JP2003513920A - 細胞内マロニルＣｏＡレベルの増加による癌の治療 - Google Patents

細胞内マロニルＣｏＡレベルの増加による癌の治療

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Abstract

(57)【要約】 アポトーシスを起こす細胞内マロニル補酵素Ａ（マロニルＣｏＡ）の急激な上昇によって癌細胞を死滅させる方法。マロニルＣｏＡの上昇は脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の阻害によって、または脂肪酸代謝の他の操作によって誘導してもよい。あるいはまた、ＦＡＳ阻害をカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ-１）阻害と組み合わせることによって腫瘍細胞の増殖を阻害してもよい。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（脂肪酸合成経路の第１の酵素）を阻害することによって脂肪酸合成を阻害する薬剤と、ＣＰＴ-１を阻害する薬剤（例えばエトモキシル）を組み合わせる療法によって、腫瘍細胞におけるアポトーシスが誘導されると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連分野の概要 多くの研究により、以下における非常に高レベルの脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ
，E.C.2.3.1.85）の発現が証明されている：悪性のヒト乳癌（Alo, P.L., Visca
, P., Marci, A., Mangoni, A., Botti, C., およびDi Tondo, U. 第１期乳癌患
者における再発の予知物質としての脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の発現, Cancer
. 77:474-482, 1996；Jensen, V., Ladekarl, M., Holm-Nielsen, P., Melsen,
F., およびSoerensen, F.B. node-negative乳癌において抗体ＭＩＢ-１によって
検出される腫瘍抗原５１９（ＯＡ-５１９）の発現および増殖活性の予後値, Jou
rnal of Pathology. 176:343-352, 1995）並びに他の癌（Rashid, A., Pizer, E
. S., Moga, M., Milgraum, L. Z., Zahurak, M., Pasternack, G. R., Kuhajda
, F. P., およびHamilton, S. R. 結腸直腸腫瘍における高い脂肪酸シンターゼ
発現および脂肪酸合成活性, American Journal of Pathology. 150:201-208, 19
97；Pizer, E., Lax, S., Kuhajda, F., Pastermack, G., およびKurman, R. 子
宮内膜癌における脂肪酸シンターゼ発現：細胞増殖およびホルモン受容体との相
関性, Cancer. 83:528-537,1998）。ＦＡＳ発現は乳房の分泌管上皮内癌および
上皮内小葉癌においても同定されている；高リスクの浸潤性乳癌の発生に関連す
る病変（Milgraum, L. Z., Witters, L. A., Pasternack, G. R., およびKuhajd
a, F. P. 脂肪酸合成経路の酵素は乳房の上皮内癌において高度に発現される, C
linical Cancer Research. 3:2115-2120, 1997）。ＦＡＳは脂肪酸合成（ＦＡ合
成）の主要な合成酵素であり、マロニル-ＣｏＡおよびアセチル-ＣｏＡのＮＡＤ
ＰＨ依存的縮合を触媒し、主として１６炭素の飽和遊離脂肪酸、パルミテートを
生成する（Wakil, S., 脂肪酸シンターゼ、熟達した多機能性酵素, Biochemistr
y. 28:4523-4530, 1989）。腫瘍組織におけるex vivo測定によってＦＡＳおよび
ＦＡ合成が共に高レベルであることが明らかにされており、これは全体的な遺伝
プログラムがヘキソキナーゼからＦＡＳまでの約２５酵素からなり、非常に活性
であることを示している。
【０００２】 培養したヒト癌細胞を真菌の産生物セルレニンおよび新規化合物Ｃ７５を含む
ＦＡＳの阻害剤で処理したところ、ＦＡ合成が急速に低下し、次いでＤＮＡ合成
が低減し、細胞周期が停止し、ついにはアポトーシスが起こった（Pizer, E. S.
, Jackisch, C., Wood, F. D., Pasternack, G. R., Davidson, N. E., およびK
uhajda, F. ヒト乳癌細胞において脂肪酸合成の阻害によってプログラム細胞死
が誘導される, Cancer Research. 56:2745-2747, 1996, Pizer, E. S., Chrest,
F. J., DiGiuseppe, J. A., およびHan, W. F. 腫瘍細胞系における哺乳動物の
脂肪酸シンターゼの薬理学的阻害剤によってＤＮＡ複製が阻害され、アポトーシ
スが誘導される, Cancer Research. 58:4611-4615, 1998）。哺乳動物の脂肪酸
シンターゼ活性の薬理学的阻害により、薬剤適用の約９０分以内にＤＮＡ複製の
阻害が誘導される。これらの知見はＦＡ合成と癌細胞の増殖との間に生命維持に
必要な生化学的関係があることを示唆している。大いに興味がもたれる一方、脂
肪酸シンターゼの阻害がいかにしてこの現象を引き起こすのかという疑問は未知
のままであった。重要なことに、これらの作用はウシ胎仔血清由来の培地中で、
外因性脂肪酸が存在しても起こる。脂肪酸を含有しない培地条件中で、ある種の
細胞に対するセルレニンの細胞障害性作用を外因性パルミテートの添加によって
救済することが可能であった一方、ほとんどの癌細胞は経路の最終産物によって
ＦＡ合成阻害から救済されなかった（データは未掲載）（Pizer, E. S., Wood,
F. D., Pasternack, G. R., およびKuhajda, F. P. 脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ
）：ＨＬ６０前骨髄白血病細胞における細胞障害性代謝拮抗物質の標的, Cancer
Research. 1996:745-751, 1996）。従って、ほとんどの癌細胞に対するＦＡ合
成阻害の細胞障害性作用は最終産物飢餓によって起こるのか、あるいは他の生化
学機構によって起こるのかは未解決のままである。
【０００３】 発明の概要 本発明は、アポトーシスを誘引する細胞内マロニル補酵素Ａ（マロニルＣｏＡ
）の急激な増加によって癌細胞を死滅させる方法について記載する。脂肪酸シン
ターゼ（ＦＡＳ）の阻害によって誘導されたマロニルＣｏＡの上昇は、脂肪酸合
成の阻害およびカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ-１）の
阻害の両方と相関する。類似の生理学的作用を生じる薬剤を組み合わせることに
よって感受性の高い腫瘍細胞に同一の効果が与えられると予想される。例えばア
セチルＣｏＡカルボキシラーゼ（脂肪酸合成経路の第１の酵素）を阻害すること
によって脂肪酸合成を阻害する薬剤とＣＰＴ-１を阻害する薬剤を組み合わせた
療法によって、腫瘍細胞においてアポトーシスが誘導されると予想される。従っ
て、本発明は癌細胞におけるＣＰＴ-１活性の全身性阻害のためのいずれの方法
も含み、それらには、限定される訳ではないがエトモキシルのような小分子阻害
剤によるＣＰＴ-１の直接的な阻害、並びに癌細胞におけるマロニルＣｏＡのレ
ベルの増加に付随するＣＰＴ-１阻害がある。
【０００４】 この治療戦略によって種々のヒト癌のための新規の化学療法薬が得られる。更
に、これはアポトーシスを起こす新規の経路であって他の癌治療薬とは共有され
ないので、高レベルのマロニルＣｏＡの誘導および／またはＣＰＴ-１阻害が他
の一般的に使用される癌治療薬の効力を増強しうると予想される。
【０００５】 ある態様では、本発明は生体の腫瘍細胞における細胞内マロニルＣｏＡの上昇
を誘引する組成物を生体に投与することによって生体中の腫瘍細胞の増殖を阻害
する方法を提供する。好ましくは少なくとも生体の腫瘍細胞における細胞内マロ
ニルＣｏＡは急に（すなわち激しく、または急激に）増加し、より好ましくは細
胞内マロニルＣｏＡはマロニルＣｏＡの消費速度の有意な上昇に先立って増加す
る。一般に、生体の細胞における細胞内マロニルＣｏＡは投与の３時間以内に増
加し、細胞内マロニルＣｏＡは細胞の増殖阻害に先立って増加すると予測されう
る。
【０００６】 本発明の方法の好ましい様式では、細胞内マロニルＣｏＡの上昇はマロニルＣ
ｏＡの消費の低下と相関する。例えば細胞内マロニルＣｏＡの上昇はマロニルＣ
ｏＡデカルボキシラーゼ（ＭＣＤ）の細胞内活性の低下または脂肪酸シンターゼ
の細胞内活性の低下と相関してもよい；また、必要により組成物はＭＣＤの阻害
剤を含有してもよい。別の好ましい様式では、細胞内マロニルＣｏＡの上昇はマ
ロニルＣｏＡ合成の上昇と相関し、そして／または細胞内マロニルＣｏＡの上昇
はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の細胞内活性の上昇と相関する。
【０００７】 本発明の方法のある態様では、組成物はＡＣＣの活性化剤、クエン酸シンター
ゼの活性化剤、5'-AMP依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の阻害剤、および
／またはアシルＣｏＡシンターゼの阻害剤からなる群から選択される物質を含有
する。本発明の別の態様では、組成物はカルニチンパルミトイルトランスフェラ
ーゼ-１（ＣＰＴ-１）の阻害剤を含有し、これはエトモキシルでもよく、好まし
くは前述の群からの物質と組み合わせて投与する。本発明の方法の更に別の態様
では、第２の化学療法薬を生体に投与し、該第２の化学療法薬は脂肪酸合成を阻
害しない。
【０００８】 好ましくは、本発明の方法を使用して、組成物の投与前の腫瘍細胞における細
胞内マロニルＣｏＡレベルが非悪性細胞の正常なマロニルＣｏＡレベルの少なく
とも２倍である生体を治療する。更に好ましくは、方法を使用して生体のある細
胞における脂肪酸合成速度が組成物の投与前に正常細胞のそれより少なくとも２
倍高い生体を治療し、組成物の投与はそれらの細胞に対して細胞障害性を有する
。好ましくは、生体は脂肪酸合成速度が高い腫瘍細胞を含有し、それらの腫瘍細
胞の細胞数は該組成物の投与後に減少する。治療の際、好ましくは細胞内マロニ
ルＣｏＡレベルは処理前のレベルに比較して上昇し、アセチルＣｏＡおよび遊離
ＣｏＡの細胞内レベルは低下する。
【０００９】 別の態様では、本発明は生体中の腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供
し、この方法は該細胞に（ａ）該細胞における脂肪酸合成の阻害剤；および（ｂ
）該細胞における脂肪酸酸化の阻害剤を投与することを含む。好ましくは、脂肪
酸酸化の阻害剤をＣＰＴ-２を有意に阻害しない量で投与する。更に好ましくは
、脂肪酸合成の阻害剤および脂肪酸酸化の阻害剤を、細胞障害を示す用量のセル
レニンで観察されるそれぞれの阻害のレベルと少なくともほぼ同等、またはそれ
より高い阻害レベルとなるような量で投与する。
【００１０】 更に別の態様では、本発明は腫瘍細胞に対して選択的な細胞障害性を有する組
成物の検出を容易にするスクリーニング法を提供し、この方法は細胞内マロニル
ＣｏＡレベルが高い細胞に標的組成物を投与し、この投与後に細胞における細胞
内マロニルＣｏＡをモニタリングすることを含み、細胞内マロニルＣｏＡの急激
な増加は選択的な細胞障害性を示す。好ましくはこの方法はＴＯＦＡの存在下お
よび非存在下での細胞内マロニルＣｏＡレベルの変化の様式を比較することを更
に含み、ここでＴＯＦＡの存在下でのマロニルＣｏＡレベルにおける変化の減少
は選択的細胞障害性を示している。
【００１１】 更に別の態様では、本発明は腫瘍細胞の増殖を阻害する組成物の検出を容易に
するスクリーニング法を提供し、この方法は標的組成物を腫瘍由来の細胞系に投
与してこの投与後の細胞におけるＣＰＴ-１活性をモニタリングすることを含み
、ここでＣＰＴ-１活性の低下は増殖阻害の可能性を示している。好ましくは、
細胞が浸潤性（permeabilized）であるときに方法を実施する。あるいはまた、
方法は該細胞のアポトーシスをモニタリングすることを更に含み、アポトーシス
のモニタリングは以下からなる群から選択される方法を含んでもよい：ミトコン
ドリア膜内外電位差の測定、生体色素での染色、ウェスタンブロットを使用する
全細胞におけるカスパーゼ活性化のモニタリング、およびウェスタンブロットを
使用するミトコンドリアから生成されたシトクロームＣの測定。
【００１２】 実施態様の詳細な説明 もし脂肪酸飢餓がセルレニンおよびＣ７５の細胞障害作用に介在するなら、同
様の効力を有する他のいずれのＦＡ合成阻害剤も同様の作用を生ずるはずである
。この考えを確認するために、発明者は癌細胞に対するアセチルＣｏＡカルボキ
シラーゼ（ＡＣＣ，E.C.6.4.1.2）（脂肪酸合成の速度を制限する酵素）の阻害
の影響をＦＡＳ阻害剤の影響と比較した。発明者はＦＡＳの阻害によって高レベ
ルのマロニルＣｏＡが誘引され、これはＣ７５処理の１時間以内に起こることを
発見した。これらの生理学的過剰レベルのマロニルＣｏＡ（単に低レベルの内部
で合成された脂肪酸ではなく）は乳癌細胞のアポトーシスの原因である。更に、
これは癌細胞の選択的アポトーシスを誘引する新規の経路である。
【００１３】 図１Ａは、この研究で使用した阻害剤の標的酵素を含むＦＡ合成経路の一部の
概要である。脂肪酸シンターゼの阻害によってマロニルＣｏＡが高レベルとなり
、これはヒト乳癌細胞に対する細胞障害性の原因である（参考文献）。その脂肪
酸合成の基質としての役割に加え、マロニルＣｏＡは脂肪酸酸化の速度を制限す
る酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ-１）の有効
な阻害剤である。ＣＰＴ-１はミトコンドリアの必須の外膜タンパク質であり、
長鎖脂肪酸アシルＣｏＡのＬ-カルニチンへのエステル交換反応を起こし、アシ
ルカルニチンを生成する。アシルカルニチンはミトコンドリア膜を通過して輸送
され、ＣＰＴ-２によってエステル化されてアシルＣｏＡに戻る。生理学的には
、ＣＰＴ-１活性は脂肪酸合成の基質であるマロニルＣｏＡによる阻害によって
調節される。マロニルＣｏＡはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ,E.C.6
.4.1.2）（脂肪酸合成の速度を決める酵素）の酵素産物である。脂肪酸合成の間
、細胞質内マロニルＣｏＡレベルはＡＣＣの活性が高いために高い。同様に、高
レベルのマロニルＣｏＡはＣＰＴ-１を阻害し、長鎖アシルＣｏＡがミトコンド
リアに侵入するのを阻害する。これによって同時に起こる脂肪酸の合成および酸
化の無益回路が阻害される。筋肉では本質的にＦＡＳがないが、ＡＣＣおよびマ
ロニルＣｏＡが心筋および骨格筋の重要な燃料源である脂肪酸酸化を調節する。
【００１４】 ＴＯＦＡ（5-（テトラデシルオキシ）-2-フロ酸）はアセチルＣｏＡカルボキ
シラーゼ（ＡＣＣ，E.C.6.4.1.2）のアロステリック阻害剤であり、アセチルＣ
ｏＡがカルボキシル化してマロニルＣｏＡとなるのを阻害する。一度エステル化
して補酵素Ａになると、ＴＯＦＡ-ＣｏＡはＡＣＣの生理学的最終産物である阻
害剤である長鎖アシルＣｏＡと同様の機構でＡＣＣをアロステリックに阻害する
（Halvorson, D. L. およびMcCune, S. A. 単離した脂肪細胞における5-（テト
ラデシルオキシ）-2-フロ酸による脂肪酸合成の阻害 Lipids. 19:851-856, 1984
）。セルレニン（Funabashi, H., Kawaguchi, A., Tomoda, H., Omura, S., Oku
da, S., およびIwasaki, S. 脂肪酸合成酵素におけるセルレニンの結合部位, J.
Biochem. 105:751-755, 1989）およびＣ７５（Pizerら, 1998）はいずれもＦＡ
Ｓ阻害剤であり、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡが縮合して脂肪酸となる
のを阻害する。セルレニンは自滅阻害剤（suicide inhibitor）であって、ＦＡ
Ｓと共に共有結合付加物（covalent adduct）を形成し（Moche, M., Schneider,
G., Edwards, P., Dehesh, K., およびLindqvist, Y. 抗生物質セルレニンおよ
びその標的、ベータ-ケトアシルキャリアータンパク質シンターゼ間の複合体の
構造, J Biol Chem. 274:6031-6034, 1999）、一方Ｃ７５は遅結合性阻害剤であ
ると考えられる（Kuhajda F.P., Pizer E.S., Mani N.S., Pinn M.L.., Han W.F
., Chrest F.J., およびCA. T. 脂肪酸シンターゼの新規の阻害剤の合成および
抗腫瘍活性, Proceeding of the American Assicoation for Cancer Research,
40:121, 1999）。ＴＯＦＡを使用して、発明者はヒト乳癌細胞系においてセルレ
ニンまたはＣ７５による阻害に匹敵するＦＡ合成阻害を得た。しかしながら、驚
くべきことにＴＯＦＡはヒト乳癌細胞のクローン原性アッセイにおいて本質的に
非細胞障害性であった。これらのデータは、脂肪酸飢餓が血清を補足した培地中
の癌細胞に対する細胞障害性の主要な原因ではないことを示している。ＦＡＳ阻
害の別の作用は（高レベルの基質、マロニルＣｏＡはＦＡＳの阻害から特異的に
生じる）、セルレニンおよびＣ７５の細胞障害性への介在であると考えられる。
【００１５】 マロニルＣｏＡはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ，E.C.6.4.1.2）
の酵素産物であるが、これは細胞代謝における重要な調節分子である。その脂肪
酸合成における基質としての役割に加え、マロニルＣｏＡは、そのミトコンドリ
アの外膜でのカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ-１（ＣＰＴ-１）との
相互作用を通じて脂肪酸のβ-酸化を調節する。カルニチンパルミトイルトラン
スフェラーゼ（ＣＰＴ-１）はミトコンドリアの脂肪酸酸化の速度を制限する酵
素である（図６参照）。これはミトコンドリアの必須の外膜タンパク質であり、
長鎖脂肪酸アシルＣｏＡのＬ-カルニチンへのエステル交換反応を起こし、アシ
ルカルニチンを生成する。アシルカルニチンはミトコンドリア膜を通過して輸送
され、ＣＰＴ-２によってエステル化されてアシルＣｏＡに戻る。
【００１６】 多くの型の癌細胞が高レベルの脂肪酸を合成する。予想されるように、高レベ
ルの脂肪酸を合成する細胞はマロニルＣｏＡの定常状態のレベルが高く、正常細
胞の少なくとも６倍のレベルである（実施例６参照）。腫瘍細胞をＦＡＳの阻害
剤で処理することによって癌細胞におけるマロニルＣｏＡレベルは生理学的過剰
レベルまで選択的かつ急激に上昇する。この処理は、脂肪酸合成における基質と
してのマロニルＣｏＡの利用の阻害、およびそれに付随するＡＣＣの脂肪酸アシ
ルＣｏＡ阻害を解除することによるマロニルＣｏＡ合成の刺激の両方によって、
マロニルＣｏＡのレベルを上昇させる（図１Ａ）。ＦＡＳは癌細胞において優先
的に発現するので、マロニルＣｏＡの上昇は主として腫瘍細胞に制限される。こ
れによって、ＦＡＳ阻害剤で処理したヒト癌異種移植で起こるように、癌細胞は
アポトーシスを起こし、正常組織は起こさない（実施例５参照）。
【００１７】 ＣＰＴ-１は２つのアイソフォーム、すなわち肝臓型（Ｌ-ＣＰＴ-１）および
筋肉型（Ｍ-ＣＰＴ-１）がある（Swanson, S. T., Foster, D. W., McGarry, J.
D., およびBrown, N. F. 酵素のマロニルＣｏＡ感受性におけるカルニチンパル
ミトイルトランスフェラーゼＩアイソフォームのＮ-およびＣ-末端ドメインの役
割：キメラタンパク質の発現および保存されたヒスチジン残基の変異からの洞察
, Biochem. J. 335:513-519, 1998）。これらのアイソフォームはそのカルニチ
ンについてのＫm（Ｍ-ＣＰＴ-１では500μM、Ｌ-ＣＰＴ-１では-30μM）、およ
びマロニルＣｏＡ阻害への感受性（Ｍ-ＣＰＴ-１では100倍感受性が高い。ＫI＝
0.07μM対7μM）において、大きく異なる速度論的特性を有する。マロニルＣｏ
Ａの調節部位はＮ-末端領域にあるが、正確な結合部位は明確になっていない（S
wansonら, 1998）。重要なことに、エトモキシル（ここで代表的なＣＰＴ-１阻
害剤として使用するＣＰＴ-１の共有結合阻害剤）はマロニルＣｏＡのものとは
異なる部位で結合する。
【００１８】 ＣＰＴ-１はヒト癌細胞において研究されていない。そのため、ヒト癌細胞で
発現されるアイソフォームは知られていない。概念的に、肝臓アイソフォームは
全ての癌腫を含む上皮性分化の腫瘍で発現するはずであり、一方、筋肉アイソフ
ォームは肉腫のような非上皮性腫瘍で発現する。しかしながら、ＡＣＣの肝臓お
よび筋肉アイソフォームの研究により、アイソフォームのいずれか、または両方
がヒト乳癌細胞で発現しうることが明らかになっている（Witters, L., Widmer,
J., King, A., Fassihi, K., およびKuhajda, F. 組織および乳癌細胞における
ヒトアセチルＣｏＡカルボキシラーゼアイソザイムの同定, International Jour
nal of Biochemistry. 26: 589-594, 1994）。同様に、ヒト癌細胞はＣＰＴ-１
アイソフォームのいずれか、または両方を発現する能力を有しうる。
【００１９】 最近、ＣＰＴ-１の阻害によって細胞に脂肪酸誘導型アポトーシスに対する感
受性が与えられることが明らかになった（Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramat
su, M., Yamamoto, M., およびHonjo, T. カルニチンパルミトイルトランスフェ
ラーゼＩの阻害によってスフィンゴ脂質合成およびパルミテート誘導型アポトー
シスが増大する, J. Biol. Chem. 272:3324-3329, 1997）。更に、脂肪酸シンタ
ーゼ（ＦＡＳ）の阻害によって誘導されるマロニルＣｏＡレベルの上昇はヒト癌
細胞に対して細胞障害性を有する（実施例４および５参照）。考え合わせると、
これらのデータはヒト癌細胞が脂肪酸代謝の変化を介してアポトーシスを誘導さ
れやすいことを示唆している。またＣＰＴ-１はミトコンドリア外膜で抗アポト
ーシスタンパク質であるＢＣＬ-２と直接相互作用することも明らかになってい
る（Paumen M. B., Ishisa, Y., Han, H., Muramatsu, M., Eguchi, Y., Tsujim
oto, Y., およびHonjo, T. ミトコンドリア膜タンパク質カルニチンパルミトイ
ルトランスフェラーゼＩとBcl-2との直接的相互作用, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 231:523-525, 1997）。可能性としては、ＣＰＴ-１とＢＣＬ-２との相
互作用は下流の機構を提供し、ＢＣＬ-２の抗アポトーシス作用の調節によって
アポトーシスを誘導しうる。
【００２０】 マロニルＣｏＡはそのＦＡＳの基質としての役割に加え、ミトコンドリア外膜
で作用してカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ-１）の阻害
によって脂肪酸酸化を調節する。ＣＰＴ-１の阻害によって細胞は脂肪酸誘導型
アポトーシスに対する感受性を与えられることが明らかになっている；また、Ｃ
ＰＴ-１はミトコンドリアで抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ-２と直接相互作用
しうる。ＦＡＳ阻害によってＣＰＴ-１を阻害するマロニルＣｏＡが高レベルと
なり、それによって癌細胞のアポトーシスが誘導される。ほとんどの増殖性およ
び非増殖性正常細胞はＦＡＳが高レベルではないので、この治療戦略の影響を受
けない。
【００２１】 マロニルＣｏＡレベルを種々の方法および標的酵素を使用して操作してもよい
。実施例に、利用の低下およびそれと同時の生成の増加によるマロニルＣｏＡの
レベルの上昇を示す。マロニルＣｏＡレベルの急激な増加によってアポトーシス
を介して癌細胞の選択的破壊が起き、正常細胞は影響を受けないままである。本
発明にかかるアポトーシスを誘導する方法は２つの広い分類に分けられる：マロ
ニルＣｏＡの急激な増加の直接誘導（例えばＦＡＳの阻害による）、そして脂肪
酸酸化および脂肪酸合成の両方を阻害するための組み合わせ療法の使用（例えば
非ＦＡＳ阻害様式によって）。この治療戦略によって、脂肪酸代謝の変更に基づ
く癌の化学療法のための新たな標的および戦略となりうるものが同定される。
【００２２】 脂肪酸酸化はエトモキシルのような阻害剤によって、ＣＰＴ-１阻害を介して
直接阻害してもよい。ＣＰＴ-１アイソフォームに対する特異的阻害剤を開発し
てもよい。あるいはまた、カルニチンレベルを操作して、ＣＰＴ-１活性をその
基質を減少させることによって低下させてもよい。また、遺伝子操作または外因
性脂肪酸の低下のいずれかによってＣＰＴ-１発現レベルを低下させてもよい。
以下の実施例７は、ヒト乳癌細胞においてエトモキシルを使用してＣＰＴ-１を
直接阻害する方法の例である。
【００２３】 脂肪酸の合成および酸化を阻害するための他の戦略には合成の増加、分解の減
少、または好ましくはその両方からマロニルＣｏＡレベルを上昇させるいずれの
方法も含まれる。マロニルＣｏＡレベルは種々の方法および標的酵素を使用して
操作してもよい。実施例４-５は利用の低下および同時におこる生成の増加によ
るマロニルＣｏＡレベルの増加を示す。マロニルＣｏＡレベルの急激な上昇によ
ってアポトーシスを介した癌細胞の選択的分解が誘引され、正常細胞は影響を受
けないままである。他の実施例は癌細胞の増殖阻害または死滅を誘引する更なる
方法を示す。
【００２４】 好ましくは、本発明にかかる脂肪酸代謝の操作は、それを必要とする生体に組
成物（または複数の組成物）を投与することによって行う。生体に投与する組成
物は、例えば細胞内マロニルＣｏＡレベルの上昇によって、脂肪酸代謝経路に対
して少なくとも１つの生物学的作用を有する物質を含有する。一般に、生体は哺
乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ
、ヒツジ、ヤギ、ブタ、または霊長類、例えばチンパンジー、ヒヒ、または好ま
しくはヒトである。通常、生体は（悪性）腫瘍細胞を含有する。本発明の方法は
悪性細胞に選択的に影響を与え、正常（非悪性）細胞には影響が少ない（または
より好ましくは影響しない）ことに関する。
【００２５】 生体に投与する組成物中の物質は、好ましくは生体中の悪性細胞の少なくとも
一部において細胞内マロニルＣｏＡレベルを上昇させる。好ましくはマロニルＣ
ｏＡレベルは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍上昇する。好まし
くは、物質は悪性細胞における細胞内マロニルＣｏＡ濃度を、周囲の正常細胞の
レベルより高いレベルまで上昇させる。
【００２６】 好適な物質は、多くの方法のいずれかによってマロニルＣｏＡレベルを上昇さ
せる（以下に掲載する、取りうる機構を参照されたい）。好ましい物質は、一般
にマロニルＣｏＡレベルを突然、または急激に上昇させる。いくつかの態様では
、２つ以上の物質を投与し、それらの物質の一部または全部は異なる機構によっ
てマロニルＣｏＡレベルに影響を与えてもよい。あるいはまた、物質を組み合わ
せて使用して脂肪酸合成を低下させ、同時に脂肪酸酸化を低下させてもよい。好
ましくは、脂肪酸の合成および酸化のレベルは、セルレニンでの細胞障害性処理
によって得られるものに匹敵するレベルまで低下する。以下のリストの様式のい
ずれかによって作用する物質を本発明の組成物および方法に使用してもよい。以
下の活性についてのアッセイは文献から得ることができ、特定の物質がこれらの
活性の１つを示すかどうかの確認は当業者の技術範囲内である。
【００２７】 マロニルＣｏＡ生成量の増加： アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のエフェクター：ＡＣＣ活性を増
加させる、ＡＣＣ阻害を低減する、または活性ＡＣＣ酵素の量を増加させる物質
はマロニルＣｏＡのレベルを上昇させる。
【００２８】 ５'-ＡＭＰプロテインキナーゼのエフェクター：５'-ＡＭＰプロテインキナー
ゼはリン酸化によってＡＣＣを阻害し、マロニルＣｏＡの急激な低下を引き起こ
す。このキナーゼの阻害剤はＡＣＣの阻害を解除することによってマロニルＣｏ
Ａのレベルを急激に上昇させる。
【００２９】 クエン酸シンターゼのエフェクター：ミトコンドリアのクエン酸の増加によっ
て脂肪酸合成の基質が提供され、またクエン酸はＡＣＣの“フィード-フォワー
ド”活性化剤として作用してマロニルＣｏＡ合成を増加させる。
【００３０】 アシルＣｏＡシンターゼのエフェクター：アシルＣｏＡシンターゼの阻害によ
って細胞の脂肪酸アシルＣｏＡ濃度が低下し、ＡＣＣの阻害が解除される。これ
によってＡＣＣ活性およびマロニルＣｏＡレベルが上昇する。
【００３１】 マロニルＣｏＡ利用の低下： マロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ（MＣＤ）のエフェクター：この酵素はマ
ロニルＣｏＡからアセチルＣｏＡに戻るＡＴＰ依存的脱炭酸反応を触媒する。Ｍ
ＣＤの阻害によってマロニルＣｏＡレベルは急激に上昇する。
【００３２】 同時に起こるマロニルＣｏＡ利用の低下と生成の増加： 脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）のエフェクター：ＦＡＳを阻害すると、脂肪酸へ
の取り込みの阻害によってマロニルＣｏＡの利用が低下する。またＦＡＳの阻害
によって脂肪酸アシルＣｏＡレベルが低下し、これによってＡＣＣが活性化され
る。代表的なＦＡＳ阻害剤は米国特許第5,759,837および5,981,575号に記載され
るようにして入手してもよく、これらの特許は参照により本明細書の一部として
ここに組み込まれる。
【００３３】 脂肪酸代謝の修飾、特にマロニルＣｏＡレベルの急激な上昇のためのこれらの
戦略を他の物質と共に、または協力させて使用して癌細胞のアポトーシスを促進
してもよい。好ましくは、本発明の組成物中の少なくとも１つの物質は、ＦＡＳ
を阻害する以外の機構によってマロニルＣｏＡのレベルを上昇させる。
【００３４】 成分の投与 本発明にかかる治療薬は好ましくは物質および薬剤的に許容しうるキャリアー
を含有する薬剤組成物に調製する。薬剤組成物は、他の成分が治療を無効とする
ほど本発明にかかる薬剤の有効性を低減しない限り、他の成分を含有してもよい
。薬剤的に許容しうるキャリアーは十分に知られており、当業者は特定の投与経
路に好適なキャリアーを容易に選択できる（例えば、レミントンの薬学, Mack P
ublishing社, Easton, PA 1985参照）。
【００３５】 本発明の薬剤のいずれかを含有する薬剤組成物を、選択した薬剤によって必要
とされるように、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹膜内、胸膜内、小胞内、ま
たは髄腔内）、局所、経口、直腸、または経鼻の経路によって投与してもよい。
薬剤的に許容しうるキャリアー中の活性物質の濃度は、投与の時点で濃度が毒性
の許容レベルを超えない限り、0.01ｍＭから1M以上の範囲であってもよい。
【００３６】 投与量および治療期間は種々の因子に依存し、それらには薬剤の治療指数、疾
病の種類、患者の年齢、患者の体重、および毒性の許容量がある。投与量は一般
に血清濃度が約0.1μg/mlから約100μg/mlとなるように選択する。好ましくは初
回量のレベルは、ここに記載するようなin vitroモデル、そしてin vivoモデル
および臨床試験において有効であることが明らかになっている周囲濃度とするた
めのその能力に基づき、最大許容レベルまでの間で選択する。標準的な臨床法で
は、化学療法を個々の患者に適合させ、化学療法薬の全身濃度を定期的にモニタ
リングするのが好ましい。特定の患者に対する特定の薬剤の投与量および治療期
間は臨床医が上記の因子を考慮して標準的な薬理学的方法を使用して決定するこ
とができる。治療への反応をモニタリングするために本発明にかかる薬剤の血液
もしくは体液レベルの分析、関係する組織における薬剤の活性もしくはそのレベ
ルの測定、または患者における病状のモニタリングを行ってもよい。臨床医はこ
れらの測定によって明らかになった治療への反応に基づいて投与量および治療期
間を調整する。
【００３７】 実施例 本発明のより完全な理解を促進するために、以下に多くの実施例を示す。しか
しながら、本発明の範囲はこれらの実施例に開示する特定の態様に限定されるも
のではなく、これらは単に例証を目的とするものである。
【００３８】 実施例１．in vitroでの細胞におけるＦＡＳの阻害 ＴＯＦＡ、セルレニン、およびＣ７５は全てヒト乳癌細胞において脂肪酸合成
を阻害した。ヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７を10％ウシ胎仔血清を含
有するＲＰＭＩ中で維持した。細胞をマイコプラズマ汚染について定期的にスク
リーニングした（Gen-probe）。全ての阻害剤はDMSO中の5mg/mlストック溶液と
して添加した。脂肪酸合成活性を測定するために、24ウェル・プレート中の5ｘ1
04細胞／ウェルを薬剤への暴露後に［Ｕ-14Ｃ］アセテートでパルス標識し、脂
質を抽出し、先に報告されているように定量した（Pizerら, 1988）。ＭＣＦ７
細胞については、阻害剤暴露の２時間後に経路の活性を測定した。ＳＫＢＲ３細
胞はＦＡＳ阻害剤に対して緩慢な反応を示したが、おそらくこれはＦＡＳ含量が
非常に高かったからであり、そのため経路の活性は阻害剤暴露の６時間後に測定
した。
【００３９】 標準的なパルス標識実験では乳癌細胞系ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７をＦＡ合成
阻害剤ＴＯＦＡ、Ｃ７５、およびセルレニンへの暴露後、２時間標識したが、全
ては［Ｕ14Ｃ］アセテートの脂質への取り込みを同程度まで阻害した（図１Ｂお
よびＤ）。多くの同様の実験で（未掲載）、ＴＯＦＡは試験した全ての細胞系に
おいて1から5μg/mlの用量範囲でＦＡ合成を最大限に阻害し、セルレニンおよび
Ｃ７５は10μg/mlの範囲でＦＡ合成を最大限に阻害した。
【００４０】 実施例２．細胞増殖に対する同じ阻害剤の効果 ＴＯＦＡ、セルレニン、およびＣ７５は全てヒト乳癌細胞において脂肪酸合成
を阻害したが、特異の細胞障害性を示した。細胞および阻害剤は実施例１に記載
するものである。クローン原性アッセイで、4x105の細胞を25cm2のフラスコに播
種し、阻害剤を掲載した濃度で6時間添加した。同数の処理細胞および対照を60m
mシャーレに播種した。7から10日後、クローンを染色して計数した。
【００４１】 全ての阻害剤は同程度にＦＡ合成を低減したが、クローン原性アッセイによる
測定ではＴＯＦＡはＡＣＣ阻害の用量範囲で癌細胞の増殖に対して非毒性である
かまたは刺激性を有し、一方セルレニンおよびＣ７５はＦＡＳ阻害の用量範囲で
有意な細胞障害性を示した（図１ＣおよびＥ）。ＡＣＣおよびＦＡＳ阻害の細胞
障害作用間の大きな相異は、脂肪酸生成の急激な低下自体は、ＦＡＳ阻害後の細
胞損傷の重要な原因ではないことを示している。
【００４２】 実施例３．マロニルＣｏＡの測定 これら２つの酵素の阻害の予測される結果における最も明白な差異は、マロニ
ルＣｏＡレベルはＡＣＣ阻害後には低下するはずであるがＦＡＳ阻害後には増加
するはずであることであった。これまで真核生物では調査されたことはなかった
が、E.coliでの最近のデータは、セルレニンへの暴露によって起こるマロニルＣ
ｏＡレベルの上昇を証明している（Chohnanら, 1997,“好気性菌および通性嫌気
性菌における非エステル化補酵素Ａおよび補酵素Ａチオエステルの細胞内プール
のサイズおよび組成の変化”, Applied and Enviromental Microbiology, 63:55
5-560）。実施例２に記載する条件下でＦＡＳ阻害およびＴＯＦＡによる阻害を
行った細胞においてマロニルＣｏＡレベルを測定した。
【００４３】 CorkeyらのＨＰＬＣ法（“生体試料中のアシル補酵素Ａエステルの分析” Met
hods in Enzymology, 166:55-70, 1988）を使用してＭＣＦ-７細胞においてマロ
ニルＣｏＡレベルを測定した。手短に言えば、24ウェル・プレート中の2.5x105
細胞／ウェルに種々の薬剤処理を行った後、4℃で1.2mlの10％ ＴＣＡを施与し
た。ペレットの質量を記録し、上清を1.2mlのエーテルで6回洗浄し、真空遠心分
離を使用して25℃で減圧乾固した。補酵素Ａエステルを分離し、逆相ＨＰＬＣを
使用して定量した（5μ Supelco C18カラム、Waters HPLCシステム、Millenium3 2 ソフトウェアで操作、補酵素Ａの最大吸光度254nmでモニタリング）。以下のグ
ラジエントおよびバッファーを使用した：バッファーＡ：0.1M リン酸カリウム
（pH5.0）、バッファーＢ：0.1M リン酸カリウム（pH5.0）（40％アセトニトリ
ル含有）。92％ Ａ、8％ Ｂを用いて0.4ml/分で20分間アイソクラチックで溶
出した後、流量を1分間にわたって0.8ml/分に増加し、すぐに10％ Ｂまでの直
線グラジエントを24分まで行い、その後10％ Ｂで50分まで保持し、直線グラジ
エントを行って55分で100％ Ｂとし、60分で完了した。以下の補酵素Ａエステ
ル（Sigma）を標準物質として溶出した：マロニルＣｏＡ、アセチルＣｏＡ、グ
ルタチオンＣｏＡ、スクシニルＣｏＡ、ＨＭＧ-ＣｏＡ、および遊離ＣｏＡ。試
料および標準物質を50μlのバッファーＡに溶解した。補酵素Ａエステルは以下
のような順で溶出した：マロニルＣｏＡ、グルタチオンＣｏＡ、遊離ＣｏＡ、ス
クシニルＣｏＡ、ＨＭＧ-ＣｏＡ、およびアセチルＣｏＡ。補酵素Ａエステルの
定量はMillenium32ソフトウェアで実施した。
【００４４】 薬剤処理した細胞からの酸溶出物を逆相ＨＰＬＣで分析してＭＣＦ-７細胞に
おける補酵素Ａ誘導体を直接測定したところ、セルレニンおよびＣ７５は共にマ
ロニルＣｏＡレベルの迅速な上昇を誘引したが、ＴＯＦＡはマロニルＣｏＡレベ
ルを低下させることが確認された。図２Ａは細胞代謝において重要な補酵素Ａ誘
導体の分離および同定を示す代表的なクロマトグラフである。マロニルＣｏＡは
これらのうちで最初に溶出し、カラム保持時間は19-22分である。図２Ｂの重ね
て示したクロマトグラフは、セルレニン処理はマロニルＣｏＡを対照より著しく
上昇させるが、ＴＯＦＡは有意に低下させることを示している。マロニルＣｏＡ
の化学的同一性を、試料に標準物質を混合して（spiking）個々に確認した（未
掲載）。
【００４５】 マロニルＣｏＡレベルはＦＡＳ阻害によって著しく上昇し、ＴＯＦＡによって
低下した。図２Ｃに示す複数の実験の分析により、10μg/mlでセルレニンまたは
Ｃ７５に1時間暴露した後、マロニルＣｏＡレベルは対照よりそれぞれ930％およ
び370％上昇するが、ＴＯＦＡ処理（20μg/ml）ではマロニルＣｏＡレベルが60
％低下することが明らかとなった。図１ＢおよびＤにおいて、マロニルＣｏＡレ
ベルを最大限に低下させるのに必要なＴＯＦＡの濃度は経路を阻害するための用
量より4倍高かった。しかしながら、ＣｏＡ誘導体の抽出に最適な培地は、基質
の他の生化学アッセイおよび生存率アッセイで使用される培地より細胞密度が5
倍高いものであった。
【００４６】 ＦＡＳ阻害後のマロニルＣｏＡの顕著な上昇は、一部にはＡＣＣの長鎖脂肪酸
アシルＣｏＡ阻害が解除されてＡＣＣ活性が上昇することによると考えることが
できる（図１Ａ）。更に、セルレニンによって誘導されるマロニルＣｏＡレベル
の上昇が処理後30分以内に起こり（対照より930+/-15％上昇。データ未掲載）、
これはＦＡ合成阻害の時間枠内であり、ＤＮＡ合成阻害の開始または初期のアポ
トーシス事象より十分に前である。従って、高レベルのマロニルＣｏＡはＦＡＳ
阻害剤の特徴的な作用であり、他の細胞応答（アポトーシスを含む）より時間的
に先行する。
【００４７】 高レベルのマロニルＣｏＡを誘導するセルレニンまたはＣ７５のレベルは、ク
ローン原性アッセイおよびフローサイトメトリー分析でのアポトーシス分析（メ
ロシアニン（merocyanin）450染色を使用）で測定したところ、ヒト乳癌細胞に
対して細胞障害性を示した。ＦＡＳ阻害によって、マロニルＣｏＡレベルはその
消費がＦＡＳ阻害によって阻害されることによって高くなり、それに付随して、
長鎖アシルＣｏＡのＡＣＣ活性に対する阻害効果が解除されることによって合成
が刺激される（図２）。
【００４８】 実施例４．ＦＡＳ阻害のＴＯＦＡ救済 ＦＡＳ阻害がＴＯＦＡによって救済されることは、高レベルのマロニルＣｏＡ
が癌細胞の細胞障害性の原因であることを示している。ＦＡＳ阻害に起因する高
レベルのマロニルＣｏＡが細胞障害性の原因であるとすれば、ＴＯＦＡでマロニ
ルＣｏＡの蓄積を低減することによってＦＡＳ阻害から細胞を救済することが可
能なはずである。ＴＯＦＡおよびセルレニンのＳＫＢＲ３細胞への共投与（図３
Ａ）により、実施例２に記載するように実施したクローン原性アッセイで、セル
レニン単独での細胞障害作用が除去された。ＭＣＦ７細胞（図３Ｃ）では、ＴＯ
ＦＡによって同様の実験条件下でセルレニンおよびＣ７５の両方が幾分救済され
た。
【００４９】 ＳＫＢＲ３細胞（図３Ｂ）およびＭＣＦ７（図３Ｄ）の代表的なフローサイト
メトリー分析はこれらの知見を実証しており、ＴＯＦＡはセルレニンによって誘
導されるアポトーシスから細胞を救済した。アポトーシスの測定はマルチパラメ
ーター・フローサイトメトリーにより、アルゴンおよびクリプトンレーザーを使
用したFACStarPlusフローサイトメーターを使用して行った（Becton Dickinson
）。アポトーシスはメロシアニン540染色（Sigma）を使用して定量したが、これ
はアポトーシスの初期に起こる細胞質膜のリン脂質充填（packing）の変化を検
出するもので、培地からの細胞に直接添加する（Pizerら, 1998；Mowerら, 1994
“成熟マウスＢ細胞のアポトーシスにおいて膜リン脂質充填の低下および細胞サ
イズの減少はDNA開裂に先行する”, J. Immunol., 152:4832-4842）。いくつか
の実験で、アポトーシスのクロマチン構造変化をLDS-751（Exciton）での染色の
低下として同時に測定した（Freyら, 1995, “生存細胞におけるアポトーシスの
検出のための核酸色素” Cytometry, 21:265-274）。メロシアニン540［10μg/m
l］を1mg/ml ストック水溶液として添加した。1mM ストックDMSO溶液から最終
濃度100nMとしたLDS-751を用いて細胞を染色した。メロシアニン540陽性細胞を
赤色蛍光の上昇によって標識し、575+/-20nmで回収し、メロシアニン540陰性細
胞に対して0.5から2 logであった。同様に、LDS-751混濁（dim）細胞はDF20バン
ドパスフィルターで660nmで回収し、正常細胞に対して0.5から1.5 logの蛍光の
低下を示した。データを収集し、CellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）
を使用して分析した。
【００５０】 これらの実験において、全てのLDS-751混濁細胞はメロシアニン540陽性であっ
たが、あるメロシアニン540陽性細胞集団はLDS-751混濁ではないことが認められ
た。全てのメロシアニン540陽性細胞はアポトーシス性と分類された。これらの
実験ではＴＯＦＡ（＜5%のアポトーシス上昇；クローン原性低下せず）とセルレ
ニン（＞85%アポトーシス；クローン原性70%低下）の間の異なる細胞障害性も確
認された。考え合わせると、これらの研究は高レベルのマロニルＣｏＡは癌細胞
に対するＦＡＳ阻害剤の細胞障害作用において役割を果たしていることを示して
いる。
【００５１】 実施例５．in vivoでの腫瘍細胞増殖に対するＦＡＳ阻害剤の作用 in vitroで見られるＦＡＳ阻害の作用が全身性の活性を必要とするin vivoの
環境に移行できるかどうかを確認するために、無胸腺ヌードマウスにおいてＣ７
５のMCF-7皮下異種移植に対する試験を行い、ＦＡ合成および確立された固形腫
瘍の増殖に対する効果を定量した。過去の研究でヒト癌異種移植に対するセルレ
ニンの局所的有効性が証明されているが（Pizerら, 1996,“卵巣癌の異種移植モ
デルにおいて脂肪酸合成の阻害は疾病の悪化を遅延させる”, Cancer Res., 56:
1189-1193）、セルレニンの全身的作用の失敗によって限界があった。in vitro
における乳癌細胞のセルレニンおよびＣ７５に対する同様の反応は、in vivoで
Ｃ７５が異種移植した乳癌細胞に対して有効でありうることを示唆している。
【００５２】 メスnu/nuマウス（Harlan）におけるヒト乳癌細胞系、MCF-7の側腹部皮下異種
移植を使用してin vivoにおけるＣ７５の抗腫瘍作用を研究した。全ての動物実
験は協会の動物管理ガイドラインに従った。全てのマウスの前方側腹部に90日間
徐放皮下エストロゲンペレット（Innovative Research）を投与し、7日後に腫瘍
を接種した。107MCF-7細胞を、10% FBSおよびインスリン10μg/mlを補足したDME
M培地から異種移植した。
【００５３】 接種の約10日後に測定可能な腫瘍が生成した時点で処理を開始した。11検体の
マウス（それぞれ5および6検体の2つの異なる実験に分けた）に毎週１回、Ｃ７
５を0.1ml RPMI中30mg/kgの投与量で腹膜内に投与した。投与量はBALB/cマウス
において40mg/kgである単一投与LD10測定に基づいた；30mg/kgは非近交系ヌード
マウスにおいて十分許容されている。11検体の対照マウス（処理群と同様に分け
た）にはRPMIのみを投与した。腫瘍の体積を、キャリパーで3次元で測定した。
対照がサロゲートエンドポイント（surrogate endpoint）に達した時点で実験を
終了した。
【００５４】 処理腫瘍および対照腫瘍における脂肪酸合成活性を測定するために平行して行
った実験で、MCF-7異種移植マウスの群を上記の投与量のＣ７５または賦形剤で
処理し、3時間後に殺害した。腫瘍および肝組織をex vivoで［Ｕ14Ｃ］アセテー
トで標識し、報告されているように脂質を抽出し、計数した（Pizerら, 1996）
。
【００５５】 処理および対照腫瘍の組織学的検査を行うために平行して行った更なる実験で
、６検体のＣ７５処理マウスおよび６検体の賦形剤対照マウスを処理の６時間後
に殺害した。腫瘍および正常組織を中性緩衝ホルマリン中で固定し、通常の組織
学のために処理し、ＦＡＳの免疫組織化学を実施した。ＦＡＳの免疫組織化学は
MCF-7異種移植で行い、マウスモノクローナル抗ＦＡＳ抗体（Aloら, 1996）を1:
2000で使用し、Dako ImmunostainerでLSAB2検出キットを使用した。
【００５６】 異種移植したマウスの組織における脂肪酸合成経路の活性を、［Ｕ-14Ｃ］ア
セテートを用いてex vivoでパルス標識して測定した。腫瘍異種移植では肝臓よ
り10倍高いＦＡ合成活性を有し、良性組織と悪性組織間の経路の活性の差異が浮
き彫りとなった（図４Ａ）。MCF-7異種移植におけるＦＡＳ発現は高レベルのＦ
Ａ合成活性と同様であった（図４Ｂ）。30mg/kgのＣ７５の腹膜内注射によって
脂肪酸合成は3時間以内に、ex vivoで標識した肝臓においては76％、MCF-7異種
移植では70％低下した（図４Ａ）。ＦＡ合成におけるこれらの変化は異種移植に
おいて細胞障害性の組織学的形跡より先に起こり、処理の６時間後に明白になっ
た（図４Ｃおよび４Ｄ）。Ｃ７５処理した異種移植は腫瘍組織全体にわたって多
数のアポトーシス体を示し、これらは賦形剤処理した腫瘍においては見られなか
った。Ｃ７５処理に続く肝臓および他のホスト組織の組織学的分析では短期また
は長期毒性のいずれの形跡も見られなかった（未掲載）。
【００５７】 異種移植のＣ７５処理によって、正常組織には損傷を与えずに細胞障害性およ
び腫瘍増殖の低減が誘引された。30mg/kgのＣ７５投与の６時間後、腫瘍組織学
によって、対照腫瘍に比較して有意な細胞障害性が明らかとなった（図４Ｃおよ
び４Ｄ、添付の前刷り）。肝臓および他の臓器の試験では組織損傷の形跡が見ら
れないのに対し、Ｃ７５処理異種移植ではアポトーシス体の形跡が見られること
に留意されたい（データは未掲載）。週毎の腹膜内Ｃ７５処理によって、確立し
た皮下MCF-7腫瘍の増殖が賦形剤対照に比較して阻止され、これは全身性の抗腫
瘍作用を示している（図４Ｅ）。週１回の処理で３２日後、処理群における腫瘍
の増殖は賦形剤対照に比較して8倍以上の差があった。セルレニンと同様に、一
時的で可逆な体重減少のみが認められた唯一の毒性であった（Pizerら, 1996）
。
【００５８】 このＣ７５の全身性薬理活性によって全身性ＦＡＳ阻害剤処理の結果の最初の
分析が提供された。生理学的レベルの周囲脂肪酸の環境におけるヒト乳癌異種移
植に対するＣ７５の有意な抗腫瘍作用は血清を補足した培地におけるin vitroの
結果と同様であり、細胞障害性の機構が脂肪酸飢餓と無関係であることと一致し
た。
【００５９】 実施例６．ヒト癌細胞はin vivoにおいて高レベルの定常状態レベルのマロニ
ルＣｏＡを有する 実施例５の結果は、マロニルＣｏＡ蓄積は正常組織において重要な問題ではな
い可能性があり、おそらくそれはＦＡ合成経路の活性が通常、肝臓のような脂肪
生成器官においてさえも低いためであることを示唆している。更に興味深いこと
に、これらの実験においてマロニルＣｏＡは乳癌細胞において検出される主たる
低分子量のＣｏＡコンジュゲートである一方、他の研究では培養した肝細胞にお
ける優位なスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡが報告されている（Corkey,
1988）。腫瘍組織における高レベルのマロニルＣｏＡは、腫瘍細胞における脂肪
酸合成が肝臓に比較して高レベルであることを反映している（Pizerら, 1996）
。
【００６０】 実施例５のMCF-7ヒト乳癌異種移植モデルを使用し、高速液体クロマトグラフ
ィーを使用して同一の動物由来の腫瘍異種移植および肝臓におけるマロニルＣｏ
Ａレベルを測定した。以下の図３は、腫瘍組織におけるマロニルＣｏＡが肝臓に
比較して高レベルであることを示している。更に、他のＣｏＡ誘導体の分布が明
らかに変化している。例えば肝臓は異種移植に比較してマロニルＣｏＡが約10倍
低く、アセチルＣｏＡレベルは約10倍高く、他のＣｏＡ誘導体、特にスクシニル
ＣｏＡのレベルが高かった。ＣｏＡ誘導体のプロフィールの相異は癌細胞と肝細
胞間のエネルギー代謝の大きな相違を示している可能性がある。
【００６１】 実施例７．ＣＰＴ-１阻害剤による細胞増殖阻害 カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩはエトモキシルによって阻害さ
れる（Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramatsu, M., Yamamoto, M., およびHonj
o, T. カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩの阻害によってスフィンゴ
脂質合成およびパルミテート誘導型アポトーシスが増大する, J. Biol. Chem. 2
72:3324-3329, 1997；Ratheiser, K., Schneeweib, B., Waldhausl, W., Faschi
ng, P., Korn, A., Nowotny, P., Rohac, M., およびWolf, H. P. O. 非インス
リン依存性糖尿病においてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩのエト
モキシル阻害によって肝グルコース生成および血清脂質が低下する, Metabolism
, 40:1185-1190, 1991）。
【００６２】
【化１】
【００６３】 図７Ａはエトモキシルが単独でＣ７５ｎｍより高い増殖阻害を誘引することを
示している。Ｃ７５はマロニルＣｏＡの増加によって間接的にＣＰＴ-１を阻害
する。図７ＢはＭＣＦ-７細胞の増殖のエトモキシル阻害がＣ７５と相加的であ
ることを示している。パネル７Ａにおいて、エトモキシルは７２時間にわたって
５μg／mlのＣ７５より高いＭＣＦ-７細胞の用量依存的増殖阻害を誘引する。パ
ネル７Ｂにおいて、エトモキシルおよびＣ７５はどちらか一方の場合よりも高い
増殖阻害性を示している。５ｘ１０4のＭＣＦ-７細胞を２４ウェルのプレートに
播種し、播種の１８時間後に図に示す濃度の阻害剤で処理した。細胞をエタノー
ルで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、ＳＤＳで可溶化し、４９０で測
定した。重要なことに、エトモキシルの濃度はＣＰＴ-１を阻害するために単離
した肝細胞で使用したものと同様であった；非特異的影響がin vitroにおいて＞
４００μMで確認された（Paumenら, 1997）。合一すると、エトモキシルおよび
Ｃ７５は相加的な増殖阻害作用を生じた。マロニルＣｏＡおよびエトモキシルは
共にＣＰＴ-１阻害剤であり、ＣＰＴ-１上の結合位置が異なるので、エトモキシ
ルおよびＣ７５による強化作用は驚くべきことではない。エトモキシルはヒトの
糖尿病を治療するために、顕著な毒性または体重減少を伴わずに使用されてきた
（Ratheiserら, 1991）。この歴史と共に、ＣＰＴ-１はこの研究をより迅速に臨
床に移行する方法を提供しうる。
【００６４】 実施例８．脂肪酸酸化のセルレニン阻害 ＦＡＳ阻害によって起こるマロニルＣｏＡの上昇はヒト乳癌細胞において細胞
障害性を有することが明らかになっているので、出願人はマロニルＣｏＡによる
ＣＰＴ-１阻害が癌細胞の死滅の機構において役割を果たすかどうかの確認を追
求した。
【００６５】 ＭＣＦ-７ヒト乳癌細胞を既知のＦＡＳ阻害剤、セルレニンで処理し、セルレ
ニンがＭＣＦ-７細胞においてアポトーシスを誘導することが知られている用量
で、実際のアポトーシスが開始する前に脂肪酸酸化の低下を誘引するかどうかを
確認した。塩基中での［14Ｃ］パルミテートの酸化から放出される14ＣＯ2を捕
捉および計数して脂肪酸酸化を測定した。
【００６６】 １ｘ１０6のＭＣＦ-７細胞を３重複測定でＴ-２５フラスコに播種し、３７℃
で一晩インキュベートした。次いで試験化合物（セルレニン）を、記載するよう
にＤＭＳＯ中の５mg/mlストック溶液から希釈して添加した。２時間後、薬剤を
含有する培地を除去し、細胞を1.5mlの以下のバッファーと共に３０分間プレイ
ンキュベートした：114mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、グル
コース 11mM。プレインキュベート後、以下を含有する200μlのアッセイバッフ
ァーを添加し：114mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、グルコー
ス 11mM、アルブミンに結合したパルミテート（100μCiの［１-14Ｃ］パルミテ
ートと共に含有）2.5mM、0.4mM Ｌ-カルニチン、そして細胞を３７℃で２時間イ
ンキュベートした。インキュベート後、400μlの塩酸ベンゾトニウムをウェルの
中央に添加し、放出された14ＣＯ2を回収した。すぐに、500μlの7% 過塩素酸を
細胞に添加して反応を停止した。次いでウェルのあるフラスコを３７℃で２時間
インキュベートし、その後塩酸ベンゾトニウムを除去し、14Ｃを計数した。ブラ
ンクは500μlの7% 過塩素酸を細胞に添加して調製し、その後アッセイバッファ
ーと共に２時間インキュベートした。
【００６７】 図８は記載する用量のセルレニンでこの系のアポトーシス開始より十分前に処
理したＭＣＦ-７細胞における脂肪酸酸化を示す。 セルレニンはＭＣＦ-７細胞において脂肪酸酸化の用量依存的阻害を起こす。1
0μg／mlでは2時間以内に9倍近いマロニルＣｏＡの上昇および＞50％の脂肪酸合
成の低下を起こすことが知られているが、この濃度でセルレニンは対照に比較し
て約50％の脂肪酸酸化の低下を起こす（p=0.0007；両側t-検定）。
【００６８】 実施例９．カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩの阻害 セルレニンは脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）が阻害される際、細胞内のマロニル
ＣｏＡレベルの上昇を引き起こすことが知られており、マロニルＣｏＡはそのカ
ルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ-１）に対する作用を通し
て脂肪酸酸化を阻害することが知られている。ＣＰＴ-１はβ酸化のための長鎖
脂肪酸のミトコンドリア内への輸送に介在する。これは長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ
のＬ-カルニチンへのエステル交換反応を起こし、アシルカルニチンを生成する
。この反応を通して、水溶性L-カルニチンは脂肪酸へのエステル化後、有機溶媒
に可溶となる。セルレニンによって誘導される脂肪酸酸化の低下がマロニルＣｏ
Ａの上昇によるのか、またはＣＰＴ-１に対するセルレニンの直接阻害によるの
かを確認するために、ＭＣＦ-７細胞におけるＣＰＴ-１アッセイにおいてセルレ
ニンを他の阻害化合物と比較した。
【００６９】 カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ-１）アッセイ：ＭＣ
Ｆ-７細胞を10％ ウシ胎仔血清を含有するRPMI 1640中、1ｘ106細胞で6ウェル
プレートに、3重複測定で播種した。37℃で一晩インキュベートした後、培地を
除去して以下からなるアッセイ培地700μｌで置換した：50ｍＭ イミダゾール、
70ｍＭ KCl、80mM スクロース、1mM EGTA、2mM MgCl2、1mM DTT、1mM KCN、1mM
ATP、0.1% 脂肪酸未含有ウシ胎仔血清アルブミン、70μM パルミトイルＣｏＡ、
0.25μCi［メチル-C14］L-カルニチン、40μg ジギトニン；20μMのマロニルＣ
ｏＡまたは他の記載する阻害剤を含有、または未含有。
【００７０】 37℃で3または6分間インキュベートした後、500μlの氷冷した4M 過塩素酸を
添加して反応を停止した。次いで細胞を回収し、10,000ｘgで5分間遠心分離した
。ペレットを500μlの氷冷した過塩素酸で洗浄し、再び遠心分離した。得られた
ペレットを800μlのdH2Oに再懸濁し、150μlのブタノールで抽出した。ブタノー
ル相を液体シンチレーションでカウントしたが、これはアシルカルニチン誘導体
を表す。
【００７１】 図９はＣＰＴ-１に対する３つの化合物の影響を示す：エトモキシル（ＣＰＴ-
１の既知の阻害剤）、ＴＯＦＡ（脂肪酸合成経路の酵素であるアセチルＣｏＡカ
ルボキシラーゼを阻害することによって脂肪酸合成を阻害することが知られてい
る）、およびセルレニン。
【００７２】 図９はセルレニンがＭＣＦ-７細胞においてＣＰＴ-１を直接阻害しないことを
示している。事実、10μg／mlでは、セルレニンは賦形剤コントロールよりわず
かに高いＣＰＴ-１活性の上昇を誘引するが、統計学的に有意ではない。従って
、セルレニンによって誘導される脂肪酸酸化の低下は、ＣＰＴ-１に対するセル
レニンの直接的な作用ではなく、同時に起こるマロニルＣｏＡの上昇によるもの
と考えられる。
【００７３】 実施例１０．ＣＰＴ-１阻害の細胞増殖に対する影響 セルレニンはマロニルＣｏＡの上昇および脂肪酸酸化の低下を誘引するので、
ＣＰＴ-１阻害がアポトーシスの誘引に関与するかどうかを確認するように試験
を考案した。その目的で、ＭＣＦ-７細胞を既知のＣＰＴ-１の直接阻害剤である
エトモキシルで処理し、細胞による脂肪酸酸化を実施例８に記載するように測定
した。図１０はエトモキシルがＭＣＦ-７細胞において脂肪酸酸化の阻害を誘引
することを示している。
【００７４】 50μg/mlで脂肪酸酸化が対照に対して＞50％低下する（p=0.012；両側t-検定
）。（図９は、エトモキシルがＣＰＴ-１を直接阻害し、10μg/mlの用量でＣＰ
Ｔ-１活性を75％低下させることを示している（p=0.023；両側t-検定）） 細胞増殖阻害アッセイ：エトモキシルはＣＰＴ-１の有効な阻害剤であるが、
ＣＰＴ-１および脂肪酸酸化を阻害することが知られている用量のエトモキシル
でＭＣＦ-７細胞を処理した場合、有意な増殖阻害または細胞障害性は見られな
い。ＭＣＦ-７細胞を、10％ウシ胎仔血清含有RPMI 1640（Hyclone）中、ウェル
当たり5ｘ104細胞で24ウェルプレートに播種した。37℃で一晩インキュベートし
た後、エトモキシルをDMSO中の5mg/mlストック溶液から添加した。培地中のDMSO
の最終濃度は0.2％以下であった。48時間または72時間後、培地を除去し、ウェ
ルをハンクス緩衝液で3回洗浄した。ウェルをクリスタルバイオレットで染色し
た後、乾燥し、10％ SDSに可溶化した。100μlアリコートを96ウェルプレートに
移し、Molecular Dynamicsプレートリーダーで490nmで測定した。データは平均
の標準誤差を示すエラーバーを付して吸光度単位で表している。統計およびグラ
フ化はPrism 2.0（Graph Pad）で実施した。
【００７５】 図１１はＭＣＦ-７細胞における増殖阻害に対するエトモキシルの影響を示す
。 わずか200μg/mlの用量で増殖が有意に低下した（p=0.006、両側t-検定）。従
って、ＣＰＴ-１単独での阻害は、ヒト乳癌細胞に対して有意な増殖阻害である
。
【００７６】 しかしながら、セルレニン処理の際、ＣＰＴ-１は阻害され、脂肪酸酸化は脂
肪酸合成阻害の間低下する；これは非生理学的反応である。生理学的には脂肪酸
合成が低下するとマロニルＣｏＡレベルは低下し、このことからＣＰＴ-１の阻
害が脂肪酸酸化を増加させることが明らかとなる。従って、ＣＰＴ-１阻害は脂
肪酸合成阻害の環境で細胞障害性も誘導する可能性が考えられる。
【００７７】 実施例１１．ＣＰＴ-１阻害および脂肪酸合成阻害を組み合わせた細胞障害性
効果 ＴＯＦＡは、脂肪酸合成の速度を制限する酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラ
ーゼ（ＡＣＣ）の阻害剤である。ＡＣＣのＴＯＦＡ阻害によってマロニルＣｏＡ
が低下し、次いで脂肪酸合成の阻害が起こる。ＴＯＦＡおよびセルレニンは共に
脂肪酸合成を阻害するが、セルレニンはＦＡＳを阻害してマロニルＣｏＡを上昇
させ、ＴＯＦＡはＡＣＣを阻害してマロニルＣｏＡを低下させる。
【００７８】 この実施例において、脂肪酸合成を阻害するためにＴＯＦＡで、また脂肪酸酸
化を阻害するためにエトモキシルで、細胞を処理した。この組み合わせた阻害の
細胞障害性に対する影響をクローン原性アッセイで測定した。
【００７９】 クローン原性アッセイ：37℃で一晩インキュベートした後、1ｘ106のＭＣＦ-
７細胞を記載する薬剤に6時間暴露し、洗浄し、トリプシン消化によって分離し
、計数し、1000または500細胞／60-mmプレートに3重複測定で播種した。播種の4
-6日後、コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、計数した。対照は薬剤の
非存在下でDMSOと共にインキュベートした細胞からなるものとした。エラーバー
は平均値の標準誤差を表す。
【００８０】 図１２はエトモキシルおよびＴＯＦＡの両方で処理したＭＣＦ-７細胞を用い
たクローン原性アッセイを示す。 細胞を5μg/mlのＴＯＦＡで処理すると有意な細胞障害性を示さない；これは
既に公表した出願人の研究と同様である（参照）。図９はＴＯＦＡがＣＰＴ-１
阻害を誘引せず、またＴＯＦＡは脂肪酸酸化において有意な変化を引き起こさな
いことを示している（データは未掲載）。エトモキシル処理も有意な細胞障害性
を示さず、図１１における増殖阻害研究を補足する。しかしながら、ＴＯＦＡお
よびエトモキシルを組み合わせると、ＴＯＦＡ単独（p=0.004、両側t-検定）ま
たはエトモキシル単独（p=0.002、両側t-検定）より有意に高い細胞障害性を示
す。
【００８１】 これらのデータはＣＰＴ-１阻害が脂肪酸合成阻害の際に、癌細胞に対して毒
性を有することを示している。従って、ＣＰＴ-１阻害剤を脂肪酸合成阻害剤と
合わせて使用して抗腫瘍反応を増加させることができる。
【００８２】 実施例１２．脂肪酸シンターゼ阻害剤およびＣＰＴ-１阻害剤の細胞障害性に
対する相加的作用 実施例Ｃに記載する方法を使用した増殖阻害アッセイにおいて、ＭＣＦ-７細
胞をＣ７５（ＦＡＳ阻害剤）単独で、またはエトモキシルと組み合わせたもので
処理し、処理の48時間後に分析した。エトモキシルおよびＣ７５は共に対照に対
して有意な増殖阻害を誘引した（p=0.0001、p=0.005、両側t-検定）。以下の図
１３はエトモキシルによってＦＡＳ阻害の細胞障害効果も向上できることを示し
ている。
【００８３】 エトモキシルおよびＣ７５の組み合わせによってエトモキシル単独より有意に
高い細胞障害性が誘引され（p=0.004、両側t-検定）、Ｃ７５単独より強い傾向
で増殖阻害が増加される（p=0.054、両側t-検定）。これらのデータはＣＰＴ-１
阻害がＦＡＳ阻害剤の抗腫瘍効果も向上しうることを示唆している。
【００８４】 理解を深める目的で、上記の発明を特定の実施態様に関連して例証および実施
例として幾分詳細に記載したが、他の観点、利点、および修飾は本発明が属する
分野の技術者に明白である。上記の説明および実施例は例証を意図するものであ
り、本発明の範囲を制限するものではない。本発明を実施するための上記の様式
の修飾で医学、生化学、薬理学、および／または関連する分野における当業者に
明白なものは本発明の範囲内であることを意図し、これは添付する特許請求の範
囲によってのみ制限される。
【００８５】 本明細書における全ての文献および特許出願は本発明が属する分野の技術者の
レベルを示している。全ての文献および特許出願は、それぞれの個々の文献また
は特許出願が特に個別に参照によって組み込まれることが示されているのと同じ
程度に、参照によってここに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は脂肪酸の合成経路、および種々の脂肪酸シンターゼ阻害剤
の脂肪酸合成および腫瘍細胞増殖に対する影響を示す。
【図２】 図２は、種々の条件下でのマロニルＣｏＡレベルを示す。
【図３】 図３は、種々の阻害剤で処理した乳癌細胞についてのクローン原
性アッセイおよびアポトーシスアッセイの結果を示す。
【図４】 図４は、腫瘍細胞および肝細胞における種々のパラメーターを示
す。
【図５】 図５は、腫瘍細胞および肝細胞におけるマロニルＣｏＡレベルを
示す。
【図６】 図６は、脂肪酸の細胞内酸化の経路を示す。ＣＰＴ-１はミトコ
ンドリアにおける脂肪酸の酸化を調節するが、これはパルミトイルＣｏＡのよう
な長鎖アシルＣｏＡ誘導体のミトコンドリア外膜からミトコンドリア内への通過
を制御し、それによって内部で合成された脂肪酸を酸化する無益回路を防止する
ことによる。
【図７】 図７は、Ｃ-７５の存在下および非存在下でのＭＣＦ-７細胞の増
殖に対するエトモキシルの影響を示す。
【図８】 図８は、ＭＣＦ-７細胞における脂肪酸酸化に対するセルレニン
の影響を示す。
【図９】 図９は、ＣＰＴ-１活性に対するエトモキシル、ＴＯＦＡ、およ
びセルレニンの影響を示す。
【図１０】 図１０は、ＭＣＦ-７細胞における脂肪酸酸化に対するエトモ
キシルの影響を示す。
【図１１】 図１１は、ＭＣＦ-７細胞の増殖に対するエトモキシルの影響
を示す。
【図１２】 図１２は、エトモキシルおよびＴＯＦＡの両方で処理したＭＣ
Ｆ-７細胞でのクローン原性アッセイの結果を示す。
【図１３】 図１３は、ＭＣＦ-７細胞の増殖に対するエトモキシルおよび
／またはＣ-７５の影響を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ // Ｃ０７Ｄ 303/48 Ｃ０７Ｄ 303/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 タウンセンド，クレイグ・エイ アメリカ合衆国メリーランド州21212，ボ ルティモア，ミッドハースト・ロード 116 (72)発明者 クハジュダ，フランシス・ピー アメリカ合衆国メリーランド州21209，ル ーサービル，ブロードウェイ・ロード 1211 Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB10 BB14 BB24 BB50 BB51 CB01 CB02 FB03 FB06 JA01 4C048 BC20 CC01 UU01 XX01 4C084 AA17 AA20 ZB21 ZB26 4C086 AA01 AA02 BA02 MA01 MA04 NA14 ZB21 ZB26 【要約の続き】

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生体において腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であり、
    該生体中の腫瘍細胞において細胞内マロニルＣｏＡの上昇を誘引する組成物を生
    体に投与することを含む上記方法。
  2. 【請求項２】 該生体の細胞中の細胞内マロニルＣｏＡが急激に増加する、
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 細胞内マロニルＣｏＡがマロニルＣｏＡの消費速度のあらゆ
    る有意な上昇に先立って増加する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 該生体の細胞中の細胞内マロニルＣｏＡが該投与の3時間以
    内に増加する、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 細胞内マロニルＣｏＡが細胞の増殖阻害に先だって増加する
    、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 細胞内マロニルＣｏＡの該増加がマロニルＣｏＡの消費の低
    下と相関する、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 細胞内マロニルＣｏＡの該増加がマロニルＣｏＡデカルボキ
    シラーゼ（ＭＣＤ）の細胞内活性の低下または脂肪酸シンターゼの細胞内活性の
    低下と相関する、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 該組成物がＭＣＤの阻害剤を含有する、請求項１記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 細胞内マロニルＣｏＡの該増加がマロニルＣｏＡ合成の増加
    と相関する、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 細胞内マロニルＣｏＡの該増加がアセチルＣｏＡカルボキ
    シラーゼ（ＡＣＣ）の細胞内活性の上昇と相関する、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該組成物がＡＣＣの活性化剤、クエン酸シンターゼの活性
    化剤、5'-AMP依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の阻害剤、および／または
    アシルＣｏＡシンターゼの阻害剤からなる群から選択される物質を含有する、請
    求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 第２の化学療法薬を生体に投与し、該第２の化学療法薬が
    脂肪酸合成を阻害しない、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該組成物の投与前の腫瘍細胞における細胞内マロニルＣｏ
    Ａレベルが非腫瘍細胞における正常なマロニルＣｏＡレベルより少なくとも２倍
    高い、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 処理前のレベルに比較してマロニルＣｏＡの細胞内レベル
    が上昇し、アセチルＣｏＡおよび遊離ＣｏＡの細胞内レベルが低下する、請求項
    １記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該生体のある細胞における脂肪酸合成速度が該組成物の投
    与前に標準より少なくとも２倍高く、該組成物の投与が該細胞に対して細胞障害
    性を有する、請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 該生体が脂肪酸合成速度が上昇した腫瘍細胞を含有し、該
    腫瘍細胞の細胞数が該組成物の投与後に減少する、請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該組成物がカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ
    （ＣＰＴ-１）の阻害剤を含有する、請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該組成物がエトモキシル（etomoxir）を含有する、請求項
    １記載の方法。
  19. 【請求項１９】 生体において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であり、該細
    胞に以下： ａ）該細胞における脂肪酸合成の阻害剤；および ｂ）該細胞における脂肪酸酸化の阻害剤 を投与することを含む上記方法。
  20. 【請求項２０】 該脂肪酸酸化阻害剤をＣＰＴ-２を有意に阻害しない量で
    投与する、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該脂肪酸合成阻害剤および該脂肪酸酸化阻害剤を、細胞障
    害性を示すセルレニンの用量で観察されるそれぞれの阻害と同様のレベルの阻害
    が起こるような量で投与する、請求項１９記載の方法。
  22. 【請求項２２】 腫瘍細胞に選択的な細胞障害性を有する組成物の検出を容
    易にするスクリーニング法であり、標的組成物を細胞内マロニルＣｏＡレベルが
    高い細胞に投与し、該投与後の該細胞における細胞内マロニルＣｏＡをモニタリ
    ングすることを含み、ここで細胞内マロニルＣｏＡの急激な上昇が選択的細胞障
    害性を示す、上記スクリーニング法。
  23. 【請求項２３】 ＴＯＦＡの存在下および非存在下での細胞内マロニルＣｏ
    Ａレベルの変化の様式を比較することを更に含み、ＴＯＦＡ存在下でのマロニル
    ＣｏＡレベルの変化の減少が選択的細胞障害性を示す、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 腫瘍細胞に対して増殖阻害性を有する組成物の検出を容易
    にするスクリーニング法であり、標的組成物を腫瘍由来細胞系に投与し、該投与
    後に該細胞におけるＣＰＴ-１活性をモニタリングすることを含み、ＣＰＴ-１活
    性の低下が増殖阻害の可能性を示す、上記スクリーニング法。
  25. 【請求項２５】 該細胞が浸潤性（permeabilized）である、請求項２４記
    載の方法。
  26. 【請求項２６】 該細胞のアポトーシスに関するモニタリングを更に含む、
    請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 アポトーシスに関するモニタリングがミトコンドリア膜内
    外電位差の測定、生体色素での染色、ウェスタンブロットを使用する全細胞にお
    けるカスパーゼ（caspase）活性化のモニタリング、そしてウェスタンブロット
    を使用するミトコンドリアから生成されるチトクロームＣの測定からなる群から
    選択される方法を含む、請求項２６記載の方法。
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