포주(HEK293/pSmBiT-HSPA1L/WT & pLgBit-METTL21AWT)를 제작하였다. 상기 세포주는 HSPA1L와 METTL21A를 타겟팅하는 화합물을 HTS로 스크리닝하는데 활용될 수 있다.
상기 세포주에 22개 후보 화합물을 처리하고 상기 화합물들의 HSPA1L와 METTL21간의 결합 억제 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 7B와 같이 22개의 후보 화합물 중 20번 화합물이 HSPA1L와 METTL21간의 결합을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, FLAG 태그된 HSPA1L와 MYC 태그된 METTL21A 야생형 단백질들을 HEK293T 세포에서 공발현시키고 화합물들을 24시간 처리한 후, 상기 세포추출물을 항 FLAG M2 친화성(affinity) 젤(gel)로 면역침강한 후 항 MYC 항체로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
그 결과, 도 7C와 같이 화합물 20이 HSPA1L와 METTL21A 상호간 결합을 억제하는 효과를 나타내는 것이 확인되었다.
또한, 도 8A 및 도 8B와 같이 화합물 20과 유사체 20-3이 HSPA1L의 SBD과 낮은 결합 에너지 값을 나타내었으며 안정적인 docking pose를 나타내었다.
상기 결과로부터 HSPA1L와 METTL21A 결합을 특이적으로 억제하는 화합물로 도 8의 화합물들을 1차 선별하였다.
<실시예 5> HSPA1L-METTL21A 결합 억제 화합물의 in vitro 항암 효과 확인
앞선 실험에서 선별된 화합물들이 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해, 화합물 20 및 화합물 20-3의 세포 생존율과 암세포에 대한 이동 및 전이 억제 효과를 확인하였다.
화합물들이 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위해, MTS assay 분석을 수행하였다. CCD841_CoN, HEK293, HCT116, DLD1 세포를 96 웰 배양 플레이트에 전 날, 분주한 후 세포 밀도가 약 70-80% 될 때 화합물 1, 20, 20-2, 20-3 각각을 농도별로 전체 배지에 섞은 후 100μl/well로 배지 교체하여 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후 CCK assay (D-Plus™ CCK cell viability assay kit, 동인LS)를 이용해서 살아있는 세포의 양을 정량화하였다.
그 결과, 도 9A와 같이 화합물 20-3이 정상세포에서는 세포독성이 나타내지 않은 반면, 암세포의 생존율을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, HCT116 및 SW480 세포에 화합물 1, 20, 20-2, 20-3 및 20-10을 25μM 농도로 처리하고 세포 이동 분석 (migration assay) 및 전이 분석 (invasion assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 9B와 같이 화합물 20-3의 암세포 이동 및 전이 억제 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 화합물 20-3이 정상세포에는 영향을 나타내지 않고 암세포 특이적으로 영향을 나타내는 것이 확인됨에 따라, 화합물 20-3을 최종 선별하였다.
상기 실험을 통하여 최종 선별된 화합물 20-3을 SW480 세포에 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 μM 농도로 처리하였다. 처리 후, 세포의 이동능 및 종양 성장능을 확인하였다.
그 결과, 도 10과 같이 화합물 20-3은 세포 독성에 영향을 주지 않으며, 대장암 세포의 이동 및 종양 형성을 농도 의존적으로 감소시키는 것이 확인되었다.
<실시예 6>
HSPA1L-METTL21A 결합 억제 화합물의 in vivo 항암 효과 확인
DLD1/Luc 세포 2×106 개를 8주령 Balb/c 누드 마우스의 맹장(cecum)에 이식하여 이종 이식 마우스 모델 (Orthotopic xenograft mouse model)을 제작하고, 암생성 2주 후부터, 화합물 20-3을 50 mg/kg 농도로 주 3회 주사하여 총 24회 주사하였다. 실험 종료 후 종양을 분리하여 무게를 측정하였으며, 실험동물의 체중 및 종양 크기는 매주 측정하였다.
그 결과, 도 11과 같이 화합물 20-3은 동물 모델의 암세포 성장을 억제시킨 반면, 실험 진행과정 동안 쥐의 체중에는 어떠한 영향도 미치지 않았다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
[화학식 1]
화학식 1에 있어서,
상기 R1은 수소, 페닐, 벤질, (C1 내지 C4)사이클로헥센, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 트리플루오로메틸페닐로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
상기 R2 및 R3 은 각각 동일하거나 다르며, 수소, (C1 내지 C4)페닐, (C1 내지 C4)인다졸, 벤조티아졸, 페닐티아졸, (C1 내지 C4)피페리딘 및 피리딘으로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는, R2 와 R3 가 서로 결합하여 5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H) 고리를 형성하는 것이고,
상기 R4는 벤조[c][1,2,5]티아디아졸, 벤조[c][1,2,5]옥사디아졸, (C1 내지 C4)알킬-1H-인다졸, 벤조[d][1,3]디옥솔, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 (C1 내지 C4)알킬페닐으로 이루어진 군에서 선택되며, *는 카이랄 센터를 의미함. - 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1에서
R1은 페닐, 벤질, 디메틸사이클로헥센, 메톡시페닐 또는 (트리플루오로메틸)페닐이고,
R2 및 R3 은 각각 동일하거나 다르며, 수소, 디메틸페닐, 에틸페닐, 메틸-1H-인다졸-4-일, 벤조[d]티아졸-2-일, 페닐티아졸-2-일, 메틸피페리딘-4-일 또는 피리딘-4-일이고, 또는 R2 와 R3 가 서로 결합하여 5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H)인 것이고,
R4는 벤조[c][1,2,5]티아디아졸, 벤조[c][1,2,5]옥사디아졸, 메틸-1H-인다졸, 벤조[d][1,3]디옥솔, 메톡시페닐 또는 메틸페틸인 것을 특징으로 하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물. - 청구항 1에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 α-[(2,1,3-벤조티아디아졸-4-일설포닐)아미노]-N-(3,5-디메틸페닐)-벤젠아세트아미드{α-[(2,1,3-benzothiadiazol-4-ylsulfonyl)amino]-N-(3,5-dimethylphenyl)-benzeneacetamide}, α-[(2,1,3-벤조티아디아졸-4-일설포닐)아미노]-N-(3-에틸페닐)-벤젠아세트아미드{α-[(2,1,3-benzothiadiazol-4-ylsulfonyl)amino]-N-(3-ethylphenyl)-benzeneacetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]티아디아졸-4-설폰아미도)-N-(1-메틸-1H-인다졸-4-일)-2-페닐아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]thiadiazole-4-sulfonamido)-N-(1-methyl-1H-indazol-4-yl)-2-phenylacetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-설폰아미도)-N-(1-메틸-1H-인다졸-4-일)-2-페닐아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]oxadiazole-4-sulfonamido)-N-(1-methyl-1H-indazol-4-yl)-2-phenylacetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]티아디아졸-4-설폰아미도)-N-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-페닐아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]thiadiazole-4-sulfonamido)-N-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2-phenylacetamide}, 2-(1-메틸-1H-인다졸-7-설폰아미도)-2-페닐-N-(4-페닐티아졸-2-일)아세트아미드{2-(1-methyl-1H-indazol-7-sulfonamido)-2-phenyl-N-(4-phenylthiazol-2-yl)acetamide}, 2-(벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-설폰아미도)-2-(3,3-디메틸사이클로헥-1-엔-1-일)-N-(1-메틸피페리딘-4-일)아세트아미드{2-(benzo[c][1,2,5]oxadiazole-4-sulfonamido)-2-(3,3-dimethylcyclohex-1-en-1-yl)-N-(1-methylpiperidin-4-yl)acetamide}, 2-(벤조[c][1,3]디옥솔-5-설폰아미도)-2-(4-메톡시페닐)-N-(피리딘-4-일)아세트아미드{2-(benzo[d][1,3]dioxole-5-sulfonamido)-2-(4-methoxyphenyl)-N-(pyridin-4-yl)acetamide}, 2-(4-메톡시페닐설폰아미도)-N-(피리딘-4-일)-2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)아세트아미드{2-(4-methoxyphenylsulfonamido)-N-(pyridin-4-yl)-2-(4-(trifluoromethyl)phenyl)acetamide}, N-(2-(3-메틸-5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-2-옥소-1-페닐에틸)벤조[c][1,2,5]티아디아졸-4-설폰아미드{N-(2-(3-methyl-5,6-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl)-2-oxo-1-phenylethyl)benzo[c][1,2,5]thiadiazole-4-sulfonamide}, 4-메틸-N-(2-(3-메틸-5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-2-옥소-1-(4-(트리플루오로메틸)페닐)에틸)벤젠설폰아미드{4-methyl-N-(2-(3-methyl-5,6-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl)-2-oxo-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)ethyl)benzenesulfonamide} 및 N-(1-(3-메틸-5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸[4,3-a]피라진-7(8H)-일)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-설폰아미드{N-(1-(3-methyl-5,6-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazole-4-sulfonamide}로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 암세포 내 METTL21A-HSPA1L 결합을 억제시키는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암질환은 대장암, 췌장암, 삼중유방암, 폐암, 간암, 위암, 갑상선암, 전립선암 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품.
[화학식 1]
화학식 1에 있어서,
상기 R1은 수소, 페닐, 벤질, (C1 내지 C4)사이클로헥센, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 트리플루오로메틸페닐로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
상기 R2 및 R3 은 각각 동일하거나 다르며, 수소, (C1 내지 C4)페닐, (C1 내지 C4)인다졸, 벤조티아졸, 페닐티아졸, (C1 내지 C4)피페리딘 및 피리딘으로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는, R2 와 R3 가 서로 결합하여 5,6-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-7(8H) 고리를 형성하는 것이고,
상기 R4는 벤조[c][1,2,5]티아디아졸, 벤조[c][1,2,5]옥사디아졸, (C1 내지 C4)알킬-1H-인다졸, 벤조[d][1,3]디옥솔, (C1 내지 C4)알콕시페닐 및 (C1 내지 C4)알킬페닐으로 이루어진 군에서 선택되며, *는 카이랄 센터를 의미함. - 청구항 6에 있어서, 상기 암질환은 대장암, 췌장암, 삼중유방암, 폐암, 간암, 위암, 갑상선암, 전립선암 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품.
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