KR20030019372A - 암세포의 증식 억제 및 세포사멸 유도 방법 - Google Patents

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KR20030019372A
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Abstract

본 발명은 선암종 암세포의 증식을 감소시키거나, 또는 선암종 암세포의 세포사멸을 유도하거나, 또는 선암종 암세포를 비-암세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 그러한 일 방법은 선암종 암세포를, 류코트리엔(leukotriene) B4 수용체에 대한 류코트리엔의 결합을 억제하기 위한 유효량의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 일 방법에서, 상기 방법은 상기 선암종 암세포를 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화합물, 또는 협동작용물(congener)을 상기 선암종 암세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 검체의 선암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 방법은 상기 검체에 류코트리엔 B4 수용체에 대한 류코트리엔의 결합을 억제하기 위한 유효량의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 방법은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화합물, 또는 협동작용물을 상기 검체에 투여하는 단계를 포함한다.

Description

암세포의 증식 억제 및 세포사멸 유도 방법 {Methods for inhibiting proliferation and inducing apoptosis in cancer cells}
췌장암 (pancreatic cancer) 은 종양학자들에게는 가장 파악하기 어렵고, 공격적인 악성 종양 질환이다 (Parker et al., "Cancer Statistics. 1996,"CA Cancer J. Clin., 46 : 5 - 27 (1996) ("Parker"). 현재 미국내 남성과 여성의 암사망 원인 중 4번째를 차지하고 있으며 지난 20년간 발병률이 급격히 증가하고 있다(Parker ; Trede et al., "췌장절제 술 이후의 생존 (Survival After Pancreaticoduodenectomy) : 수술중 사망 없이 118 번의 연속적인 절제술 (118 consecutive Resections Without an Operative Mortality) "Ann. Surg., 211 : 447 - 458 (1990) ; Cameron et al., "사망 위험없는 145 번의 연속적인 췌장절제술 (One Hundred and forty-five Consecutive Pancreaticoduodenectomies Without Mortality),"Ann. surg., 217 : 430 - 438 (1993) : Horward, " 췌장 선암종 (Pancreatic Ademocarcinoma), "Curr. Prob. in Cancer, 20 : 286 - 293 (1996)("Horward") ; Poston et al., Gut. biology of Pancreatic cancer, 32 : 800 -812 (1991) ("Poston") ; 및 Black et al., " 췌장암 치료법 : 현재의 한계, 미래의 가능성들, "Oncology, 10 : 301 - 307 (1996) ("Black")).
췌장암은 미국내에서 연간 27,000 명의 사망원인이 되고 있다. 초기 진단법의 부족과 열악한 치료법으로 인해 지난 5 년간 췌장암 환자의 겨우 2% 만이 생존하였고 췌장암 진단이후 평균 수명률은 6 개월 이하인 것으로 나타났다 (Horward ; Poston; 및 black).
대장암은 미국내에서 2 번째로 발병률이 높다 (Doll et al., " 흡연과 관련된 사망 : 영국인 남성 의사를 대상으로 한 20년간의 연구,"BMJ, 2 : 1525 - 1536 (1976) ; Hruban et al., " 암과 미세전이에 대한 분자적 진단,"Adv. Anat. Pathol., 5 : 175 - 178 (1998) ("Hruban") ; Figueredo et al., " 완전 절제술이후 2 단계 대장암에 대한 보조 치료법. 지방 위장관련 질병 모임 (Adjuvant Therapy for Stage II Colon Cancer After Complete Resection. Provincial Gastrointestinal Disease Site Group),"Cancer Prev. Control, 1 : 379 - 92 (1997) ("Figueredo") ; Ness et al., "대장암의 말기 : 테스트 환자 그룹을 통한 동정과 설명 (Outcome States of Colorectal Cancer : Identification and Description Using patient Focus Groups), "Am. J. Gastroenterol., 93 : 1491 - 7 (1998) ("Ness") ; Trehu et al., " 대장암에 대한 스크리닝 (Screening) 비용 : 대량 스크리닝 프로그램의 결과와 그에 대한 연구 보고서,"South Med. J., 85 : 248 - 253 (1992) ; Wingo et al., " 암 통계학(Cancer Statistics),"CACancer J. Clin.,45 : 8 - 30 (1995) ("Wingo")). 대장암은 138,000명 이상의 환자가 존재하며 미국내에서 연간 55,000명 이상이 사망하는 원인이 된다 (Wingo). 대장암 환자의 약 70% 가 간으로의 전이가 일어나는데 이는 수술중 발견하기 어려운 미세한 전이가 존재하다는 것을 뜻한다 (Hruban; Figueredo; 및 Ness). 게다가 전이성 암의 경우 종종 일반적인 화학요법술에 대한 반응성을 보이지 않아 실패율이 높게 나타난다 (Figueredo 및 Ness). 진행중이거나 비 절제 대장암 환자의 일반적인 화학요법 치료제에 대한 반응성은 26 내지 44 % 까지 다양한다. 예를 들어, 간 전이가 일어난 대장암 환자의 1/3 이하만이 5-FU와 루코보린 (leucovorin) 에 반응을 나타낸다(Id.).
유방암의 경우 미국내에서 가장 발병률이 높은 암으로 연간 275,000명 이상의 여성들이 선고를 받는다 (Richards et al., " 유방암환자의 생존률 대한 영향 : 체계적인 보고서, " Lancet, 353 : 1119 -26 (1999) ; Norton, " 보조적인 유방암 치료법: 현재의 상황과 미래 전략 -- 유방암에 대한 증식 역학과 향상된 약물 치료법,"Semin. Oncol., 26 : 1 - 4 (1999) : Morrow et al., " 유방암 치료기술에 대한 최근의 논의, "Curr. Probl. Surg., 36 : 163-216 (1999) ; and Ruppert et al., " 유방암에 대한 유전자 치료법 전략,"Breast Cancer Res. Treatement, 44 : 93 - 114 (1997)). 비록 지난 5년간 유방암 환자의 생존률이 80% 이상 증가하였으나 해마다 77,000 명 이상의 여성들이 사망하고 있다(Id.).
따라서, 췌장암, 대장암, 및 유방암에 대한 화학요법제들은 특히 전이성과 비절제 암의 억제에 높은 유용성이 요구된다.
-발명의 요약-
본 발명은 선암종 암세포의 증식을 감소시키거나 선암종 암세포의 세포사멸을 유도하거나 또는 선암종 암세포를 비-암 세포로 분화시키는 방법과 관련된 것이다. 선암종 세포를 포함하는 샘플을 류코트리엔 B4 수용체와 결합하는 류코트리엔 B4의 결합력을 저해하는 조건 하에서 화합물과 결합한다.
본 발명은 피검자의 선암종 세포를 다루는 방법이다. 이 방법은 류코트린 B4의 류코트린 B4 수용체에 대한 결합력 저해에 효과적인 화합물의 적정량을 검에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 선암종 암세포의 증식을 감소시키거나, 선암종 암세포의 세포사멸을 유도하거나, 선암종 암세포의 비-암 세포로의 분화를 유도하는 것과 관련된 것이다. 이 방법은 선암종 암세포를 포함하는 샘플이 하기 화학식I 또는 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물로 이루어진 조합물과 결합하는 것을 포함한다.
[화학식 I]
여기서, R1은 C1-C5알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)티오, 할로, 또는 R2-치환형 페닐이고;
R2및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4알킬, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)-S(O)q-, 트리플루오로메틸, 또는 디-(C1-C3알킬)아미노이고;
X는 -O-, -S-, -C(=O), 또는 -CH2-, 및 Y는 -O-, 또는 -CH2- ; 또는 함께 선택될때, -X-Y-는 -CH=CH- 또는 -C≡C-이고;
Z는 직쇄 또는 측쇄의 C1-C10알킬리데닐이고,
A는 결합, -O-, -S-, -CH=CH-, 또는 -CRaRb-이고, 여기서, Ra및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-C5알킬, 또는 R7-치환형 페닐이거나, 또는 Ra및 Rb가 탄소 원자와 함께 부착되어 선택될때, C4-C8사이클로알킬 환을 형성하고; R4는 R6또는 R4는 하기 화학식들 중 하나를 갖는 잔기이고,
,
,
,
,
, 또는
, 및
여기서, 각각의 R6은 독립적으로 -COOH, 5-테트라졸일, -CON(R9)2, 또는 -CONHSO2R10이고;
각각의 R7은 수소, C1-C4알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, 벤질, 메톡시, -W-R6, -T-G-R6, (C1-C4알킬)-T-(C1-C4알킬리데닐)-O-, 또는 히드록시이고,
R8은 수소 또는 할로이고;
각각의 R9는 독립적으로 수소, 페닐, 또는 C1-C4알킬이거나 또는 R9는 그들이 질소 원자와 함께 부착되어 선택될때, 모르폴리노, 피페리디노, 피페라지노, 또는 파이롤리디노 군을 형성하고;
R10은 C1-C4알킬 또는 페닐이고;
R11은 R2, -W-R6, 또는 -T-G-R6이고;
각각의 W는 결합 또는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고,
각각의 G는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고,
각각의 T는 결합, -CH2-, -O-, -NH-, -NHCO-, -C(=O)-, 또는 -S(O)q-이고;
K는 -C(=O)- 또는 -CH(OH)-이고;
각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
p는 0 또는 1이며;
t는 0 또는 1이고;
이때, X가 -O- 또는 -S-일때, Y는 -O-가 아니고;
또한, A가 -O- 또는 -S-일때, R4는 R6이 아니고;
또한, A가 -O- 또는 -S-이고 Z가 결합일때, Y는 -O-가 아니고;
또한, p가 0일때, W는 결합이 아니다.
본 발명은 또한 검체의 선암종 세포의 치료에 관한 것이다. 이 방법은 검체에 대한 화학식 I 의 화합물의 치료학적 유효량 또는 약제학적으로 허용되는 염 이나 용매 화합물의 투여 방법을 포함한다.
본 발명은 일반적으로, 암세포의 증식을 감소시키거나 또는 암세포의 세포사 멸 (apoptosis) 을 유도하거나 또는 암세포를 비-암 세포로의 분화를 유도하는 방법, 및 검체에서 선암 종(adenocarcinoma) 을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1A 및 1B은 LTB4 수용체의 길항체인 LY293111 가 췌장 암세포인 MiaPaCa-2 에 대한 티미딘 흡입 실험상에서의 농도 구배에 의한 저해 효과 (도 1A)와 시간구배에 따른 효과 (도 1B)를 나타내는 막대 그래프이다. 결과는 대조구 (control) 에 대한 퍼센트로 나타내었고 ; 대조구와 비교하여 * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 이고 ; 4 번의 독립적인 실험에 의한 결과이다.
도 2는 MiaPaCa-2 췌장암 세포의 세포 수에 대한 LY293111 의 효과를 시간별로 보여주는 그래프이다. 세포에 500 nM LY293111 을 24, 48, 및 72 시간 동안 처리하고 그 결과는 한 웰(well)당 비교 세포수로 나타내었다 (실선, ■). 대조구 또한 나타내였다 (점선, ▲). 대조구와 비교하여 * = p < 0.05 이고; ** = p < 0.01 이며 ; *** = p < 0.001 이다. 4 번의 독립된 실험을 통한 결과를 나타낸다.
도 3A - 3D는 위상차 현미경의 사진이다. 도 3B는 대조구 MiaPaCa-2 췌장암 세포 (도 3A)와 비교하여 12시간 동안 MiaPaCa-2 췌장암 세포에 250 nM LY293111 을 처리하여 유도된 세포 형태의 변화를 나타낸다. 도 3D는 대조구 LoVo 대장암 세포 (도 3C) 와 비교하여 250 nM LY293111을 처리하여 유도된 LoVo 대장암 세포의 형태 변화를 보여준다.
도 4A와 4B는 LTD4 길항체, LY171883를 다른 농도로 48 시간동안 처리한 MiaPaCa-2 췌장암 세포 (도 4A) 와 HPAF (도 4B)에 대한 티미딘 흡입 실험에 대한 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 대조구에 대한 퍼센트로 나타내고; 대조구와 비교하여 * = p < 0.05 이고 ; ** = p < 0.01 이며 ; *** = p < 0.001 이다. 4 번의 독립된 실험을 통한 결과를 나타낸다.
도 5 A는 24 시간동안 MiaPaCa-2 세포에 LTB4를 다른 농도로 처리한 후 티미딘 흡입실험에 대한 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 5B와 5C는 MiaCaPa-2 세포(도 5B)와 HPAF 세포 (도 5C)에 대해 100 nM의 LTB4를 24, 48, 및 72 시간동안 처리하고 티미딘 흡입실험에서의 효과를 나타낸 막대 그래프이다. 티미딘 흡입에 대한 결과는 cpm 으로 나타내었고 ; 대조구와 비교하여 * = p < 0.05 이 고 ; ** = p < 0.01 이며 ; *** = p < 0.001 이다. 4 번의 독립된 실험을 통한 결과를 나타낸다.
도 6A 와 6B 는 24 시간동안 100 nM LTB4를 처리한 췌장암 세포 MiaPaCa-2 (도 6A)와 HPAF (도 6B)에 대한 250 nM LY293111의 자극 효과를 나타낸다. 결과는 대조구에 대한 퍼센트로 표현한다. 대조구와 비교하여 * = p < 0.05 이고 ; ** = p < 0.01 이며 ; *** = p < 0.001 이다. 4번의 독립된 실험을 통한 결과를 나타낸다.
도 7은 LY293111에 의해 유도된 MiaPaCa-2 세포의 사멸에 의한 DNA 절단화를 보여주는 아가로즈 겔 전기 영동의 사진이다. 세포에 250, 500, 및 1000 nM LY293111을 48 시간동안 처리하였다. 전체 세포 DNA 를 1.8% 아가로즈로 분리하여 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 결과는 3 번의 독립된 실험에 의한 것이다.
도 8A - 8C는 48 시간동안 250 nM (도 8B)와 500 nM (도 8C)의 LY293111를 처리한 MiaCaPa-2 췌장암 세포의 터널 정량법 (TUNEL assay)을 보여주는 그래프이다. 오른쪽 위 사분면의 형광 물질 증가는 절단된 DNA의 UTP 표식에 기인하고, 결과는 세번의 독립된 실험에 의한 것이다.
도 9A - 9F는 췌장암과 대장암세포주들의 증식에 대한 LY293111의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 도 9A, 9C, 및 9D는 각각 췌장암 세포 MiaPaCa 2, HPAF 와 Capan 2에 대한 LY293111의 적량 효과를 보여준다. 도 9B는 췌장암 세포 MiaPaCa-2에 대한 LY293111의 시간별 효과에 대해 보여준다. 도 9E와 9F는 췌장암 세포 MiaPaCa-2 (도 9E)와 대장암 세포 LoVo (도 9F)에 대한 0.5 uM LY293111의 시간별 세포 수에 대한 효과를 보여준다.
도 10A와 10B는 각각 MCF-7 유방암 세포에서의 Bcl-2의 발현에 대한 LTB4와 LY293111의 효과를 특수 단백 검출 검정법 (Western blots)으로 보여주는 사진이다.
도 11은 인간 췌장 세포 AsPc-1을 이종 이식시킨 생쥐의 암세포 부피를 LY293111을 경구 투여한 경우 (▲)를 대조구 (●)와 처리 시간별로 비교한 그래프이다.
본 발명은 선암종 암세포의 증식 감소, 선암종 암세포의 세포사멸 유도 및 선암종 암세포의 비-암 세포로의 분화 유도 방법과 관련된 것이다. 이 방법은 선암종 암세포를 포함하는 샘플을 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 결합을 억제하는 화합물과 접촉하게 하는 방법이다.
"저해" 와 이의 다른 형태들 (예; 저해하는 )은 어느정도 까지의 모든 저해(예; 약 20 % 이상, 약 30 % 이상, 약 40 % 이상, 약 50 % 이상, 약 60 % 이상, 약70 % 이상, 약 80 % 이상, 약 90 % 이상, 약 99 % 이상 )와 완벽한 억제(100 % 저해)를 포함하는 뜻이다.
류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 저해하는 기작은 본 발명의 적용에 실질적으로 중요하지 않다. 저해는 화합물이 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 직접적으로 방해 (예; 류코트리엔 B4 수용체에 직접 결합함으로써 저해는 하기에 보다 자세히 설명함) 하거나 간접적으로 류코트리엔 B4 및/ 또는 류코트리엔 B4 수용체의 합성을 방해하는 화합물인 경우로 하기에 보충 설명한다.
예를 들어, 화합물이 류코트리엔 B4 수용체와 결합하여 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4가 결합하는 것을 저해할 수 있다. 바람직하게, 류코트리엔 B4 수용체에 화합물의 결합이 특이적이어서 샘플내에 존재하는 다른 생물학적 물질에 실질적으로 결합할 수 없다. 예를 들어, 류코트리엔 B4 수용체에 대한 화합물의 IC50이 샘플내 모든 다른 생물학적 물질에 대한 화합물의 IC50보다 약 1.1 배 이상바람직하고, 좀 더 바람직하게, 1.5배 이상, 좀더 바람직하게는 2배 이상, 5배 이상, 좀더 바람직하게는 10배 이상이다. 류코트리엔 B4 수용체에 대한 화합물의 결합력은 류코트리엔 B4 수용체에 결합하는 류코트리엔 B4의 결합력이 낮은 상황 (즉, 낮은 IC50을 갖음) 에서 바람직한 효과를 얻을 수 있음에도 류코트리엔 B4 수용체에 대한 화합물의 결합력은 류코트리엔 B4 수용체에 결합하는 류코트리엔 B4의 결합력보다 오히려 높다 (즉, 높은 IC50을 갖음).
여기서 사용하는 용어 "결합"은 비가역적 결합과 가역적 결합을 포함하는 의미이다. 결합은 열역학적 힘(예; 바람직한 평형상수)이나 동력학적 이유(예; 바람직한 시작/종결 속도 상수)의 결과이고 화학 작용(예; 공유 결합, 이온 결합, 수소 결합, 반데르 발스 결합, 킬레이션(chelation), 파이-시그마(pi-sigma) 결합 및/또는 파이-파이(pi-pi) 결합이나 물리적 작용(예; 표면 현상, 포착등)에 의한 결과일 수 있다. 명세서에서 사용하는 결합 파트너와 화합물의 "결합"(예; 화합물과 류코트리엔 B4 수용체의 결합)에서의 "결합"은 또한 화합물과 그 결합 파트너의 생리학적 역할을 수행하기 위한 능력을 떨어뜨리는 결과를 수반하는 모든 상호작용도 포함하는 뜻이다. 예를 들어, 결합 파트너가 류코트리엔 B4 수용체이면, 화합물과 류코트리엔 B4 수용체의 "결합" 은 물리적, 화학적, 및/또는 류코트리엔 B4 수용체가 류코트리엔 B4에 결합하는 능력을 떨어뜨리는 어떠한 변화도 수반할 수 있는 상호작용 또는 그러한 작용들의 조합을 포함하는 뜻이다. 다양한 화합물들은 류코트리엔 B4 수용체와 결합하여 류코트리엔 B4가 류코트리엔 B4 수용체에 결합하는 것을 저해하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 화합물은 하기의 화학식 I 또는 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화합물을 포함한다 :
R1은 C1-C5알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)티오, 할로, 또는 R2-치환형 페닐이다. R2및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4알킬, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)-S(O)q-, 트리플루오로메틸, 또는 디-(C1-C3알킬)아미노이다. X는 -O-, -S-, -C(=O), 또는 -CH2-, 및 Y는 -O-, 또는 -CH2- ; 또는 함께 선택될 때, -X-Y-는 -CH=CH- 또는 -C≡C-이다. Z는 직쇄 또는 측쇄의 C1-C10알킬리데닐이다. A는 결합, -O-, -S-, -CH=CH-, 또는 -CRaRb-이고, 여기서, Ra및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-C5알킬, 또는 R7-치환형 페닐이거나, 또는 그들이 탄소 원자와 함께 부착되어 선택될때, C4-C8사이클로알킬 환을 형성한다. R4는 R6(하기에 정의됨) 또는 R4는 하기 화학식들 중 하나의 잔기를 취한다.
,
,
,
,
, 또는
.
각각의 R6은 독립적으로 -COOH, 5-테트라졸일, -CON(R9)2, 또는 -CONHSO2R10이다. 각각의 R7은 수소, C1-C4알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, 벤질, 메톡시, -W-R6, -T-G-R6, (C1-C4알킬)-T-(C1-C4알킬리데닐)-O-, 또는 히드록시이다. R8은 수소 또는 할로이다. 각각의 R9는 독립적으로수소, 페닐, 또는 C1-C4알킬이거나 또는 R9는 그들이 질소 원자와 함께 부착되어 선택될때, 모르폴리노, 피페리디노, 피페라지노, 또는 파이롤리디노 군을 형성한다. R10은 C1-C4알킬 또는 페닐이다. R11은 R2, -W-R6, 또는 -T-G-R6이다. 각각의 W는 1∼8개의 탄소 원자의 결합 또는 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이다. 각각의 G는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이다. 각각의 T는 결합, -CH2-, -O-, -NH-, -NHCO-, -C(=O)-, 또는 -S(O)q-이다. K는 -C(=O)- 또는 -CH(OH)-이다. 각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2이고; p는 0 또는 1이며; t는 0 또는 1이다. 되도록이며, X가 -O- 또는 -S-일때, Y는 -O- 가 아니고; A가 -O- 또는 -S-일때, R4는 R6이 아니고; A가 -O- 또는 -S-이고 Z가 결합일때, Y는 -O- 가 아니고; p가 0일때, W는 결합이 아니다.
"C1-C6알킬" 은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 2,2-디메틸프로필, 헥실, 및 이와 유사한 1 ∼ 6개의 탄소 원자의 직쇄와 측쇄 지방족 라디칼을 의미한다. "C1-C3일킬", "C1-C4알킬", 그리고 "C1-C5알킬" 의 용어도 이러한 정의에 포함된다. "C2-C5알케닐"은 -CH=CH2, -CH2-CH=CH2, -CH2-CH2-CH=CH2, -CH-C(CH3)=CH2, -CH2-CH=C(CH3)2, 및 이와 유사한 단일 이중 결합을 포함하는 2 ∼ 5 개의 탄소들의 직쇄와 측쇄 지방족 라디칼을 의미한다. "C2-C5알키닐"은 -C ≡CH, -CH2-C ≡CH, -CH2-CH2-C ≡CH, -CH2-CH(CH3)-C ≡CH, -CH2-C ≡C-CH3, 및 이와 유사한 단일 삼중 결합을 포함하는 2 ∼ 5 개의 탄소들의 직쇄와 측쇄 지방족 라디칼을 의미한다. "C1-C4 알콕시"는 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, sec-부톡시, 및 tert-부톡시를 의미한다. "할로"는 예를 들어, 프루오로, 클로로, 브로모, 및 요오드를 의미한다. "C1-C10알킬리데닐"은 -CH2-, -CH(CH3)-, -C(CH3)2-, -CH(C2H5)-, -CH2-CH2-, -CH2-CH(CH3)-, -CH(CH3)-CH2-, -CH(CH3)-CH(CH3)-, -CH2-CH(C2H5)-, -CH2-CH(C2H5)-CH2-, -CH2-CH2-CH(C2H5)-, -C(CH3)2-CH2-CH2-, -CH(CH3)-CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(CH3)2-CH2-CH2-, -CH2-C(CH3)2-CH2-, -CH2-CH2-CH(C2H5)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH(CH2)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -(CH2)10-, 및 이와 유사한 C1-C10알칸에서 유도된 2가 라디칼을 의미한다. "C1-C4알킬리덴"과 "C2-C4알킬리덴"도 이와 같은 정의에 포함된다. "C4-C8 사이클로알킬"은 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 4,4-디메틸사이클로헥실, 사이클로 헵틸, 사이클로옥틸, 및 이와 유사한 4 ∼ 8 개 탄소 원자의 사이클로알킬 환을 의미한다. "1 ∼ 8개 탄소의 직쇄 또는 측쇄 2가 하이드로카빌 잔기"는 1 ∼ 8 개 탄소원자의 직쇄 또는 측쇄 알칸, 알켄, 또는 알킨을 의미한다. 유기화학자에 의해 식별되듯이, 측쇄와 탄소 원자의 수에 따라 이와 같은 성분은 1,2, 및 3 개의 이중 또는 삼중결합 또는 이들의 조합을 같이 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이 용어는 선택적으로 1 ∼ 2개의 이중 또는 삼중결합, 또는 이들의 조합을 갖는 1 ∼ 8개의 탄소 원자를 포함하는 상기에서 정의한 알킬리덴 군을 의미한다.
전술한 바와 같이, 화학식 I의 화합물에 약제학적으로 허용 가능한 염기를 갖는 염 또한 사용할 수있다. 이와 같은 염은 암모니움과 알카리 및 알카리토 금속 히드록사이드, 카보네이트, 바이카보네이드 및 이와 유사한 무기 염기뿐 아니라 지방족과 방향족 아민, 지방족 디아민, 하이드록시 알킬아민 및 이와 유사한 염기유기 아민에서 유래된 염을 포함한다. 본 발명에서 실제로 사용하는 염을 제조하는데 유용한 염기는 수산화 암모니움, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 수산화칼슘, 메틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 사이클로헥실아민, 에탄올아민, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 칼륨과 나트륨 염기의 형태가 특히 바람직하다.
본 발명은 단일 염 형태, 즉 화학식 I과 염기를 1 : 1 비율로 조합한 화합물뿐 아니라 두개의 산 기를 갖는 화학식 I의 화합물을 포함하는 2가 염 형태의 사용도 포함한다. 아울러, 본 발명의 방법은 에탄올 용매 화합물, 수산화물, 및 그와 유사한 화학식 I 또는 그것의 염의 화합물의 용매화합물을 사용하여 실행할 수 있다.
측쇄 알킬, 알킬리데닐, 또는 하이드로카빌 작용기를 갖는 화합물과 여기에 이중 또는 삼중 결합, 다양한 입체 이성질체가 존재할 수 있다.
본 발명의 방법은 어떤 특이적 입체 이성질체에 한정되지 않고 모든 가능한 개별의 이성질체와 그것의 혼합물을 포함한다. 용어 "5-테트라졸릴"은 호변체, 즉, (1H)-5-테트라졸릴 및 (2H)-5-테트라졸릴을 의미한다.
본 발명의 방법의 실시에서 사용되는 실질적인 화합물들은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산, 3-(2-(3-(2-에틸-4-(4-플로오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)-6-(4-카복시-페녹시)페닐)프로피온산, 1-(4-(카복시메톡시)페닐)-1-(1H-테트라졸-5-일)-6-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)헥산, 3-(4-(7-카복시-9-옥소-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)-9H-크산틴))프로파논산, 5-(3-(2-(1-카복시)-에틸)-4-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)페닐)-4-펜티노익산, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매 화합물, 및 이들의 조합물을 포함한다.
선택적으로, 본 발명에서는 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매 화합물을 이용한다.
화학식 I의 화합물은 참고 문헌인 Baker et al.의 미국특허 제 5,462,953호및 Fleisch et al.의 미국특허 제 5,910,505호와 같이 기존에 확립된 방법에 의해 합성하였다.
그 자체가 류코트리엔 B4 수용체와 결합하여 류코트리엔 B4 수용체와 류코트리엔 B4의 결합을 저해하는 다른 화합물들은 다음에 기술된 다른 류코트리엔 B4 길항체들을 포함한다. Fleisch et al.의 미국특허 제 5,998,454호 ; Fleisch et al. 미국특허 제 5,914,340호 ; Fleisch et al. 미국특허 제 5,817,864호 ; Anderskewitz et al.의 미국특허 제 6,037,377호 ; Perchonock et al. " 5-아릴-4,6-디티아논아네디오 산과 관련 화합물의 유사물들의 합성과 구조-활성 관계 연구 : 새로운 종류의 류코트리엔 B4 길항체들,"J. Med. Chem., 29 ;1442-1452 (1986) ; Gleason et al., " 편집자와의 교신 (Communications to the Editor),"J. Med. Chem., 30 : 959-961 91987) ; Konno et al., " 새로운 종류의 류코트리엔 B4 길항체인 치환-페닐프로피온 산의 유사물들의 합성과 구조-활성 관계,"Adv. Prostaglandin Thromboxane leukot. Res., 21 A : 411-414 (1991) ; Daines etal., " (E)-3-[[[[6-(2-카르복시에테닐)-5-[[8-(4-메토시페닐)옥틸]옥시]-2-피리디닐]-메틸]티오]메틸]벤조산 : 새로운 높은 친화력을 갖는 류코트리엔 B4 길항체,"J. Med. Chem., 36(18) : 2703-2705 (1993) (J. Med. Chem.36(25) : 4130 (1993) 에 오식으로 발간됨) ; Showell et al., " 강력한 효능과 선택성이 있는 류코트리엔 B4 길항체 CP-195543의 임상 전의 약제학적 분석,"J. Pharmacol. Exp. Ther., 285(3) : 346-954 (1998) ; 및 Hullot et al., " 새로운 류코트리엔 B4 길항체 나트륨 (1S*, 3S*)-1-하이드록시-3-[(3R*S*, E)-3-하이드록시-7-페닐-1-헵텐-1-일]-1-사이클로헥산 아세테이트의 합성과 생화학적/약제학적 분석,"Arzneimittelforschung, 47(1) : 51-58 (1997), 상기문헌들은 본 발명에 참조 문헌으로 포함된다.
또한 류코트리엔 B4 수용체에 결합하여 류코트리엔 B4 수용체와 류코트리엔 B4의 결합을 저해하는 다른 화합물로 항체 (단일클론성 또는 다클론성)와 류코트리엔 B4 수용체를 인지하여 결합하는 미모토프(mimotope)와 같은 펩타이드 약제를 포함한다. 상기 항체와 미모토프을 제조하고 사용하는 방법은 당업자들에게 잘알려져 있으며 류코트리엔 A4 하이드로라제를 인식하여 결합하는 항체와 미모토프의 제작과 관련하여 하기에 기술한다.
선택적으로, 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4 의 결합은 예를 들어, 류코트리엔 B4에 결합하여 류코트리엔 B4 수용체에 결합할 수 없는 복합체를 형성하도록 하는 화합물을 이용하여 억제될 수 있다. 바람직하게는, 류코트리엔 B4에 대한 화합물의 결합은 특이적으로; 즉, 샘플내에 존재하는 다른 생물학적 물질에실질적으로 결합할 수 없는 화합물이다. 예를 들어, 화합물의 류코트리엔 B4 수용체에 대한 IC50이 샘플내 모든 다른 생물학적 물질에 대한 화합물의 IC50보다 약 1.1 배 이상이 바람직하고, 좀 더 바람직하게는 1.5배 이상, 좀 더 바람직하게는 2배 이상, 좀 더 바람직하게는 5배 이상이거나, 좀 더 바람직하게는 10배 이상이다. 류코트리엔 B4 수용체에 대한 화합물의 결합력은 류코트리엔 B4 수용체에 결합하는 류코트리엔 B4의 결합력이 낮은 상황(즉, 낮은 IC50을 갖음)에서 바람직한 효과를 얻을 수 있음에도 류코트리엔 B4 수용체에 대한 화합물의 결합력은 류코트리엔 B4 수용체에 결합하는 류코트리엔 B4의 결합력보다 오히려 높다(즉, 높은 IC50을 갖음).
또한 다른 방법으로, 류코트리엔 B4 수용체와 류코트리엔 B4의 결합은 류코트리엔 B4의 생성을 저해하여 억제할 수 있다. 류코트리엔 B4 의 생성은 예를 들어, 류코트리엔 B4 합성 경로의 하나 또는 그 이상의 단계를 저해하여 억제할 수 있다.
예를 들어, 류코트리엔 A4의 류코트리엔 B4로의 전환을 억제하는 화합물을 사용할 수 있다.
실질적으로, 류코트리엔 A4의 류코트리엔 B4로의 전환은 샘플을 류코트리엔 A4 하이드로라제에 의한 가수분해에 류코트리엔 A4보다 덜 민감하거나 민감하지 않은 복합체가 형성되도록 하는 류코트리엔 A4에 결합하는 화합물과 접촉시켜 억제할 수 있다.
또한 실질적으로, 류코트리엔 A4의 류코트리엔 B4로의 전환은 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성을 저해하는 화합물과 샘플을 접촉시켜 억제할 수 있다.
이 분야의 동상의 지식을 가진 자가 인식하는 바와 같이, 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성은 류코트리엔 A4 하이드로라제에 결합하는 화합물과 샘플을 접촉하여 억제할 수 있다. 이와 같은 전형적인 작은 분자거나 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 류코트리엔 A4 하이드로라제 저해제의 예로는 3-옥시라닐 벤조산 및 이의 유도체; Rhone-Poulenc Rorer RP-64996 ; 및 (2S) -2-아미노-3-페닐프로필 머캅탄, 2-아미노-3-(4'-벤질옥시)페닐프로필 머캅탄, 및 (2S) -3-(4-(2-나프틸메틸옥시)페닐)-1,2-디아미노-프로판 염산과 같은 2-아미노-3-페닐프로판 유도체, 및 이에 상응하는 4'-벤질옥시 유도체를 포함한다. 다른 류코트리엔 A4 하이드로라제 저해제들의 예는 다음과 같다. Djuric et al.의 미국특허 제 5,990,326호 ; Isakson et al.의 미국특허 제 5,990,148호 ; Yuan et al.의 미국특허 제 5,455,271호 : 국제 공개 특허 WO96/11192호와 WO96/1099호 ; Evan et al.,Prostaglandins, Leukotrienes and Medicine, 23 : 167 - 171 (1986) ; Yuan et al. " 큰쥐에서 류코트리엔 A4 하이드로라제 저해제 SC-57461의 대사산물의 분리와 동정,"Drug Metab. Dispos., 24(10) : 1124 - 1133 (1996) ; Tsuji et al., "류코트리엔 A4 하이드로라제 저해제, SA6541과 인도메타신의 쥐과의 카라지이난 (Carrageenan)-유도 피부염에 대한 효과,"Eur. J. Pharmacol., 346(1) : 81 - 85 (1998) ; 및 Penning et al., " 강력한 류코트리엔 A(4) (LTA(4)) 하이드로라제 저해제, 1-[2-(4-페닐페녹시)에틸]피로리딘 (SC-22716)에 대한 구조-활성 관계연구,"J. Med. Chem., 43(4):721 - 735 (2000), 상기문헌들을 본 발명의 참조문헌으로 포함한다.
류코트리엔 A4 하이드로라제 저해제는 또한 펩타이드 약제물의 형태일 수도 있다. 일반적으로, Bevan et al.,Trends in Biotechnology, 13(3) : 115 - 121 (1995); Sepetov et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 92 : 5426 - 5430 (1995) ; O'Connor et al.,Cancer Chemother. Pharmacol., 34 : 225 - 229 (1994) ; 및 Webber et al.,J. Med. Chem., 36 : 733 - 746 (1993), 상기문헌들을 본 발명의 참조문허으로 포함한다.
펩타이드 약제와 같은 약제들은 이 분야에서 알려진 다양한 방법을 이용해 제작할 수 있다. 에피토프 라이브러리 (epitope libraries)의 개발과 박테리오 파지 라이브러리 (bacteriophage libraries)의 바이오패닝(biopanning)을 이용한 방법같은 것이 있다. 간단히 말해, 다양한 단일클론성 항체에 대한 결합 부위를 결정하려는 시도를 통해 에피토프 라이브러리의 개발이 이루어진다. 참고 문헌, Parmley et al., Gene, 73 : 305 - 318 (1988)("Parmley") 에 박테리오파지 표면에 외래 에피토프를 발현시킬 수 있는 박테리오파지 발현 벡터 (bacteriophage expression vector)가 기술되었다. 이 벡터는 실질적으로 모든 가능한 짧은 펩타이드 서열(예 : 6개 아미노산)들을 갖는 거대한 박테리오 파지 집합체를 제작하는데 사용할 수 있다. Parmley에 의하면, 또한 특이적 항체를 사용하여 외래 에피토프를 발현하는 파지를 친화력을 이용하여 정제하는 방법인 바이오패닝에 대해 기술하고 있다. 예를 들어, Parmley ; Cwirla et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87 :6378 - 6382 (1990) ; Scott et al.,Science, 249 : 386 - 390 (1990); Cristian et al.,J. Mol. Biol., 227 : 711 - 718 (1992); 및 Smith et al.,Methods in Enzymology, 217 : 228 - 257 (1993) ("Smith") 상기 문헌들은 본 발명에 참조 문헌으로 포함된다.
에피토프 라이브러리의 개발 후, 상기 Smith의 참조 문헌은 Parmley의 박테리오파지 발현 벡터와 바이오패닝 기술을 주어진 길이의 모든 가능한 서열들의 에피토프를 확인하는데 사용하는것이 가능하다고 주장하였다. 이러한 에피토프 라이브러리의 바이오패닝에 의한 항체의 펩타이드 리간드(ligand) 확인이라는 개념은 백신 디자인, 에피토프 매핑 (mapping), 유전자의 동정, 및 다른 많은 응용분야에서 사용할 수 있다 (Parmley ; 및 Scott,Trends in Biochem. Sci., 17 : 241 - 245 (1992)).
에피토프 라이브러리와 바이오패닝을 이용하여, 에피토프 서열을 조사하는 연구자들은 연속적인 선형의 본래 서열을 확인할 수 없거나 또는 실제 자연계 단백질 서열에서는 나타나지 않는 서열들의 에피토프와 유사한 대체 펩타이드 서열을 찾아낸다. 이러한 유사 펩타이드들을 미모토프라 한다. 이러한 방법으로, 다양한 결합 부위/단백질들의 미모토프를 찾아내었다. 본 발명의 참조문헌으로 포함시킨, LaRocca et al.,Hybridoma, 11 : 191 - 201 (1992)에서는 대장균내에서 인간 가슴 상피 무친(mucin)의 직렬 반복무늬 미모토프 발현에 대해, Balass et al.,Proc. nat'l Acad. Sci. USA, 90 : 10638 -10642 (1993)("Balass")에서는 아세틸콜린 수용체의 형태 의존적 결합 부위와 유사한 헥사펩디드(hexapeptide)의 동정에 대해기술하고 있다. Hobart et al.,Proc. P. Soc. London. B, 252 : 157 - 162 (1993)에서는 C6 에피토프(보체의 6번째 구성성분에 대한 에피토프) 와 유사한 미모토프 분리에 대해 개시하고 있다.
정의에 의하면, 이들 및 다른 미모토프의 서열은 , 연속적인 선형의 본래 서열을 확인할 수 없거나 또는 예를 들어 자연계에 존재하는 단백질들처럼, 자연적으로 존재하는 분자에서는 어떤 형식으로든 실제로 존재하는 것이 아니다. 미모토프의 서열은 단지 자연계에 존재하는 단백질의 결합 부위와 기능적으로 유사한 펩타이드 형태일 뿐이다. 예를 들어, Balass가 기술한 미모토프의 경우 아세틸콜린 수용체의 결합부위와 유사하다.
많은 수의 이들 미모토프은 짧은 펩타이드들이다. 쉽게 대량 생산이 가능하고 자연계에 존재하는 서열( 예 : 결합 부위)과 유사한 짧은 펩타이드들의 유용성은 본 발명의 방법에서 활용할 수 있다.
예를 들어, 이 기술을 이용하여, 류코트리엔 A4 하이드로라제를 인식하는 단일 클론성 항체에 대한 미모토프을 동정할 수 있다. 이들 미모토프의 서열은 예를 들어, 류코트리엔 A4 하이드로라제에 결합하여 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성을 떨어뜨리는 펩타이드 약제와 같은 짧은 펩타이드를 의미한다. 미모토프가 결정되면 펩타이드 약제를 화학적으로 합성할 수 있다.
류코트리엔 A4 하이드로라제에 대한 항체는 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성을 저해하여 류코트리엔 A4의 류코트리엔 B4로의 전환을 저해하는데 유용한 또 다른 종류의 합성물을 의미한다. 여기서 "항체" 는 Fab, Fab2, 및 Fd 단편과 같은항체 단편 뿐 아니라 인체에 적응된 형태를 포함하는 것을 뜻한다. 인체에 적응된 형태의 항체는 키메라화(chimerization)와 같은 당 분야에서 알려진 방법중 하나를 이용해 생산할 수 있다. 이 항체는 류코트리엔 A4 하이드로라제에 결합하여 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성을 감소시킨다. 적합한 항체는 다클론성과 단일클론성 항체를 포함한다.
류코트리엔 A4 하이드로라제에 결합하는 단일클론성 항체는 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산할 수 있다. 하이브리도마는 특이적 단일클론성 항체를 분비할 수 있는 불멸의 세포주이다.
일반적으로, 다클론성 항체와 단일클론성 항체를 준비하는 기술과 적절한 항체를 생산한는 하이브리도마는 당 분야에서 잘 알려져 있다. Campbell,단일클론성 항체 기술: 생화학과 분자생물학의 실험 기술, 암스테르담, 네덜란드: 엘스비어 과학 출판사 (1984) ("Campbell"); 및 St. Groth et al.,J. Immunol. Methods., 35 : 1 - 21 (1980)등을 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다. 항체를 생산하는 것으로 알려진 어떠한 동물(생쥐, 토끼 등)을 류코트리엔 A4 하이드로라제 항원(또는 항원의 단편)으로 면역화시킨다. 면역화 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있다. 이들 방법은 피하 또는 복강내로 효소를 주사하는 것을 포함한다. 당업자들은 면역화된 동물, 효소의 항원성, 및 주사 부위에 기초하여 면역화를 위해 사용하는 효소의 적정량을 알고 있다.
면역원으로 사용되는 효소는 효소의 항원성을 증가시키기 위해 변형시키거나 보조약과 함께 투여할 수 있다. 효소의 항원성을 증가시키는 방법은 당 분야에서잘 알려져 있고, 이종 단백질(글로블린 또는 베타-갈락토시다제)을 항원과 결합시키거나 면역화동안 보조약을 첨가하는 것을 포함한다.
단일클론성 항체의 경우, 면역화시킨 동물의 비장 세포를 SP2/O-Ag 15 세포같은 골수종 세포와 융합하면 단일클론 항체를 생산한는 하이브리도마 세포가 형성된다.
당 분야에서 잘 알려진 방법 중 어떤 것도 바람직한 특징을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 확인에 이용할 수 있다. 이들 방법은 ELISA 검정법, 특수 단백 검출 검사, 또는 방사 면역 검정법을 이용한 하이브리도마 스크리닝을 포함한다. Lutz et al.,Exp. Cell Res., 175 : 109 - 124 (1998)을 본 발명의 참조문헌으로 포함한다.
바람직한 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 만들고 Campbell에서 기술한 당 분야에서 알려진 방법을 통해 원하는 부류와 하위 부류를 결정한다.
다클론성 항체의 경우, 항체를 포함한 혈청을 면역화시킨 동물에서 분리하고 바람직한 특이성을 갖는 항체가 존재하는 지를 상기에 기술한 방법을 통해 스크리닝한다.
또한 실질적으로, 류코트리엔 A4 의 류코트리엔 B4로의 전환은 샘플을 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 핵산 분자에 결합하는 핵산 합성물과 접촉시켜, 류코트리엔 A4 하이드로라제 발현을 감소시킴으로써 저해할 수 있다.
적절한 핵산 분자는 예를 들어 안티센스(antisense)와 라이보자임(ribozyme)을 포함한다. 안티센스는 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 mRNA의 적어도한 부분에 상보적이다. 류코트리엔 A4 하이드로라제의 핵산과 아미노산 서열은 알려져 있다. 예를 들어, Medina et al.,"생쥐의 류코트리엔 A-4 하이드로라제 cDNA 분자의 클로닝(cloning) 과 발현,"Biochem. Biophys. Res. Commun., 176 : 1516 - 1524 (1991) ; Minami, et al., " 인간 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 cDNA 분자의 클로닝: 아이코자노이드(eicosanoid)합성에 관련되는 효소의 완전한 일차 구조,"J. Biol. Chem., 262 : 13873 - 13876 (1987); Funk et al., " 클로닝과 류코트리엔 A4 하이드로라제의 아미노산 서열,"Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84 : 6677 - 6681 (1987) ; Mancini et al., "류코트리엔 A4 하이드로라제 유전자의 특징과 클로닝,"Eur. J. Biochem., 231(1) : 65 - 71 (1995); Makita et al., " 폴리머라제 연속 반응을 이용한 큰쥐의 류코트리엔 A4 하이드로라제의 클로닝과 기능적 발현,"FEBS Lett., 299(3) : 273 - 277 (1992); 유전자은행 번호 M63848 (생쥐의 mRNA 와 아미노산 서열), 유전자은행 번호 J03459, J02959, 및 U27393 (인간 mRNA와 아미노산서열); 및 유전자은행 번호 S87522(큰쥐의 mRNA와 아미노산 서열)을 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다. 안티센스는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 및 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 전체 mRNA 분자에 상보적(즉, 전체 분자와 같은 길이의 뉴클레오티드(nucleotide) 일 수 있다). 그러나 짧은 분자일 수록 바람직하다. 본 실시 예에 있어서, 안티센스는 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 전체 mRNA 분자의 한 부분에 상보적이다. 이들 짧은 안티센스는 전체 분자를 코딩하는 mRNA를 가수분해 할 수 있고 바람직하게, 적어도 15 뉴클레오티드와 최대 약 100 뉴클레오티드로 구성된다. 세포를 류코트리엔 A4 하이드로라제의 코딩하는 mRNA의 적어도 한 부분과 상보적인 RNA 또는 단일-가닥 DNA 안티센스와 접촉시켜(예; 안티센스를 샘플에 넣음) 류코트리엔 A4 하이드로라제의 양을 줄이는데 사용될 수 있다. 안티센스는 류코트리엔 A4 하이드로라제의 mRNA와 베이스(base) 결합할 수 있어, mRNA가 단백질로 번역되는 것을 방해한다. 따라서, 류코트리엔 A4 하이드로라제의 안티센스는 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 mRNA가 기능성의 류코트리엔 A4 하이드로라제로 번역되는 것을 막아서, 세포내의 류코트리엔 A4 하이드로라제 활성을 감소시킨다.
안티센스를 적절한 방법을 이용해 세포와 접촉시킨다. 본 발명의 방법에 따르면, 세포는 전립선 암 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 유방암 세포, 대장암 세포,및 췌장암 세포와 같은 선암종 세포들이다. 구체적으로, 상보적 RNA 분자를 직접 세포질내로 주입하면, 여기서 RNA의 번역이 방해된다. 또한 벡터를 세포내에 상보적 핵산 물질을 주입하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 벡터는 다양한 플라즈미드(plasmid)와 바이러스 유래 벡터들을 포함한다. 안티센스는 또한 리포좀(liposome)을 이용하여 세포내로 주입할 수 있다. 안티센스와 그것의 사용에 대한 일반적인 내용은 Han et al., Proc. Nat'l Acad. USA, 88 : 4313 - 4317 (1991)("Han"); 및 Rossi, British Medical Bulletin 51(1) : 217 - 225 (1995) 를 본 발명에 참조 문헌으로 포함한다.
라이보자임으로 알려진 안티센스 RNA 분자의 특별한 종류는 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 mRNA의 특정 부위에 상보적으로 인식가능한 염기서열을 가지고 있어서 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성을 저해하는데 이용할 수 있다.라이보자임은 상보적인 핵산 서열을 통해 목표 염기서열과 결합할 뿐 아니라, 주형 mRNA 분자의 가수 분해, 또는 분열을 촉진할 수있다.
세포내에서 라이보자임의 발현은 유전자 발현(류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현등)을 저해할 수 있다. 보다 구체적으로, 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 mRNA 부분을 인식하는 상보적 염기 서열을 갖는 라이보자임은 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현을 감소시키는데 이용할 수 있다. 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현이 높은 세포를 선택하고 라이보자임을 세포내로 주입한다. 세포내의 라이보자임은 일반적으로, 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 mRNA를 절단하여 번역이 이루어지지 않기 때문에, 세포내의 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현이 감소한다.
라이보자임은 모든 적절한 방법을 통해 본 발명의 방법에 따라서 암세포와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 라이보자임을 직접 세포질내로 주입시키면, 라이보자임은 mRNA를 절단하여 번역 작용을 방해할 수 있다. 다른 방법으로, 벡터를 이용하여 라이보자임을 세포내로 주입시킬 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 라이보자임을 코딩하는 DNA를 숙주 세포의 게놈(genome)내로 "삽입"할 필요는 없으며; 대신에, 예를 들어, 라이보자임-코딩 DNA 분자를 라이보자임을 발현하는 바이러스 유래 벡터를 숙주내로 침입시켜 발현시킬 수 있다. 라이보자임 분자는 또한 리보좀을 이용하여 세포내로 주입시킬 수 있다. 라이보자임과 그것의 이용에 대한 일반적인 내용은 Sarver et al.,Science, 247 : 1222 - 1225 (1990); Chrisey et al.,Antisense Research and Development, 1(1) : 57 - 63 (1991) ; Rossi et al.,AIDS Research and Human Retroviruses, 8(2) : 183 - 189 (1992); 및 Christoffersen et al.,Journal of Medicinal Chemistry, 38(12) : 2023 - 2037 (1995)를 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다.
전술한 바와 같이, 세포를 변형시키는 이들 방법은 매개 플라즈미드 벡터를 이용하여 선택적으로 수행 되어진다, Cohen et al.의 미국특허 제 4,237,224호를 참고하면, 제한 효소 절단과 DNA 리가제(ligase)를 이용한 접합을 이용한 재조합 플라즈미드 형태의 발현 조직을 제작하는 방법이 기술되어 있다. 이러한 재조합 플라즈미드는 형질전환 방법을 통해 주입고 원핵생물과 조직배양을 통해 성장한 진핵세포를 포함한 단일세포 배양으로 복제되어 진다. DNA 염기 서열을 이 분야에서 알려진 일반적인 클로닝 방법을 통해 플라즈미드 벡터에 클로닝한다. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)에 기술되어 있다.
전술한 바와 같이, 전립선암, 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 또는 췌장암 등의 선암종 암세포에서의 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현 정도는 세포내로 안티센스 또는 라이보자임을 주입하여 감소시킬 수 있다. 안티센스 구성물은 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 mRNA가 류코트리엔 A4 하이드로라제로 번역되는 것을 차단한다. 라이보자임 구성물은 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 mRNA를 절단하여 기능성 류코트리엔 A4 하이드로라제 발현을 방해한다. 생체내에서 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현을 감소시키기 위해, 다양한 유전자 치료 기술을 상보적 핵산 또는 라이보자임 구성물을 적당한 세포로 주입하는데 이용할 수 있다. 그구성물은 알려진 방법에 의해 적합한 세포(예; 전립선암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 또는 유방암 세포)를 표적으로 해야하는데, 왜냐면, 검체의 다른 세포들에서 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현이 감소하는 것은 바람직하지 않기 때문이다.
전술한 바와 같이, 류코트리엔 B4 수용체와 류코트리엔 B4의 결합은 류코트리엔 B4의 생산을 억제하여 저해할 수 있다. 또한 상술한 바와 같이, 류코트리엔 B4의 생산은 저해할 수 있는데, 예를 들어, 류코트리엔 B4의 생산 경로의 하나나 그 이상의 단계를 저해할 수 있다. 또 다른 류코트리엔 B4의 생산 경로를 저해하는 방법은 예를 들어, 선암종 암세포 샘플을 5-리포옥시나제 저해제과 접촉시켜 류코트리엔 A4의 생산을 저해하는 것을 포함할 수 있다. 여기서 사용한, 5-리포옥시나제 저해제는 직접적으로 또는 간접적으로 5-리포옥시나제 활성을 저해하는 모든 화합물을 의미한다. 이와 같은 5-리포옥시나제 저해제의 예로는 5-리포옥시나제-활성화 단백질 저해제 (예; 3-(1-(4-콜로로벤질)-3-t-부틸-티오-5-이소프로필-2-일)-2,2-디메틸프로파논산 및/또는 노디하이드로구아이아레티산) 및 5-리포옥시나제 발현을 감소시키는 핵산 분자를 포함한다. 이들 화합물에 대한 구체적인 사항은 본 출원인이 출원한 미국특허 제 09/111,343호에 기술되어 있고 이 내용은 본 발명에 포함된다.
다른 방법으로, 본 발명의 방법은 류코트리엔 A4의 생산은 저해하지 않고 류코트리엔 B4 수용체와 류코트리엔 B4의 결합만을 억제하는 화합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 5-리포옥시나제 저해제가 아니고, 5-리포옥시나제-활성화 단백질 저해제가 아니며, 3-(1-(4-콜로로벤질)-3-t-부틸-티오-5-이소프로필-2-일)-2,2-디메틸프로파논산 및/또는 노디하이드로구아이아레티산이 아닌 화학물을 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 류코트리엔 B4 수용체와 류코트리엔 B4의 결합을 저해하는 화합물을 이용해 수행한다. 상술한 다양한 방법을 추가하여, 이 화합물을 류코트리엔 B4 수용체의 발현을 감소시키는데 사용한다. 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현을 감소시키는데 관련하여 상술한 방법들을 여기서 동일하게 적용한다. 보다 실질적으로, 화합물은 류코트리엔 B4 수용체를 코딩하는 핵산분자에 결합하는 핵산 분자, 예를 들어, 류코트리엔 B4 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 표적으로하는 상보적 핵산 및 라이보자임일 수 있다. 적절한 안티센스와 라이보자임을 디자인하기 위해 사용되어지는 류코트리엔 B4 수용체의 핵산과 아미노산 서열은 예를 들어, Martin et al., "생쥐와 인간 류코트리엔 B4 수용체로 감염시킨 세포에서의 류코티엔 결합, 신호, 및 HIV 공동 수용체 기능의 분석,"J. Biol. Chem., 274(13): 8597 - 8603 (1999); Yokomizo et al., " 화학주성을 매개하는 류코트리엔 B4에 대한 G-단백질 결합된 수용체,"Nature, 387(6633): 620 - 624 (1997): Toda et al., "큰쥐의 류코트리엔 B(4) 수용체의 클로닝과 특징,"Biochem. Biophys. Res. Commun., 262(3): 806 - 812 (1999); 유전자 은행 번호 AF077673 (생쥐의 유전자 및 아미노산 서열); 유전자 은행 번호 D89078 및 D89079(인간 유전자 및 아미노산 서열); 및 유전자 은행 번호 AB025530(큰쥐 유전자 및 아미노산 서열) 등을 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다.
류코트리엔 B4와 류코트리엔 B4 수용체의 결합을 저해하는데 사용하는 다양한 화합물을 지금까지 확인하였으며, 본 발명의 방법은 선암종 암 세포의 증식을 감소시키고, 또는 선암종 암세포의 사멸을 유도시키고, 또는 선암종 암세포의 비-암 세포로 분화를 유도하는 이들 화합물을 찾는 것을 기본으로한다. 용어 "증식", "세포사멸", 및 "분화"의 의미는 본 발명과 관련된 분야에서 쉽게 이해되어 진다. 증식, 세포 사멸, 또는 분화를 검정하는 실질적인 방법은 본 출원인이 출원한 미국특허 제09/111,343호 에 기술되어 있고 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다. 이들 방법은 류코트리엔 B4와 류코트리엔 B4 수용체의 결합을 저해하고 증식을 "감소"시키고, 세포사멸을 "유도", 및/또는 분화를 "유도"하는 다른 화합물의 확인에 이용할 수 있다.
상술한 내용은 선암종 세포, 특히 전립선 암 세포, 폐암세포, 위암세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 및 대장암 세포와 같은 상피 암세포 상에서 류코트리엔 B4와 류코트리엔 B4 수용체의 결합을 저해하는 화합물의 효과와 관련된 본 발명의 개념을 기술한 것이다. 본 발명의 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 실행할 수있다.
예를 들어, 본 발명의 방법은 선암종 암세포(전립선 암 세포, 폐암 세포, 위암세포, 유방암 세포, 대장암 세포, 및/또는 췌장암 세포 등)의 치료에 이용 가능한 화합물을 스크리닝하기 위해서; 선암종 암세포 치료에 대한 화합물의 효능을 평가하기 위해; 또는 화합물이 선암종 암세포를 제거하는 기작(예; 세포사멸을 유도하는가, 분화를 유도하는가, 증식을 감소시키는가 등)을 연구하기 위해 시험관 내에서 이용할 수 있다. 예를 들어, 류코트리엔 B4와 류코트리엔 B4 수용체의 결합을 저해하는 화합물로 확인 되면, 당업자들은 암세포의 사멸 유도, 분화 유도, 및/또는 증식 감소시키는 화합물의 정도를 평가하기위해 시험관내에서 본 발명의 방법을 응용할 수 있고; 또는 당업자들은 본 발명의 방법을 화학물이 세포사멸 유도에 작용하는가, 분화를 유도하는가, 증식을 감소시키는가, 또는 이들의 공동기작인가를 판단하기 위해 응용할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 방법은 생체 내에서 전립선 암 세포, 폐암세포, 위암세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 및 대장암 세포와 같은 선암종 암세포를 치료하는데 사용할 수 있다. 본 방법을 생체 내에서 수행하는 경우, 예를 들면, 선암종 암 세포가 인간 검체 내에 존재하면, 치료학상 효과적인 양의 화학물을 인간 검체에 투여하거나, 종양에 직접 화학물을 투여하여 화학물과의 접촉을 수행한다. 본 발명의 방법에 의한 화합물의 투여에 대한 세부사항은 하기에 기술하였다.
본 발명은, 또 다른 면에서 검체내의 전립선 암 세포, 폐암세포, 위암세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 및 대장암 세포, 또는 상피세포를 포함하는 다른 암세포 등과 같은 선암종 암세포의 치료 방법과 관련이 있다. 본 방법은 류코트리엔 B4와 류코트리엔 B4 수용체의 결합을 저해하는데 효과적인 화합물의 적정량을 검체에 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 검체는, 예를 들면, 큰쥐, 생쥐, 고양이, 개, 원숭이, 및 인간과 같은 포유동물을 포함한다. 바람직한 인간 검체는, 예를 들면, 이전에 전립선 암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 및/또는 유방암이 위험한 상태로 판명된 사람들 및 전립선 암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 및/또는 유방암 진단을 받았던 사람들을포함한다. 바람직하게, 검체는 구강 편평 상피 세포암종에 걸리지 않거나 또는 구강 편평상피세포 암종의 치료 증후가 나타나지 않아야 한다. 선암종 암의 위험 상태로 판명된(바람직하게, 구강 편평 상피 세포 암종에 걸리지 않은) 검체에 있어서, 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 저해하는 화합물은 진행중인 선암종 암세포에서 효과적으로 증식을 감소 및/또는 세포사멸을 유도 및/또는 분화를 유도하는 조건하에서 검체에 투여된다. 이와 같은 예방(100% 완벽한 의미로 사용한 것은 아님) 치료는 예방책의 가능한 혜택이 류코트리엔 B4와 류코트리엔 B4 수용체의 결합을 저해하는 화학물의 투여에 의한 부작용보다 큰 경우면 병의 위험 상태가 높은 개인에게 유용할 수 있다.
상술한 어떠한 화합물도 본 발명의 치료 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 밝힌 류코트리엔 B4 수용체에 직접 결합하는 전형적인 화합물 및 펩티드 약제와 같은 류코트리엔 B4와 류코트리엔 B4 수용체의 결합을 억제하는 화합물들은 단독 또는 조합물로 친화적인 매개체와 혼합하여 투여될 수 있다. 친화적인 매개체는 바람직한 약제학적 매개체 및 희석액을 포함한다. 희석액 및 매개체 성분은 선택적이므로 본 발명에서 사용되는 화합물의 치료학적 효능을 감소시키지 않는다.
본 발명에서 조합물은 적절한 사용을 위한 모든 바람직한 형태로 이루어진다. 바람직한 투여 형태의 예는 경구, 비경구, 또는 국부 투여 형태를 포함한다. 바람직한 경구 투여 형태는 정제(tablets), 분말, 미립자, 캡슐, 현탁액, 시럽, 및 엘리시어(elixirs)를 포함한다. 정제를 위한 비활성 희석액 및 매개체는, 예를 들면, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 유당, 및 활석을 포함한다. 정제는 또한 전분 및 알진 산과 같은 물질미립화 및 분해 작용제; 전분, 젤라틴, 및 아카시아와 같은 결합 작용제; 및 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 및 활석과 같은 윤활 작용제 등을 함유한다. 정제는 코팅되지 않거나 또는 분해 및 흡수를 지연시키기 위해 알려진 방법으로 코팅할 수 있다. 캡슐에 사용되는 비활성 희석액 및 매개체는 예를 들면, 탄산칼슘, 인산 칼슘, 및 카올린을 포함한다. 현탁액, 시럽, 및 엘리시어는 재래식 첨가제, 예를 들면, 메틸 셀루로즈, 트래거캔스(tragacanth), 알긴산 나트륨; 레시틴 및 폴리옥시데틸렌 스테아레이트와 같은 습윤 작용제; 및 에틸-p-하이드로시벤조에이트와 같은 보존제를 함유한다.
비경구 투여를 위한 바람직한 형태는 용액, 현탁액, 분산액, 유상액, 및 그와 유사한 것을 포함한다. 이들은 또한 사용전 살균된 주사액에 즉시 용해 및 현탁 할 수 있는 살균된 고체 성분 형태로 제조된다. 이들은 이 분야에서 알려진 현탁 및 분산 작용제를 함유한다. 비경구 투여의 예는 심실내, 뇌, 근육내, 정맥내, 복막내, 직장내, 및 피하내 투여를 포함한다.
부가적으로, 일반적으로 상술한 조성의 비-활성 성분, 이들 조성은 다른 활성 물질을 포함할 수 있고, 특히, 활성제는 전립선암, 폐암, 위암, 유방암, 대장암, 췌장암 및/또는 다른 선암종 암의 치료에 효과적인 것으로 확인되었다. 이들 활성제는 광범위한 항암제일 수 있고, 또한 다른 형태의 암(즉, 선암종 암을 포함해서)의 치료에 유용하거나 또는 예를 들면, 구강 편평 상피 세포 암종의 치료에는 사용할 수 없고 선암종 암 치료에 사용하는 다른 활성제의 경우에 보다 특이적일수도 있다. 다른 활성제는 또한 비-항-암 약제학적 특성 뿐 아니라 항-선암종 암의 특성도 갖는다. 예를 들어, 다른 활성제는 항-염증성을 갖거나, 또는 다르게는, 어떠한 항-염증성도 갖지 않을 수 있다.
본 발명에 따라 투여하는 화학물의 실제 적정양은 특정 화합물, 특정 조합물, 및 투여 방식에 따라 변화될 수 있다. 화합물의 작용을 변형시킬수 있는 다양한 요인들(예; 몸무게, 성별, 식사, 투여 시간, 투여 경로, 배설 정도, 검체의 상태, 약제 조합, 및 반응 민감성 및 통증)은 당업자들에 의해 고려되어질 것이다. 투약은 최대 내성 복용양 이내에서 연속적 또는 정기적으로 수행될 것이다. 환자의 상태에 따른 적정한 투약 정도는 당업자들에 의해 일반적인 적량 투여 시험을 거쳐 확정될 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 -- 재료 및 방법
다음의 재료 와 방법을 사용하였다.
재료: DMEM, MEM, 및 McCoy's 5A 배지, 페니실린 - 스트렙토마이신 용액, 트립신 - EDTA 용액, 프로티나제 A, 프로피디움 아이오다이드, RNase A, 및 페놀/클로로포름은 시그마 케미 칼사 (세인트 루이스, 미주리) 에서 구입하였다. 소 태아 혈청 (FBS) 은 아틀란타 바이오로지 컬사 (노크로스, 조지아)에서 구입하였다. TUNEL 정량법을 위한 APO - BRDU 키트는 파밍젠사 (샌디에고, 캘리포니아)에서 구입하였다. 류코트리엔 B4 ("LTB4")는 케이만 케미칼사 (앤 아버, 미시간)에서 구입하였다. LTB4의 길항체, 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오페닐)-5-하이드로시페닐_프로포시)-페노시) 벤졸산 (여기서는 "LY293111")은 엘리 릴리 앤 컴패니 (인디아나폴리스, 인디아나) 에서 구입하였다. LTD4 길항체, 1-(2-하이드로시-3-프로필-4-(4-(1H-테트라졸-5-일)부토시)페닐)에타논 (여기서, LY171883) 은 바이오몰 리서치 래버래토리사 (프리마우스 미팅, 펜실베니아)에서 구입하였다.
세포 배양: 다음의 췌장 세포주를 사용하였다. MiaPaCa-2 와 PANC - 1 (불완전 분화) ; Capan - 1 과 Capan - 2 (완전 분화) ; 및 HPAF 와 AsPC - 1 (다형태). 이들은 미국 세포주 은행 (락빌, 메릴랜드)에서 구입하였다. PANC - 1과 MiaPaCa-2 는 DMEM 에서 배양하였고 ; Capan - 1 과 Capan - 2 는 McCcoy's 배지에서 배양하였다. 배지는 10% FBS를 보충하였고 세포는 37 ℃ 에서 95%의 산소와 5%의 이산화 탄소의 대기습도로 단층 배양하였다. 세포는 이틀에 한번 배지를 갈아준 75 ㎤ 플라스크에 정기적으로 분주하였다. 실험을 위해, 세포를 80% 덮히도록 배양하여 트립신 - EDTA로 분해하고 12 웰 (well)이나 24 웰 플레이트에 50,000 / ㎖의 농도로 알맞게 분주하였다.
트리티움 표식된 티아민 흡입에 의한 DNA 합성: 세포를 12 또는 24 - 웰 (well)플레이트에 분주하였다. 70% 세포가 자란 후 혈청이 없는 배지에서 24 시간동안 배양하고 적당한 농도의 류코티엔 B4 수용체의 길항체인 LY293111 (62.5 - 1000 nM), LTB4 (100 - 400 nM)또는 둘을 같이 넣거나 넣지 않은 혈청이 없는 새로은 배지로 교체하였다. 적당기간 배양 후 0.5 uCi/웰의 트리티움 - 메틸 - 티아민을 세포에 처리하고 다시 2 시간 동안 배양 후 각각의 웰을 PBS 로 두번 세척하고 10% 트리클로로 아세트산 ("TCA") 으로 30분간 고정한 다음 0.4 M의 수산화 나트륨을 첨가하여 용해하고 세포의 DNA 합성을 정량하였다.
트리티움 표식된 티아민의 DNA로의 흡입을 나타내는 방사능은 섬광 칵테일 (scintillation cocktail)을 첨가하여 섬광측정기(scintillation counter) (LKB RackBeta, Wallac, Turku, 핀란드)로 측정하였다.
세포 증식 정량법: 췌장암 세포를 24 - 웰 마이크로 플레이트에 접종하여 37 ℃에서 배양하였다. 24 시간후 , 세포를 250 nM LY293111 을 함유하거나 함유하지 않은 혈청이 없는 배지에서 24, 48, 및 72 시간동안 다시 배양하였다. 각 시간의 마지막에 세포에 트립신을 처리하여 단일 세포액으로 분리하고 각 웰의 세포 수를 Z1- 쿨터 카운터(Z1-Coulter Counter) (루톤, 베드포드시어, 영국)로 측정하였다.
광학 현미경을 이용한 형태변화: 75 ㎠ 플라스크에서 배양한 췌장암 세포에 각각 다른 농도의 LY293111을 다른 시간별로 처리하였다. 이것을 위상차 현미경으로 관찰하여 사진을 찍었다.
DNA 절단화 정량 법(DNA fragmentation assay): 아가로즈 겔 전기영동을 통한 DNA 절단화를 정량하기 위해 75 ㎠ 프라스크에서 배양한 췌장암 세포에 트립신을 처리하여 떨어뜨리고 PBS로 두번 씻어낸후 1 ㎖ 의 용해 완충용액 (25 mM EDTA, 10 mM 트리스, 0.5 % 트리톤 X-100, 및 1 % SDS) 에 현탁시키고 - 80℃에서 하룻밤 동안 동결 융해하였다. 그리고나서 동량의 PEG/염화나트륨 원액 용액을 세포 분해질에 첨가하여 최종농도가 0.25 % PEG와 1 M 염화 나트륨이 되게하고 튜브를 30 분간 4 ℃에서 13,200 g로 원심 분리한다. 절단된 작은 분자 무게의 DNA가 포함된 상층액을 RNAse A (0.3 ㎎/㎖) 와 함께 37 ℃에서 1 시간동안 반응시킨 후 페놀/클로로포름으로 추출하여 70 % 에탄올을 넣어 하룻밤 동안 침전시킨다. DNA가 포함된 펠릿(Pellets)을 50 ㎖의 TE 완충용액에 용해하여 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) (1 ㎎/㎖)이 함유된 1.8 % 아가로즈 겔상에서 전기영동하고 UV 로 조명하고 겔 분석기(Molecular Analyst Gel Documentation System) (바이오라드 래버래토리, 헤르쿨레스, 캘리포니아)로 분석하였다.
터널 정량법 (TUNEL assay): 세포사멸은 닉 - 말단 (nick - end)에 데옥시유리딘 트리포스페이트 표식을 매개하는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라 제(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling ("TUNEL")) 를 이용하여 플로사이토메트리(flow cytometry)로 측정하였다. 적정 시간동안 LY293111을 처리한 세포를 트립신-EDTA로 분리하고 차가운 PBS로 두번 씻어준 후 10 % 파라포름알데히드로 얼음에서 20 분간 고정한다. 세포를 다시 PBS로 씻어준 후 적어도 4 시간 동안 70 % 에탄올을 투과시키고 한번 더 PBS로 씻어주고 2.5 units의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (TdT 효소)와 100 pmol Br-dUTP가 포함된 DNA 표식 용액과 함께 30 분간 암실에서 반응시킨다. 그리고나서 0.5 ㎖ 프로피디움 요오드 / RNAse A 용액을 넣고 세포를 488 nm에서 흥분시켜 플로사이토메트리로 정량하였다.
통계학적 정량법 (Statistical analysis): 자료의 변동 정도 (variance("ANOVA")) 의 다양한 비교를 위해 본페로니 교정 (Bonferroni's correction) 의 듀네트 (Dunnett's)를 사용하여 분석하였다. 이 분석은 프리즘 소프트웨에 패키지 (그리프패드, 샌 디에고, 캘리포니아) 로 수행하였다. 결과는 ±SEM으로 표현하였다.
실시예 2 -- 췌장 암세포에 대한 LY293111 의 효과
류코트리엔 B4 수용체의 길항체인 LY293111은 MiaPaCa-2 췌장 암세포주에 대해 농도 구배에 따른(도 1 A) [F(5,30) = 77.30, p < 0.0001] 및 시간 구배 (도 1 B) [F(3,20) = 331.1, p < 0.0001)에 따른 티아민 흡입과 세포 수 저해 (도 2) 를 야기한다.
실험은 5 종의 췌장암 세포주들 (HPAF, Capan-1, Capan-2, AsPC-1과 PANC-1)에 대해 실시하였고 또한 LY293111처리 24 시간 후 농도 구배에 따라 세포 증식을 억제하였다. 이 실험의 결과는 하기 표 1에 나타내었고 대조구에 대한 퍼센트로 표현하였다. (평균 ±SEM) 및 여기서 * = p < 0.05, ** = p < 0.01, 및 *** = p < 0.001 이다.
LY293111 (nM), 24 시간, % 대조구
농도 62.5nM 125nM 250nM 500nM 1000nM
HPAF 103.6 ±21.8 97.6 ±24.5 49.3 ±9.0** 13.3 ±3.0*** 2.3 ±1.4***
Capan-1 99.1 ±4.8 56.9 ±4.9** 16.4 ±2.0*** 15.7 ±3.4*** 0.2 ±0.3***
Capan-2 95.4 ±8.7 67.3 ±6.8** 51.2 ±5.8** 15.8 ±9.6*** 8.9 ±2.1***
AsPC-1 90.6 ±4.6 72.8 ±5.4* 44.5 ±7.7** 18.4 ±6.9*** 7.3 ±1.2***
PANC-1 89.4 ±4.4 65.2 ±3.8** 43.5 ±5.7** 12.4 ±3.1*** 5.6 ±1.0***
또한, 5 종의 췌장암 세포주들 (HPAF, Capan-1, Capan-2, AsPC-1 과 PANC-1) 에 대한 시간에 따른 LY293111의 효과를 조사하였다. 하기 표 2에 나타낸 결과는각각의 세포주에 대해 500 nM LY293111의 시간에 따른 췌장 암세포의 증식 억제를 보여준다. 하기 표 2에서, 결과는 대조구에 대한 퍼센트 (평균 ±SEM) 로 표현하고 * = p < 0.05, ** = p < 0.01, 및 *** = p < 0.001 이다.
LY293111 (500nM), % 대조구
시간 6시간 12시간 24시간
HPAF 67.5 ±11.6** 35.7 ±8.9*** 12.4 ±3.3***
Capan-1 70.5 ±8.7** 44.5 ±10.2** 15.7 ±3.4***
capan-2 57.8 ±4.3** 32.1 ±5.6 *** 10.9 ±6.0***
AsPC-1 65.8 ±7.7** 44.7 ±4.1** 16.7 ±2.1***
PANC-1 60.2 ±6.5** 48.9 ±5.3** 13.6 ±1.0***
LY293111은 농도 250 nM에서 적어도 50 %를 1000 nM에서는 95 %이상 증식을 억제하였다. 위상차 현미경을 통해 본 결과, 250 nM LY293111을 처리한 4 시간 후 MiaPaCa-2 췌장암 세포의 뚜렷한 세포 형태 변화를 대조 구(도 3 A)와 비교하여 관찰할 수 있었다. 시간이 지나면, 처리한 세포가 둥글게 되면서 막의 기포화(blebbing), 염색질의 응축, 핵의 분열과 최종적으로 마이크로 플레이트상에서 떨어져 나간다. 이러한 형태 변화는 세포사멸을 보여주는 것임을 미리 설명하였었다. 도 3 D(LY293111 처리)와 도 3 C(대조구)에 나타나듯이 유사한 결과를 대장암 세포주인 LoVo 세포에서도에서 볼 수 있다.
실시예 3 -- 췌장암 세포에 대한 LY171883 의 효과
LTB4 의 길항체인 LY293111의 효과와 비교하여, LTD4 수용체의 특이적 길항체인 LY171883 은 MiaPaCa-2 [F(5,6) = 1.875, p = 0.2316]과 HPAF [F(5,6) = 1.940, p = 0.2217] 췌장암 세포에서 매우 높은 농도 (10 mM)일 경우 증식에만 영향을 주었다. 그러나 이것은 독성에 의한 영향인 듯하다. MiaPaCa - 1와 HPAF 췌장암 세포에 대한 이 결과는 도 4 A와 4 B에 각각 나타내었다.
실시예 4 -- 췌장 세포 증식에 대한 류코트리엔 B4의 영향
류코트리엔 B4는 MiaPaCa-2 [F(3,8) = 64.02 와 F(3,8) = 50.31, p < 0.0001]와 HPAF [F(3,8) = 30.06, p < 0.0001] 췌장암 세포주들에 대해 농도와 시간에 따라 증식을 촉진하였다. 도 5 A는 각각 다른 농도의 LTB4를 24 시간동안 처리한 MiaPaCa-2 세포의 티아민 흡입에 대한 효과를 보여준다. 도 5 B와 5 C는 100 nM 의 LTB4를 24, 48, 및 72 시간동안 처리한 MiaPaCa-2 세포 (도 5B)와 HPAF 세포 (도 5C)의 티아민 흡입에 대한 효과를 보여준다. 100 nM 농도의 LTB4를 72 시간 동안 처리한 경우, 티아민 흡입이 대조구에 비해 두배 증가하였다.
실시예 5 -- 췌장 암 세포 증식에 대한 LTB4의 자극 효과에 미치는 LY293111의 효과
LTB4는 MiaPaCa-2 세포(도 6A)와 HPAF 세포(도 6B)에 대한 류코트리엔 B4 수용체의 길항체인 LY293111의 증식 억제 효과를 제거하였다. 100 nM LTB4를 처리한 24 시간 후, 대조구와 비교하여 25%의 세포증식이 증가하였고 250 nM LY293111은 50%의 증식 감소를 야기하였다. LTB4와 그것의 길항체인 LY293111을 함께 처리하면 거의 대조구 수준으로 증식이 회복되었다.
실시예 6 -- DNA 절편화 정량법
DNA 절편화 정량법을 LY293111을 처리한 췌장암 세포의 사멸을 확인하기 위해 이용하였다. MiaPaCa-2세포에 각각 250, 500, 및 1000 nM LY293111을 48 시간 동안 처리한 후, 1.8 % 아가로즈 겔에서 세포 DNA 의 전기영동후 대조구에서는 볼수 없는 특이적인 DNA 래더(ladder) 를 볼 수 있었다 (도 7). 유사한 결과를 다른 췌장암 세포주들의 분석에서도 얻을 수 있었다
실시예 7 -- 터널 정량법
LY293111에 의해 유도된 췌장암 세포주들의 세포사멸을 터널 정량법을 이용해서도 측정하였다. 24 시간동안 250 nM과 500 nM LY293111을 처리한 MiaPaCa-2 세포에서 각각 12.6 % 와 18.6 %의 세포사멸이 증가하였다. 반대로 대조구 세포의 사멸은 매우 낮았다 (1.5 %). 도 8A - 8C에서 나타난 결과에서 오른쪽 위 사분면에서 절단된 DNA의 UTP 표식에 기인한 형광물질 빈도가 증가하였다.
실시예 8 -- 췌장암과 대장암 세포의 증식에 대한 LY293111의 효과
암 세포 증식에 대한 LY293111의 효과를 티아민 흡입과 세포 수의 정량으로 측정하였다. LY293111은 모든 췌장암 세포, 대장암 세포, 및 유방암 세포에 대해 농도 구배와 시간에 따른 확실한 증식 저해를 야기하였다. 도 9A - 9에 결과를 나타내었다. 도 9 A 및 9B는 췌장암 세포인 MiaPaCa-2에 대한 것이고 ; 도 9C는 췌장암 세포 HPAF에 대한 것이며, 도 9D는 췌장암 세포 Capan 2에 대한 것이다. 각각의 도 9A, 9C, 및 도 9D는 이들 췌장암 세포주에 대한 적량 효과를 보여준다. 아울러 도 9B는 췌장암 세포 MiaPaCa-2에 대한 시간에 따른 LY293111의 효과를 보여준다. 도 9E 와 9F는 대조구와 비교하여 시간에 따른 0.5 uM LY293111를 처리한 췌장암 세포 MiaPaCa-2 (도 9E)와 대장암 세포 LoVo (도 9F)의 수를 보여준다.
실시예 9 -- Bcl-2에 대한 LTB4와 LT293111의 효과
도 10 A에서 보듯이, LTB4 (100 nM)가 MCF-7 유방암 세포에서의 선-세포사멸 단백질인 Bcl-2의 발현 증가를 Bcl-2에 특이적인 항혈청을 사용한 웨스턴 블랏으로 밝혀주었다. 반대로, 도 10B에서 보듯이, LY293111 (500 nM)는 MCF-7 유방암 세포에서 선-세포사멸 단백질, Bcl-2의 발현을 억제하였다.
실시예 10 -- AsPc-1 인간 췌장 종양 세포를 이종이식 시킨 무흉선 생쥐에 대한 LY293111의 효과
무흉선 생쥐에 3 백만 암세포가 있는 무혈청 배지 50㎕를 피하주사로 주입하였다. 매우 악성이고 공격적인 췌장 종양 세포주인 AsPc-1을 이 실험에서 사용하였다. 이 종양은 식수내에 0.01 % LY293111를 처리하기 전 4일 동안 자라서 안정화된다. 도 11은 처리 시간별 종양의 크기(mm3)를 보여준다. 대조구와 비교하여 식수에 LY293111을 투여받은 생쥐 그룹의 종양 크기가 보다 작았다.
본 발명에서는 바람직한 구체예에 대하여 상세히 기술하였지만 후술되는 청구항에서 정의되는 본 발명의 보호 범위내에서 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변형, 부가 및 교체가 가능함은 당해 분야의 당업자에게 자명할 것이다.

Claims (45)

  1. 류코트리엔(leukotriene) B4 수용체에 류코트리엔의 결합을 억제하기 위한 유효 조건하의 화합물과 선암종 암세포를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 선암종 암세포의 증식을 감소시키거나, 또는 선암종 암세포의 세포사멸을 유도하거나, 또는 선암종 암세포를 비-암성 세포로의 분화를 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 경구 편평상피세포(squamous cell) 암을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 전립선암세포(prostate cancer cells), 폐암세포(lung cancer cells), 위암세포(stomach cancer cells), 유방암세포(breast cancer cells), 췌장암 세포(pancreatic cancer cells), 대장암 세포(colon cancer cells) 또는 이들의 조합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 B4 수용체에 결합하여 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
    여기서, R1은 C1-C5알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)티오, 할로, 또는 R2-치환형 페닐이고;
    R2및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4알킬, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)-S(O)q-, 트리플루오로메틸, 또는 디-(C1-C3알킬)아미노이고;
    X는 -O-, -S-, -C(=O), 또는 -CH2-, 및 Y는 -O-, 또는 -CH2- ; 또는 함께 선택될때, -X-Y-는 -CH=CH- 또는 -C≡C-이고;
    Z는 직쇄 또는 측쇄의 C1-C10알킬리데닐이고;
    A는 결합, -O-, -S-, -CH=CH-, 또는 -CRaRb-이고, 여기서, Ra및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-C5알킬, 또는 R7-치환형 페닐이거나, 또는 그들이 탄소 원자와 함께 부착되어 선택될때, C4-C8사이클로알킬 환을 형성하고;
    R4는 R6또는 R4는 하기 화학식들 중 하나를 갖는 잔기이고,
    ,
    ,
    ,
    ,
    , 또는
    , 및
    여기서, 각각의 R6은 독립적으로 -COOH, 5-테트라졸일, -CON(R9)2, 또는 -CONHSO2R10이고;
    각각의 R7은 수소, C1-C4알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, 벤질, 메톡시, -W-R6, -T-G-R6, (C1-C4알킬)-T-(C1-C4알킬리데닐)-O-, 또는 히드록시이고,
    R8은 수소 또는 할로이고;
    각각의 R9는 독립적으로수소, 페닐, 또는 C1-C4알킬이거나 또는 R9는 그들이 질소 원자와 함께 부착되어 선택될때, 모르폴리노, 피페리디노, 피페라지노, 또는 파이롤리디노 군을 형성하고;
    R10은 C1-C4알킬 또는 페닐이고;
    R11은 R2, -W-R6, 또는 -T-G-R6이고;
    각각의 W는 결합 또는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고,
    각각의 G는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고,
    각각의 T는 결합, -CH2-, -O-, -NH-, -NHCO-, -C(=O)-, 또는 -S(O)q-이고,
    K는 -C(=O)- 또는 -CH(OH)-이고;
    각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
    p는 0 또는 1이며;
    t는 0 또는 1이고;
    이때, X가 -O- 또는 -S-일때, Y는 -O- 가 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-일때, R4는 R6이 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-이고 Z가 결합일때, Y는 -O- 가 아니고;
    또한, p가 0일때, W는 결합이 아니다.
  6. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산, 3-(2-(3-(2-에틸-4-(4-플로오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)-6-(4-카복시-페녹시)페닐)프로피온산, 1-(4-(카복시메톡시)페닐)-1-(1H-테트라졸-5-일)-6-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)헥산, 3-(4-(7-카복시-9-옥소-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)-9H-크산틴))프로파논산, 5-(3-(2-(1-카복시)-에틸)-4-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)페닐)-4-펜티노익산, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물, 및 이의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 B4 수용체의 발현을 감소시켜 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 B4 수용체를 코딩하는 핵산 분자에 결합시키 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 B4를 결합시켜 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 B4의 생성을 억제하여 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 B4로 류코트리엔 A4의 전환을 억제시켜 류코트리엔 B4의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 A4에 결합하여 류코트리엔 B4로 류코트리엔 A4의 전환을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 A4 하이드로라제(hydrolase)의 활성을 억제시켜 류코트리엔 B4로 류코트리엔 A4의 전환을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 A4 하이드로라제에 결합 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 A4 하이드로라제의 발현을 감소시켜 류코트리엔 A4 하이드로라제의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 A4 하이드로라제를 코딩하는 핵산 분자에 결합하는 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 A4의 생성을 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 5-리폭시게나아제(5-lipoxygenase) 억제제가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 5-리폭시게나아제-활성 단백질의 억제제가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 5-리폭시게나아제의 발현을 감소시키는 핵산 분자가 아닌 것을 특징으로 하는 방법,
  22. 제1항에 있어서, 상기 선암종 암세포는 사람 검체에 존재하고, 여기서, 상기접촉 단계는 상기 화합물의 치료학적 유효량을 상기 사람 검체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 억제하기 위해 유효한 양의 화합물을 검체에 투여하는 단계를 포함하는 검체의 선암종을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 검체는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 검체는 경구 편평세포 암에 걸리지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 양은 상기 검체의 암세포의 증식을 감소시킬 수 있는 유효량인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 양은 상기 검체에서 암세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 유효량인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 양은 상기 검체의 암세포를 비-암 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 유효량인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 B4 수용체에 결합함으로써 류코트리엔 B4 수용체에 류코트리엔 B4의 결합을 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
    여기서, R1은 C1-C5알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)티오, 할로, 또는 R2-치환형 페닐이고;
    R2및 R3는 각각 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4알킬, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)-S(O)q-, 트리플루오로메틸, 또는 디-(C1-C3알킬)아미노이고;
    X는 -O-, -S-, -C(=O), 또는 -CH2-, 및 Y는 -O-, 또는 -CH2- ; 또는 함께 선택될때, -X-Y-는 -CH=CH- 또는 -C≡C-이고;
    Z는 직쇄 또는 측쇄의 C1-C10알킬리데닐이고;
    A는 결합, -O-, -S-, -CH=CH-, 또는 -CRaRb-이고, 여기서, Ra및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-C5알킬, 또는 R7-치환형 페닐이거나, 또는 그들이 탄소 원자와함께 부착되어 선택될때, C4-C8사이클로알킬 환을 형성하고;
    R4는 R6또는 R4는 하기 화학식들 중 하나를 갖는 잔기이고,
    ,
    ,
    ,
    ,
    , 또는
    , 및
    여기서, 각각의 R6은 독립적으로 -COOH, 5-테트라졸일, -CON(R9)2, 또는 -CONHSO2R10이고;
    각각의 R7은 수소, C1-C4알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, 벤질, 메톡시, -W-R6, -T-G-R6, (C1-C4알킬)-T-(C1-C4알킬리데닐)-O-, 또는 히드록시이고,
    R8은 수소 또는 할로이고;
    각각의 R9는 독립적으로 수소, 페닐, 또는 C1-C4알킬이거나 또는 R9는 그들이 질소 원자와 함께 부착되어 선택될때, 모르폴리노, 피페리디노, 피페라지노, 또는 파이롤리디노 군을 형성하고;
    R10은 C1-C4알킬 또는 페닐이고;
    R11은 R2, -W-R6, 또는 -T-G-R6이고;
    각각의 W는 결합 또는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고,
    각각의 G는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고;
    각각의 T는 결합, -CH2-, -O-, -NH-, -NHCO-, -C(=O)-, 또는 -S(O)q-이고;
    K는 -C(=O)- 또는 -CH(OH)-이고;
    각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
    p는 0 또는 1이며;
    t는 0 또는 1이고;
    이때, X가 -O- 또는 -S-일때, Y는 -O- 가 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-일때, R4는 R6이 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-이고 Z가 결합일때, Y는 -O-가 아니고,
    또한, p가 0일때, W는 결합이 아니다.
  31. 제29항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산, 3-(2-(3-(2-에틸-4-(4-플로오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)-6-(4-카복시-페녹시)페닐)프로피온산, 1-(4-(카복시메톡시)페닐)-1-(1H-테트라졸-5-일)-6-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)헥산, 3-(4-(7-카복시-9-옥소-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)-9H-크산틴))프로파논산, 5-(3-(2-(1-카복시)-에틸)-4-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)페닐)-4-펜티노익산, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물, 및 이의 조합물으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제23항에 있어서, 상기 화합물은 류코트리엔 A4의 생성을 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제23항에 있어서, 상기 선암종은 전립선암세포, 폐암세포, 위암세포, 유방암세포, 대장암 세포, 췌장암 세포, 및 이들의 조합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 선암종 암세포를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는 선암종 암세포의 증식을 감소시키거나, 또는 선암종 암세포의 세포사멸을 유도하거나, 선암종 암세포를 비-암세포로 분화를 유도하는 방법.
    여기서, R1은 C1-C5알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)티오, 할로, 또는 R2-치환형 페닐이고;
    R2및 R3는 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, C1-C4알킬, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)-S(O)q-, 트리플루오로메틸, 또는 디-(C1-C3알킬)아미노이고;
    X는 -O-, -S-, -C(=O), 또는 -CH2-, 및 Y는 -O-, 또는 -CH2- ;또는 함께 선택될때, -X-Y-는 -CH=CH- 또는 -C≡C-이고;
    Z는 직쇄 또는 측쇄의 C1-C10알킬리데닐이고;
    A는 결합, -O-, -S-, -CH=CH-, 또는 -CRaRb-이고, 여기서, Ra및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-C5알킬, 또는 R7-치환형 페닐이거나, 또는 그들이 탄소 원자와 함께 부착되어 선택될때, C4-C8사이클로알킬 환을 형성하고;
    R4는 R6또는 R4는 하기 화학식들 중 하나를 갖는 잔기이고,
    ,
    ,
    ,
    ,
    , 또는
    , 및
    여기서, 각각의 R6은 독립적으로 -COOH, 5-테트라졸일, -CON(R9)2, 또는 -CONHSO2R10이고;
    각각의 R7은 수소, C1-C4알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, 벤질, 메톡시, -W-R6, -T-G-R6, (C1-C4알킬)-T-(C1-C4알킬리데닐)-O-, 또는 히드록시이고,
    R8은 수소 또는 할로이고;
    각각의 R9는 독립적으로 수소, 페닐, 또는 C1-C4알킬이거나 또는 R9는 그들이 질소 원자와 함께 부착되어 선택될때, 모르폴리노, 피페리디노, 피페라지노, 또는 파이롤리디노 군을 형성하고;
    R10은 C1-C4알킬 또는 페닐이고;
    R11은 R2, -W-R6, 또는 -T-G-R6이고;
    각각의 W는 결합 또는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고,
    각각의 G는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고;
    각각의 T는 결합, -CH2-, -O-, -NH-, -NHCO-, -C(=O)-, 또는 -S(O)q-이고;
    K는 -C(=O)- 또는 -CH(OH)-이고;
    각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
    p는 0 또는 1이며;
    t는 0 또는 1이고;
    이때, X가 -O- 또는 -S-일때, Y는 -O-가 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-일때, R4는 R6이 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-이고 Z가 결합일때, Y는 -O-가 아니고;
    또한, p가 0일때, W는 결합이 아니다.
  36. 제35항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산, 3-(2-(3-(2-에틸-4-(4-플로오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)-6-(4-카복시-페녹시)페닐)프로피온산, 1-(4-(카복시메톡시)페닐)-1-(1H-테트라졸-5-일)-6-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)헥산, 3-(4-(7-카복시-9-옥소-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)-9H-크산틴))프로파논산, 5-(3-(2-(1-카복시)-에틸)-4-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)페닐)-4-펜티노익산, 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물, 및 이의 조합물으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 샘플은 경구 편평세포 암 세포를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 샘플은 전립선암세포, 폐암세포, 위암세포, 유방암세포, 췌장암 세포, 대장암 세포, 또는 이들의 조합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 하기 화학식으로 표시되는 화합물의 치료적 유효량을 검체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체의 선암종을 치료하는 방법.
    여기서, R1은 C1-C5알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)티오, 할로, 또는 R1-치환형 페닐이고,
    R2및 R3는 각각 수소, 할로, 히드록시, C1-C4알킬, C1-C4알콕시, (C1-C4알킬)-S(O)q-, 트리플루오로메틸, 또는 디-(C1-C3알킬)아미노이고,
    X는 -O-, -S-, -C(=O), 또는 -CH2-, 및 Y는 -O-, 또는 -CH2-이거나 또는 함께 선택될때, -X-Y-는 -CH=CH- 또는 -C≡C-이고,
    Z는 직쇄 또는 측쇄의 C1-C10알킬이데닐이고,
    A는 결합, -O-, -S-, -CH=CH-, 또는 -CRaRb-이고, 여기서, Ra및 Rb는 각각 수소, C1-C5알킬, 또는 R7-치환형 페닐이거나, 또는 그들이 부착된 위치에 탄소 원자와 함께 선택될때, C4-C8사이클로알킬 환을 형성하고,
    R4는 R6이거나 또는 R4는 하기 화학식들 중 하나를 갖는 잔기이고,
    ,
    ,
    ,
    ,
    , 또는
    , 및
    여기서, 각각의 R6은 독립적으로 -COOH, 5-테트라졸일, -CON(R9)2, 또는 -CONHSO2R10이고,
    각각의 R7은 수소, C1-C4알킬, C2-C5알케닐, C2-C5알키닐, 벤질, 메톡시, -W-R6, -T-G-R6, (C1-C4알킬)-T-(C1-C4알킬리데닐)-O-, 또는 히드록시이고,
    R8은 수소 또는 할로이고;
    각각의 R9는 독립적으로 수소, 페닐, 또는 C1-C4알킬이거나 또는 R9는 그들이 질소 원자와 함께 부착되어선택될때, 모르폴리노, 피페리디노, 피페라지노, 또는 파이롤리디노 군을 형성하고;
    R10은 C1-C4알킬 또는 페닐이고;
    R11은 R2, -W-R6, 또는 -T-G-R6이고;
    각각의 W는 결합 또는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고,
    각각의 G는 1∼8개의 탄소 원자의 직쇄 또는 측쇄 2가의 히드로카빌 라디칼이고;
    각각의 T는 결합, -CH2-, -O-, -NH-, -NHCO-, -C(=O)-, 또는 -S(O)q-이고;
    K는 -C(=O)- 또는 -CH(OH)-이고;
    각각의 q는 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
    p는 0 또는 1이며;
    t는 0 또는 1이고;
    이때, X가 -O- 또는 -S-일때, Y는 -O-가 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-일때, R4는 R6이 아니고;
    또한, A가 -O- 또는 -S-이고 Z가 결합일때, Y는 -O-가 아니고,
    또한, p가 0일때, W는 결합이 아니다.
  41. 제40항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산, 3-(2-(3-(2-에틸-4-(4-플로오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)-6-(4-카복시-페녹시)페닐)프로피온산, 1-(4-(카복시메톡시)페닐)-1-(1H-테트라졸-5-일)-6-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)헥산, 3-(4-(7-카복시-9-옥소-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)-9H-크산틴))프로파논산, 5-(3-(2-(1-카복시)-에틸)-4-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)-프로폭시)페닐)-4-펜티노익산, 이의약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물, 및 이의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 화합물은 2-(2-프로필-3-(3-(2-에틸-4-(4-플루오로페닐)-5-히드록시페녹시)프로폭시)페녹시)벤조산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 검체는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 검체는 구강 편평상피 세포암종에 걸리지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제40항에 있어서, 상기 선암종은 전립선암세포, 폐암세포, 위암세포, 유방암세포, 대장암 세포, 췌장암 세포, 및 이들의 조합물인 것을 특징으로 하는 방법.
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