WO2007117038A1 - 癌の予防・治療剤 - Google Patents

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WO2007117038A1
WO2007117038A1 PCT/JP2007/058125 JP2007058125W WO2007117038A1 WO 2007117038 A1 WO2007117038 A1 WO 2007117038A1 JP 2007058125 W JP2007058125 W JP 2007058125W WO 2007117038 A1 WO2007117038 A1 WO 2007117038A1
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seq
inhibits
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present
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PCT/JP2007/058125
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Tetsuo Mashima
Takashi Tsuruo
Hideaki Tojo
Hiroyuki Sumi
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Japanese Foundation For Cancer Research
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive / therapeutic agent for cancer.
  • Fatty acid synthase is an enzyme responsible for the conversion of malonyl-CoA, which is a reaction at the entrance of fatty acid biosynthesis, to long-chain fatty acids (Wakil, SJ, Biochemistry, 28 ⁇ , 4523-4530, 1989) .
  • FAS is up-regulated in many cancer cells (Kuhajda, FP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 ⁇ , 6379-6383, 1994), and FAS expression suppression Inhibition of activity induces selective growth inhibition and cell death in cancer cells, while low toxicity to normal cells (Kuhajda, FP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Cerulenin As a FAS inhibitor, Cerulenin (Vance, D. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 48 ,, 649-656, 1972) is a natural low molecular weight compound derived from Cepha losporium caerulence. C75 (Pizer, ES et al., Cancer Res., 60 ⁇ , pp. 213-218, 2000) is known as a synthetic low-molecular compound.
  • ACS an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family
  • ACS-CoA is a substrate in intracellular lipid synthesis and fatty acid degradation / elongation reactions
  • ACS plays a central role in intracellular lipid metabolism and intracellular signal transduction by lipids.
  • ACS is also involved in the uptake of extracellular fatty acids (Faergemen, NJ & Knudsen, J., Biochemical. J., 323, 1-12, 1997).
  • ACS4 and ACS5 are up-regulated in human colon cancer and other human gliomas (Cao, Y. et al. Cancer Res., 61 ⁇ , 8429-843 pages 4, 2001, Yamashita, Y et al. Oncogene, 19 ⁇ , 5919-5925, 2000) .
  • ACS inhibition induces cancer-selective cell death (Mashima, T. et al. J. Natl.
  • Triacsin C As an ACS inhibitor, Triacsin C (Tomoda, H. et al., Biochem., A natural low-molecular compound derived from Streptorayces sp.
  • Triacsin C is known to inhibit A CS1 and ACS4 (Kim, J. -H. Et al. J. Biol. Chem.,
  • cancer cells can be killed more strongly by simultaneously inhibiting the activity of ACS and the activity of FAS. I found it. As a result of repeated studies based on these findings, the present invention has been completed.
  • Enzymes belonging to the Fasyl-CoA synthase family are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:
  • Enzymes belonging to the first Facil-CoA synthase family are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11
  • the prophylactic / therapeutic agent according to [1] above which is at least one selected from a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence to be produced, a partial peptide thereof, or a salt thereof,
  • Cancer preventive / therapeutic agent is a combination drug, the preventive / therapeutic agent described in [1] above, and [9]
  • Prophylactic / therapeutic agent is (i) an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family (Ii) a substance that inhibits the activity of a fatty acid synthase; and (ii) a substance that inhibits the activity of a fatty acid synthase.
  • a prophylactic / therapeutic agent according to [1] above which is a kit comprising at least one selected from the group consisting of a substance that inhibits the expression of a fatty acid synthase gene.
  • [1 0] (i) inhibits the activity of an enzyme belonging to the facilyl-CoA synthase family or (and) inhibits the expression of the gene of the enzyme, and (ii) the activity of a fatty acid synthase or
  • [1 1] (i) an effective amount of at least one selected from a substance that inhibits the activity of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family and a substance that inhibits the expression of a gene of the enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family. (Ii) a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a mammal at least one effective amount selected from a substance that inhibits the activity of a fatty acid synthase and a substance that inhibits the expression of a fatty acid synthase gene;
  • a substance that inhibits the activity of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family, and an enzyme gene belonging to the family of the acyl-CoA synthase family At least one selected from substances that inhibit expression;
  • Inhibitor a substance that inhibits the activity of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family, and a substance that inhibits the expression of the gene of the enzyme belonging to the facil-CoA synthase family.
  • an antibody against an enzyme belonging to the Facil-CoA synthase family (belonging to the Facil-CoA synthase family)
  • [1 6 ''] (i) An effective amount of a substance that inhibits the activity of the opi fatty acid synthase, an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family, or (and) (ii) the acyl-CoA synthase family A method for promoting apoptosis of cancer cells or a method for inhibiting the growth of cancer cells, wherein an effective amount of a substance that inhibits the expression of the gene of the enzyme to which it belongs and the gene of fatty acid synthase is administered to a mammal;
  • [1 7] (i) inhibits the activity of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family or (and) expression of the gene of the enzyme, and (ii) the activity of fatty acid synthase or (and) the gene of the enzyme Cancer cell apoptosis characterized by inhibiting the expression of PT / JP2007 / 058125 Method for promoting cis or method for inhibiting proliferation of cancer cells,
  • [17 ′] (i) the activity of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family or (and) an effective amount of a substance that inhibits the expression of the gene of the enzyme; and (ii) the activity of the fatty acid synthase or (and A method for promoting apoptosis of cancer cells or a method for suppressing proliferation of cancer cells, comprising administering an effective amount of a substance that inhibits gene expression of the enzyme to a mammal
  • Cancer preventive / therapeutic medicine refers to substances that have cancer preventive / therapeutic effects (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts) Liquid, animal tissue extract, plasma, etc.) itself or a medicine containing the substance. “Cancer prevention” includes preventing cancer metastasis or Z and recurrence.
  • the “pharmaceutical for promoting apoptosis of cancer cells” may be a substance itself having an effect of promoting apoptosis of cancer cells, and the substance (eg, synthetic compound, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, fermentation production) , Cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.).
  • substance eg, synthetic compound, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, fermentation production
  • Cell extracts eg, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.
  • “Pharmaceuticals for inhibiting cancer cell growth” are substances that have cancer cell growth-inhibiting action (eg, compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts) , Animal tissue extract, plasma, etc.) itself, or a medicine containing the substance.
  • “Inhibiting gene expression” refers to any one of a series of events from gene to protein production (for example, transcription (mRNA production) and translation (protein production)). By inhibiting it is meant inhibiting the production of the protein encoded by the gene.
  • “Inhibiting protein expression” means any of a series of events from gene encoding the protein to protein production (for example, including transcription (mRNA production) and translation (protein production)). By inhibiting these events, it means inhibiting the production of the protein.
  • Low molecular weight compound means a molecular weight of 10, 0 0 0 or less (preferably a molecular weight of 5, 0 And organic and inorganic substances having a molecular weight of 2,000 or less, particularly preferably a molecular weight of 70 or less.
  • Fig. 1 shows the effect of inhibiting cell growth when FASP and the harmful agent Cerulenin (15 g / ml) or C75 (15 ⁇ ⁇ / ⁇ 1) are added to SF268 / mock or SF268 / ACS5 cells and cultured for 24 hours.
  • FIG. The vertical axis shows the cell viability (%) when SF268 / mock without treatment is 100%.
  • Enzymes belonging to the Fasyl-CoA synthase family, fatty acid synthases (hereinafter sometimes referred to as proteins used in the present invention) are human warm-blooded animals (eg, mo ⁇ / mot, rats, mice, chickens).
  • Usagi, pig, hidge, ushi, monkey, etc. eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, knee cells, bone marrow cells, mesangium cells, Langerhans cells, epidermal cells, Epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils Spheres, monocytes, platelets, etc.), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or Such as cells, stem cells or cancer cells) or any tissue in which those cells exist, eg, the brain, each part of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal
  • SEQ ID NO: 1 As an enzyme belonging to the Fasyl-CoA synthase family, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: No .: 1 3 and SEQ ID NO: 15.
  • Examples include at least one selected from a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by amino acid sequence, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • the fatty acid synthase includes at least one selected from a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 or a partial peptide thereof or a salt thereof. Can be mentioned.
  • SEQ ID NO: 1 As the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence to be determined, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 1 3, SEQ ID NO: 1 5, or SEQ ID NO: 1 7
  • SEQ ID NO: 1 As the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence to be determined, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1, 1, SEQ ID NO: 1 3, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 17
  • Particularly preferred is an amino acid sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
  • proteins containing identical amino acid sequences include, for example, the above-mentioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 1 3 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • proteins containing identical amino acid sequences include, for example, the above-mentioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1 3 or SEQ ID NO: 15 containing the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: : 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 1 3 or SEQ ID NO: 15
  • acyl-CoA synthetase activity examples include, for example, an acyl-CoA synthetase activity.
  • Substantially homogeneous means that their properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, the acyl-CoA synthase activity is the same.
  • Etc. eg, about ⁇ ⁇ 0 1 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as molecular weight may be different.
  • the acyl-CoA synthase activity can be measured according to a method known per se, for example, the method described in J. Biol. Chem., 256 ⁇ , pages 5702-5707, 1981 or a method analogous thereto.
  • the protein used in the present invention is divided into 0.2 M Tris-HC1 buffer (pH 7.5), 2.5 mM ATP, 8 mM MgCl 2 , 2 mM EDTA, 20 mM NaF, 0.1 % (w / v) Triton X - 100, 10 ⁇ ⁇ [1 - 14 C] palmitic acid (5 ⁇ ( ⁇ / / ⁇ 1 ) and 0. 5 mM coenzyme a (CoA) 0.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 And a protein having substantially the same quality of activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is preferred.
  • substantially the same activity examples include fatty acid synthase activity.
  • Substantially homogeneous means that their properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. Accordingly, it is preferable that the fatty acid synthase activity and the like are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about .0 :! to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). However, the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Fatty acid synthase activity is measured according to a method known per se, for example, the method described in Nepokroeff, CM et al., Methods Enzymol., 26 ⁇ , pp. 37-39, 1975, or a similar method. Can do.
  • the protein used in the present invention was prepared by adding 0.5 M potassium phosphate buffer (H 7.0), 0.2 mM malonyl-CoA, 0.06 6 mM acetyl-CoA, 0. 5 min at 30 ° C in 1 ml reaction solution containing 2 mM NADPH Measure the absorbance at 340 nm before and after the reaction, and calculate the enzyme activity from the difference in the absorbance values.
  • Examples of the protein used in the present invention include (1) (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 3 or SEQ ID NO: 15 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably 1 to An amino acid sequence from which about 10 amino acids, more preferably a number (1 to 5) amino acids have been deleted, (ii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 1 3 or SEQ ID NO: 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 (for example, about 1 to 100, preferably 1 to 30) An amino acid sequence to which about 1, preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids are added, (iii) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5,
  • (Ii) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 Amino acid sequence to which more than one (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are added (Iii) 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 (for example, 1 to: about L 0, preferably about 1 to 30 and preferably 1 to 10) Degree, more preferably a few (1-5) amino acids inserted (Iv) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably A so-called mutin such as a protein containing an amino acid sequence in which about 10 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (V) an amino acid sequence combining them included.
  • mutin such as a protein containing an amino acid sequence in which about 10 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the protein in this specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation.
  • the protein used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminal carboxyl group (-C00H), carboxylate (-C00-), amide (- C0N) or ester (-C00R) may be used.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl
  • alkyl groups such as n- butyl, for example, consequent opening pentyl
  • C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl , ⁇ 6 _ 12
  • Ariru group such as a one-naphthyl, for example, benzyl, phenyl one C DOO 2 a one-naphthyl primary alkyl group of which C 7 _ 14
  • Ararukiru group such as an alkyl group or flying one naphthylmethyl such phenethyl, Viva A royloxymethyl group or the like is used.
  • the protein used in the present invention has a carboxyl group (or force hydroxylate) other than the C-terminus
  • the protein used in the present invention also includes those in which the carboxyl group has been rendered or esterified. It is.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the amino acid residue (e.g., main Chionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C M Arukanoiru such Asechiru group
  • N-terminal glutamine residue produced by cleavage in the body is pyroglutamine oxidized
  • Substituents on the side chain of amino acids in the molecule for example, 1 OH, 1 SH, amino group, imidazole group, indole group, guaiacolsulfonate - Gino group, etc.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, shall be protected by Asechiru like C Ashiru group such as C M Arukanoiru group such as groups
  • Complex proteins such as so-called glycoproteins Included.
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • a protein containing the amino acid sequence represented are examples of the amino acid sequence represented.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is a partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. You can use either one. For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 2 or more of the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention. A peptide having an amino acid sequence of 0 or more is used.
  • the partial peptide used in the present invention is one or more in the amino acid sequence (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acids have been deleted, or 1 or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably numbers (1 to 5 pieces) in the amino acid sequence. ) Amino acids, or 1 or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably numbers (1 to 5) in the amino acid sequence. ) Amino acids, or one or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably a number (1) in the amino acid sequence. ⁇ 5)) amino acids may be substituted with other amino acids.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—C00H), a carboxylate (—C00—), an amide (—CONli), or an ester (—C00R).
  • the partial peptide used in the present invention includes those having a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C terminus, as well as the protein used in the present invention described above, an N-terminal amino acid residue (example) , A methionine residue) protected with a protecting group, a glutamine residue generated by cleavage of the N-terminal in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of the amino acid in the molecule Is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called sugar peptide to which a sugar chain is bound.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for antibody production.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • base eg, alkali metal salt
  • the acid addition salts that are acceptable are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid).
  • the protein used in the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced from the aforementioned human warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method, or a DNA encoding the protein can be obtained. It can also be produced by culturing the contained transformant. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human mammal tissue or cells are homogenized and then extracted with acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. It is possible to purify and isolate by combining chromatography such as chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be used for the synthesis of the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or an amide thereof.
  • Such resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 -Hydro Methyl oxymethyl methyl phenylamide resin, polyacrylamide
  • calpositimides are particularly preferable.
  • carbodiimides include DCC, N, N'-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl N, mono (3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, and the like.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOB t, HOOB t), or the activity of the protected amino acid as a symmetric anhydride, HOB t ester, or HOOB t ester in advance. It can be added to the resin after conversion.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin may be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, .N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as salt methylene chloride and black mouth form
  • Alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, -tolyls such as acetonitrile and propionitryl, and esters such as methyl acetate and ethyl acetate
  • an appropriate mixture of these is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be used for protein bond formation reaction, and is usually selected appropriately from a range of about 120 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • protecting groups for the starting amino groups include Z, B oc, t-pentyloxy, l-pionol, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 Z ⁇ B r — Z, Ryodamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, honolemil, 2_nitrophenylenosnolephenyl, dipheninorephosphinothioyl, F moc, etc. are used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (e.g., methyl, ethyl, propinole, pentinole, t-butyl ⁇ cyclopentinole, cyclohexenole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified e.g., methyl, ethyl, propinole, pentinole, t-butyl ⁇ cyclopentinole, cyclohexenole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Cyclic alkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzene esterenore, 4-methoxybenzenoestenole, 4-chlorobenzoinenoester, benzhydrylesterification
  • Phenacyl esterification pendinoreoxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected by, for example, esterification or etherification.
  • groups suitable for esterification include low-grade groups such as acetyl groups (aromatic groups such as C-to-alkanoyl groups, benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups derived from carbonates).
  • groups suitable for etherification include benzyl group, tetrahydrobiranyl group, and t-butyl group.
  • Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include B z 1 and C 1 2 —
  • Examples of protecting groups for imidazole in histidine include Tos, 4-methoxy
  • the activated carboxyl group of the raw material examples include, for example, the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophloenophenol, 2,4-dinitrophenol). Nore, Sianomethinore Alconole, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HO B t)] and the like.
  • the corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., or sodium in liquid ammonia Reduction is also used.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • an amide form of a protein or partial peptide for example, first, the first carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide (protein) chain on the amino group side is a desired chain. After extending to the length, the protein or partial peptide except for the protecting group of the N-terminal amino group of the peptide chain and the protein or partial peptide from which only the protecting group of the C-terminal carboxyl group is removed And these proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by condensation, all the protection is performed by the above method. The protecting group can be removed to obtain the desired crude protein or peptide. This crude protein or peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain the desired protein or peptide amide.
  • ester of a protein or peptide for example, the ⁇ -carboxyl group of the amino acid at the carboxy terminal is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired protein is obtained in the same manner as the protein or peptide amide. A quality or peptide ester can be obtained.
  • the partial peptide used in the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptide.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or amino acid that can constitute a partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protective group, the target peptide is produced by removing the protective group. Can do. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in the following (i) to (V).
  • Partial peptides used in the present invention can be purified and isolated by combining recrystallization and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained by a salt, the known method Alternatively, it can be converted into a free form or other salt by a method according to the method.
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the protein used in the present invention described above.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell, tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell 'tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. Any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like may be used.
  • it can be directly amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell tissue.
  • RT-PCR method reverse transcription polymerase chain reaction
  • DNA encoding the protein used in the present invention examples include (1) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: : DNA containing the nucleotide sequence represented by 14 or SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, sequence SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a base sequence that hybridizes under highly stringent conditions, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, sequence SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 DNA, or (2) arrangement DNA containing the nucleotide sequence represented by the sequence
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 2, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16
  • DNAs that can hybridize under various conditions include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 or sequences.
  • the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 under high stringency conditions is, for example, about 50% or more, preferably about 60%, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 % Or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of a DNA containing a base sequence having homology. Is used.
  • the hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring HarDor Lab. Press, 1989).
  • a method analogous thereto such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring HarDor Lab. Press, 1989).
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
  • High stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 4 OmM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 6 Indicates conditions at 5 ° C.
  • the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like represented by SEQ ID NO: 3.
  • a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence to be encoded a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 encodes a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • Examples of DNA include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, and DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is represented by SEQ ID NO: 8.
  • DNA containing the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 9.
  • a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 includes a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the like As the DNA encoding, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the like, and the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14
  • the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 contains the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • DNA that encodes a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 such as DNA
  • DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 is used.
  • the DNA encoding the partial peptide used in the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the partial peptide used in the present invention described above.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cDNA derived from cells, yarns and tissues, the above-described cDNA library derived from cells, yarns and tissues, and synthetic DNAs may be used.
  • DNA encoding the partial peptide used in the present invention examples include: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18
  • a DNA that can hybridize with a sequence has the same significance as described above.
  • the same high hydration method and high stringency conditions as described above are used.
  • Proteins and partial peptides used in the present invention (hereinafter referred to as D encoding these) In the explanation of cloning and expression of NA, these may simply be abbreviated as proteins used in the present invention).
  • Synthetic DNA having a part of the base sequence encoding the protein The ability to amplify by the PCR method using a DNA primer, or DNA incorporated into an appropriate vector or a part of the protein used in the present invention Can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding DNA or labeled with synthetic DNA.
  • the method of Haipuridaize Ichin Yon for example, Molecular Cloning 2 nd Ed (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) as possible out that according to the method described in.
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted by PCR, using known kits such as Mutan TM _super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc. It can be carried out according to a method known per se, such as duplex method or Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the third end side. These translation initiation codons and translation termination codons can also be added using appropriate synthetic DNA adapters.
  • the protein expression vector used in the present invention is, for example, (i) excising the target DNA fragment from the DNA encoding the protein used in the present invention, and (ii) extracting the DNA fragment in an appropriate expression vector. It can be produced by linking it downstream of the promoter.
  • plasmids derived from E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast Plasmids eg, p SH1 9 and p SH 15
  • pacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus
  • ⁇ 1_1 1, ⁇ 1, ⁇ Rc / CMV, pRc / RSV, pc DNAI / Neo, etc. are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are used as the host, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • the CMV (cytomegalovirus) promoter, SRa promoter, etc. are preferably used.
  • the host is Escherichia, trp promoter, 1 ac promoter, recA promoter, LP L promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc.
  • the host is Bacillus, S PO l promoter
  • yeast such as SP02 promoter and penP promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector contains an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selectable marker, SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r ), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G41 8 resistance).
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cells and using the dhfr gene as a selection marker, the target gene can be selected even in a medium containing no thymidine.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein used in the present invention. If the host is Escherichia, PhoA 'signal sequence, OmpA signal sequence, etc. If the host is Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If the MFa signal sequence, SUC2 'signal sequence, etc., the host is an animal cell In this case, insulin signal sequence, a / f interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced by using the thus constructed vector containing DNA encoding the protein used in the present invention.
  • the host for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K 1 2-DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 ⁇ , 160 (1968)], JM1 03 [Nucleic Acids Research, 9 ⁇ , 309 (1981)], JA 22 1 (Journal of Molecular Biology, 120 ⁇ , 517 (1978)], HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41 ⁇ , 459 (1969)], C 600 [Genetics, 39 ⁇ , 440 (1954)] are used.
  • Bacillus examples include Bacillus subtilis MI 1 14 [Gene, 24, 255 (1983)], 20 7-21 [Journal of Biochemistry, 95 ⁇ , 87 (1984)] Is used.
  • yeast examples include Saccharomyces cere visiae AH 22, AH22 R-, NA8 7-1 1 A, DKD-5D, 20 B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1 9 1 3, NCYC 20 36, Pichia Nono 0 Sutorisu (Pichia pastoris), such as KM 7 1 is used. .
  • insect cells for example, when the virus is Ac NP V, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; S f cells), MG l cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, Trichoplusia ni Egg-derived High Five TM cells, Mamestra b rassicae-derived cells or Estigmena acrea-derived cells are used.
  • S f cells include S f 9 cells (ATCC CRL 1711), S f 21 cells (above, Vaughn, J. et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). It is done.
  • Animal cells include, for example, monkey cells COS-7, Chinese /, Muster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cells)
  • CHO cells monkey cells COS-7, Chinese /, Muster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cells)
  • Mouse L cells mouse At T-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC 5 cells, rat GH3, and human FL cells.
  • Transformation of Escherichia can be carried out, for example, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 ⁇ , 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982).
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168 ⁇ , 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding the protein can be obtained.
  • a liquid medium is appropriate as the culture medium, and some of them are necessary for the growth of the transformants.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn stee 'liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, etc.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. You can also add yeast extracts, vitamins, growth-promoting factors, etc.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of the medium for culturing Escherichia bacteria include glucose, casami M9 medium containing no acid (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972).
  • a drug such as 3 J3 -indolylacrylic acid can be added.
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • the medium When cultivating a transformant whose host is yeast, the medium may be, for example, a Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1 ⁇ 77 ⁇ , 4505 (1 98 0)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 ,, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Incubate at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, with aeration and agitation if necessary.
  • the medium used is Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). A material to which additives such as sera are appropriately added can be used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Incubate at about 27 ° C for about 3 to 5 days with aeration or agitation if necessary.
  • the medium When culturing a transformant whose host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122 ⁇ , 501 (1952)], DM EM Medium [Virology, 8 ⁇ , 396 (1959)], RPMI 1640 40 [The Journal of the American Medical Association 199 ⁇ , 519 (1967)], 1 9 9 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73 ⁇ , 1 (1950)] etc.
  • the pH is preferably about 6 to 8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours. Add aeration and agitation as necessary.
  • the protein used in the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
  • Separation and purification of the protein used in the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
  • the protein used in the present invention is extracted from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or
  • a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by freeze-thawing or the like is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-1100 TM . If the protein is secreted into the culture medium, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods that mainly use molecular weight differences methods that use charge differences such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, reverse-phase high-performance liquid chromatography, etc.
  • a method using the difference in hydrophobicity between the two a method using the difference in isoelectric point, such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the protein obtained by force When the protein obtained by force is obtained in the free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely when it is obtained as a salt, It can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the protein produced by the thread-recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein-modifying enzyme to act before or after purification.
  • protein-modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, anoregininoendopeptidase, protein kinase, and glycosidase.
  • the presence of the protein used in the present invention thus produced can be measured by engineering immunoassay or Western plotting using a specific antibody.
  • Anti-protein or partial peptide or salt thereof used in the present invention The body may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as the antibody can recognize the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof.
  • An antibody to a protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter, in the description of an antibody, these may be simply abbreviated as a protein used in the present invention) It can be used as an antigen and can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the protein used in the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier or diluent, at a site where antibody production is possible by administration.
  • a carrier or diluent In order to increase the ability to produce antibodies upon administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hidges, goats and chickens, with mice and rats being preferred.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with myeloma cells of the same or different animals.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but preferably PEG is used.
  • myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P 3U1, SP 2/0, AP-1 and P 3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG6000) Is added at a concentration of about 10 to 80%, and cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • PEG preferably PEG 1000 to PEG6000
  • the supernatant of a hybridoma is added to a solid phase (eg, a microplate) on which protein antigens are adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive substances or enzymes anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mouse
  • protein A is added to detect monoclonal antibody bound to the solid phase
  • Monoclonal antibody bound to the solid phase by adding the hyperidoma culture supernatant to the solid phase adsorbed with the anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding the protein labeled with a radioactive substance or enzyme, etc.
  • the method of detecting is mentioned.
  • the selection of monoclonal antibodies can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HA T (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). Any culture medium may be used as the selection culture medium as long as Hypridoma can grow. For example: ⁇ 20%, preferably 10 ⁇ 20% RPMI medium containing fetal bovine serum RPMI 16 40 medium, GIT medium containing 1 ⁇ 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) For example, serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • SFM-101 serum-free medium for hybridoma culture
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • Culture can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, such as immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE)).
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Adsorption / desorption method by ultracentrifugation, ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method to obtain antibody by dissociating the binding using active adsorbent such as protein A or protein G Can be done.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immune antigen (protein antigen) itself or a complex of it and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. It can be produced by collecting an antibody-containing substance against a protein and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are antibodies against hapten immunized by cross-linking with carrier.
  • a method of coupling at a ratio of 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • Various condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier, but glutaraldehyde is a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group, an active ester reagent containing a dithiobilidyl group, or the like.
  • the condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, or with a carrier or diluent.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • the administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the method described above.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as that of the monoclonal antibody.
  • Polynucleotides preferably DNA encoding proteins or partial peptides used in the present invention (hereinafter, in the description of antisense polynucleotides, these DNAs may be abbreviated as DNA used in the present invention.
  • the antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of (1) or a part thereof is the DNA sequence of DNA used in the present invention. Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a complementary or substantially complementary nucleotide sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA.
  • Antisense DN A is preferred.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to DNA used in the present invention is, for example, all bases of the nucleotide sequence complementary to DNA used in the present invention (that is, the complementary strand of DNA used in the present invention).
  • Examples include base sequences having homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a sequence or partial base sequence.
  • the base of the portion encoding the N-terminal site of the protein used in the present invention about 70% or more, preferably about 80 ° / 0 or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more homology with the complementary strand of the sequence (eg, base sequence near the start codon).
  • the antisense polynucleotide having the property is (ii) an antisense polynucleotide directed to RNA degradation by RNa se H, it is about 70% of the complementary strand of the entire base sequence of the DNA used in the present invention including the intron.
  • Each of the antisense polynucleotides having a homology of at least%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 90%, most preferably at least about 95% is suitable.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO:
  • An antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or a part of the base sequence (more preferably, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, sequence) Number: 12, distribution Column
  • Antisense polynucleotide is usually about 10 to 40, preferably 15 to Consists of about 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide that composes antisense DNA are chemically modified phosphate residues such as phosphoroate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. May be substituted.
  • the sugar (deoxyribose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2'-O-methylation, and the basic moiety (pyrimidine, purine) is also chemically modified. Any DNA may be used as long as it is hybridized to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer.
  • an antisense polynucleotide (nucleic acid) corresponding to the gene capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene used in the present invention is cloned or encoded as a determined protein. Design and synthesis based on DNA base sequence information.
  • Such an antisense polynucleotide can hybridize with the RNA of the protein gene used in the present invention, can inhibit the synthesis or function of the RNA, or the protein-related RNA used in the present invention. Through this interaction, the expression of the protein gene used in the present invention can be regulated and controlled.
  • a polynucleotide complementary to a selected sequence of the protein-related RNA used in the present invention and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the protein-related RNA used in the present invention are in vivo and in vivo. It is useful for regulating / controlling the expression of the protein gene used in the present invention, and for treating or diagnosing diseases.
  • the term “corresponding” means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, nucleotide sequences or nucleic acids including genes.
  • a “corresponding” between a nucleotide, a nucleotide sequence or a nucleic acid and a protein usually refers to the amino acid of the protein (as indicated) derived from the sequence of the nucleotide (nucleic acid) or its complement.
  • the target nucleic acid if the target nucleic acid can hybridize with the target region, the target nucleic acid is compared with the polynucleotide of the target region. It can be said that it is “antisense”.
  • Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, Other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (provided that such polymers are found in DNA and RNA) Base pairing contains nucleotides with a configuration that allows base attachment).
  • They may be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, DNA: RNA hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides) , With known modifications added, such as those with labels known in the art, capped, methylated, substituted with one or more natural nucleotides, analogs, molecules Internal nucleotide modifications, such as those with uncharged bonds (eg, methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, force rubamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate) , Phosphorothioate, etc., eg proteins (eg, nucleases, nucleases' inhibitors, toxins, antibodies Signal peptide, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharide), etc., side chain groups, those with intercurrent compounds (eg
  • Nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” as used herein include not only those containing purine opipyrimidine bases but also those having other heterocyclic bases modified. Good. Such modifications may include methylated purine opipyrimidine, acylated purine opipyrimidine, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more hydroxyl groups are replaced by halogens or aliphatic groups, or functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be designed as follows. That is, to make the antisense polynucleotide in the cell more stable, to increase the cell permeability of the antisense polynucleotide, to increase the affinity for the target sense strand, If it is toxic, make the antisense polynucleotide less toxic. Many such modifications have been reported, for example, in Pharm Tech Japan, 8 pp. 247 or 395, 1992, Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
  • the antisense polynucleotides of the present invention may be altered, contain modified sugars, bases, bonds, donated in special forms such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, It can be given in an added form. In this way, it can be used in addition form as a polycation such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, or a lipid that increases the interaction with the cell membrane or increases the uptake of nucleic acid ( Examples include hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterol. Preferred lipids to add include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside linkages.
  • Other groups include a cap group specifically located at the 3 or 5 or 5 ends of a nucleic acid to prevent degradation by nucleases such as exonuclease or RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylenedaricol.
  • the inhibitory activity of the antisense polynucleotide should be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein used in the present invention. Can do.
  • the pharmaceuticals such as the preventive / therapeutic agent for cancer of the present invention will be described in detail below.
  • amino acid represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1 3 or SEQ ID NO: 15 A protein containing an amino acid sequence substantially the same as the sequence “protein A used in the present invention”, a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 It may be abbreviated as “protein B used in the present invention”.
  • protein A used in the present invention an enzyme belonging to the Fasyl-CoA synthase family
  • protein B used in the present invention an enzyme belonging to the Fasyl-CoA synthase family
  • the apoptosis of cancer cells is selectively and strongly induced, and cancer cells are induced. Can be killed selectively and effectively. Therefore, (i) at least selected from a substance that inhibits the activity of protein A used in the present invention (eg, acyl-CoA synthetase activity) and a substance that inhibits the expression of the gene of protein A used in the present invention. And (ii) a small amount selected from a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention (eg, fatty acid synthase activity) and a substance that inhibits the expression of the gene for protein B used in the present invention.
  • a substance that inhibits the activity of protein A used in the present invention eg, acyl-CoA synthetase activity
  • a small amount selected from a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention eg, fatty acid synthase activity
  • Drugs that are combined with at least one type include, for example, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, retinal sarcoma, thyroid cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, Mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, duodenal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, knee cancer, vaginal endocrine tumor
  • cancer eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, retinal sarcoma, thyroid cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, Mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell
  • At least one selected from substances that inhibit the activity of protein A used in the present invention eg, acyl-CoA synthase activity
  • substances that inhibit the expression of protein A used in the present invention eg, acyl-CoA synthase activity
  • at least one selected from a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention eg, fatty acid synthase activity
  • a substance that inhibits the expression of the gene for protein B used in the present invention eg, fatty acid synthase activity
  • a substance that inhibits the expression of the gene for protein B used in the present invention may be the same substance.
  • a substance that inhibits the expression of the protein B gene used in the present invention also inhibits the activity or expression of the protein A used in the present invention and the activity or expression of the protein B used in the present invention at the same time. Therefore, it can be suitably used as a medicament for the above-described cancer preventive / therapeutic agent, cancer cell apoptosis promoter, cancer cell growth inhibitor, etc. of the present invention.
  • substances that inhibit the activity of protein A used in the present invention include: (a) a compound that inhibits the activity of protein A used in the present invention or a salt thereof; and (c) an antibody against protein A used in the present invention.
  • F A variant of protein A used in the present invention that acts in a dominant negative manner on protein A used in the present invention, or a polynucleotide encoding the same.
  • the activity of protein A used in the present invention is inhibited. It can be suitably used as a substance to be used.
  • the compound or salt thereof that inhibits the activity of protein A used in the present invention may be any compound or salt thereof that can inhibit the activity (eg, acyl-CoA synthase activity) of protein A used in the present invention.
  • a compound that binds to protein A used in the present invention and inhibits its activity or a salt thereof can be mentioned.
  • Such a compound or a salt thereof is, for example, a compound selected from peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like.
  • the compound may be a novel compound or a known compound.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids. It is done.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and strong sodium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; aluminum salt and the like.
  • Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picolin, 2,6-norethidine, ethanol ⁇ amine, diethanolamine, trieteranolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. N, N′-dibenzilethylenediamine and the like.
  • Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citrate, succinic acid, malic acid, methane
  • examples include salts with sulfonic acid, benzoic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and the like.
  • salt with basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like
  • preferable examples of the salt with acidic amino acid include aspartic acid, glutamic acid and the like. And salt.
  • physiologically acceptable salts are preferred.
  • inorganic salts such as alkali metal salts (eg, sodium salt, potassium salt), alkali earth metal salts (eg, calcium salt, magnesium salt, barium salt)
  • a salt with an inorganic acid such as hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, or acetic acid, phthalic acid, fumaric acid, sulfur And salts with organic acids such as acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, and p-toluenesulfonic acid.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of protein A used in the present invention Is preferably a low molecular weight compound.
  • Examples of the compound or a salt thereof that inhibits the activity of protein A used in the present invention include Triacsin C, 2-bromopalmitic acid or a salt thereof, and Triacsin C or a salt thereof is preferable.
  • the above compound or a salt thereof can be formulated and administered according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules) ), Syrups, emulsions and suspensions.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections and suppositories are used as parenterals for parenteral administration, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, joints, etc. Includes dosage forms such as internal injections.
  • Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above substance in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous solutions for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysonolene 80, HCO—50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)), etc.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysonolene 80, HCO—50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • An antibody against protein A used in the present invention preferably an antibody having a function of neutralizing (decreasing or eliminating) the activity of protein A used in the present invention (neutralizing antibody) is used in the present invention.
  • neutralizing antibody an antibody having a function of neutralizing (decreasing or eliminating) the activity of protein A used in the present invention.
  • Can inhibit protein A activity Therefore, it can be suitably used as a substance that inhibits the activity of protein A used in the present invention.
  • the antibody can be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration (eg, intravenous injection). Preferably provided as an inhalant.
  • compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
  • a variant of protein A used in the present invention that acts dominant negatively on protein A used in the present invention or a polynucleotide encoding the same inhibits the activity of protein A used in the present invention. Therefore, it can be suitably used as a substance that inhibits the activity of protein A used in the present invention.
  • “a variant of protein A that acts dominant negatively on protein A used in the present invention” means that its expression inhibits the activity of protein A used in the present invention ( It means a protein that has the effect of disappearing (or disappearing) (see Taira Yoshikazu, Gene Function Inhibition Experiments, Yodosha, pages 26-32, 2000, etc.).
  • the variant of protein A used in the present invention or a polynucleotide encoding the same can be formulated and administered according to conventional means.
  • the substance that inhibits the expression of protein A used in the present invention is not particularly limited as long as it inhibits the expression of protein A used in the present invention.
  • the protein used in the present invention A gene that codes for A (DNA) force, a substance that inhibits transcription to mRNA that encodes protein A used in the present invention, (ii) From the mRNA that encodes protein A used in the present invention, Examples include substances that inhibit the translation into protein A used.
  • protein A used in the present invention As a substance that inhibits the transcription from the gene (DNA) encoding protein A used in the present invention to the mRNA encoding protein A used in the present invention, protein A used in the present invention is used.
  • Encoding gene (DNA) used in the present invention There is no particular limitation as long as it inhibits transcription to mRNA encoding protein A.
  • DNA for transcription from the gene encoding DNA used in the present invention (DNA) to transcription to mRNA. Examples thereof include a substance that binds to a factor involved and inhibits transcription from the gene (DNA) encoding protein A used in the present invention to mRNA.
  • the substance that inhibits the expression of protein A used in the present invention include, for example, (b) a compound that inhibits the expression of protein A used in the present invention or a salt thereof, (d ) An antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding protein A used in the present invention, or a part thereof (e) used in the present invention A double-stranded RNA having an RNAI effect on a polynucleotide encoding protein A (eg, siRNA or shRNA to a polynucleotide encoding protein A used in the present invention), (g) Examples thereof include a polynucleotide having a ribozyme activity with respect to a polynucleotide encoding protein A used in the invention.
  • the compound or salt thereof that inhibits the expression of protein A used in the present invention can suppress the expression of protein A used in the present invention, it inhibits the expression of protein A used in the present invention. It can be suitably used as a substance to be used.
  • the compound or salt thereof that inhibits the expression of protein A used in the present invention is not particularly limited as long as it can inhibit the expression of protein A used in the present invention.
  • the present A gene (DNA) that encodes protein A used in the invention a compound that inhibits transcription to mRNA encoding protein A used in the present invention, and
  • niRN that encodes protein A used in the present invention A compound that inhibits translation from A to protein A used in the present invention. And so on.
  • protein A used in the present invention is encoded. There is no particular limitation as long as it inhibits transcription from the gene (DNA) to mRNA, but for example, transcription from the gene (DNA) encoding protein A used in the present invention to mRNA. Examples include compounds that bind to factors involved and inhibit transcription.
  • the compound encoding the protein A used in the present invention may be used in the present invention.
  • Examples of the compound or a salt thereof that inhibits the expression of protein A used in the present invention include Triacsin C, 2-promopalmitic acid or a salt thereof, and Triacsin C or a salt thereof is preferable.
  • the above compound or a salt thereof can be formulated and administered according to conventional means, for example, in the same manner as the above compound or a salt thereof that inhibits the activity of protein A used in the present invention. ..
  • An antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding protein A used in the present invention or a part thereof is low toxic, Since the expression of the gene encoding protein A used in the invention can be suppressed and the expression of protein A used in the present invention can be suppressed, the expression of protein A used in the present invention is inhibited. It can be suitably used as a substance. As such an antisense polynucleotide, those described above are used.
  • the antisense polynucleotide can be formulated and administered according to a method known per se.
  • the above-described antisense polynucleotide can be used alone or as a retrotoxin After insertion into an appropriate vector such as a virus vector, adenovirus vector, adenovirus association virus vector, etc., a human or mammal (eg, rat, rabbit, hidge, pig, mouse, etc.) is routinely used. , Cats, dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally.
  • the antisense polynucleotide can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as a trapping agent for promoting ingestion, and can be administered through a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter. Alternatively, it can be aerosolized and locally administered into the trachea as an inhaler.
  • the above-mentioned antisense polynucleotides can be formulated (injection) alone or together with a carrier such as ribosome, and then intravenous, subcutaneous, joint May be administered intracavity, cancerous lesions, etc.
  • Double-stranded RNA having an RNAi action on a polynucleotide encoding protein A used in the present invention eg, si RNA or sh RNA for a polynucleotide encoding protein A used in the present invention, etc.
  • a polynucleotide encoding protein A used in the present invention eg, si RNA or sh RNA for a polynucleotide encoding protein A used in the present invention, etc.
  • Is low toxic can inhibit the translation of the gene encoding protein A used in the present invention, and can suppress the expression of protein A used in the present invention. It can be suitably used as a substance that inhibits the expression of protein A.
  • Such a double-stranded RNA having an RNA i action on a polynucleotide encoding the protein A used in the present invention contains a part of the RNA encoding the protein used in the present invention.
  • Double-stranded RNA eg, si RNA (small ⁇ short) interfering RNA for the polynucleotide encoding protein A used in the present invention
  • sh RNA small (short) hai rpin RNA
  • Such double-stranded RNA can be obtained by known methods (eg, Nature, 411 ⁇ , 494, 2001; JP 2002-516606 A2; US Patent Application Publication No. 2002/086356; Nature Genetics, 24 ⁇ , 180-183, 2000; Genesis, 26 ⁇ , 240-244, 2000; Nature, 407 ⁇ , 319-320, 2002; Genes & Dev., 16 ⁇ , 948-958 , 2002; Pro c. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 5515-5520, 2002; Science, 296, 550-553, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the length of double-stranded RNA having RNA i action used in the present invention is usually 17 to 30 bases, preferably 19 to 27 bases, more preferably 20 to 22 bases.
  • the heavy chain RNA can be formulated and administered in the same manner as the above antisense polynucleotide.
  • the polynucleotide having the ribozyme activity with respect to the polynucleotide encoding the protein A used in the present invention can suppress the expression of the protein A used in the present invention
  • the protein A used in the present invention It can be suitably used as a substance that inhibits the expression of.
  • Such ribozymes can be obtained by known methods (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7 ⁇ , 221 pages, 2001; FEBS Lett., 228 ⁇ , 228 pages, 1988; FEBS Lett., 239 ⁇ , pages 285). , 1988; Nucl. Acids. Res., 17 ⁇ , 7059, 1989; Nature, 323 ⁇ , 349, 1986; Nucl. Acids.
  • RNA encoding protein A used in the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known ribozyme.
  • the above ribozymes include large ribozymes such as group I introns and MRNA contained in RNase P, and small ribozymes such as hammerheads and hairpins (Protein Nucleic Acid Enzyme, 35 ⁇ , 2191, 1990) )
  • hammerhead ribozymes see, for example, FEBS Lett., 228 ⁇ , p. 228,
  • the polynucleotide having the ribozyme activity can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention include (a) a compound that inhibits the activity of protein B used in the present invention or a salt thereof, and (c) a protein used in the present invention.
  • the compound or its salt that inhibits the activity of protein B used in the present invention can inhibit the activity of protein B used in the present invention, it inhibits the activity of protein B used in the present invention. It can be suitably used as a substance to be used.
  • the compound or its salt that inhibits the activity of protein B used in the present invention is not particularly limited as long as it can inhibit the activity (eg, fatty acid synthase activity) possessed by protein B used in the present invention. However, examples thereof include compounds or salts thereof that bind to protein B used in the present invention and inhibit its activity.
  • Such a compound or a salt thereof is, for example, a compound selected from peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. May be.
  • the compound may be a novel compound or a known compound.
  • the salt of the compound the same salt as the salt of the compound that inhibits the activity of protein B used in the present invention is used.
  • a low molecular weight compound is preferable.
  • Examples of the compound or a salt thereof that inhibits the activity of protein B used in the present invention include Cerulenin, C75 or a salt thereof, and Cerulenin, C75 or a salt thereof is preferable.
  • the above compound or salt thereof can be formulated and administered in the same manner as the compound or salt thereof that inhibits the activity of protein A used in the present invention.
  • An antibody against protein B used in the present invention preferably an antibody having a function of neutralizing (decreasing or eliminating) the activity of protein B used in the present invention (neutralizing antibody) is used in the present invention. Since the activity of protein B can be inhibited, it can be suitably used as a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention.
  • the above antibody can be formulated and administered in the same manner as the antibody against protein A used in the present invention described above.
  • variant of protein B used in the present invention that acts in a dominant negative manner on protein B used in the present invention or a polynucleotide encoding the same inhibits the activity of protein B used in the present invention. Therefore, it can be suitably used as a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention.
  • mutant of protein B acting in a dominant negative manner against protein B used in the present invention is used in the present invention by expressing a polynucleotide encoding the same. It means a protein that has the action of inhibiting (disappearing or reducing) the activity of protein B (see Taira Yoshikazu, edited by gene function inhibition method, Yodosha, pp. 26-32, 2001, etc.)
  • the variant of protein B used in the present invention or the polynucleotide encoding the same can be formulated and administered according to conventional means.
  • the substance that inhibits the expression of protein B used in the present invention is not particularly limited as long as it inhibits the expression of protein B used in the present invention.
  • the protein used in the present invention A gene that inhibits transcription of the gene (DNA) encoding B to the mRNA encoding the protein B used in the present invention; (ii) used in the present invention from the mRNA encoding the protein B used in the present invention.
  • a substance that inhibits translation into protein B is not particularly limited as long as it inhibits the expression of protein B used in the present invention.
  • the substance encoding protein B used in the present invention is encoded. Any gene may be used as long as it inhibits the transcription of the gene (DNA) to the mRNA encoding the protein B used in the present invention. Although not limited, for example, it binds to a factor involved in transcription from the gene encoding protein B used in the present invention (DNA) to mRNA, and encodes protein B used in the present invention. Examples include substances that inhibit transcription from genes (DNA) to mRNA.
  • the substance used in the present invention from the mRNA encoding the protein B used in the present invention is used. There is no particular limitation as long as it inhibits the translation into the protein B to be obtained. For example, it is involved in the translation from the mRNA encoding the protein B used in the present invention to the protein B used in the present invention. And a substance that inhibits the translation of nRNA from protein B used in the present invention to the protein B used in the present invention.
  • the substance that inhibits the expression of protein B used in the present invention include, for example, (b) a compound that inhibits the expression of protein B used in the present invention or a salt thereof, (d ) An antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding protein B used in the present invention, or a part thereof, (e) used in the present invention A double-stranded RNA having an RNA i action on a polynucleotide encoding protein B (eg, siRNA or shRNA for a polynucleotide encoding protein B used in the present invention), (g) Examples thereof include a polynucleotide having a ribozyme activity with respect to a polynucleotide encoding protein B used in the description.
  • a compound that inhibits the expression of protein B used in the present invention or a salt thereof an antisense polynucleotide containing a base
  • the compound or salt thereof that inhibits the expression of protein B used in the present invention can suppress the expression of protein B used in the present invention, it inhibits the expression of protein B used in the present invention. It can be suitably used as a substance to be used.
  • the compound or salt thereof that inhibits the expression of protein B used in the present invention is not particularly limited as long as it can inhibit the expression of protein B used in the present invention.
  • the present A compound that inhibits transcription of the gene (DNA) encoding the protein B used in the invention to the mRNA encoding the protein B used in the present invention to the protein B used in the present invention.
  • an mRNA that encodes the protein B used in the present invention To the protein B used in the present invention.
  • (I) a gene encoding protein B used in the present invention As a compound that inhibits transcription from (DNA) to niRNA encoding the protein B used in the present invention, transcription from the gene (DNA) encoding protein B used in the present invention to mRNA is used. There is no particular limitation as long as it inhibits, but, for example, a compound that binds to a factor involved in transcription from the gene (DNA) encoding protein B used in the present invention to mRNA and inhibits transcription, etc. Are listed.
  • the present invention is derived from the mRNA encoding the protein B used in the present invention.
  • the present invention inhibits the translation into protein B used in the invention.
  • it is involved in the translation from the mRNA encoding the protein B used in the present invention to the protein B used in the present invention.
  • a compound that binds to a factor that inhibits translation and inhibits translation As the compound or its salt that inhibits the expression of protein B used in the present invention, a low molecular weight compound is preferred.
  • Examples of the compound or a salt thereof that inhibits the expression of protein B used in the present invention include Cerulenin, C75 or a salt thereof, and Cerulenin, C75 or a salt thereof is preferable.
  • the above compound or a salt thereof can be formulated and administered in the same manner as the compound or a salt thereof that inhibits the expression of protein A used in the present invention.
  • An antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding protein B used in the present invention or a part thereof has low toxicity, Since the expression of the gene encoding the protein B used in the present invention can be suppressed and the expression of the protein B used in the present invention can be suppressed, the expression of the protein B used in the present invention is inhibited. It can be suitably used as a substance to be used. As such an antisense polynucleotide, those described above are used.
  • the antisense polynucleotide includes an antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide encoding protein A used in the present invention, or a part thereof. Similarly, it can be formulated and administered.
  • double-stranded RNA having an RNA i action for example, siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding protein B used in the present invention
  • RNA i action for example, siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding protein B used in the present invention
  • protein B used in the present invention Since the translation of the encoded gene can be suppressed and the expression of protein B used in the present invention can be suppressed, it is preferably used as a substance that inhibits the expression of protein B used in the present invention. Can do.
  • Such a double-stranded RNA having an RNA i action on the polynucleotide encoding protein B used in the present invention contains a part of the RNA encoding the protein used in the present invention.
  • Double-stranded RNA eg, siRNA (small (short) interfering RNA), sh RNA (small (short) hai rpin RNA), etc.
  • siRNA small (short) interfering RNA
  • sh RNA small (short) hai rpin RNA
  • Such double-stranded RNA is based on the sequence of the polynucleotide of the present invention in the same manner as double-stranded RNA having RNAi action on the polynucleotide encoding protein A used in the present invention. Can be designed and manufactured.
  • the length of the double-stranded RNA having R NA i action used in the present invention is usually 17 to 30 bases, preferably 19 to 27 bases, more preferably 20 to 22 bases.
  • the double-stranded RNA can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • protein B used in the present invention can be suitably used as a substance that inhibits the expression of.
  • ribozymes are prepared by known methods (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7, 221, 2001; FEBS Lett., 228 ⁇ , 228, 1988; FEBS Lett., 239 ⁇ , 285, 1988; Nucl. Aci ds. Res., 17 ⁇ , 7059, 1989; Nature, 323, 349, 1986; Nucl. Acid s.
  • RNA encoding protein B used in the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known liposome.
  • the above ribozymes include large ribozymes such as Group I introns and MlRNA contained in RNase P, and small ribozymes such as hammerheads and hairpins (Protein Nucleic Acid Enzyme, 35 ⁇ , pages 2191) 1990).
  • hammerhead ribozyme and hairpin ribozyme you can refer to the documents mentioned above.
  • the polynucleotide having the ribozyme activity can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • Examples of the medicament for preventing / treating cancer according to the present invention include a compound that inhibits the activity of protein A used in the present invention or a salt thereof, and a compound that inhibits the activity of protein B used in the present invention or a salt thereof.
  • a cancer preventive / therapeutic agent combined with a salt, a cancer cell apoptosis promoter, a cancer cell growth inhibitor and the like are preferred.
  • a substance that inhibits the activity of an enzyme belonging to the first acyl-CoA synthase family and a fatty acid synthase (i) a substance that inhibits the activity of an enzyme belonging to the first acyl-CoA synthase family and a fatty acid synthase; and (ii) expression of an enzyme gene belonging to the acyl-CoA synthase family and a fatty acid synthase gene.
  • the substance that inhibits the same may be the same substance.
  • the pharmaceutical agent such as the above-described cancer preventive / therapeutic agent of the present invention is in a form capable of simultaneously inhibiting the activity or expression of protein A used in the present invention and the activity or expression of protein B used in the present invention. That's fine.
  • (i) used in the present invention And (ii) the activity of protein B used in the present invention, and at least one selected from a substance that inhibits the activity of protein A, and a substance that inhibits the expression of the gene of protein A used in the present invention.
  • a pharmaceutical composition eg, tablets (including sugar-coated tablets, film-coated tablets)
  • a medicament such as a prophylactic / therapeutic agent for cancer of the present invention comprises: (i) a substance that inhibits the activity of protein A used in the present invention and a substance that inhibits the expression of the gene for protein A used in the present invention.
  • a pharmaceutical comprising at least one selected from the above, and (ii) a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention and a substance that inhibits the expression of the protein B gene used in the present invention. It may be a kit comprising a pharmaceutical comprising at least one of the above.
  • a medicament containing at least one selected from the substance that inhibits the activity of protein A used in the present invention and the substance that inhibits the expression of the gene of protein A used in the present invention;
  • a pharmaceutical comprising at least one selected from a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention and a substance that inhibits the expression of the gene of protein B used in the present invention.
  • a weight ratio of about 1: 500 to 500: preferably about 1: 100 to 100: 1, more preferably 1:10 to: 10: 1, especially Preferably it is 1: 5 to 5: 1.
  • a substance that inhibits the activity of protein B used in the invention, and at least one selected from substances that inhibit the expression of the gene of protein B used in the present invention for example, the method described above Etc., and can be formulated according to conventional means.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules) ), Syrups, emulsions and suspensions.
  • a powerful composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, intraarticular injections. Includes dosage forms such as agents.
  • Such an injection is prepared by a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above substance in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous solutions for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polyoxyethylene (80 mol), HCO—50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polyoxyethylene (80 mol), HCO—50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form. 5 to 10 O mg for injections and 10 to 25 O mg for other dosage forms
  • Substances that inhibit the activity of protein A used in the present invention, and proteins used in the present invention At least one selected from substances that inhibit the expression of the gene of A, (ii) the substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention, and the expression of the gene of protein B used in the present invention It is preferable that at least one selected from the substances to be contained is contained.
  • compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the above substances.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • humans or warm-blooded animals eg mice, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, birds, cats, dogs, monkeys) , Chimpanzee etc.
  • parenterally e.g. mice, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, birds, cats, dogs, monkeys.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, symptom, administration route, etc.
  • the protein used in the present invention A substance that inhibits the activity of A, and at least one substance selected from substances that inhibit the expression of the gene of protein A used in the present invention; and (ii) a substance that inhibits the activity of protein B used in the present invention, and
  • oral administration of at least one selected from substances that inhibit the expression of the protein B gene used in the present invention generally in adults (with a body weight of 60 kg), About 0. To about 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 O mg.
  • the dose of the substance varies depending on the target disease, administration subject, symptom, administration route, etc.
  • At least one selected from a substance that inhibits the activity of protein A used and a substance that inhibits the expression of the gene of protein A used in the present invention are used in the present invention.
  • at least one selected from substances that inhibit the active life of protein B and substances that inhibit the expression of the protein B gene used in the present invention is generally used.
  • the substance is about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 mg per day, respectively.
  • the pharmaceuticals such as the above-mentioned cancer preventive / therapeutic agents of the present invention include hormone therapeutic agents, anticancer agents (eg, chemotherapeutic agents, immunotherapeutic agents, or agents that inhibit the action of cell growth factors and their receptors).
  • concomitant drug e.g, chemotherapeutic agents, immunotherapeutic agents, or agents that inhibit the action of cell growth factors and their receptors.
  • the administration time is not limited, and these may be administered to the administration subject at the same time or may be administered with a time difference.
  • the dose can be appropriately selected based on clinically used dose.
  • the compounding ratio of the pharmaceutical agent such as the above-described cancer preventive / therapeutic agent of the present invention and the concomitant drug can be appropriately selected according to the administration subject, administration route, target disease, symptom, combination and the like.
  • hormones include phosfestol, jetylstilbestrone, chlorotriacene, medroxyprogesterone acetate, megestronole acetate, chronoremadinone acetate, cyproterone acetate, danazonore, dienogest, asoprisnil, guest arylestrenol, Linone, Nomegestronole, Tadenan, Mepanoretricine, Raloxifene, Talented Noremeloxifen, Reponolemeroxifene, Antiestrogens (eg, Tamenofen Taenoate, Toremifene Taenoate), ER Down Regulator (eg, Fluvestrant), Human menopausal gonadotropins, follicle stimulating hormone, pill formulation, mepitiostan, test mouth lactone, aminoglutethimide, LH-RH agonist (eg, vinegar Goserelin, buserelin, leu)
  • LH-RHagost eg, goserelin acetate, buserelin, reuprorelin, etc.
  • LH-RHagost eg, goserelin acetate, buserelin, reuprorelin, etc.
  • chemotherapeutic agent examples include alkylating agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, plant-derived anticancer agents and the like.
  • Alkylating agents include, for example, nitrogen mustard, nitrogen mustard hydrochloride-N-oxide, chlorambutyl, cyclophosphamide, phosphamide, thiotepa, canolevocon, and improsul tosylate.
  • Fan Busulfan, Dimustine hydrochloride, Mitobronitol, Melphalan, dacarbazine, Ranimustine, Estramustine sodium phosphate, Triethylenemelamine, Carmustine, Mouthmustine, Streptozocin, Piprobroman, Etognoresid, Canolepo brachin, Cisplatin , Mipoplatin, nedaplatin, oxalibratin, altretamine, ambmustine, dibrosbi hydrochloride, fotemustine, pre-donimustine, pumitepa, ribomustine, temozofume Leos ⁇ / fan, door opening Fosufuami de, zinostatin Lamar, Ryo Dozereshin, system scan Chin, Bizereshin and the like.
  • Antimetabolites include, for example, mercaptopurine, 6-mercaptopurine riboside, thioinosine, methotrexate, enocitabine, cytarabine, cytarabine otaphosphatate, ancitabine hydrochloride, 5-FU drugs (eg, fluorouracinore) ), Tegafunenore, UFT, Doxyfluridine, Carmofur, Garocitabine, Emitefur, etc.), Aminopterin, Leukovorin calcium, Tabloid, Butocin, Folate calcium, Levofolate calcium, Cladribine, Emitefur, Funoledarabine, Gemcidotorine , Pyritrexim, idoxyuridine, mitoguazone, thiazofurin, and ambmustine.
  • 5-FU drugs eg, fluorouracinore
  • Tegafunenore UFT
  • Doxyfluridine Carmofur, Garocitabine
  • anticancer antibiotics examples include actinomycin D, actinomycin mitomycin C, chromomycin A3, bleomycin hydrochloride, bleomycin sulfate, pepromycin sulfate, daunorubicin hydrochloride, doxorubicin hydrochloride, aclarubicin hydrochloride, pirarubicin hydrochloride, hydrochloric acid hydrochloride Epirubicin, Neocartinostatin, Misramycin, Sarcomomycin, Carcinophylline, Mitotane, Zorbi hydrochloride Syn, mitoxantrone hydrochloride, idarubicin hydrochloride, and the like.
  • plant-derived anticancer agent examples include etoposide, etoposide phosphate, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, vindesine sulfate, teposide, paclitaxel, docetaxel, pinorelbine and the like.
  • Immunotherapy includes, for example, pisipanil, krestin, schizophyllan, lentinan, ubenimex, interferon, interleukin, macrophage colony stimulating factor, granulocyte colony stimulating factor, erythropoietin, lymphotoxin, BCG vaccine, Examples include Corynebata trumpanolebum, levamisole, polysaccharide K, and procodazole.
  • cell growth factor in the “drug that inhibits the action of cell growth factor and its receptor”, any substance that promotes cell growth may be used.
  • a peptide with a molecular weight of 20,000 or less is used, and a factor that exerts its action at a low concentration by binding to the receptor is used.
  • EGF epidermal growth factor
  • substantially Substances with the same activity eg, EGF, Halledalin (HER2 ligand), etc.
  • Insulin or substances with substantially the same activity eg, insulin, IGF (insulin-like growth factor)- 1, IGF-2 etc.
  • FGF fibroblast growth factor
  • a substance having substantially the same activity eg, acidic FGF, basic FGF, KGF (keratinocyte growth factor), FGF-1 0, etc.
  • Others Cell growth factors e.g., CSF (colony stimulating factor), EP0 (erythropoietin;), IL-2 (interleukin-2), NGF (nerve growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGF ⁇ (transforming growth) fac tor ⁇ ), HGF (hepatocyte growth factor) N VEGF (vascular endothelial growth factor) and the like.
  • CSF colony stimulating factor
  • EP0 erythropoietin
  • IL-2 interleukin-2
  • NGF nerve growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF ⁇ transforming growth) fac tor ⁇
  • HGF hepatocyte growth factor
  • N VEGF vascular endothelial growth factor
  • the “cell growth factor receptor” may be any receptor that has the ability to bind to the above-mentioned cell growth factor. Specifically, the EGF receptor, the haredarin receptor (HER2) Insulin receptor, IGF receptor, FGF receptor-1 or FGF receptor-2.
  • “Agents that inhibit the action of cell growth factors” include trastuzumab (Herceptin TM; HER2 antibody), imatinib mesylate, ZD1839 or cetuximab, antibodies to VEGF (eg, bevacizumab), VEGF receptor Antibody, Gehuichi And el mouth chinib.
  • SEQ ID NOs in the sequence listing of the present specification indicate the following sequences.
  • 1 shows the amino acid sequence of human ACS6 isoform b.
  • Example 2 The base sequence of the primer used in Example 1 is shown.
  • Example 3 The base sequence of the primer used in Example 1 is shown.
  • Example 1 Acquisition of FASP and harmful agent resistance by ACS expression
  • Human ACS5 gene was cloned by PCR from human colon cancer HCT-15 cell cDNA. The following sequence was used as a primer for cloning of human ACS5.
  • the primer was set in the form that the termination codon TAG was replaced with TAT.
  • the reaction was performed at 94 ° C using AmpliTaq DNA polymerase (Applied Biosystems). 30 cycles of 30 seconds, 65 ° C, 30 seconds, 72 ° C for 4 minutes
  • the obtained cDNA fragment was cleaved at both ends with EcoRI and BamHI (Takara Bio Inc.), then cloned into pFLAG-CMV5 (Cosmo Bio Inc.) to obtain pFLAG-CMV-ACS5, and its DNA sequencing was performed. .
  • the sequence of the obtained cDNA was consistent with the known human ACS5 (AB033899).
  • the obtained ACS5 cDNA was excised from pFLAG-CMV-ACS5 in the form of a FLAG tag linked at the end of 3, and then the retrovirus vector pHa-IRES-DHFR (Kage K. et al. Int. J. Cancer, 97 ⁇ , 626-630 (2002), and pHa-ACS5-FLAG-IRES-DHFR was constructed.
  • the retroviral vector pHa-ACS5-FLAG-IRES-DHFR and the empty vector pHa- IRES- DHFR constructed by the method described in the previous section were introduced into mouse fibroblast PA317 using a mammalian transfection kit (Stratagene), and the virus A liquid was obtained. Furthermore, by infecting human glioma SF268 cells (ATCC) with the obtained virus solution and selecting with methotrexate 100 ng / ml as a selective drug, the stable expression strain SF268 / ACS5 and control / got mock.
  • the cell extract of each cell was analyzed by Western blot using anti-FLAG-M2 antibody (Sigma) (and anti-tubulin antibody (Sigma) as a control), and the stability of ACS5 protein in SF268 / ACS5 Expression was confirmed.
  • NCI-H23 cells were seeded on a 96iell plate at a concentration of 2000 cells / well, and one day later (A) Triacsin C, (B) Cerulenin, (C) C75, (D) Triacsin C and Cerulenin, (E) Triacsin C and C75, respectively, and treated for 3 days. It was measured by the Sulforhodamine B method (Skehan, P. et al., J. Natl. Cancer Inst., 82 ⁇ , pages 1107-1112, 1990), and each was compared with the results without treatment with the drug.
  • the added drug concentrations are 0.3 / x M for Triacsin C, 2 ⁇ M for Cerulenin, and C75 power 3 ⁇ 4 ⁇ .
  • the survival cell rate under the drug treatment conditions from (i) to (ii) above is as follows: (A) 56.3 ⁇ 0.5%, B) 70. 2 ⁇ 7.9%, (C) 61. 2 ⁇ 3.6%, (D) 13.4 ⁇ 1%, (iii) 15-3 ⁇ 1.0%.
  • Cancer cells can be selectively and effectively killed. Therefore, 1) (i) (a) a compound that inhibits the activity of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthetase family or a salt thereof, and (b) a compound that inhibits the expression of a gene of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthetase family.
  • An antisense polynucleotide containing a typical nucleotide sequence or a part thereof, and (e) at least one selected from siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family (Ii) (a) a compound that inhibits the activity of fatty acid synthase or a salt thereof, and (b) a compound that inhibits the expression of a fatty acid synthase gene or a salt thereof.
  • a polynucleotide, and (e) at least one selected from siRNA or shRNA against a polynucleotide encoding a fatty acid synthase 2) (i) a substance that inhibits the activity of an enzyme belonging to the acyl-CoA synthase family and a fatty acid synthase, or (and) (ii) a gene of an enzyme belonging to the family of the acyl-CoA synthase family
  • pharmaceuticals containing substances that inhibit the expression of fatty acid synthase genes include, for example, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, retinal sarcoma, thyroid cancer, pharyngeal cancer , Laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, duo

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Abstract

本発明は、癌細胞を選択的かつ効果的に死滅させることができる癌の予防・治療剤などを提供する。本発明のアシル-CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の活性を阻害する物質、およびアシル-CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、脂肪酸合成酵素の活性を阻害する物質、および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種とを組み合わせてなる医薬などは、癌細胞を選択的かつ効果的に死滅させることができる癌の予防・治療剤などとして使用することができる。

Description

明細書
癌の予防 ·治療剤 技術分野
本発明は、 癌の予防 ·治療剤などに関する。 発明の背景
脂肪酸合成酵素 （FAS) は、 脂肪酸生合成の入り口の反応であるマロニル -CoA から長鎖脂肪酸への変換を担う酵素である （Wakil, S. J. , Biochemistry, 28卷， 4523- 4530頁， 1989年） 。 FASは多くのがん細胞で発現が亢進しており （Kuhajda ， F. P. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91卷， 6379- 6383頁， 1994年） 、 また、 FASの発現抑制または活性抑制は、 正常細胞に対しては低毒性であるのに 対し、 癌細胞に選択的な増殖抑制や細胞死を誘導する （Kuhajda, F. P, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97卷， 3450 - 3454頁， 2000年， De Schrijver, E. et al. , Cancer Res. , 63巻， 3799- 3804頁， 2003年） 。 FAS阻害剤としては Cepha losporium caerulence由来の天然物低分子ィ匕合物である Cerulenin (Vance, D. e t al.， Biochem. Biophys. Res. Commun. , 48卷， 649- 656頁， 1972年） および合 成低分子化合物である C75 (Pizer, E. S. et al.， Cancer Res. , 60卷， 213-218 頁， 2000年） が知られている。
r~方、 ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素 （以下、 ACSと略記する） は、 長鎖脂肪酸からァシル -CoAへの変換を司る酵素である。 ァシル- CoAは、 細胞 内脂質合成および脂肪酸分解 ·伸長反応における基質となることから、 ACSは、 細胞内の脂質代謝さらには脂質による細胞内シグナル伝達において中心的な役割 を担う。 また ACSは、 細胞外脂肪酸の取込みにも関与する （Faergemen, N. J. & K nudsen, J.， Biochemical. J. , 323卷， 1-12頁， 1997年） 。 現在までに基質選択 性や細胞内局在の異なる 5つのアイソザィム （ACS1， 3, 4, 5， 6) がヒトおよび げっ歯類において同定されている （Coleman, R. A. et al. J. Nutr. , 132卷， 21 23 - 2126頁， 2002年） 。 これらのうち、 ACS4や ACS5は、 ヒト大腸がんゃヒトグリ ォーマなどで発現亢進している （Cao， Y. et al. Cancer Res. , 61卷， 8429 - 843 4頁， 2001年、 Yamashita, Y. et al. Oncogene, 19卷， 5919- 5925頁， 2000年） 。 さらに ACS阻害は癌選択的な細胞死を誘導する （Mashima, T. et al. J. Natl.
Cancer Inst. , 97卷， 765- 777頁， 2005年） 。 ACS阻害剤としては Streptorayces sp.由来の天然物低分子化合物である Triacsin C (Tomoda, H. et al. , Biochem.
Biophys. Acta. , 921卷， 595- 598頁， 1987年） が知られている。 Triacsin Cが A CS1と ACS4を阻害することが知られている （Kim， J. -H. et al. J. Biol. Chem. ,
276卷， 24667- 24673頁， 2001年） 。 発明の開示
現状の癌治療において、 既存の治療法によっては多くの癌を根治に導くことは できず、 新しい治療法の開発が望まれている。 とくに、 既存の抗癌剤はヒト正常 組織に対する副作用が問題である。 正常細胞に低毒性、 かつ、 癌細胞を選択的か つ強力に死に追い込む安全で優れた方法の開発が、 がんの治療成績の向上のため に切望されている。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 ACSの活 性と FASの活性を同時に阻害することにより、 癌細胞をより強く死滅させること が可能であることを見出した。 これらの知見に基づいて、 検討を重ねた結果、 本 発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
〔 1〕 (i) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の活性を阻害する物 質、 .およびァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素の遺伝子の発現を阻害す る物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する 物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なく とも一種とを組み合わせてなる癌の予防 ·治療剤、
〔2〕 ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素が、 配列番号： 1、 配列番 号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番 号： 1 3および配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩から選ばれる少なくとも一種である上記 〔1〕 記載の予防 ·治療剤、
C 3〕 ァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素が、 配列番号： 1、 配列番 号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9および配列番号： 1 1で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分べプチドまたはその塩から選ばれる少なくとも一種であ る上記 〔 1〕 記載の予防 ·治療剤、
〔4〕 脂肪酸合成酵素が、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩である上記 〔1〕 記載の予防 ·治療剤、
〔5〕 (i) (a) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素の活性を阻害す る化合物またはその塩、 （b) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 (c) ァシル -CoA合成酵素ファミリ 一に属する酵素に対する抗体、 （d) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵 素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 および （e ) ァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素をコードするポリヌクレオチドに 対する s i R NAまたは s h R N Aから選ばれる少なくとも一種と、 （ii) (a ) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、 （b) 脂肪酸合成酵素 の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （ 脂肪酸合成酵素に対する 抗体、 （d) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的 もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリ ヌクレオチド、 および （e) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドに対 する s i R NAまたは s h R.NAから選ばれる少なくとも一種とを組み合わせて なる上記 〔1〕 記載の予防 ·治療剤、
〔6〕 ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の活性を阻害する化合物ま たはその塩と脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩とを組み合わ せてなる上記 〔 1〕 記載の予防 ·治療剤、
〔7〕 (i) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素および脂肪酸合成酵 素の活性を阻害する物質、 または （および） （ii) ァシル -CoA合成酵素ファミリ 一に属する酵素の遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質を 含有してなる癌の予防 ·治療剤、
〔8〕 癌の予防 ·治療剤が配合剤である上記 〔1〕 記載の予防 ·治療剤、 〔9〕 予防'治療剤が、 （i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の 活性を阻害する物質、 およびァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素の遺伝 子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種を含有してなる医薬と、 （ ii) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発 現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種を含有してなる医薬とからなるキ ットである上記 〔 1〕 記載の予防 ·治療剤、
〔1 0〕 (i) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素の活性または （お よび） 該酵素の遺伝子の発現を阻害し、 かつ （ii) 脂肪酸合成酵素の活性または
(および） 該酵素の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌の予防 ·'治療方 法、
〔1 1〕 (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の活性を阻害する 物質、 およびァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素の遺伝子の発現を阻害 する物質から選ばれる少なくとも一種の有効量と、 （ii) 脂肪酸合成酵素の活性 を阻害する物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ば れる少なくとも一種の有効量とを哺乳動物に対して投与する癌の予防 ·治療方法 、
〔1 2〕 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 （i) ァシル -CoA合成酵素ファ ミリーに属する酵素の活性を阻害する物質、 およびァシル -CoA合成酵素フアミリ 一に属する酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、
(ii) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の 発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種との使用、 .
〔1 3〕 (i) ァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素の活性を阻害する 物質、 およぴァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素の遺伝子の発現を阻害 する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害す る物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少な くとも一種とを組み合わせてなる癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増 殖抑制剤、
〔1 4〕 (i) (a) ァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素の活性を阻害 する化合物またはその塩、 （b) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) ァシル -CoA合成酵素フアミ リ一に属する酵素に対する抗体、 （ ァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する 酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的 な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 および （ e) ァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素をコードするポリヌクレオチド に対する s i R N Aまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一種と、 （ii) ( a) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、 （b) 脂肪酸合成酵素 の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) 脂肪酸合成酵素に対する 抗体、 .(d) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的 もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリ ヌクレオチド、 および （e) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドに対 する s i R N Aまたは s li R NAから選ばれる少なくとも一種とを組み合わせて なる上記 〔1 3〕 記載の剤、
〔1 5〕 ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の活性を阻害する化合物 またはその塩と脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩とを組み合 わせてなる上記 〔1 3〕 記載の剤、
〔1 6〕 (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素および脂肪酸合成 酵素の活性を阻害する物質、 または （および） （ii) ァシル -CoA合成酵素フアミ リーに属する酵素の遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質 を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤、 〔1 6 ' 〕 (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素および脂肪酸合 成酵素の活性を阻害し、 または （および） （ii) ァシル -CoA合成酵素ファミリー に属する酵素の遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害することを特 徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法または癌細胞の増殖抑制方法、
〔1 6 ' ' 〕 (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素おょぴ脂肪酸 合成酵素の活性を阻害する物質の有効量、 または （および） （ii) ァシル -CoA合 成酵素フアミリ一に属する酵素の遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を 阻害する物質の有効量を哺乳動物に対して投与する癌細胞のアポトーシス促進方 法または癌細胞の増殖抑制方法、
〔1 7〕 (i) ァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素の活性または （お よび） 該酵素の遺伝子の発現を阻害し、 かつ （ii) 脂肪酸合成酵素の活性または (および） 該酵素の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトー P T/JP2007/058125 シス促進方法または癌細胞の増殖抑制方法、
〔1 7 ' 〕 (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の活性または （ および） 該酵素の遺伝子の発現を阻害する物質の有効量と、 （ii) 脂肪酸合成酵 素の活性または （および） 該酵素の遺伝子の発現を阻害する物質の有効量とを哺 乳動物に対して投与する癌細胞のアポトーシス促進方法または癌細胞の増殖抑制 方法
などを提供する。
「癌の予防 ·治療用医薬」 は、 癌の予防 ·治療作用を有する物質 （例、 合成化 合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽 出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） 自体であってもよく、 該物質を 含有してなる医薬であってもよい。 「癌の予防」 とは、 癌の転移または Zおよび 再発を防止するという意味を含む。
「癌細胞のアポトーシス促進用医薬」 は、 癌細胞のアポトーシス促進作用を有 する物質自体であってもよく、 該物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質 、 抗体、 非ぺプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血漿など） を含有してなる医薬であってもよい。
「癌細胞の増殖抑制用医薬」 は、 癌細胞の増殖抑制作用を有する物質 （例、 合 ^化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細 胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） 自体であってもよく、 該物 質を含有してなる医薬であってもよい。
「遺伝子の発現を阻害する」 とは、 遺伝子からタンパク質生成までの一連の事 象 （例えば、 転写 （m R NAの生成） 、 翻訳 （タンパク質の生成） を含む） のう ちのいずれかの事象を阻害することによって、 その遺伝子によってコードされる タンパク質の生成を阻害することを意味する。
「タンパク質の発現を阻害する」 とは、 当該タンパク質をコードする遺伝子か らタンパク質生成までの一連の事象 （例えば、 転写 （mR N Aの生成） 、 翻訳 （ タンパク質の生成） を含む） のうちのいずれかの事象を阻害することによって、 当該タンパク質の生成を阻害することを意味する。
「低分子化合物」 とは、 分子量 1 0 , 0 0 0以下 （好ましくは、 分子量 5 , 0 0 0以下、 より好ましくは分子量 2 , 0 0 0以下、 特に好ましくは分子量 7 0 0 以下） の有機および無機物質を意味する。 図面の簡単な説明
図 1は、 SF268/mockまたは SF268/ACS5細胞に、 FASP且害剤である Cerulenin (15 g/ml) または C75 (15 μ β/πι1) を添加して 24時間培養したときの細胞増殖抑制 効果を示す図である。 縦軸は薬剤無処理の SF268/mockを 100%としたときの細胞 生存率 （％) を示す。 ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素、 脂肪酸合成酵素 （以下、 これら を本発明で用いられるタンパク質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例 、 モ^/モット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル など） の細胞 （例、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓細 胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロフ ァージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球 、 好酸球、 単球、 血小板など） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細 胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の 駆細 胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大脳基库球、 海馬、 視床 、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 脾臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小 腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細胞もしくはその培養細胞 （例え ば、 MEL、 Ml、 CTLL- 2、 HT- 2、 WEHI- 3、 HL- 60、 JOSK- 1、 K562、 ML- 1、 MOLT- 3、 MO LT - 4、 MOLT- 10、 CCRF-CEMS TALL- 1、 Jurkat, CCRT- HSB- 2、 KE- 37、 SKW- 3、 HUT - 7 8、 HUT- 102、 H9、 U937、 TOP- 1、 HEレ JK- 1、 CMK、 K0- 812、 MEG- 01など） に由来 するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
ァシル- CoA合成酵素フアミリーに属する酵素としては、 配列番号： 1、 配列番 号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番 号： 1 3および配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその 塩から選ばれる少なくとも一種が挙げられる。
脂肪酸合成酵素としては、 配列番号： 1 7で表されるァミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩から選ばれる少なくとも一種が挙げられる。
配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 5または配列番号： 1 7で表さ れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 1、 配列 番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列 番号： 1 3、 配列番号： 1 5または配列番号： 1 7で表わされるアミノ酸配列と 約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Cen ter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) ¾r 用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリタス =BL0SUM62； フィ ルタリング = 0FF) にて計算することができる。
配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 3または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 前記の 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配 列番号： 1 1、 配列番号： 1 3または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号 : 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 3または配 列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活 性を有するタンパク質などが好まし！/、。
実質的に同質の活性としては、 例えばァシル- CoA合成酵素活性などが挙げられ る。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理 学的に） 同質であることを示す。 したがって、 ァシル -CoA合成酵素活性などが同 等 （例、 約 ο · 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分 子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ァシル -CoA合成酵素活性の測定は、 自体公知の方法、 例えば、 J. Biol. Chem. ， 256卷、 5702- 5707頁， 1981年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測 定することができる。 具体的には、 本発明で用いられるタンパク質を、 0. 2 M Tr is- HC1緩衝液 (pH7. 5) 、 2. 5 mM ATP、 8 mM MgCl2、 2mM EDTA、 20 mM NaF、 0. 1 % (w/v) Triton X - 100、 10 μ Μ [1 -14 C]パルミチン酸 （5 μ (^/ / ιηο1) および 0. 5 mM coenzyme A (CoA)を含む 0. 5 mlの溶液中において、 35°Cで 10分間反応させる 。 反応は CoAを加えることにより開始し、 イソプロパノール： n -ヘプタン： 1M 硫酸 （40： 10： 1, v/v) を 2. 5 ral加えることにより停止する。 反応停止後、 0. 5 mlの水および 2. 5 mlの n-ヘプタンを加えて未反応の脂肪酸を含む有機溶媒相を除 き、 さらに、 水相を 2. 5 mlの n -ヘプタンで 3回洗浄し、 水相に残った放射活性を シンチレーションカウンターで測定する。
配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
実質的に同質の活性としては、 例えば脂肪酸合成酵素活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的 に） 同質であることを示す。 したがって、 脂肪酸合成酵素活性などが同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . ：!〜 1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量など の量的要素は異なっていてもよい。
脂肪酸合成酵素活性の測定は、 自体公知の方法、 例えば、 Nepokroeff, C. M. e t al.， Methods Enzymol. , 26卷， 37- 39頁， 1975年に記載の方法またはそれに準 じる方法に従って測定することができる。 具体的には、 本発明で用いられるタン パク質を、 0. 5 Mリン酸カリゥム緩衝液 ( H 7. 0) 、 0. 2 mMマロニル- CoA、 0. 06 6 mMァセチル- CoA、 0. 2 mM NADPHを含む 1 mlの反応溶液中において 30°Cで 5分間 反応させ、 反応前後の 340 nmの吸光度を測定し、 それらの吸光度の値の差から酵 素活性を算出する。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （1 ) (i) 配列番 号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号 : 1 1、 配列番号： 1 3または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列中の 1ま たは 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましく は 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7 、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 3または配列番号： 1 5で表さ れるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1 〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配 列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 3ま たは配列番号： 1 5で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好 ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番 号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号 : 1 1、 配列番号： 1 3または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列中の 1ま たは 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましく は 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ 酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列 を含有するタンパク質などのいわゆるムティン、 （2 ) (i) 配列番号： 1 7で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好まし くは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 1 7で表されるァ ミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0 個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミ ノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列 に 1または 2個以上 （例えば 1〜： L 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入 されたァミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1 7で表されるァミノ酸配列中の 1また は 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸 で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を 含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入 、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明で用いられる タンパク質は、 C末端がカルボキシル基 (-C00H) 、 カルボキシレート（-C00— ) 、 アミ ド （- C0N ) またはエステル （- C00R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピル、 n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シク口ペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 a一ナフチル などの〇6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル一 Cト2 アルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの a一ナフチル一 アルキル基な どの C 7_14ァラルキル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （または力ルポ キシレート） を有している場合、 カルボキシル基が了ミ ド化またはエステル化さ れているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メ チォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C Mアルカノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断 されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一 O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール 基、 インドール基、 グァ -ジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C Mアルカノィル基などの C ァシル基など） で保護されてい るもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質な ども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配 列を含有するタンパク質、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号 ： 9で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 1で表される ァミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 3で表されるァミノ酸配列を 含有するタンパク質、 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質、 配列番号： 1 7で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげ られる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明で用 いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明で用 いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよレ、。 例えば、 本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好まし くは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチ ドなどが用いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好 ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1 または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付カ卩し、 または、 そのアミノ酸 配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0 個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そ のアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好まし くは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （- C00H) 、 カルボキシレート （- C00— ) 、 アミ ド （- CONli) またはエステル （- C00R) の何 れであってもよい。 さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられる タンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が 保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残 基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のァミノ酸の側鎖上の置換基が適当な 保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプチドなど の複合ぺプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分べプチドは抗体作成のための抗原としても用いること ができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に 許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩 が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩と しては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前 述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法に よって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D N Aを含有する形質 転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド 合成法に準じて製造することもできる。
ヒ トゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒ トゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを糸且み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそ のアミ ド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる 。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル榭脂、 ヒ ドロキシメチル樹脂 、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジル アルコール樹脂、 4一メチルベンズヒ ドリルアミン榭脂、 P AM樹脂、 4ーヒ ド 口キシメチルメチルフエ二ルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹月旨
、 4一 （2， ， 4 ' ージメ トキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂 、 4一 （2， ， 4 ' ージメ トキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノキシ 樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官 能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公 知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク 質または部分べプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶 液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部 分ぺプチドまたはそれらのァミ ド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性ィ匕試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類がよい。 カルボジィ ミド類としては、 D C C、 N， N'—ジイソプロピルカルボジイミ ド、 N—ェチ ルー N，一 （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミ ドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t , H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性 化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護ァミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, . N—ジメチルホルムァ.ミ ド， N, N—ジメチルァセトアミ ド， N—メチルビ ロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩ィ匕メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒ ドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの-トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応 を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十 分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて 未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないよう にすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t一ペンチルォキシ 力ルポ二ノレ、 イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメ トキシベンジルォキシカノレ ボニル、 C 1一 Zヽ B r— Z、 了ダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホノレミル、 2 _ニトロフエニノレスノレフエニル、 ジフエ二ノレ ホスフイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピノレ、 プチノレ、 t―ブチルゝ シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニ トロべンジノレエステノレ、 4—メ トキシべンジノレエステノレ、 4—クロ口べンジノレ エステル、 ベンズヒ ドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ペンジノレオキ シカルポニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテルィ匕によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 ( Cト アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシ カルボ-ル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸かち誘導される基などが用いら れる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒ ド ロビラニル基、 t -ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2—
B z l、 2—ニトロベンジル、 B r—Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4ーメ トキシ
- 2 , 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル
、 B u m、 B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 , 4， 5—トリクロ口フエノーノレ、 2， 4一ジニトロフエノ一ノレ、 シァノメチノレ アルコーノレ、 パラニトロフエノール、 H O N B、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N —ヒドロキシフタルイミ ド、 HO B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァ-ソール、 フエノーノレ、 チオアニソーノレ、 メタクレゾ一ノレ、 ノ ラクレゾ一ノレ、 ジメチノレスノレ フイド、 1， 4ーブタンジチオースレ、 1 , 2一エタンジチォーノレなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され 、 トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 ， 2 _エタンジチオール、 1 ， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸化ナトリゥム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。
' 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸のひ一カルボキシル基をアミ ド化して保護した後 、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプ チド鎖の N末端のひーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ぺプ チドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺ プチドとを製造し、 これらのタンパク質またはべプチドを上記したような混合溶 媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得 られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗 タンパク質またはべプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を 凍結乾燥することで所望のタンパク質またはべプチドのァミド体を得ることがで さる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミ ド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分べプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のぺプチドの 合成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダーゼ で切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例 えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用 いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
(i) M. Bodanszkyおよぴ M. A. 0ndetti、 ペプチド、シンセシス (Peptide Syn thesis) , Interscience Publ ishers, New York (1966年)
(ii) Schroederおよび Luebkeヽ ザ-ペプチド (The Peptide) , Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 20 5、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 .カラムクロマトダラ フィ一'液体ク口マトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分ぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分ぺプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によつて適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によつて遊離体または他の塩に変換することができる。 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述 した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとしては、 ゲ ノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 .組織由来の c DNA、 前記した細胞 '組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcri ption Polymerase Chain Reaction (以下、 RT- PCR法と略称する） によって増幅 することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 （1) 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 12、 配列番号： 14もしくは配列番号： 16で表される塩基配列を 含有する DNA、 または配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号 ： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 12、 配列番号： 14もしくは配列番号： 1 6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩 基配列を含有し、 前記した配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番 号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 13もしくは配列番号： 1 5で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有する タンパク質をコードする DNA、 または （2) 配列番号： 18で表される塩基配 列を含有する DNA、 または配列番号： 18で表される塩基配列とハイストリン ジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 前記した配列番号： 1 7で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有す るタンパク質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 10 、 配列番号： 1 2、 配列番号： 14または配列番号： 16で表される塩基配列と ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる DN Aとしては、 例えば 、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 10 、 配列番号： 12、 配列番号： 14または配列番号： 16で表される塩基配列と 約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 よ.り 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 1 8で表される塩基配列とハイストリンジ ントな条件下でハイブ リダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 1 8で表される塩基配列と 約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology information Basic Local Alignment Search Tool) を用レヽ 、 以下の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコ ァ = 1； ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
ハイプリダイゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え は、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring HarDor Lab. P ress, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライ ブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことが できる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従つて行なうことがで さる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 O m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 をコードする D N Aとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D N Aなどが、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコード する D NAとしては、 配列番号： 4で表される塩基配列を含有する D N Aなどが 、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 6で表される塩基配列を含有する D N Aなどが、 配列番 号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D N Aとして は、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する D N Aなどが、 配列番号： 9で 表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列 番号： 10で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、 配列番号： 1 1で表さ れるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号 ： 12で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、 配列番号： 13で表される アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 1 4で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 1 5で表されるアミ ノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 16で 表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 17で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 18で表さ れる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発 明で用いられる部分ぺプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいか なるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前 記した細胞 ·糸且織由来の c DNA、 前記した細胞 ·糸且織由来の c DNAライブラ リー、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 10、 配列 番号： 12、 配列番号： 14、 配列番号： 1 6もしくは配列番号： 18で表され る塩基配列を含有する DN Aの一部分を有する DNA、 または配列番号： 2、 配 列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 12、 配列番号： 14、 配列番号： 16もしくは配列番号： 18で表される塩基配列と ハイストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、 本発明 で用いられるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DN Aの一部分を含有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 10 、 配列番号： 1 2、 配列番号： 14、 配列番号： 16もしくは配列番号： 18で 表される塩基配列とハイブリダイズできる D N Aは、 前記と同意義を示す。 ハイプリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする D N Aのクロー-ングおよぴ発現の説明においては、 これらを単に本発明で用いら れるタンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニン グの手段としては、 本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列の一部 分を有する合成 DN Aプライマーを用いて PC R法によって増幅する力、 または 適当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明で用いられるタンパク質の一部ある いは全領域をコードする DN A断片もしくは合成 DNAを用いて標識したものと のハイブリダイゼーシヨンによつて選別することができる。 ハイプリダイゼ一ン ヨンの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2nd Ed (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことがで きる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方 法に従って行なうことができる。
D N Aの塩基配列の変換は、 P C R、 公知のキット、 例えば、 MutanTM_super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA - LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる 方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用することが できる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 ま た 3， 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適.当な合成 DN Aァ ダブターを用いて付加することもできる。
本発明で用いられるタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （i) 本発明で用 いられるタンパク質をコードする DN Aから目的とする DN A断片を切り出し、 (ii) 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ とにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 p BR322， p BR 32 5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10， p TP 5, p C 1 94) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH1 9， p SH 1 5) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス ， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρΑ1_1 1、 ρΧΤ 1、 ρ R c/CMV, p R c/RSV、 p c D N A I /N e oなどが用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を 宿主として用いる場合は、 SRひプロモーター、 SV40プロモーター、 LTR プロモーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられ る。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロ モーターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 1 a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 L PLプロモ 一ター、 l p pプロモーター、 T7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌で ある場合は、 S PO lプロモーター、 S P〇 2プロモーター、 p e nPプロモー ターなど、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモータ 一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞 である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい 。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r i と略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne o rと略称する場合がある、 G41 8耐性） 等が挙げられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明で用いられるタン パク質の N端末側に付加する。 宿主がェシヱリヒア属菌である場合は、 PhoA 'シ グナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α 一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母 である場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 'シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 a一/ f ンターフェロン · シグナ ル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明で用いられるタンパク質をコードする DN A を含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。 . 宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア ' コリ （Escheric hia coli) K 1 2 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160 (1968)〕 ， JM1 03 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309(1981)〕 ， J A 22 1 (Journal of Molecular Biology, 120卷， 517(1978)〕 ， HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41卷， 459 (1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39卷， 440 (1954)〕 などが用い られる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis ) M I 1 1 4 [Gene, 24 , 255(1983)] ， 20 7— 2 1 [Journal of Biochemist ry， 95卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ (Saccharomyces cere visiae) AH 22, AH22 R―， NA8 7- 1 1 A, DKD— 5D， 20 B- 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 9 1 3， NCYC 20 36, ピキア ノヽ0ストリス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。 . .
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NP Vの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞） 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG l細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra b rassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmN PVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細胞 ) などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711 ) 、 S f 2 1細胞 (以上、 Vaughn, J.し.ら、 In Vivo, 13, 213 - 217， (1977)) など が用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 卷， 592(1985)〕 。 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズ/、 ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r -) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH3, ヒ ト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA ， 69卷， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 1 68卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194卷， 182- 187 (19 91)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75卷， 1929 (1978) などに記載の方法に従って 行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6， 47-55 ( 1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール 263-267(1995) (秀潤社発行） 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。. - 宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ'リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよレ、。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー (Miller) ， Journal of Experiments in Molecula r Genetics, 431—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 カ好ま しい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 J3 —インドリルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシヱリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な レ、、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ —ノレダー （Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci . 1^ん77卷，4505 (1980)〕 や 0 · 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Bitter， G. A. ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81卷， 5330 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4 〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace' s Insect Medium (Grace, T. C. C.， Nature, 195, 788 (1962) ) に非動ィ匕した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用レヽられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜 6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行な い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
.宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を含む ME M培地 [Science, 122卷， 501 (1952)〕 ， DM E M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the American Medical Association 199卷， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地 (Proceedi ng of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1 (1950)〕 などが用いら れる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜4 0 °Cで約 1 5〜 6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明で用い られるタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明で用いられるタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法により行なうことができる。 本発明で用いられるタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して は、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁 し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞 を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが 適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や 、 トリ トン X—1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に タンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ある いは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
力べして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によつて塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 糸且換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモト リプシン、 ァノレギニノレエンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリ コシダー ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明で用いられるタンパク質の存在は、 特異抗体を用いた 工ンザィムィムノアッセィやウェスタンプロッティングなどにより測定すること ができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ぺプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって あよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗 体の説明においては、 これらを単に本発明で用いられるタンパク質と略記する場 合がある） に対する抗体は、 本発明で用いられるタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明で用いられるタンパク質は、 温血動物に^ fして投与により抗体産生が可 能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗 体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュ バントを投与してもよレ、。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度 行われる。 用いられる温血動物としては、.例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおょぴ ラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化タ ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミ ルスタインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975)〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイゥ ィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0、 AP—lな どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 -20 : 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0〜4 0 °C、 好ましくは 3 0〜3 7 °C で 1〜 1 0分間ィンキュペートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 通常 HA T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン) を添カ卩した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別おょぴ育種用培地として は、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 ：！〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あ るいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） な どを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイブリ ドーマ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリン の分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことが できる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕 本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あるい はそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体 の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明で用いられる タンパク質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより 製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァータンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 グルタルアルデヒドゃカルボジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従つて行なうことがで さる。
本発明で用いられるタンパク質または部分べプチドをコードするポリヌクレオ チド （好ましくは D N A) (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明におい ては、 これらの D NAを本発明で用いられる D N Aと略記する場合がある） の塩 基配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するァ ンチセンスポリヌクレオチドとしては、 本発明で用いられる D NAの塩基配列に 相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 DNAの 発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレ ォチドであってもよいが、 アンチセンス DN Aが好ましい。
本発明で用いられる DN Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明 で用いられる DN Aに相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明で用いられる DNA の相補鎖） の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性 を有する塩基配列などが挙げられる。 特に、 本発明で用いられる DN Aの相補鎖 の全塩基配列うち、 （i) 翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの 場合は、 本発明で用いられるタンパク質の N末端部位をコードする部分の塩基配 列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖と約 70%以上、 好まし くは約 80 °/0以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上 の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、 (ii) RNa s eHによる RN A分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 イントロンを含 む本発明で用いられる DNAの全塩基配列の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは 約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相 同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配 列番号： 10、 配列番号： 1 2、 配列番号： 14、 配列番号： 16もしくは配列 番号： 18で表わされる塩基配列を含有する DN Aの塩基配列に相補的な、 もし くは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌ クレオチド、 好ましくは例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 12、 配列番号： 14、 配列番号： 16もしくは配列番号： 18で表わされる塩基配列を含有する DN Aの塩基配列 に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド (より好ましくは、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8 、 配列番号： 10、 配列番号： 12、 配列番号： 14、 配列番号： 16もしくは 配列番号： 18で表わされる塩基配列を含有する DNAの塩基配列に相補な塩基 配列を有するァンチセンスポリヌクレオチド) が挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 10~40個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ ロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾りん 酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシリボース ) は、 2 ' —O—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、 塩 基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであってもよく、 配列番 号： 2で表わされる塩基配列を有する D N Aにハイプリダイズするものであれば いずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明で用いられるタンパク質遺伝子の複製または発現を阻 害することのできる該遺伝子に対-応するァンチセンスポリヌクレオチド (核酸) を、 クローン化した、 あるいは決定されたタンパク質をコードする D N Aの塩基 配列情報に基づき設計し、. 合成しうる。 かかるアンチセンスポリヌクレオチドは 、 本発明で用いられるタンパク質遺伝子の R N Aとハイブリダィズすることがで き、 該 R NAの合成または機能を阻害することができるか、 あるいは本発明で用 いられるタンパク質関連 R N Aとの相互作用を介して本発明で用いられるタンパ ク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明で用いられるタンパク 質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明で用 いられるタンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができるポリ ヌクレオチドは、 生体内および生体外で本発明で用いられるタンパク質遺伝子の 発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用で ある。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核 酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレ ォチド、 塩基配列または核酸とタンパク質との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオ チド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される （指令にある） タンパク質 のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5， 端ヘアピンループ、 5， 端 6—^ ^一スペア ' リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン 、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3， 端非翻訳領域、 3 ' 端パ リンドローム領域または 3 ' 端ヘアピンループなどは、 好ましい対象領域として 選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 については、 目的核酸が対象領域とハイブリダィズすることができる場合は、 そ の目的核酸は、 当該対象領域のポリヌクレオチドに対して 「アンチセンス」 であ るということができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一D— リボースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リボースを含有しているポリヌ クレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイ プのポリヌクレオチド、 非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば 、 市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結 合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出さ れるような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを 含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R N A、 D N A ： R NAハイブリッドであってもよく、 さらに非 修飾ポリヌクレオチド （または非修飾ォリゴヌクレオチド） 、 公知の修飾の付加 されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの 、 メチルイ匕されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの 、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホ スホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を 持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例、 ホスホロチォエート、 ホ スホロジチォエートなど） を持つもの、 例えばタンパク質 （例、 ヌクレアーゼ、 ヌクレアーゼ 'インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルぺプチド、 ポリ一 L一 リジンなど） や糖 （例、 モノサッカライ ドなど） などの側鎖基を有しているもの 、 インターカレント化合物 (例、 アタリジン、 ソラレンなど) を持つもの、 キレ ート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例 えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「 ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおょぴピリミジン塩基を含有するの みでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでレ、て良い 。 このような修飾物は、 メチル化されたプリンおょぴピリミジン、 ァシル化され たプリンおょぴピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾され ていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンまたは脂肪族基などで置換さ れているか、 またはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 R N A、 D NAまたは修飾された 核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例としては、 核酸の硫黄 誘導体、 チォホスフエート誘導体、 ポリヌクレオシドアミドゃォリゴヌクレオシ ドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。 本発明のアンチセンスポリヌ クレオチドは、 例えば、 以下のように設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアン チセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、 アンチセンスボリヌクレオ チドの細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大き なものにする、 また、 もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチ ドの毒性をより小さなものにする。 このような修飾は、 例えば Pharm Tech Japan ， 8卷， 247頁または 395頁， 1992年、 Anti sense Research and Applications, CR C Press, 1993年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された 糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊 な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与え られることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基 骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜と の相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例、 ホスホリ ピド、 コレステロールなど） などの疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ま しい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例、 コレステリルクロ口ホル メート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端または 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3， 端または 5， 端に特異 的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌク レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の 基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレンダリコールなどのグリコ ールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに 限定されるものではない。 アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の 生体内や生体外の遺伝子発現系、 または本発明で用いられるタンパク質の生体内 や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 以下に、 本発明の癌の予防 ·治療剤などの医薬について詳細に説明する。 なお、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号 ： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 3または配列番号： 1 5で表されるァミノ 酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質を 「本発明で用いら れるタンパク質 A」 、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質を 「本発明で用いられるタンパク質 B」 と略 記することもある。
また、 ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素を 「本発明で用いられるタ ンパク質 A」 、 脂肪酸合成酵素を 「本発明で用いられるタンパク質 B」 と称する こともある。
本発明で用いられるタンパク質 Aの活性または発現と、 本発明で用いられるタ ンパク質 Bの活性または発現を同時に阻害することにより、 癌細胞のアポトーシ スを選択的かつ強力に誘導し、 癌細胞を選択的かつ効果的に死滅させることがで きる。 よって、 （i) 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性 （例、 ァシル -CoA 合成酵素活性） を阻害する物質、 および本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝 子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) .本発明で用いら れるタンパク質 Bの活性 （例、 脂肪酸合成酵素活性） を阻害する物質、 および本 発明で用いられるタンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少な くとも一種とを組み合わせてなる医薬などは、 例えば、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体 腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 網膜肉腫、 甲状腺癌、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸 腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 十二指 腸癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 膝癌、 腌内分泌腫瘍、 胆管 癌、 胆囊癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌 、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮頸部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫 、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白 血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ 性白血病、 成人 τ細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 腌内分泌腫瘍、 線維性組織 球腫、 平滑筋肉腫、 横紋筋肉腫、 原発不明癌など） の予防 ·治療剤、 癌細胞のァ ポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などとして安全な医薬として使用するこ とができる。
(i) 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性 （例、 ァシル -CoA合成酵素活性 ) を阻害する物質、 およぴ本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻 害する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 本発明で用いられるタンパク 質 Bの活性 （例、 脂肪酸合成酵素活性） を阻害する物質、 および本発明で用いら れるタンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と は、 同一の物質であってもよい。 このような物質、 すなわち （i' ) 本発明で用い られるタンパク質 Aの活性または本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝子の発 現と、 （ii' ) 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性または本発明で用いられ るタンパク質 Bの遺伝子の発現とを阻害する物質なども、 本発明で用いられるタ ンパク質 Aの活性または発現と、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性または 発現とを同時に阻害することができるので、 上記した本発明の癌の予防 ·治療剤 、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などの医薬として好適に使 用することができる。 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する物質としては、 例えば、 （ a) 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩、 （c ) 本発明で用いられるタンパク質 Aに対する抗体、 （f) 本発明で用いられるタ ンパク質 Aに対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパ ク質 Aの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。
(a) 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩 は、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害することができるので、 本発 明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する物質として好適に使用することが できる。 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩 としては、 本発明で用いられるタンパク質 Aの有する活性 （例、 ァシル -CoA合成 酵素活性） を阻害しうる化合物またはその塩であればよく特に制限はないが、 例 えば、 本発明で用いられるタンパク質 Aに結合し、 その活性を阻害する化合物ま たはその塩などが挙げられる。 このような化合物またはその塩は、 例えば、 ぺプ チド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液 、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物であってもよい。 該化合物は、 新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 該 化合物の塩としては、 例えば、 生理学的に許容される金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との 塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例としては、 例えばナトリゥム塩、 力リウ ム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリゥム塩などの アルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適 な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリ ン、 2， 6—ノレチジン、 エタノー^^ァミン、 ジエタノーノレアミン、 トリエタノー ルァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N, N'—ジベン ジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適な例として は、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有 機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 プロピ オン酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハ ク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 安息香酸、 ベンゼンスルホン酸、 p—トル エンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例とし ては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミ ノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの 塩が挙げられる。
このうち、 生理学的に許容し得る塩が好ましい。 例えば、 化合物内に酸性官能 基を有する場合にはアルカリ金属塩 （例、 ナトリウム塩， カリウム塩など） 、 ァ ルカリ土類金属塩 （例、 カルシウム塩， マグネシウム塩， バリウム塩など） など の無機塩、 アンモニゥム塩など、 また、 化合物内に塩基性官能基を有する場合に は、 例えば臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など無機酸との塩、 または酢酸、 フ タル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタ ンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩として は、 低分子化合物が好ましい。
本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩として は、 例えば、 Triacsin C、 2 -ブロモパルミチン酸またはそれらの塩などが挙げら れ、 Triacsin Cまたはその塩が好ましい。
上記化合物またはその塩は、 常套手段に従って製剤化し、 投与することができ る。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられ る。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用 いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の 担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。
非経口投与のための糸且成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関節 内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例 えば、 上記物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸 濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生 理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解 補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピ レングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソ ノレべ一卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大 豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール などを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填され る。 直 J3昜投与に用いられる坐剤は、 上記物質を通常の坐薬用基剤に混合すること によって調製される。
(c) 本発明で用いられるタンパク質 Aに対する抗体、 好ましくは本発明で用 いられるタンパク質 Aの活性を中和 （減退または消失） する作用を有する抗体 （ 中和抗体） は、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害することができる ので、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する物質として好適に使用 することができる。
上記抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与 （例、 静脈注射） に適する剤形として提供される。 好ましくは 吸入剤として提供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
(f) 本発明で用いられるタンパク質 Aに対してドミナントネガティブに作用 する本発明で用いられるタンパク質 Aの変異体もしくはそれをコードするポリヌ クレオチドは、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害することができる ので、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する物質として好適に使用 することができる。 本明細書において、 「本発明で用いられるタンパク質 Aに対 してドミナントネガティブに作用するタンパク質 Aの変異体」 とは、 それが発現 することによって、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害 （消失もしく は低下） させる作用を有するタンパク質を意味する （多比良和誠編， 遺伝子の機 能阻害実験法， 羊土社， 2 6 _ 3 2頁， 2 0 0 1年など参照） 。
上記本発明で用いられるタンパク質 Aの変異体もしくはそれをコードするポリ ヌクレオチドは、 常套手段に従って製剤化し、 投与することができる。 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害する物質としては、 本発明で用 いられるタンパク質 Aの発現を阻害するものであれば特に制限はないが、 例えば 、 (i) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子 （D NA) 力 ら本 発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mR N Aへの転写を阻害する物質、 (ii) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mR NAから本発明で用い られるタンパク質 Aへの翻訳を阻害する物質などが挙げられる。 （i) 本発明で 用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子 （D NA) から本発明で用いられる タンパク質 Aをコードする m R NAへの転写を阻害する物質としては、 本発明で 用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子 （D NA) から本発明で用いられる タンパク質 Aをコードする mRNAへの転写を阻害するものであればよく特に制 限はないが、 例えば、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子 （D NA) から mRNAへの転写への転写に関与する因子に結合し、 本発明で用いら れるタンパク質 Aをコードする遺伝子 （DNA) から mRNAへの転写を阻害す る物質などが挙げられる。 （ii) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mRNAから本発明で用いられるタンパク質 Aへの翻訳を阻害する物質としては 、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mRNAから本発明で用いられ るタンパク質 Aへの翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、 例えば 、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mRNAから本発明で用いられ るタンパク質 Aへの翻訳に関与する因子に結合し、 本発明で用いられるタンパク 質 Aをコードする mRNAから本発明で用いられるタンパク質 Aへの翻訳を阻害 する物質などが挙げられる。 このような本発明で用いられるタンパク質 Aの発現 を阻害する物質としては、 具体的には、 例えば、 （b) 本発明で用いられるタン パク質 Aの発現を阻害する化合物またはその塩、 （d) 本発明で用いられるタン パク質 Aをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相 補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 （e ) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドに対して RN A i作用を有する二重鎖 RN A (例、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコード するポリヌクレオチドに対する s i RNAまたは s hRNAなど） 、 （g) 本発 明で用いられるタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドに対してリボ.ザィム 活性を有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。
(b) 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害する化合物またはその塩 は、 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を抑制することができるので、 本発 明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害する物質として好適に使用することが できる。 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害する化合物またはその塩 としては、 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害しうるものであればよ く特に制限はないが、 例えば、 （i) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコード する遺伝子 （DNA) 力、ら本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする mRN Aへの転写を阻害する化合物、 （ii) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコード する niRN Aから本発明で用いられるタンパク質 Aへの翻訳を阻害する化合物な どが挙げられる。 （i) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子 （ D N A) から本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする m R NAへの転写を 阻害する化合物としては、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子 (D NA) から m R NAへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが 、 例えば、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子 （D N A) から m R N Aへの転写に関与する因子に結合し、 転写を阻害する化合物などが挙げら れる。 （i i) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする m R N Aから本発明 で用いられるタンパク質 Aへの翻訳を阻害する化合物としては、 本発明で用いら れるタンパク質 Aをコードする m R N Aから本発明で用いられるタンパク質 Aへ の翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、 例えば、 本発明で用いら れるタンパク質 Aをコードする m R N Aから本発明で用いられるタンパク質 Aへ の翻訳に関与する因子に結合し、 翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害する化合物またはその塩として は、 低分子化合物が好ましい。
本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害する化合物またはその塩として は、 例えば、 Triacsin C、 2 -プロモパルミチン酸またはそれらの塩などが挙げら れ、 Triacsin Cまたはその塩が好ましい。
上記化合物またはその塩は、 常套手段に従って、 例えば上記本発明で用いられ るタンパク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩と同様にして製剤化し、 投 与する.ことができる。 . . .
(d) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドの塩基 配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアン チセンスポリヌクレオチドは、 低毒性であり、 本発明で用いられるタンパク質 A をコードする遺伝子の発現を抑制することができ、 本発明で用いられるタンパク 質 Aの発現を抑制することができるので、 本発明で用いられるタンパク質 Aの発 現を阻害する物質として好適に使用することができる。 このようなアンチセンス ポリヌクレオチドとしては、 上述したものなどが用いられる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドは、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投 与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレト口ゥ ィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウ ィルスべクタ一などの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトま たは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチセンスポ リヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために捕助剤などの生理学 的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化して吸入剤として 気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目的 に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担体と ともに製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下、 関節腔内、 癌病変部等に投与してもよ レ、。
(e) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドに対し て R NA i作用を有する二重鎖 R N A (例、 本発明で用いられるタンパク質 Aを コードするポリヌクレオチドに対する s i R N Aまたは s h R N Aなど） は、 低 毒性であり、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする遺伝子の翻訳を抑制 することができ、 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を抑制することができ るので、 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を阻害する物質として好適に使 用することができる。 このような、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードす るポリヌ.クレオチドに対して R N A i作用を有する二重鎖 R N Aとしては、 本発 明で用いられるタンパク質をコードする R N Aの一部を含有する二重鎖 R NA ( 例、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドに対する s i R NA (small ^short) interfering RNA) 、 s h R NA (, small (short) hai rpin RNA) など） などが挙げられる。
このような二重鎖 R N Aは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年 ； 特表 2002- 516062号公報； 米国特許出願公開第 2002/086356号明細書； Nature G enetics, 24卷， 180- 183頁， 2000年； Genesis, 26卷， 240- 244頁， 2000年； Nat ure, 407卷， 319- 320頁， 2002年； Genes & Dev.， 16卷， 948-958頁， 2002年； Pro c. Natl. Acad. Sci. USA. , 99卷， 5515 - 5520頁， 2002年； Science, 296卷， 55 0-553頁， 2002年； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99卷， 6047- 6052頁， 2002年； Nature Biotechnology, 20卷， 497 - 500頁， 2002年； Nature Biotechnology, 20 卷， 500- 505頁， 2002年； Nucleic Acids Res.， 30巻， e46， 2002年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
本発明で用いられる R N A i作用を有する二重鎖 R N Aの長さは、 通常、 1 7 〜3 0塩基、 好ましくは 1 9〜2 7塩基、 より好ましくは 2 0〜2 2塩基である 上記二重鎖 R N Aは、 上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化 し、 投与することができる。
(g) 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードするポリヌクレオチドに対し てリボザィム活性を有するポリヌクレオチドは、 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現を抑制することができるので、 本発明で用いられるタンパク質 Aの発現 を阻害する物質として好適に使用することができる。 このようなリボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medi cine, 7卷， 221頁， 2001年； FEBS L ett.， 228卷， 228頁， 1988年； FEBS Lett.， 239卷， 285頁， 1988年； Nucl. Aci ds. Res. , 17卷， 7059頁， 1989年； Nature, 323卷， 349頁， 1986年； Nucl . Acid s. Res. , 19巻， 6751頁， 1991年； Protein Eng. 3卷， 733頁， 1990年； Nucl. Ac ids Res.， 19卷， 3875頁， 1991年； Nucl. Ac ids Res. , 19卷， 5125頁， 1991年； Biochem. Biophys. Res. Commun. , 186卷， 1271頁， 1992年など参照） に準じて 、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 例え ば、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードする R N Aの一部に公知のリボザ ィムを連結することによって製造することができる。 本発明で用いられるタンパ ク質 Aをコードする R N Aの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され 得る本発明の R N A上の切断部位に近接した部分 （R N A断片） が挙げられる。 上記リボザィムには、 グループ Iイントロン型や R N a s e Pに含まれる M l R N Aなどのラージリボザィム、 ハンマーヘッド型やヘアピン型などのスモール リボザィムなどが含まれる （タンパク質核酸酵素， 35卷， 2191頁， 1990年） 。 ハンマーヘッド型リボザィムについては、 例えば、 FEBS Lett. , 228卷， 228頁，
1988年； FEBS Lett. , 239卷， 285頁， 1988年； タンパク質核酸酵素， 35卷， 219 1頁， 1990年； Nucl. Acids Res.， 17卷， 7059頁， 1989年などを参照することが できる。 また、 ヘアピン型リボザィムについては、 例えば、 Nature, 323卷， 349 頁， 1986年； Nucl. Acids Res. , 19卷, 6751頁， 1991年; 化学と生物， 30卷， 1 12頁， 1992年などを参照することができる。
上記リボザィム活性を有するポリヌクレオチドは、 上記アンチセンスポリヌク レオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。 本発明で用いられるタンパク質 Bの活 1·生を阻害する物質としては、 例えば、 （ a) 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩、 (c ) 本発明で用いられるタンパク質 Bに対する抗体、 （f) 本発明で用いられるタ ンパク質 Bに対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパ ク質 Bの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。
(a) 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩 は、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害することができるので、 本発 明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質として好適に使用することが できる。 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩 としては、 本発明で用いられるタンパク質 Bの有する活性 （例、 脂肪酸合成酵素 活性） を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、 例えば、 本発明で用い られるタンパク質 Bに結合し、 その活性を阻害する化合物またはその塩などが挙 げられる。 このような化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、.血漿などから選ばれた化合物であってもよい。 該化合物は、 新規な 化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 該化合物の塩としては 、 前記した本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する化合物の塩と同様 のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩として は、 低分子化合物が好ましい。
本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩として は、 例えば、 Cerulenin、 C75またはそれらの塩などが挙げられ、 Cerulenin、 C75 またはそれらの塩が好ましい。
上記化合物またはその塩は、 前述した本発明で用いられるタンパク質 Aの活性 を阻害する化合物またはその塩と同様にして製剤化し、 投与することができる。 (c) 本発明で用いられるタンパク質 Bに対する抗体、 好ましくは本発明で用 いられるタンパク質 Bの活性を中和 （減退または消失） する作用を有する抗体 （ 中和抗体） は、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害することができる ので、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質として好適に使用 することができる。
上記抗体は、 前述した本発明で用いられるタンパク質 Aに対する抗体と同様に して製剤化し、 投与することができる。
(f) 本発明で用いられるタンパク質 Bに対してドミナントネガティブに作用 する本発明で用いられるタンパク質 Bの変異体もしくはそれをコードするポリヌ クレオチドは、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害することができる ので、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質として好適に使用 することができる。 本明細書において、 「本発明で用いられるタンパク質 Bに対 + してドミナントネガティブに作用するタンパク質 Bの変異体」 とは、 それをコー ドするポリヌクレオチドを発現させることによって、 本発明で用いられるタンパ ク質 Bの活性を阻害 （消失もしくは低下） させる作用を有するタンパク質を意味 する （多比良和誠編， 遺伝子の機能阻害実験法， 羊土社， 26-32頁， 2001年など 参照）
上記本発明で用いられるタンパク質 Bの変異体もしくはそれをコードするポリ ヌクレオチドは、 常套手段に従って製剤化し、 投与することができる。 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害する物質としては、 本発明で用 いられるタンパク質 Bの発現を阻害するものであれば特に制限はないが、 例えば 、 (i) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子 （D N A) 力 ら本 発明で用いられるタンパク質 Bをコードする mR NAへの転写を阻害する物質、 (ii) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする mR N Aから本発明で用い られるタンパク質 Bへの翻訳を阻害する物質などが挙げられる。 （i) 本発明で 用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子 （D NA) から本発明で用いられる タンパク質 Bをコードする m R N Aへの転写を阻害する物質としては、 本発明で 用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子 （D NA) から本発明で用いられる タンパク質 Bをコードする m R NAへの転写を阻害するものであればよく特に制 限はないが、 例えば、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子 （D NA) から mR N Aへの転写への転写に関与する因子に結合し、 本発明で用いら れるタンパク質 Bをコードする遺伝子 （D N A) から mR NAへの転写を阻害す る物質などが挙げられる。 （ii) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする mR NAから本発明で用いられるタンパク質 Bへの翻訳を阻害する物質としては 、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする mR NAから本発明で用いられ るタンパク質 Bへの翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、 例えば 、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする m R NAから本発明で用いられ るタンパク質 Bへの翻訳に関与する因子に結合し、 本発明で用いられるタンパク 質 Bをコードする! nR NAから本発明で用いられるタンパク質 Bへの翻訳を阻害 する物質などが挙げられる。 このような本発明で用いられるタンパク質 Bの発現 を阻害する物質としては、 具体的には、 例えば、 （b) 本発明で用いられるタン パク質 Bの発現を阻害する化合物またはその塩、 （d) 本発明で用いられるタン パク質 Bをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相 補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 （e ) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドに対して R N A i作用を有する二重鎖 R N A (例、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコード するポリヌクレオチドに対する s i R N Aまたは s h R NAなど） 、 （g) 本発 明で用いられるタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドに対してリボザィム 活性を有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。
(b) 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害する化合物またはその塩 は、 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を抑制することができるので、 本発 明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害する物質として好適に使用することが できる。 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害する化合物またはその塩 としては、 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害しうるものであればよ く特に制限はないが、 例えば、 （i) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコード する遺伝子 （D N A) 力 ら本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする m R N Aへの転写を阻害する化合物、 （ii) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコード する mR N Aから本発明で用いられるタンパク質 Bへの翻訳を阻害する化合物な どが挙げられる。 （i) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子 （ D NA) から本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする ni R NAへの転写を 阻害する化合物としては、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子 (D NA) から m R NAへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが 、 例えば、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子 （D NA) から mR NAへの転写に関与する因子に結合し、 転写を阻害する化合物などが挙げら れる。 （ii) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする m R NAから本発明 で用いられるタンパク質 Bへの翻訳を阻害する化合物としては、 本発明で用いら れるタンパク質 Bをコードする mR NAから本発明で用いられるタンパク質 Bへ の翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、 例えば、 、 本発明で用い られるタンパク質 Bをコードする mR N Aから本発明で用いられるタンパク質 B への翻訳に関与する因子に結合し、 翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害する化合物またはその塩として は、 低分子化合物が好ましい。
本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害する化合物またはその塩として は、 例えば、 Cerulenin、 C75またはそれらの塩などが挙げられ、 Cerulenin、 C75 またはそれらの塩が好ましい。
上記化合物またはその塩は、 前述した本発明で用いられるタンパク質 Aの発現 を阻害する化合物またはその塩と同様にして製剤化し、 投与することができる。
(d) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドの塩基 配列に相捕的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアン チセンスポリヌクレオチドは、 低毒性であり、 本発明で用いられるタンパク質 B をコードする遺伝子の発現を抑制することができ、 本発明で用いられるタンパク 質 Bの発現を抑制することができるので、 本発明で用いられるタンパク質 Bの発 現を阻害する物質として好適に使用することができる。 このようなアンチセンス ポリヌクレオチドとしては、 上述したものなどが用いられる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドは、 前述した本発明で用いられるタンパク 質 Aをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相捕的もしくは実質的に相補的 な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドと同様にし て製剤ィヒし、 投与することができる。
(e) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドに対し て R N A i作用を有する二重鎖 R N A (例、 本発明で用いられるタンパク質 Bを コードするポリヌクレオチドに対する s i R NAまたは s h R NAなど） は、 低 毒性であり、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする遺伝子の翻訳を抑制 することができ、 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を抑制することができ るので、 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を阻害する物質として好適に使 用することができる。 このような、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードす るポリヌクレオチドに対して R N A i作用を有する二重鎖 R NAとしては、 本発 明で用いられるタンパク質をコードする R N Aの一部を含有する二重鎖 R NA ( 例、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドに対する s i R NA (small (short) interfering RNA) 、 s h R N A (small (short) hai rpin RNA) など） などが挙げられる。
このような二重鎖 R NAは、 本発明で用いられるタンパク質 Aをコードするポ リヌクレオチドに対して R N A i作用を有する二重鎖 R N Aと同様の方法により 、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
本発明で用いられる R NA i作用を有する二重鎖 R NAの長さは、 通常、 1 7 〜3 0塩基、 好ましくは 1 9〜2 7塩基、 より好ましくは 2 0〜2 2塩基である 上記二重鎖 R N Aは、 上記ァンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化 し、 投与することができる。
(g) 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードするポリヌクレオチドに対し てリボザィム活性を有するポリヌクレオチドは、 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現を抑制することができるので、 本発明で用いられるタンパク質 Bの発現 を阻害する物質として好適に使用することができる。 このようなリボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7巻， 221頁， 2001年； FEBS L ett. , 228卷， 228頁， 1988年； FEBS Lett. , 239卷， 285頁， 1988年； Nucl. Aci ds. Res. , 17卷， 7059頁， 1989年； Nature, 323卷， 349頁， 1986年； Nucl. Acid s. Res. , 19卷， 6751頁， 1991年； Protein Eng. 3卷， 733頁， 1990年； Nucl. Ac ids Res. , 19卷， 3875頁， 1991年； Nucl. Acids Res. , 19卷， 5125頁， 1991年； Biochem. Biophys. Res. Commun. , 186卷， 1271頁， 1992年など参照） に準じて 、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 例え ば、 本発明で用いられるタンパク質 Bをコードする R N Aの一部に公知のリボザ ィムを連結することによつて製造することができる。 本発明で用いられるタンパ ク質 Bをコードする R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断され 得る本発明の R N A上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。 上記リボザィムには、 グループ Iイントロン型や R N a s e Pに含まれる M l R NAなどのラージリボザィム、 ハンマーへッド型ゃヘアピン型などのスモール リボザィムなどが含まれる （タンパク質核酸酵素， 35卷， 2191頁， 1990年） 。 ハンマーヘッド型リボザィム、 ヘアピン型リボザィムについては、 前述した文献 などを参照することができる。
上記リボザィム活性を有するポリヌクレオチドは、 上記アンチセンスポリヌク レオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
上記本発明の癌の予防 ·治療剤などの医薬としては、 本発明で用いられるタン パク質 Aの活性を阻害する化合物またはその塩と本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する化合物またはその塩とを組み合わせてなる癌の予防 ·治療剤 、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などが好ましい。
また、 （i) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素および脂肪酸合成酵 素の活性を阻害する物質、 （ii) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の 遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質なども、 本発明で用 いられるタンパク質 Aの活性または発現と、 本発明で用いられるタンパク質 Bの 活性または発現とを同時に阻害することができるので、 上記した本発明の癌の予 防-治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などの医薬とし て好適に使用することができる。
さらに、 （i) ァシル- CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素および脂肪酸合成 酵素の活性を阻害する物質と、 （i i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵 素の遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質とは、 同一の物 質であってもよい。 上記本発明の癌の予防 ·治療剤などの医薬は、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性または発現と、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性または発現とを 同時に阻害することができる形態であればよい。 例えば、 （i) 本発明で用いら れるタンパク質 Aの活'生を阻害する物質、 およぴ本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 本発明 で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質、 およぴ本発明で用いられるタ ンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種とを、 一 つの医薬組成物 （例、 錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸 濁剤、 注射剤、 坐剤など） 中に製剤化した配合剤としてもよい。 また、 本発明の 癌の予防 ·治療剤などの医薬は、 （i) 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性 を阻害する物質、 および本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害 する物質から選ばれる少なくとも一種を含有してなる医薬と、 （ii) 本発明で用 いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質、 および本発明で用いられるタンパ ク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種を含有してな る医薬とからなるキットであってもよい。 この場合、 （i) 本発明で用いられる タンパク質 Aの活性を阻害する物質、 および本発明で用いられるタンパク質 Aの 遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種を含有してなる医薬と 、 (ii) 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質、 およぴ本発明 で用いられるタンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくと も一種を含有してなる医薬とは、 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性または 発現と本発明で用いられるタンパク質 Bの活性または発現とを同時に阻害するこ とができるかぎり時間差を置いて投与してもよいが、 同時に投与するのが好まし レ、。
本発明の癌の予防 ·治療剤などの医薬における （i) 本発明で用いられるタン パク質 Aの活性を阻害する物質、 およぴ本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝 子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 本発明で用いら れるタンパク質 Bの活 1·生を阻害する物質、 およぴ本発明で用いられるタンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種との投与量の比率 (または配合比） は、 投与 （または配合） される本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する物質、 本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻 害する物質、 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質およぴ本発 明で用いられるタンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質の種類および Zまた は組み合わせ、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが
、 例えば、 重量比で、 約 1 ： 5 0 0〜 5 0 0 ： 1、 好ましくは約 1 ： 1 0 0〜 1 0 0 ： 1、 より好ましくは 1 ： 1 0〜： 1 0 ： 1、 特に好ましくは 1 ： 5〜 5 ： 1 である。
本発明の （i) 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する物質、 およ び本発明で用いられるタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる 少なくとも一種と、 （ii) 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物 質、 およぴ本発明で用いられるタンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から 選ばれる少なくとも一種とを上述の剤として使用する場合、 例えば上述した方法 など、 常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられ る。 力かる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用 いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の 担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関節 内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従.つて、 例 えば、 上記物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸 濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生 理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解 補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピ レンダリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソ ノレへ一卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大 豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール などを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填され る。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記物質を通常の坐薬用基剤に混合すること によって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 O m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 O m gの上記 （i) 本発明で用いられるタ ンパク質 Aの活性を阻害する物質、 および本発明で用いられるタンパク質 Aの遺 伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 本発明で用い られるタンパク質 Bの活性を阻害する物質、 および本発明で用いられるタンパク 質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種とが、 それぞれ 含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記物質との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ 、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投 与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投 与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 肺癌の治療の目的で本発明の （i) 本発明で用いられるタンパク質 Aの活性を阻害する物質、 および本発明で用いら れるタンパク質 Aの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と 、 (ii) 本発明で用いられるタンパク質 Bの活性を阻害する物質、 および本発明 で用いられるタンパク質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくと も一種とを経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） においては 、 一日にっき該物質を、 それぞれ約 0 . ：！〜 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m g投与する。 非経口的に投与する場 合は、 該物質の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 症状、 投与ルートなどによって も異なるが、 例えば、 肺癌の治療の目的で本発明の （i) 本発明で用いられるタ ンパク質 Aの活性を阻害する物質、 および本発明で用いられるタンパク質 Aの遺 伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 本発明で用い られるタンパク質 Bの活す生を阻害する物質、 およぴ本発明で用いられるタンパク 質 Bの遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種とを注射剤の形 で投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき 該物質を、 それぞれ約 0 . 0 1〜3 0 m g、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g、 よ り好ましくは約 0 . 1〜1 O m gを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 また、 上記本発明の癌の予防 ·治療剤などの医薬は、 ホルモン療法剤、 抗癌剤 (例、 化学療法剤、 免疫療法剤、 または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用 を阻害する薬剤） など （以下、 併用薬物と略記する） と併用して使用することが できる。 この際、 投与時期は限定されず、 これらを投与対象に対し、 同時に投与 してもよいし、 時間差をおいて投与してもよい。 投与量は、 臨床上用いられてい る用量を基準として適宜選択することができる。 また、 上記本発明の癌の予防' 治療剤などの医薬と併用薬物の配合比は、 投与対象、 投与ルート、 対象疾患、 症 状、 組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
「ホルモン療法剤」 としては、 例えば、 ホスフェストロール、 ジェチルスチル ベストローノレ、 クロロトリア二セン、 酢酸メ ドロキシプロゲステロン、 酢酸メゲ ストローノレ、 酢酸クロノレマジノン、 酢酸シプロテロン、 ダナゾーノレ、 ジエノゲス ト、 ァソプリスニル、 ァリルエストレノール、 ゲストリノン、 ノメゲストローノレ 、 タデナン、 メパノレトリシン、 ラロキシフェン、 才ノレメロキシフェン、 レポノレメ ロキシフェン、 抗エストロゲン (例、 タエン酸タモキシフェン、 タエン酸トレミ フェン等） 、 ERダウンレギュレーター (例、 フルべストラント等) 、 ヒ ト閉経ゴ ナドトロピン、 卵胞刺激ホルモン、 ピル製剤、 メピチォスタン、 テスト口ラクト ン、 ァミノグルテチイミ ド、 LH- RHァゴニスト （例、 酢酸ゴセレリン、 ブセレリ ン、 リュープロレリン等） 、 ドロロキシフェン、 ェピチォスタノ一ル、 スルホン 酸ェチェルエストラジオール、 ァロマターゼ阻害薬 （例、 塩酸フアドロゾール、 アナストロゾーノレ、 レトロゾーノレ、 ェキセメスタン、 ボロゾーノレ、 フォノレメスタ ン等） 、 抗アンドロゲン (例、 フルタミ ド、 ビカルタミ ド、 ニルタミ ド等） 、 5 α -レダクターゼ阻害薬 （例、 フィナステリ ド、 デュタステリ ド、 エブリステリ ド等） 、 副腎皮質ホルモン系薬剤 （例、 デキサメタゾン、 プレドニゾロン、 ベタ メタゾン、 トリアムシノロン等） 、 アンドロゲン合成阻害薬 (例、 アビラテロン 等） 、 レチノイドおょぴレチノイドの代謝を遅らせる薬剤 （例、 リアロゾール等
) などが挙げられる。 LH- RHァゴ-ス ト （例、 酢酸ゴセレリン、 ブセレリン、 リ ユープロレリン等） が好ましい。
「化学療法剤」 としては、 例えばアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌性抗生物質 、 植物由来抗癌剤などが挙げられる。
「アルキル化剤」 としては、 例えば、 ナイ トロジヱンマスタード、 塩酸ナイ ト ロジェンマスタード- N -ォキシド、 クロラムブチル、 シクロフォスフアミ ド、 ィ ホスフアミ ド、 チォテパ、 カノレボコン、 トシル酸ィンプロスルファン、 ブスルフ アン、 塩酸二ムスチン、 ミ トブロニトール、 メルファラン、 ダカルバジン、 ラニ ムスチン、 リン酸エストラムスチンナトリゥム、 トリエチレンメラミン、 カルム スチン、 口ムスチン、 ストレプトゾシン、 ピポブロマン、 エトグノレシド、 カノレポ ブラチン、 シスプラチン、 ミポプラチン、 ネダプラチン、 ォキサリブラチン、 ァ ルトレタミン、 アンバムスチン、 塩酸ジブロスビジゥム、 フォテムスチン、 プレ ドニムスチン、 プミテパ、 リボムスチン、 テモゾ口ミ ド、 トレオス^/ファン、 ト 口フォスフアミ ド、 ジノスタチンスチマラマー、 了ドゼレシン、 システムスチン 、 ビゼレシンなどが挙げられる。
「代謝拮抗剤」 としては、 例えば、 メルカプトプリン、 6 -メルカプトプリンリ ボシド、 チォイノシン、 メ ト トレキサート、 エノシタビン、 シタラビン、 シタラ ビンオタフォスフアート、 塩酸アンシタビン、 5- FU系薬剤 （例、 フルォロウラシ ノレ、 テガフーノレ、 UFT、 ドキシフルリジン、 カルモフール、 ガロシタビン、 エミ テフール等） 、 アミノプテリン、 ロイコボリンカルシウム、 タブロイド、 ブトシ ン、 フオリネイ トカルシウム、 レボフオリネイ トカルシウム、 クラドリビン、 ェ ミテフール、 フノレダラビン、 ゲムシタビン、 ヒ ドロキシカルバミ ド、 ペントスタ チン、 ピリ トレキシム、 ィ ドキシゥリジン、 ミ トグァゾン、 チアゾフリン、 アン バムスチンなどが挙げられる。
「抗癌性抗生物質」 としては、 例えば、 ァクチノマイシン D、 ァクチノマイシ ン マイ トマイシン C、 クロモマイシン A3、 塩酸ブレオマイシン、 硫酸ブレオマ イシン、 硫酸ぺプロマイシン、 塩酸ダウノルビシン、 塩酸ドキソルビシン、 塩酸 アクラルビシン、 塩酸ピラルビシン、 塩酸ェピルビシン、 ネオカルチノスタチン 、 ミスラマイシン、 ザルコマイシン、 カルチノフィリン、 ミ トタン、 塩酸ゾルビ シン、 塩酸ミトキサントロン、 塩酸イダルビシンなどが挙げられる。
「植物由来抗癌剤」 としては、 例えば、 エトポシド、 リン酸エトポシド、 硫酸 ビンブラスチン、 硫酸ビンクリスチン、 硫酸ビンデシン、 テ-ポシド、 パクリタ キセル、 ドセタクセル、 ピノレルビンなどが挙げられる。
「免疫療法剤 （BRM) 」 としては、 例えば、 ピシパニール、 クレスチン、 シゾ フイラン、 レンチナン、 ウベニメクス、 インターフェロン、 ィンターロイキン、 マクロファージコロニー刺激因子、 顆粒球コロニー刺激因子、 エリスロポイエチ ン、 リンホトキシン、 BCGワクチン、 コリネバタテリゥムパノレブム、 レバミゾー ル、 ポリサッカライ ド K、 プロコダゾールなどが挙げられる。
「細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤」 における 「細胞増 殖因子」 としては、 細胞の増殖を促進する物質であればどのようなものでもよく
、 通常、 分子量が 20, 000以下のペプチドで、 受容体との結合により低濃度で作用 が発揮される因子が用いられ、 具体的には、 （1) EGF (epidermal growth facto r) またはそれと実質的に同一の活性を有する物質 〔例、 EGF、 ハレダリン （HER2 リガンド) 等〕 、 (2) インシュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する 物質 〔例、 インシュリン、 IGF (insulin-like growth factor) - 1、 IGF- 2等〕 、
(3) FGF (fibroblast growth factor) またはそれと実質的に同一の活性を有す る物質 〔例、 酸性 FGF、 塩基性 FGF、 KGF (keratinocyte growth factor) 、 FGF- 1 0等〕 、 （4) その他の細胞増殖因子 〔例、 CSF (colony stimulating factor) 、 EP0 (erythropoietin; 、 IL - 2 (interleukin-2) 、 NGF (nerve growth factor) 、 PDGF (platelet-derived growth factor)、 TGF β ( t ransforming growth fac tor β ) 、 HGF (hepatocyte growth factor) N VEGF (vascular endothelial gro wth factor)等〕 などが挙げられる。
「細胞増殖因子の受容体」 としては、 前記の細胞増殖因子と結合能を有する受 容体であればいかなるものであってもよく、 具体的には、 EGF受容体、 ハレダリ ン受容体 （HER2) 、 インシュリン受容体、 IGF受容体、 FGF受容体- 1または FGF受 容体- 2などが挙げられる。
「細胞増殖因子の作用を阻害する薬剤」 としては、 トラスッズマブ （ハーセプ チン （商標） ； HER2抗体） 、 メシル酸ィマチ-ブ、 ZD1839またはセツキシマブ、 VEGFに対する抗体 (例、 べバシツマブ) 、 VEGF受容体に対する抗体、 ゲフイチ二 ブ、 エル口チニブなどが挙げられる。
前記の薬剤の他に、 L-ァスパラギナーゼ、 ァセグラトン、 塩酸プロカルバジン 、 プロトポルフィリン ·コバルト錯塩、 水銀へマトポルフィリン .ナトリウム、 トポイソメラーゼ I阻害薬 （例、 イリノテカン、 トポテカン等） 、 トポイソメラ ーゼ II阻害薬 （例えば、 ソブゾキサン等） 、 分化誘導剤 （例、 レチノイド、 ビタ ミン D類等） 、 血管新生阻害薬 （例、 サリ ドマイド、 SU11248等） 、 ひ一プロッカ 一 (例、 塩酸タムスロシン、 ナフトビジノレ、 ゥラピジル、 アルフゾシン、 テラゾ シン、 プラゾシン、 シロ ドシン等) セリン ' スレオニンキナーゼ阻害薬、 エンド セリン受容体拮抗薬 （例、 アトラセンタン等） 、 プロテアゾーム阻害薬 （例、 ボ ルテゾミブ等） 、 Hsp90阻害薬（例、 17- 0等）、 スピロノラタトン、 ミノキシジ ル、 li ce—ヒドロキシプロゲステロン、 骨吸収阻害 ·転移抑制薬 (例、 ゾレドロ ン酸、 アレンドロン酸、 パミ ドロン酸、 ェチドロン酸、 ィバンドロン酸、 クロ ド ロン酸）なども用いることができる。 本明細書および配列表において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該 分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に 関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
D NA デォキシリボ核酸
c D NA 相補的デォキシリボ核酸
A アデユン
T チミン
G グァユン
C シトシン
R NA リボ核酸
mR NA メッセンジャーリボ核酸
d A T P デォキシアデノシン三リン酸
d T T P デォキシチミジン三リン酸
d G T P デォキシグァノシン三リン酸
d C T P デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシノレ硫酸ナトリゥム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L e u ロイシン
I 1 e イソロイシン
e x セリン
T h r スレオニン
C y s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グノレタミン酸
A s
L y s リジン
Ar g ァノレギニン
H i s
P h e フエュノレァラニン
T y r チロシン
T r p トリプトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グノレタミン
p G 1 u ピログ タミン酸
S e c セレノシスティン (selenocysteine
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基およぴ試薬を下記の記号で表記 する。
Me メチル基
E t ェチル基
B u プチル基 P h フヱニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) 一カルボキサミド基
T o s p一トノレエンスノレフォニノレ
CHO ホルミル
B z 1 ベンジル
Cl2 - Bzl 2， 6—ジクロロべンジノレ
B om ペンジノレオキシメチル
Z ペンジノレオキシカノレポ二ノレ
C 1 -Z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r -Z 2一ブロモペンジノレオキシカノレボニノレ
B o c t—ブトキシカノレポ二ノレ
DNP ジニト口フ； ニル
T r t トリチル
Bum tーブトキシメチノレ
F m o c N— 9—フノレオレニルメ トキシカノレボニル
HOB t 1—ヒ ドロキシベンズトリァゾーノレ
HOOB t 3， 4ージヒ ドロ一 3—ヒ ドロキシ一4 _ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリァジン
HONB 1 -ヒ ドロキシ -5-ノルボルネン- 2， 3-ジカルボキシィミ ド DCC ： N, N'ージシクロへキシルカルボジィミ ド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト ACS1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒ ト ACS1をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ヒト ACS3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
ヒト ACS3をコードする cDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 5〕
ヒ ト ACS4 isoform 1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
ヒト ACS4 isoform 1をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
ヒト ACS4 isoform 2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
ヒト ACS4 isoform 2をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
ヒ ト ACS5 isoform aのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 10〕
ヒト ACS5 isoform aをコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
ヒ ト ACS5 isoform bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
ヒト ACS5 isoform bをコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕
ヒト ACS6 isoform aのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 14〕
ヒト ACS6 isoform aをコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 5〕
ヒト ACS6 isoform bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 6〕
ヒト ACS6 isoform bをコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
ヒト FASのアミノ酸配列を示す。 （GeneBank NP_004095)
〔配列番号： 18〕
ヒ ト FASをコードする cDNAの塩基配列を示す。 （GeneBank匪— 004104) 〔配列番号： 1 9〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号： 2 0〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。 実施例
以下において実施例により本発明をより具体的にするが、 この発明はこれらに 限定されるものではない。 実施例 1 ACS発現による FASP且害剤抵抗性の獲得
( 1 ) ヒ ト ACS5のクローニングと発現ベクターの構築
ヒ ト ACS5遺伝子は、 ヒ ト大腸癌 HCT- 15細胞 cDNAより PCRでクローニングした。 ヒト ACS5のクローニングには次の配列をプライマーとして用いた。
5' -AAAGAATTCTATGCTTTTTATCTTTAACTTTTTGTTTTCCC-3' (配列番号： 1 9 )
5' -AAAGGATCCATAATCCTGGATGTGCTCATACAGGC-3' (配列番号： 2 0 )
(なお、 3，_末端に FLAGタグを連結させるため、 終始コドン TAGを TATに置換した 形でプライマーを設定した。 ) 反応は、 AmpliTaq DNA polymerase (アプライド •バイオシステムズ社) を用い、 94°C 30秒、 65°C 30秒、 72°C 4分を 35サイクル で行なった。 得られた cDNA断片は EcoRIおよび BamHI (タカラバイオ社） で両末端 を切断した後、 pFLAG-CMV5 (コスモバイオ社） にクローニングして pFLAG- CMV - AC S5を得て、 その DNA sequencingを行なった。 その結果、 得られた cDNAの配列は公 知のヒト ACS5 (AB033899)と一致した。 得られた ACS5 cDNAは、 3，末に FLAGタグを 連結した形で、 pFLAG- CMV- ACS5より切り出した後、 レトロウィルスべクタ一 pHa - IRES-DHFR (Kage K. et al. Int. J. Cancer, 97卷， 626- 630頁， 2002年） に組 み込み、 pHa-ACS5- FLAG- IRES- DHFRを構築した。
( 2 ) ACS5の安定発現細胞の樹立
ACS5の安定発現細胞の樹立を以下のように行なった。 前項の方法で構築したレ ト口ウィルスベクター pHa - ACS5-FLAG - IRES - DHFRおよび空ベクター pHa- IRES- DHFR は、 mammalian transfection kit (ストラタジーン） を用いてマウス繊維芽細胞 PA317に導入し、 ウィルス液を得た。 さらに得られたウィルス液をヒトグリオ一 マ SF268細胞 （ATCC) に感染させ、 選択薬剤であるメ トトレキセート 100 ng/mlに て選択することにより、 安定発現株 SF268/ACS5およぴコントローノレとして SF268/ mockを得た。 各細胞の細胞抽出液を抗 FLAG- M2抗体 （シグマ社） （およびコント口 ールとして、 抗チューブリン抗体 (シグマ社) )によるウェスタンブロットにて 解析し、 SF268/ACS5において、 ACS5蛋白質の安定発現を確認した。
( 3 ) ACS発現による癌細胞における FAS阻害剤感受性変化の検討
検討においては、 前項の方法で榭立した ACS5安定高発現細胞 SF268/ACS5および 対照細胞である SF268/mock細胞を用い、 また細胞培養液としては、 RPMI 1640-10% FBS (ゥシ胎児血清） - 20mM HEPES (PH6. 5)を用いた。 SF268/mock細胞および SF26 8/ACS5細胞を 6- well plateに 100000細胞/ wellにて播種後、 RPMI1640- 10%FBS- 20m M HEPES (pH6. 5)にて 7日間 37°Cで培養した。 その後、 薬剤無処理または、 上記 培地に FAS阻害剤として 15 ;u g/ml のセルレニン （Cerulenin) [ (2R, 3S, E, E) -2, 3-epoxy-4-oxo-7, 10-dodecadienamide] (シグマ社) 、 または 15 /_i g/ml の C75 [ 4一 methylene— 2— octy丄一 5— oxotetranydrofuran— 3— carboxylic acidj (Alexis Bioc hemicals社） を添加し 24時間処理した後、 生存細胞数をトリパンブルー 'イクス クルージョン法にて測定した。 生存細胞数は、 薬剤無処理の SF268/mock細胞の細 胞数を 100%として示す。
結果を図 1に示す。
薬剤無処理において、 コントロールの SF268/mock細胞に比べ、 ACS5安定高発現 細胞 SF268/ACS5では有意な生存細胞の増加を認めた。 さらに、 FAS阻害剤に対す る感受性を比較すると、 コントロールの SF268/mock細胞では、 セルレニンおよび C75による明らかな増殖抑制効果が認められたが、 ACS5安定高発現細胞 SF268/ACS 5ではセルレニンおよび C75による増殖抑制効果は認められなかった。 このことは ACSを過剰に発現した癌細胞が、 FAS阻害に対して抵抗性を獲得することを示して いる。 実施例 2 ACS阻害剤と FAS阻害剤の併用効果の検証
肺癌細胞株である NCI- H23 (ATCC) を用いて ACS阻害剤 （Triacsin C [2， 4， 7-un decatrienal nitrosohydrazone] ) および FAS阻害斉 lj (Ceruleninまたは C75) を用 いた抗腫瘍作用の併用効果を検証した。 NCI-H23細胞は RPMI1640- 10%FBSで培養し た。 添加薬剤である Triacsin C、 Ceruleninおよび C75はいずれもシグマ社から購 入した。 NCI- H23細胞を 96iell plateに 2000細胞/ wellの濃度で播種し、 1日後に 上記培地に （A) Triacsin C、 （B) Cerulenin, (C) C75、 (D) Triacsin Cお よび Cerulenin、 (E) Triacsin Cおよび C75をそれぞれ添加し 3日間処理した後 、 細胞の生存率を Sulforhodamine B法 (Skehan, P. et al. , J. Natl. Cancer I nst. , 82卷， 1107-1112頁， 1990年） によって測定し、 それぞれ薬剤無処理の結 果と比較した。 添加した薬剤濃度は Triacsin Cが 0. 3 /x M、 Ceruleninが 2 μ M、 C75 力 ¾ μ Μである。 また実験は η = 3で行った。 その結果、 上記 （Α) から （Ε) まで の薬剤処理条件での生存細胞率は、 薬剤無処理の生存細胞率を 100%としたとき 、 (A) 56. 3±0. 5%、 (B) 70. 2±7. 9%、 （C) 61. 2± 3. 6%、 (D) 13. 4± 1· 4% 、 (Ε) 15· 3± 1. 0%であった。 これらの結果から ACS阻害剤 （Triacsin C) と FAS 阻害剤 （Ceruleninまたは C75) を併用することにより、 抗腫瘍効果が増強される ことが示された。 産業上の利用可能性
ァシル -CoA合成酵素 (ACS)フアミリーに属する酵素の活性または発現を、 脂肪 酸合成酵素 (FAS)の活性または発現と同時に阻害することにより、 癌細胞のアポ トーシスを選択的かつ強力に誘導し、 癌細胞を選択的かつ 果的に死滅させるこ とができる。 よって、 1) (i) (a) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵 素の活性を阻害する化合物またはその塩、 （b) ァシル -CoA合成酵素ファミリー に属する酵素の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) ァシル -CoA 合成酵素ファミリーに属する酵素に対する抗体、 （d) ァシル -CoA合成酵素ファ ミリ一に属する酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相捕的もしくは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオ チド、 および （e) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素をコードするポ リヌクレオチドに対する s i R NAまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一 種と、 （ii) (a) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、 （b) 脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) 脂肪酸合 成酵素に対する抗体、 （d) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩 基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するァ ンチセンスポリヌクレオチド、 および （e) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌ クレオチドに対する s i R N Aまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一種と を組み合わせてなる医薬、 2) (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素 および脂肪酸合成酵素の活性を阻害する物質、 または （および） （ii) ァシル -C oA合成酵素ファミリーに属する酵素の遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発 現を阻害する物質を含有してなる医薬などは、 例えば、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体 腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 網膜肉腫、 甲状腺癌、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸 腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 十二指 腸癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 滕癌、 膝内分泌腫瘍、 胆管 癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌 、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮頸部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫 、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白 血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ 性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 膝内分泌腫瘍、 線維性組織 球腫、 平滑筋肉腫、 横紋筋肉腫、 原発不明癌など） の予防 ·治療剤、 癌細胞のァ ポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤、 癌の転移 ·再発抑制剤などとして安全 な医薬として使用することができる。
(i) (a) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の活性を阻害する化合 物またはその塩、 （b) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の遺伝子の 発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属 する酵素に対する抗体、 .（d) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素をコ 一ドするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配 列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 および （e) ァシ ル- CoA合成酵素フアミリーに属する酵素をコードするポリヌクレオチドに対する s i R N Aまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一種と、 （ii) (a) 脂肪 酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、 （b) 脂肪酸合成酵素の遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) 脂肪酸合成酵素に対する抗体、 (d) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしく は実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレ ォチド、 および （e) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドに対する s i R NAまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一種とが同一物質であっても よい。
(i) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素および脂肪酸合成酵素の活 性を阻害する物質と （ii) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の遺伝子 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質とが同一物質であってもよ

Claims

請求の範囲
1 . (i) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の活性を阻害する物質 、 およびァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素の遺伝子の発現を阻害する 物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する物 質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくと も一種とを組み合わせてなる癌の予防 ·治療剤。
2 . ァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素が、 配列番号： 1、 配列番号 ： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号 ： 1 3および配列番号： 1 5で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩 から選ばれる少なくとも一種である請求項 1記載の予防 ·治療剤。
3 . ァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素が、 配列番号： 1、 配列番号 ： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9および配列番号： 1 1で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩から選ばれる少なくとも一種である 請求項 1記載の予防 ·治療剤。
4 . 脂肪酸合成酵素が、 配列番号： 1 7で表されるァミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチド またはその塩である請求項 1.記載の予防 ·治療剤。
5 . (i) (a) ァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素の活性を阻害する 化合物またはその塩、 （b) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （ ァシル -CoA合成酵素ファミリー に属する酵素に対する抗体、 （d) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素 をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 および （e) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素をコードするポリヌクレオチドに対 する s i R NAまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一種と、 （ii) (a) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、 （b) 脂肪酸合成酵素の 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) 脂肪酸合成酵素に対する抗 体、 （d) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的も しくは実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌ クレオチド、 および （e) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドに対す る s i R N Aまたは s h R N Aから選ばれる少なくとも一種とを組み合わせてな る請求項 1記載の予防 ·治療剤。
6 . . ァシル - CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素の活性を阻害する化合物また はその塩と脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩とを組み合わせ てなる請求項 1記載の予防 ·治療剤。
7 . (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリ一に属する酵素および脂肪酸合成酵素 の活性を阻害する物質、 または （および） （i i) ァシル -CoA合成酵素ファミリー に属する酵素の遺伝子および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質を含 有してなる癌の予防 ·治療剤。
8 . 癌の予防 ·治療剤が配合剤である請求項 1記載の予防 ·治療剤。
9 . 予防 ·治療剤が、 （i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の活 性を阻害する物質、 およびァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素の遺伝子 の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種を含有してなる医薬と、 （ii ) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現 を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種を含有してなる医薬とからなるキッ トである請求項 1記載の予防 ·治療剤。
1 0 . (i) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素の活性または （およ ぴ） 該酵素の遺伝子の発現を阻害し、 かつ （ii) 脂肪酸合成酵素の活性または （ および） 該酵素の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌の予防 ·治療方法
1 1 . (i) ァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の活性を阻害する物 質、 およびァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の遺伝子の発現を阻害す る物質から選ばれる少なくとも一種の有効量と、 （i i) 脂肪酸合成酵素の活性を 阻害する物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれ る少なくとも一種の有効量とを哺乳動物に対して投与する癌の予防 ·治療方法。
1 2 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 （i) ァシル -CoA合成酵素フアミ リ一に属する酵素の活性を阻害する物質、 およぴァシル -CoA合成酵素ファミリ一 に属する酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ ii) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発 現を阻害する物質から選ばれる少なくとも一種との使用。
1 3 . (i) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素の活性を阻害する物 質、 およぴァシル -CoA合成酵素フアミリ一に属する酵素の遺伝子の発現を阻害す る物質から選ばれる少なくとも一種と、 （ii) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する 物質、 および脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質から選ばれる少なく とも一種とを組み合わせてなる癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖 抑制剤。
1 4 . (i) (a) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の活性を阻害す る化合物またはその塩、 （b) ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素の遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 （c) ァシル -CoA合成酵素ファミリ 一に属する酵素に対する抗体、 （d) ァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵 素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 および （e ) ァシル -CoA合成酵素フアミリーに属する酵素をコードするポリヌクレオチドに 対する s i R NAまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一種と、 （ii) (a ) 脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩、 （b) 脂肪酸合成酵素 の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 (c) 脂肪酸合成酵素に対する 抗体、 （d) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的 もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリ ヌクレオチド、 および （e) 脂肪酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドに対 する s i R N Aまたは s h R NAから選ばれる少なくとも一種とを組み合わせて なる請求項 1 3記載の剤。
1 5 . ァシル -CoA合成酵素ファミ リーに属する酵素の活性を阻害する化合物ま たはその塩と脂肪酸合成酵素の活性を阻害する化合物またはその塩とを組み合わ せてなる請求項 1 3記載の剤。
1 6 . (i) ァシル -CoA合成酵素ファミ リ一に属する酵素および脂肪酸合成酵 素の活性を阻害する物質、 または （および） （ii) ァシル -CoA合成酵素ファミリ 一に属する酵素の遺伝子おょぴ脂肪酸合成酵素の遺伝子の発現を阻害する物質を 含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤。
1 7 . (i) ァシル -CoA合成酵素ファミリーに属する酵素の活性または （およ ぴ） 該酵素の遺伝子の発現を阻害し、 かつ （ii) 脂肪酸合成酵素の活性または （ および） 該酵素の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトーシ ス促進方法または癌細胞の増殖抑制方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011140296A1 (en) 2010-05-05 2011-11-10 Infinity Pharmaceuticals Triazoles as inhibitors of fatty acid synthase
EP3159331A1 (en) 2010-05-05 2017-04-26 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Tetrazolones as inhibitors of fatty acid synthase
EP2585115A4 (en) * 2010-06-23 2014-12-17 Univ Brandeis ANTICANCER TREATMENT
CN112587664A (zh) * 2020-12-29 2021-04-02 四川大学华西医院 长链脂酰辅酶a合成酶4的抑制剂在治疗帕金森疾病中的应用
CN113876958B (zh) * 2021-06-18 2023-05-12 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种治疗癌症的药物组合物及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07509470A (ja) * 1992-07-24 1995-10-19 ザ・ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ がんの治療に脂肪酸合成阻害剤を用いる方法
US5759837A (en) * 1989-01-17 1998-06-02 John Hopkins University Chemotherapy for cancer by inhibiting the fatty acid biosynthetic pathway
US20020086356A1 (en) 2000-03-30 2002-07-04 Whitehead Institute For Biomedical Research RNA sequence-specific mediators of RNA interference

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924355B2 (en) * 1998-09-01 2005-08-02 Genentech, Inc. PRO1343 polypeptides
US6294364B1 (en) * 1999-03-03 2001-09-25 Smithkline Beecham Corporation Human FAS
ATE330598T1 (de) * 1999-11-12 2006-07-15 Univ Johns Hopkins Behandlung von krebs durch erhöhung des malonyl- coa-spiegels
WO2003076565A2 (en) * 2001-09-17 2003-09-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of using 46828, a human acyl-coa synthetase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5759837A (en) * 1989-01-17 1998-06-02 John Hopkins University Chemotherapy for cancer by inhibiting the fatty acid biosynthetic pathway
JPH07509470A (ja) * 1992-07-24 1995-10-19 ザ・ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ がんの治療に脂肪酸合成阻害剤を用いる方法
US20020086356A1 (en) 2000-03-30 2002-07-04 Whitehead Institute For Biomedical Research RNA sequence-specific mediators of RNA interference

Non-Patent Citations (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Antisense Research and Applications", 1993, CRC PRESS
"Idenshi no Kino Sogai Jikkenho", 2001, YODOSHA, pages: 26 - 32
"Idenshi to Kino Sogai Jikkenho", 2001, YODOSHA, pages: 26 - 32
"Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu", vol. 14, HIROKAWA SHOTEN
BIO/TECHNOLOGY, vol. 6, 1988, pages 47 - 55
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 186, 1992, pages 1271
BITTER, G. A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 5330
BOSTIAN, K. L. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 77, 1980, pages 4505
CAO, Y. ET AL., CANCER RES., vol. 61, 2001, pages 8429 - 8434
COLEMAN, R. A. ET AL., J. NUTR., vol. 132, 2002, pages 2123 - 2126
DE S.C. ET AL.: "RNA interference-mediated silencing of the fatty acid synthase gene attenuates growth and induces morphological changes and apoptosis of LNCaP prostate cancer cells", CANCER RES., vol. 63, no. 13, 2003, pages 3799 - 3804, XP003018253 *
DE SCHRIJVER, E. ET AL., CANCER RES., vol. 63, 2003, pages 3799 - 3804
FAERGEMEN, N. J.; KNUDSEN, J., BIOCHEMICAL J., vol. 323, 1997, pages 1 - 12
FEBS LETT., vol. 228, 1988, pages 228
FEBS LETT., vol. 239, 1988, pages 285
GENE, vol. 17, 1982, pages 107
GENE, vol. 24, no. 255 5, 1983, pages 207 - 21
GENES & DEVE., vol. 16, 2002, pages 948 - 958
GENESIS, vol. 26, 2000, pages 240 - 244
GENETICS, vol. 39, 1954, pages 440
GRACE, T. C. C., NATURE, vol. 195, 1962, pages 788
IZUMIYA; NOBUO ET AL.: "Peptide Gosei no Kiso to Jikken", 1975, MARUZEN
J. BIOL. CHEM., vol. 256, 1981, pages 5702 - 5707
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 95, 1984, pages 87
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 120, 1978, pages 517
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 41, 1969, pages 459
JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
KAGAKU TO SEIBUTSU, vol. 30, 1992, pages 112
KAGE, K. ET AL., INT. J. CANCER, vol. 97, 2002, pages 626 - 630
KIM, J.-H. ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 276, 2001, pages 24667 - 24673
KOHLER; MILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
KUHAJDA, F. P. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 91, 1994, pages 6379 - 6383
KUHAJDA, F. P. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 97, 2000, pages 3450 - 3454
MAEDA ET AL., NATURE, vol. 315, 1985, pages 592
MASHIMA T. ET AL.: "p53-defective tumors with a functional apoptosome-mediated pathway: a new therapeutic target", J. NATL. CANCER INST., vol. 97, no. 10, 2005, pages 765 - 777, XP002991796 *
MASHIMA, T. ET AL., J. NATL. CANCER INST., vol. 97, 2005, pages 765 - 777
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 194, 1991, pages 182 - 187
MILLER: "Journal of Experiments in Molecular Genetics", 1972, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, pages: 431 - 433
MOLECULAR 7 GENERAL GENETICS, vol. 168, 1979, pages 111
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 20, 2002, pages 497 - 500
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 20, 2002, pages 500 - 505
NATURE GENETICS, vol. 24, 2000, pages 180 - 183
NATURE, vol. 323, 1986, pages 349
NATURE, vol. 407, 2002, pages 319 - 320
NATURE, vol. 411, 2001, pages 494
NEPOKROEFF, C. M. ET AL., METHODS ENZYMOL., vol. 26, 1975, pages 37 - 39
NUCL ACIDS RES., vol. 19, 1991, pages 3875
NUCL ACIDS RES., vol. 19, 1991, pages 6751
NUCL. ACIDS RES., vol. 17, 1989, pages 7059
NUCL. ACIDS RES., vol. 19, 1991, pages 5125
NUCL. ACIDS RES., vol. 19, 1991, pages 6751
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 30, 2002, pages E46
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 9, 1981, pages 309
PHARM. TECH. JAPAN, vol. 8, 1992, pages 247
PIZER E.S. ET AL.: "Pharmacological inhibitors of mammalian fatty acid synthase suppress DNA replication and induce apoptosis in tumor cell lines", CANCER RES., vol. 58, no. 20, 1998, pages 4611 - 4615, XP000942095 *
PIZER, E. S. ET AL., CANCER RES., vol. 60, 2000, pages 213 - 218
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 60, 1968, pages 160
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 69, 1972, pages 2110
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, 1978, pages 1929
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, 2002, pages 5515 - 5520
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, 2002, pages 6047 - 6052
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
PROTEIN ENG., vol. 3, 1990, pages 733
PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 35, 1990, pages 2191
SAIBO KOGAKU BESSATSU 8, SHIN SAIBO KOGAKU JIKKEN PROTOCOL, 1995, pages 263 - 267
SCHROEDER; LUEBKE: "The Peptide", 1965, ACADEMIC PRESS
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
SCIENCE, vol. 296, 2002, pages 550 - 553
SKEHAN, P. ET AL., J. NATL. CANCER INST., vol. 82, 1990, pages 1107 - 1112
TOMODA, H. ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA, vol. 921, 1987, pages 595 - 598
TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 7, 2001, pages 221
VANCE, D. ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 48, 1972, pages 649 - 656
VAUGHN, J. L. ET AL., IN VIVO, vol. 13, 1977, pages 213 - 217
VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396
WAKIL, S. J., BIOCHEMISTRY, vol. 28, 1989, pages 4523 - 4530
YAJIMA; HARUAKI; SAKAKIBARA, SHUMPEI SEIKAGAKU JIKKEN KOZA 1, TANPAKUSHITSU NO KAGAKU, vol. IV, 1977, pages 205
YAMASHITA, Y. ET AL., ONCOGENE, vol. 19, 2000, pages 5919 - 5925

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013038907A1 (ja) * 2011-09-14 2013-03-21 日本化薬株式会社 細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤
JPWO2013038907A1 (ja) * 2011-09-14 2015-03-26 日本化薬株式会社 細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤
WO2013118857A1 (ja) * 2012-02-10 2013-08-15 国立大学法人大阪大学 Ａｃｓｌ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド

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EP2018873A1 (en) 2009-01-28

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