ES2267587T3 - Tratamiento del cancer aumentando los niveles de malonil-coa. - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor de la MCD (malonil-CoA descarboxilasa), que provoca un aumento en la malonil CoA intracelular en las células tumorales de un organismo, en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de las células tumorales en el organismo.

Description

Tratamiento del cáncer aumentando los niveles de malonil-CoA.

Revisión de la técnica relacionada

Diversos estudios han demostrado sorprendentemente altos niveles de expresión de la sintasa de ácidos grasos (FAS, E.G. 2.3.1.85) en cáncer de mama humano virulento (Alo, P. L, Visca, P., Marci, A., Mangoni, A., Botti, C. y Di Tondo, U. Expression of fatty acid synthase (FAS0 as a predictor of recurrence in stage I breast carcinoma patients., Cancer. 77: 474-482, 1996; Jensen, V., Ladekarl, M., Holm-Nielsen, P., Melsen, F. y Soerensen, F. B. The prognostic value of oncogenic antigen 519 (OA-519) expression and proliferative activity detected by antibody M IB-1 in node-negative breast cancer., Journal of Pathology. 176: 343-352, 1995), así como en otros cánceres (Rashid, A., Pizer, E. S., Moga, M., Milgraum, L. Z., Zahurak, M., Pastemack, G. R., Kuhajda, F. P. y Hamilton, S. R. Elevated expression of fatty acid synthase and fatty acid synthetic activity in colorectal neoplasia., American Journal of Pathology. 150: 201-208, 1997; Pizer, E., Lax, S., Kuhajda, F., Pasternack, G. y Kurman, R. Fatty acid synthase expression in endometrial carcinoma: correlation with cell proliferation and hormone receptors., Cancer. 83: 528-537, 1998). La expresión de la FAS también se ha identificado en el carcinoma mamario in situ intraductal y lobular; lesiones asociadas con un aumento del riesgo de desarrollar un cáncer de mama infiltratante (Milgraum, L. Z., Witters, L. A., Pasternack, G. R. y Kuhajda, F. P. Enzymes of the fatty acid synthesis pathway are highly expressed in in situ breast carcinoma., Clinical Cancer Research. 3: 2115-2120, 1997). La FAS es la principal enzima sintética de la síntesis de ácidos grasos (síntesis de AG) que cataliza la condensación dependiente de NADPH de malonil-CoA y acetil-CoA para producir predominantemente el ácido graso saturado de 16 carbonos libre palmitato (Wakil, S. Fatty acid synthase, a proficient multifunctional enzyme., Biochemistry. 28: 4523-4530, 1989). Las mediciones ex vivo en tejido tumoral han revelado altos niveles de síntesis tanto de FAS como de AG, lo que indica que todo el programa genético es altamente activo, consistiendo en unas 25 enzimas desde la hexocinasa hasta la FAS.

Las células cancerosas humanas cultivadas tratadas con inhibidores de la FAS, incluyendo el producto fúngico cerulenina, y el nuevo compuesto C75, mostraron una rápida disminución en la síntesis de AG, con la subsiguiente reducción en la síntesis de DNA y la detención del ciclo celular, culminando en apoptosis (Pizer, E. S., Jackisch, C., Wood, F. D., Pasternack, G. R, Davidson, N. E. y Kuhajda, F. Inhibition of fatty acid synthesis induces programmed cell death in human breast cancer cells., Cancer Research. 56: 2745-2747, 1996, Pizer, E. S., Chrest, F. J., DiGiuseppe, J. A. y Han, W. F. Pharmacological inhibitors of mammalian fatty acid synthase suppress DNA replication and induce apoptosis in tumor cell lines., Cancer Research. 58: 4611-4615, 1998). La inhibición farmacológica de la actividad de sintasa de ácidos grasos de mamíferos dio lugar a una inhibición de la replicación del DNA aproximadamente a los 90 minutos de la aplicación del fármaco. Estos hallazgos sugirieron una conexión bioquímica vital entre la síntesis de FA y el crecimiento de células cancerosas. Aunque despierta un gran interés, la cuestión sobre cómo la inhibición de la sintasa de ácidos grasos desencadenó este fenómeno permanece desconocida. De forma importante, estos efectos ocurrieron a pesar de la presencia de ácidos grasos exógenos en el medio de cultivo procedentes de suero bovino fetal. Aunque ha sido posible librar de los efectos citotóxicos de la cerulenina a ciertas células en condiciones de cultivos sin ácidos grasos mediante la adición de palmitato exógeno, la mayoría de las células cancerosas no se libraron de la inhibición de la síntesis de FA mediante la vía del producto final (datos no mostrados) (Pizer, E. S., Wood, F. D., Pasternack, G. R. y Kuhajda, F. P. Fatty acid synthase (FAS): A target for cytotoxic antimetabolities in HL60 promyelocytic leukemia cells., Cancer Research. 1996: 745-751, 1996). Por lo tanto, no se ha resuelto si el efecto citotóxico de la inhibición de la síntesis de FA sobre la mayoría de las células cancerosas es el resultado de un agotamiento del producto final o de algún otro mecanismo bioquímico.

Resumen de la invención

Según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un inhibidor de la MCD que provoca un aumento de la malonil CoA intracelular en células tumorales de un organismo, en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de células tumorales en el organismo.

En un aspecto alternativo de la invención, se proporciona el uso de una composición que provoca un aumento la malonil CoA intracelular en células tumorales de un organismo, en el que dicho aumento de la malonil CoA intracelular se correlaciona con un aumento de la síntesis de malonil CoA, en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de células tumorales en un organismo.

Esta invención proporciona un procedimiento para destruir células cancerosas mediante la elevación aguda de la malonil Coenzima A (Malonil CoA) celular, que da lugar a una apoptosis. La elevación de la malonil CoA inducida mediante la inhibición de la sintasa de ácidos grasos (FAS), se correlaciona tanto con la inhibición de la síntesis de ácidos grasos como con la inhibición de la palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT-1). Puede esperarse que cualquier combinación de fármacos que produzca un efecto fisiológico análogo dé lugar al mismo efecto sobre células tumorales susceptibles. Por ejemplo, puede esperarse que la terapia combinada con fármacos que inhiben la síntesis de ácidos grasos inhibiendo la acetil CoA carboxilasa (la primera enzima de la vía de síntesis de ácidos grasos) y fármacos que inhiban la CPT-1, induzcan la apoptosis en células tumorales. Por lo tanto, esta invención proporciona cualquier procedimiento para inhibir de forma sistémica la actividad de la CPT-1 en células cancerosas incluyendo, pero no limitándose a, la inhibición directa de la CPT-1 a través de pequeñas moléculas inhibidoras tales como etomoxir, así como la inhibición de la CPT-1 como consecuencia de un aumento del nivel de malonil CoA en células cancerosas.

Esta estrategia terapéutica dará lugar a nuevos agentes quimioterapéuticos para una amplia variedad de cánceres humanos. Además, como esta es una nueva vía para dar lugar a una apoptosis que no es compartida por otros fármacos contra el cáncer, puede anticiparse que la inducción de altos niveles de inhibición de malonil CoA y/o CPT-1 podría potenciar otros agentes terapéuticos contra el cáncer utilizados habitualmente.

La invención proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento de células tumorales en un organismo administrando al organismo una composición que provoca un aumento de la malonil CoA intracelular en células tumorales del organismo. Preferiblemente, la malonil CoA intracelular aumenta bruscamente al menos en las células tumorales del organismo (es decir, de forma aguda o repentina), y más preferiblemente, la malonil CoA intracelular aumenta antes de cualquier aumento significativo de la tasa de consumo de la malonil CoA. Típicamente, la malonil CoA intracelular de las células del organismo aumenta a las 3 horas de la administración, y puede esperarse que la malonil CoA intracelular aumente antes de la inhibición del crecimiento de las células.

Preferiblemente, el aumento de la malonil CoA intracelular se correlaciona con un consumo reducido de malonil CoA. Por ejemplo, el aumento de la malonil CoA intracelular puede correlacionarse con una actividad intracelular reducida de la descarboxilasa de malonil CoA (MCD) o una actividad intracelular reducida de la sintasa de ácidos grasos; y opcionalmente, la composición puede comprender un inhibidor de la MCD. En una preferencia adicional, el aumento de la malonil CoA intracelular se correlaciona con un aumento de la síntesis de malonil CoA y/o el aumento de la malonil CoA intracelular se correlaciona con un aumento de la actividad intracelular de la carboxilasa de acetil-CoA (ACC).

La invención proporciona una composición que comprende un agente seleccionado del grupo constituido por un activador de la ACC, un inhibidor de la cinasa de proteína activada por 5'-AMP (AMPK), y/o un inhibidor de la sintasa de acil CoA. La composición puede comprender un inhibidor de la palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT-1), que puede ser etomoxir, administrado preferiblemente en combinación con un agente del grupo anterior. Alternativamente, se administra un segundo agente quimioterapéutico al organismo, no siendo dicho segundo agente quimioterapéutico inhibidor de la síntesis de ácidos grasos.

Preferiblemente, el procedimiento proporcionado por esta invención se usa para tratar organismos que tienen, antes de la administración de la composición, un nivel de malonil CoA intracelular en células tumorales al menos 2 veces mayor que el nivel normal de malonil CoA en células no malignas. Más preferiblemente, el procedimiento se usa para tratar organismos en los que la tasa de síntesis de ácidos grasos en algunas células del organismo es al menos 2 veces mayor que la de las células normales antes de la administración de la composición, y la administración de la composición es citotóxica para esas células. Preferiblemente, el organismo comprende células tumorales con elevadas tasas de síntesis de ácidos grasos, y el número de células de dichas células tumorales se reduce subsiguientemente a la administración de dicha composición. Durante el tratamiento, preferiblemente, el nivel intracelular de malonil CoA es elevado, y el nivel intracelular de acetil CoA, y de CoA libres son reducidos respecto a los niveles previos al tratamiento.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de (a) un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos en las células tumorales de un organismo; y (b) un inhibidor de la oxidación de ácidos grasos en dichas células, en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de células tumorales en el organismo. Preferiblemente, el inhibidor de la oxidación de ácidos grasos está incluido en una cantidad que no inhibe significativamente la CPT-2. Más preferiblemente, el inhibidor de la síntesis de ácidos grasos y el inhibidor de la oxidación de ácidos grasos están incluidos en cantidades para alcanzar unos niveles de inhibición que son al menos aproximadamente iguales o mayores a los niveles de las respectivas inhibiciones observadas para dosis citotóxicas de cerulenina.

En otra forma de realización, esta invención proporciona un procedimiento de cribado para ayudar a detectar composiciones que son selectivamente citotóxicas para las células tumorales, que comprende administrar una composición objetivo a una célula con un elevado nivel intracelular de malonil CoA, monitorizar la malonil CoA intracelular en la célula subsiguientemente a esta administración, siendo un descenso abrupto en la malonil CoA intracelular indicativo de una citotoxicidad selectiva. Preferiblemente, este procedimiento comprende adicionalmente comparar el patrón de cambios en el nivel de malonil CoA intracelular en presencia y ausencia de TOFA, en el que pequeños cambios en el nivel de malonil CoA en presencia de TOFA es indicativo de una citotoxicidad selectiva.

En otra forma de realización más, esta invención proporciona un procedimiento de cribado para ayudar a detectar composiciones que son inhibidoras del crecimiento de células tumorales, que comprende administrar una composición objetivo a una línea celular derivada de un tumor y monitorizar la actividad de la CPT-1 en la célula subsiguientemente a esta administración, en el que un descenso en la actividad de la CPT-1 es indicativo de un potencial inhibidor del crecimiento. Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo cuando la célula está permeabilizada. Alternativamente, el procedimiento comprende adicionalmente monitorizar la apoptosis de dicha célula, y la monitorización de la apoptosis puede comprender un procedimiento seleccionado del grupo constituido por la medición del potencial transmembranal mitocondrial, la tinción con colorantes vitales, la monitorización de la activación de la caspasa en células completas usando una transferencia del tipo Western, y la medición del citocromo C elaborado en las mitocondrias usando una transferencia del tipo Western.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la vía de síntesis de ácidos grasos, y el efecto de diversos inhibidores de la sintasa de ácidos grasos sobre la síntesis de ácidos grasos y el crecimiento de células tumorales.

La Figura 2 muestra los niveles de malonil CoA en diversas condiciones.

La Figura 3 muestra los resultados de los ensayos clonogénicos y de los ensayos de apoptosis sobre células de cáncer de mama tratadas con diversos inhibidores.

La Figura 4 muestra diversos parámetros en células tumorales y en hepatocitos.

La Figura 5 muestra los niveles de malonil CoA en células tumorales y en hepatocitos.

La Figura 6 muestra la vía de oxidación celular de ácidos grasos. La CPT-1 regula la oxidación de ácidos grasos en la mitocondria controlando el paso de derivados de cadena larga de la acil CoA tales como palmitoil CoA a través de la membrana externa de las mitocondrias hacia la mitocondria, evitando así el inútil ciclo de oxidar endógenamente los ácidos grasos sintetizados.

La Figura 7 muestra el efecto de Etomoxir sobre el crecimiento de células MCF-7 con y sin C-75.

La Figura 8 muestra el efecto de la cerulenina sobre la oxidación de ácidos grasos en células MCF-7.

La Figura 9 muestra el efecto de Etomoxir, TOFA y cerulenina sobre la actividad de la CPT-1.

La Figura 10 muestra el efecto de Etomoxir sobre la oxidación de ácidos grasos en células MCF-7.

La Figura 11 muestra el efecto de Etomoxir sobre el crecimiento de células MCF-7.

La Figura 12 muestra los resultados de los ensayos clonogénicos con células MCF-7 tratadas tanto con Etomoxir como con TOFA.

La Figura 13 muestra el efecto de Etomoxir y/o C-75 sobre el crecimiento de células MCF-7.

Descripción detallada de las formas de realización

Si el agotamiento de ácidos grasos media los efectos citotóxicos de la cerulenina y el C75, entonces cualquier otro inhibidor de la síntesis de FA con una potencia similar debería producir unos efectos similares. Para probar esta idea, los inventores compararon los efectos sobre células cancerosas de la inhibición de la carboxilasa de acetil-CoA (ACC, E.C. 6.4.1.2), la enzima limitante de la tasa de síntesis de ácidos grasos, con los efectos de los inhibidores de la FAS. Los inventores descubrieron que la inhibición de la FAS da lugar a altos niveles de malonil-CoA, que aparecen tras una hora de tratamiento con C75. Estos niveles suprafisiológicos de malonil-CoA, en lugar de simplemente disminuir los niveles de ácidos grasos sintetizados endógenamente, son responsables de la apoptosis de las células del cáncer de mama. Además, esta es una nueva vía que da lugar a una apoptosis selectiva de las células cancerosas.

La Figura 1A esquematiza la porción de la vía de síntesis de FA que contiene las enzimas objetivo de los inhibidores usados en este estudio. La inhibición de la sintasa de ácidos grasos da como resultado altos niveles de malonil-CoA que contribuyen a la citotoxicidad frente a células de cáncer de mama humano (ref). Además de su papel como sustrato para la síntesis de ácidos grasos, la malonil-CoA es un potente inhibidor de la palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT-1), la enzima limitante de la tasa de oxidación de los ácidos grasos. La CPT-1 es una proteína integral de la membrana externa de la mitocondria que realiza una transesterificación de lipoacil CoA de cadena larga a L-carnitina produciendo acilcarnitina. La acilcarnitina es transportada a través de las membranas mitocondriales, donde es esterificada de nuevo a acil-CoA por la CPT-2. Fisiológicamente, la actividad de la CPT-1 es regulada a través de la inhibición por la malonil-CoA, un sustrato de la síntesis de ácidos grasos. La malonil-CoA es el producto enzimático de la carboxilasa de acetil-CoA (ACC, E.C. 6.4.1.2), la enzima reguladora de la síntesis de ácidos grasos. Los niveles citoplasmáticos de malonil-CoA son mayores durante la síntesis de ácidos grasos debido a un aumento en la actividad de la ACC. Los elevados niveles de malonil-CoA, a su vez, inhiben la CPT-1, y bloquean la entrada de acil-CoA de cadena larga en la mitocondria. Esto evita el inútil ciclo de síntesis y oxidación simultáneas de ácidos grasos. En el músculo, que es esencialmente carente de FAS, la ACC y la malonil-CoA regulan la oxidación de los ácidos grasos, una importante fuente de combustible para el músculo cardíaco y esquelético.

El TOFA (ácido 5-(tetradeciloxi)-2-furoico) es un inhibidor alostérico de la carboxilasa de acetil-CoA (ACC, E.C. 6.4.1.2), que bloquea la carboxilación de la acetil-CoA en malonil-CoA. Una vez esterificada a coenzima-A, la TOFA-CoA inhibe alostéricamente la ACC con un mecanismo similar al de las acil-CoA de cadena larga, los inhibidores fisiológicos por producto final de la ACC (Halvorson, D. L. y McCune, S. A. Inhibition of fatty acid synthesis in isolated adipocytes by 5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid., Lipids. 19: 851-856, 1984). Tanto la cerulenina (Funabashi, H., Kawaguchi, A., Tomoda, H., Omura, S., Okuda, S. e Iwasaki, S. Binding site of cerulenin in fatty acid synthetase., J. Biochem. 105: 751-755, 1989) como el C75 (Pizer, y col., 1998) son inhibidores de la FAS, que evitan la condensación de malonil-CoA y acetil-CoA en ácidos grasos. La cerulenina es un inhibidor suicida, que forma un producto de adición covalente con la FAS (Moche, M., Schneider, G., Edwards, P., Dehesh, K. y Lindqvist, Y. Structure of the complex between the antibiotic cerulenin and its target, beta-ketoacyl carrier protein synthase., J Biol Chem. 274: 6031-6034, 1999), mientras que es probable que el C75 sea un inhibidor de unión lenta (Kuhajda, F. P., Pizer E. S., Mani, N. S., Pinn, M. L., Han W. F., Chrest F. J. y CA. T., Synthesis and anti-tumor activity of a novel inhibitor of fatty acid synthase, Proceeding of the American Association for Cancer Research, 40: 121, 1999). Usando el TOFA, los inventores han logrado una inhibición de la síntesis de FA en líneas celulares de cáncer de mama humano comparable a la inhibición por la cerulenina o el C75. Sorprendentemente, sin embargo, el TOFA era esencialmente no citotóxico ensayos clonogénicos de células de cáncer de mama humano. Estos datos indican que el agotamiento de los ácidos grasos no es una fuente principal de citotoxicidad para las células cancerosas en cultivo complementado con suero. Un efecto alternativo de la inhibición de la FAS (altos niveles del sustrato, la malonil-CoA, que resultan específicamente de la inhibición de la FAS) parece mediar en la citotoxicidad de la cerulenina y el C75.

La malonil-CoA, el producto enzimático de la carboxilasa de acetil-CoA (ACC, E.C. 6.4.1.2), es una molécula reguladora clave en el metabolismo celular. Además de su papel como sustrato en la síntesis de ácidos grasos, la malonil-CoA regula la \beta-oxidación de los ácidos grasos a través de su interacción con la palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT-1) en la membrana externa de la mitocondria. La palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT-1) es la enzima limitante de la tasa de oxidación mitocondrial de ácidos grasos (véase la Figura 6). Es una proteína integral de la membrana externa de la mitocondria que realiza una transesterificación de lipoacil CoA de cadena larga en L-carnitina, produciendo acilcarnitina. La acilcarnitina es transportada a través de las membranas mitocondriales, donde es esterificada de nuevo a acil-CoA por la CPT-2.

Muchos tipos de células cancerosas tienen altos niveles de síntesis de ácidos grasos. Como se esperaba, las células con altos niveles de síntesis de ácidos grasos tienen altos niveles en equilibrio de malonil-CoA, al menos seis veces los niveles de las células normales (véase el Ejemplo 6). El tratamiento de células tumorales con inhibidores de la FAS aumentará selectiva y abruptamente los niveles de malonil-CoA hasta niveles suprafisiológicos en células cancerosas. Esta maniobra aumenta los niveles de malonil-CoA, bloqueando la utilización de la malonil-CoA como sustrato en la síntesis de ácidos grasos, y estimulando simultáneamente la síntesis de malonil-CoA, aliviando la inhibición de la lipoacil-CoA sobre la ACC (Figura 1 A). Dado que la FAS se expresa preferentemente en células cancerosas, el aumento de la malonil-CoA está restringido en su mayor parte a células tumorales. Esto da lugar a una apoptosis de la célula cancerosa y a una economía de los tejidos normales, como sucede en los xenotransplantes de cáncer humano tratados con inhibidores de la FAS (véase el Ejemplo 5).

La CPT-1 tiene dos isoformas, la hepática (L-CPT-1) y la muscular (M-CPT-1) (Swanson, S. T., Foster, D. W., McGarry, J. D. y Brown, N. F. Roles of the N- and C-terminal domains of carnitine palmitoyltransferase I isoforms in malonyl-CoA sensitivity of the enzymes: insights from expression of chimaeric proteins and mutation of conserved histidine residues., Biochem. J. 335: 513-519, 1998). Estas isoformas tienen propiedades genéticas muy diferentes en su K_{m} para la carnitina (500 \muM para la M-CPT-1 y \sim30 \muM para la L-CPT-1) y en su sensibilidad a la inhibición por la malonil-CoA (la M-CPT-1 es 100 veces más sensible, K_{i} = 0,07 \muM frente a 7 \muM). Mientras que el sitio regulador de la malonil-CoA reside en la región N-terminal, el sitio de unión exacto no ha sido aclarado (Swanson, y col., 1998). Importantemente, el etomoxir, un inhibidor covalente de la CPT-1 que se usa en este documento como ejemplo de un inhibidor de la CPT-1, se une en un sitio diferente al de la malonil-CoA.

La CPT-1 no ha sido estudiada en células cancerosas humanas. Por lo tanto, la isoforma expresada en las células cancerosas humanas es desconocida. Conceptualmente, la isoforma debería ser expresada en tumores de diferenciación epitelial que incluyen todos los carcinomas, mientras que la isoforma muscular debería ser expresada en tumores no epiteliales tales como los sarcomas. Sin embargo, los estudios de las isoformas hepática y muscular de la ACC han averiguado que una o ambas isoformas pueden ser expresadas en células de cáncer de mama humano (Witters, L., Widmer, J., King, A., Fassihi, K. y Kuhajda, F. Identification of human acetyl-CoA carboxylase isozymes in tissue and in breast cancer cells., International Journal of Biochemistry. 26 589-594, 1994). De forma similar, las células de carcinoma humano pueden tener la capacidad de expresar una o ambas isoformas de la CPT-1.

Recientemente se ha demostrado que la inhibición de la CPT-1 sensibilizaba a las células a una apoptosis inducida por ácidos grasos (Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramatsu, M., Yamamoto, M. y Honjo, T. Inhibition of carntine palmitoyltransferase I augments sphingolipid synthesis and palmitate-induced apoptosis., J. Biol. Chem. 272: 3324-3329, 1997). Además, un aumento en los niveles de malonil CoA inducido por la inhibición de la sintasa de ácidos grasos (FAS) es citotóxico para las células cancerosas humanas (véanse los Ejemplos 4 y 5). Considerados conjuntamente, estos datos sugieren que las células cancerosas humanas son susceptibles de una inducción de la apoptosis a través de alteraciones en el metabolismo de los ácidos grasos. También se ha demostrado que la CPT-1 interactúa directamente con la BCL-2, la proteína antiapoptosis, en la membrana mitocondrial externa (Paumen, M. B., Ishisa, Y., Han, H., Muramatsu, M., Eguchi, Y., Tsujimoto, Y. y Honjo, T. Direct interaction of the mitochondrial membrane protein carnitine palmitoyltransferase I with Bc1-2, Biochem Biophys Res Commun. 231: 523-525, 1997). Potencialmente, la interacción de la CPT-1 con la BCL-2 puede proporcionar un mecanismo anterógrado que dé lugar a una apoptosis, modulando los efectos antiapoptóticos de la BCL-2.

Además de su papel como sustrato de la FAS, la malonil-CoA actúa en la membrana mitocondrial externa regulando la oxidación de los ácidos grasos mediante la inhibición de la palmitoiltransferasa 1 de carnitina (CPT-1). Se ha demostrado que la inhibición de la CPT-1 sensibiliza a las células ante una apoptosis inducida por ácidos grasos; la CPT-1 también puede interactuar directamente con la BCL-2, la proteína antiapoptosis, en las mitocondrias. La inhibición de la FAS da lugar a altos niveles de malonil-CoA que inhiben la CPT-1, lo que induce una apoptosis en las células cancerosas. Dado que la mayoría de las células normales proliferativas y no proliferativas no tienen altos niveles de FAS, no se verán afectadas por esta estrategia terapéutica.

Los niveles de malonil CoA pueden manipularse usando una variedad de procedimientos y enzimas objetivo. Los Ejemplos muestran el aumento de los niveles de malonil CoA a través de una utilización reducida y un incremento simultáneo de la producción. Un aumento agudo en los niveles de malonil CoA da lugar a una destrucción selectiva de las células cancerosas a través de una apoptosis, dejando intactas las células normales. Los procedimientos para inducir la apoptosis según esta invención se clasifican en dos amplias categorías: inducción directa de un aumento agudo de la malonil-CoA (por ejemplo, inhibiendo la FAS) y uso de una politerapia para inhibir tanto la oxidación de ácidos grasos como la síntesis de ácidos grasos (por ejemplo, mediante un modo no inhibidor de la FAS). Esta estrategia terapéutica identifica nuevos objetivos y estrategias potenciales para la quimioterapia anticancerosa basados en la alteración del metabolismo de los ácidos grasos.

La oxidación de los ácidos grasos puede inhibirse a través de una inhibición directa de la CPT-1 por parte de agentes inhibidores, tales como etomoxir. También pueden desarrollarse inhibidores específicos de isoformas de la CPT-1. Alternativamente, podrían manipularse los niveles de carnitina para reducir la actividad de la CPT-1 reduciendo su sustrato. También se pueden reducir los niveles de expresión de la CPT-1 bien mediante una manipulación genética o bien reduciendo los ácidos grasos exógenos. El Ejemplo 7, a continuación, es un ejemplo de un procedimiento de inhibición directa de la CPT-1 usando etomoxir en células de cáncer de mama humano.

Otras estrategias para inhibir la síntesis y la oxidación de ácidos grasos incluyen cualquier procedimiento para aumentar los niveles de malonil-CoA desde un aumento de la síntesis, una disminución de la degradación o preferiblemente ambos. Los niveles de malonil-CoA pueden manipularse usando una variedad de procedimientos y enzimas objetivo. Los Ejemplos 4-5 muestran un aumento en los niveles de malonil-CoA a través de una utilización reducida y un incremento simultáneo de la producción. Un aumento agudo en los niveles de malonil-CoA da lugar a la destrucción selectiva de células cancerosas a través de una apoptosis, dejando intactas las células normales. Otros ejemplos muestran vías adicionales para provocar una inhibición del crecimiento o la muerte de las células cancerosas.

Preferiblemente, la manipulación del metabolismo de los ácidos grasos según esta invención se consigue administrando una composición (o múltiples composiciones) a un organismo en necesidad de la misma. La composición administrada al organismo contendrá un agente con al menos un efecto biológico sobre las vías metabólicas de los ácidos grasos, por ejemplo, aumentando los niveles de malonil-CoA intracelular. Típicamente, el organismo será un mamífero, tal como un ratón, una rata, un conejo, un cobaya, un perro, un gato, un caballo, una vaca, una oveja, una cabra, un cerdo o un primate, tal como un chimpancé, un babuino o preferiblemente un ser humano. Habitualmente el organismo contendrá células neoplásicas (malignas). El procedimiento de esta invención está dirigido a afectar selectivamente a las células malignas y a tener menos efecto (o más preferiblemente ningún efecto) en las células normales (no malignas).

El agente de la composición administrada al organismo aumentará preferiblemente lo niveles de malonil CoA intracelular en al menos una porción de las células malignas del organismo. Preferiblemente, el nivel de malonil CoA aumentará al menos 2 veces, más preferiblemente al menos 5 veces. Preferiblemente, el agente aumentará la concentración intracelular de malonil-CoA en las células malignas hasta un nivel mayor que el nivel de las células normales circundantes.

Los agentes adecuados pueden aumentar el nivel de malonil CoA mediante cualquiera de los diversos procedimientos (véanse los mecanismos alternativos enumerados a continuación). Los agentes preferidos inducen típicamente un aumento brusco o abrupto en el nivel de malonil CoA. En algunas formas de realización se administran dos o más agentes, y algunos o todos estos agentes pueden afectar al nivel de malonil CoA mediante un mecanismo diferente. Alternativamente, puede usarse una combinación de agentes para disminuir la síntesis de ácidos grasos y disminuir simultáneamente la oxidación de ácidos grasos. Preferiblemente, los niveles de síntesis y oxidación de ácidos grasos disminuirán hasta unos niveles comparables a los conseguidos mediante un tratamiento citotóxico con cerulenina. En las composiciones y procedimientos de esta invención pueden usarse agentes que actúan mediante cualquiera de los modos de la siguiente lista. Los ensayos de las siguientes actividades están disponibles en la bibliografía, y la determinación de si un agente en particular muestra una de estas actividades está en la experiencia en la
materia.

Aumento en la producción de la malonil-CoA

Efectores de la carboxilasa de acetil-CoA (ACC): los agentes que aumentan la actividad de la ACC, que reducen la inhibición de la ACC o que aumentan la cantidad de enzima ACC activa, darán lugar a un aumento en los niveles de malonil-CoA.

Efectores de la cinasa de proteínas 5'-AMP: la cinasa de proteínas 5'-AMP inhibe la ACC mediante una fosforilación que da lugar a una reducción aguda de la malonil-CoA. Los inhibidores de esta cinasa darían lugar a un aumento agudo de los niveles de malonil-CoA, liberando la inhibición de la ACC.

Efectores de la sintasa de citrato: un aumento del citrato mitocondrial proporcionaría el sustrato para la síntesis de ácidos grasos, y el citrato también actúa como un activador "anterorregulador" de la ACC provocando un aumento en la síntesis de malonil-CoA.

Efectores de la sintasa de acil-CoA: la inhibición de la sintasa de acil-CoA reduciría la concentración celular de lipoacil-CoA, liberando la inhibición de la ACC. Esto daría como resultado un aumento en la actividad de la ACC y en los niveles de malonil-CoA.

Disminución de la utilización de la malonil-CoA

Efectores de la descarboxilasa de malonil-CoA (MCD): esta enzima cataliza una descarboxilación dependiente de ATP de la malonil-CoA de nuevo a acetil-CoA. La inhibición de la MCD aumentaría de forma aguda los niveles de malonil-CoA.

Disminución de la utilización y aumento simultáneo de la producción de malonil-CoA

Efectores de la sintasa de ácidos grasos (FAS): la inhibición de la FAS produce un descenso en la utilización de la malonil-CoA bloqueando su incorporación en los ácidos grasos. La inhibición de la FAS también da lugar a una reducción en los niveles de lipoacil-CoA, lo que activaría la ACC. Algunos ejemplos de inhibidores de la FAS pueden obtenerse según se describe en las patentes de EE.UU. n^{os} 5.759.837 y 5.981.575.

Estas estrategias para modificar el metabolismo de los ácidos grasos, y especialmente para aumentar de forma aguda los niveles de malonil-CoA, pueden usarse conjuntamente en concierto con otros fármacos para incrementar la apoptosis en células cancerosas. Preferiblemente, al menos un agente de las composiciones de esta invención aumenta el nivel de malonil-CoA mediante un mecanismo distinto al de la inhibición de la FAS.

Administración de los componentes

Los agentes terapéuticos según esta invención se formulan preferiblemente en composiciones farmacéuticas que contienen el agente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede contener otros componentes siempre que los otros componentes no reduzcan la eficacia del agente según esta invención hasta el punto de invalidar la terapia. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos, y el experto en materia farmacéutica puede elegir fácilmente vehículos adecuados para vías de administración en particular (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985).

Las composiciones farmacéuticas que contienen cualquiera de los agentes de esta invención pueden ser administradas por vía parenteral (subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intrapleuralmente, intravesicularmente o intratecalmente), tópica, oral, rectal o nasal, según sea necesario según la elección del fármaco. Las concentraciones del agente activo en los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden variar desde 0,01 mM hasta 1 M o mayores, siempre que la concentración no exceda un nivel aceptable de toxicidad en el punto de administración.

La dosis y la duración de la terapia dependerán de una variedad de factores, incluyendo el índice terapéutico de los fármacos, el tipo de enfermedad, la edad del paciente, el peso del paciente y la tolerancia a la toxicidad. La dosis se elegirá generalmente para conseguir concentraciones séricas de desde aproximadamente 0,1 \mug/ml hasta aproximadamente 100 \mug/ml. Preferiblemente, los niveles de dosis inicial se elegirán según su capacidad para conseguir concentraciones ambientales que han demostrado ser eficaces en modelos in vitro, tales como las descritas en este documento, y en modelos in vivo y en estudios clínicos, hasta los máximos niveles tolerados. El procedimiento clínico convencional prefiere que la quimioterapia se ajuste a cada paciente individual, y la concentración sistémica del agente quimioterapéutico sea monitorizada regularmente. La dosis de un fármaco en particular y la duración de la terapia para un paciente en particular pueden ser determinadas por el clínico experto usando metodologías farmacológicas convencionales en vista de los factores anteriores. La respuesta al tratamiento puede ser monitorizada mediante el análisis de los niveles en sangre o en fluidos corporales del agente según esta invención, la medida de la actividad del agente o sus niveles en los tejidos pertinentes con la monitorización del estado de la enfermedad en el paciente. El clínico experto ajustará la dosis y la duración de la terapia basándose en la respuesta al tratamiento revelada por estas medidas.

Ejemplos

Con objeto de facilitar una comprensión más completa de la invención, se proporcionan a continuación varios Ejemplos. Sin embargo, el alcance de la invención no se limita a las formas de realización específicas descritas en estos Ejemplos, que tienen un propósito únicamente ilustrativo.

Ejemplo 1 Inhibición de la FAS en células in vitro

El TOFA, la cerulenina y el C75 inhibieron, todos, la síntesis de ácidos grasos en células de cáncer de mama humano. Las líneas celulares de cáncer de mama humano, SKBR3 y MCF7, se mantuvieron en RPMI con un 10% de suero bovino fetal. Las células se cribaron periódicamente para comprobar la contaminación por Mycoplasma (Gen-probe). Todos los inhibidores se añadieron como disoluciones madre de 5 mg/ml en DMSO. Para las determinaciones de la actividad de síntesis de ácidos grasos se marcaron por impulsos 5 x 10^{4} células/pocillo en placas de 24 pocillos con [U-^{14}C]-acetato tras la exposición al fármaco, y los lípidos se extrajeron y cuantificaron según se describió previamente (Pizer, y col., 1988). Para las células MCF7, se determinó la actividad de la vía después de 2 horas de exposición al inhibidor. Las células SKBR3 mostraron una respuesta más lenta ante los inhibidores de la FAS, posiblemente debido a su extremadamente alto contenido en FAS, de forma que la actividad de la vía se determinó después de 6 horas de exposición al inhibidor.

En los experimentos convencionales de marcaje por impulsos en los que se marcaron las líneas celulares de cáncer de mama, SKBR3 y MCF7, durante 2 horas tras la exposición a los inhibidores de la síntesis de AG, TOFA, C75 y cerulenina, todos inhibieron la incorporación del [U^{14}C-acetato] en los lípidos en un grado similar (Figura 1B y D). En numerosos experimentos similares (no mostrados), el TOFA inhibió de forma máxima la síntesis de FA en el intervalo de dosis de 1 a 5 \mug/ml en todas las líneas celulares probadas, y la cerulenina y el C75 inhibieron de forma máxima la síntesis de FA en el intervalo de 10 \mug/ml.

Ejemplo 2 Efecto de los mismos inhibidores sobre el crecimiento celular

El TOFA, la cerulenina y el C75 inhibieron, todos, la síntesis de ácidos grasos en células de cáncer de mama humano, pero mostraron una citotoxicidad diferencial. Las células y los inhibidores fueron según se describen para el Ejemplo 1. Para los ensayos clonogénicos se colocaron en placa 4 x 10^{5} células en matraces de 25 cm^{3} con inhibidores añadidos durante 6 horas en las concentraciones enumeradas. Un número igual de células tratadas y de control se colocó en placas en discos de 60 mm. Los clones se tiñeron y se contaron después de 7 a 10 días.

Aunque todos los inhibidores redujeron la síntesis de FA hasta un grado similar, el TOFA no era tóxico ni estimulaba el crecimiento de las células cancerosas en el intervalo de dosis para la inhibición de la ACC, medido mediante ensayos clonogénicos, mientras que la cerulenina y el C75 eran significativamente citotóxicos en el intervalo de dosis para la inhibición de la FAS (Figura 1C y E). La profunda diferencia entre los efectos citotóxicos en la inhibición de la ACC y de la FAS demuestra que la reducción aguda de la proporción de ácidos grasos no es per se la principal fuente de lesión celular tras la inhibición de la FAS.

Ejemplo 3 Medida de la malonil-CoA

La diferencia más obvia en los resultados esperados de la inhibición de estas dos enzimas era que los niveles de malonil-CoA deberían caer después de la inhibición de la ACC, pero deberían aumentar después de la inhibición de la FAS. Aunque no se ha investigado previamente en eucariotas, datos recientes en E. coli han mostrado elevados niveles de malonil-CoA resultantes de la exposición a cerulenina (Chohnan, y col., 1997, "Changes in the size and composition of intracellular pools of non-esterified coenzyme A and coenzyme A thioesters in aerobic and facultatively anaerobic bacteria", Applied and Environmental Microbiology, 63: 555-560). Se midieron los niveles de malonil-CoA en células sometidas a una inhibición de la FAS y a una inhibición por el TOFA en las condiciones descritas en el Ejemplo 2.

Se midieron los niveles de malonil-CoA en células MCF-7 usando el método de HPLC de Corkey, y col. (1988, "Analysis of acyl-coenzyme A esters in biological samples, "Methods in Enzymology, 166:55-70). En resumen, se sometieron 2,5 x 10^{5} células/pocillo en placas de 24 pocillos a 1,2 ml de TCA al 10% a 4°C después de diversos tratamientos farmacológicos. La masa de sedimento se registró y el sobrenadante se lavó 6 veces con 1,2 ml de éter y se redujo a sequedad usando una centrifugación a vacío a 25°C. Los ésteres de coenzima-A se separaron y cuantificaron usando una HPLC en fase inversa en una columna de 5 \mu Supelco C18 con un sistema de HPLC Waters que utilizaba el programa informático Millenium32, monitorizando a 254 nm como la absorbancia máxima para la coenzima-A. Se utilizaron los siguientes gradientes y tampones: Tampón A: fosfato potásico 0,1 M, pH 5,0, Tampón B: fosfato potásico 0,1 M, pH 5,0, con acetonitrilo al 40%. Después de 20 min de recorrido isocrático con un 92% de A, un 8% de B a 0,4 ml/min, el flujo se aumentó hasta 0,8 ml/min durante un minuto, momento en el cual se utilizó un gradiente lineal de un 10% de B hasta los 24 min, y después se mantuvo con un 10% de B hasta los 50 min., momento en el que se utilizó un gradiente lineal hasta un 100% de B a los 55 min., completando a los 60 min. Como patrones se utilizaron los siguientes ésteres de coenzima-A (Sigma): malonil-CoA, acetil-CoA, glutatión-CoA, succinil-CoA, HMGCoA y CoA libre. Las muestras y los patrones se disolvieron en 50 \mul de tampón A. Los ésteres de coenzima-A eluyeron secuencialmente como sigue: malonil-CoA, glutatión-CoA, CoA libre, succinil-CoA, HMG-CoA y acetil-CoA. La cuantificación de los ésteres de coenzima-A se realizó mediante el programa informático Millenium32.

La medida directa de los derivados de la coenzima-A en células MCF-7 mediante una HPLC en fase inversa de los extractos solubles en ácido a partir de células tratadas con fármacos confirmó que tanto la cerulenina como el C75 provocaban un rápido aumento en los niveles de malonil-CoA, mientras que el TOFA reducía los niveles de malonil-CoA. La Figura 2A es un cromatograma representativo que muestra la separación y la identificación de los derivados de la coenzima-A importantes en el metabolismo celular. La malonil-CoA es la primera de éstos en eluir, con un tiempo de retención en la columna de 19-22 minutos. La superposición de los cromatogramas de la Figura 2B muestra que el tratamiento con cerulenina dio lugar a un notable aumento de la malonil-CoA respecto al control, mientras que el TOFA provocó una reducción significativa. La identidad química de la malonil-CoA fue confirmada de forma independiente añadiendo a las muestras los patrones (no mostrado).

Los niveles de malonil-CoA aumentaron notablemente con la inhibición de la FAS y se redujeron con el TOFA. El análisis de los múltiples experimentos de la Figura 2C muestra que después de 1 hora de exposición a la cerulenina o al C75 a 10 \mug/ml, los niveles de malonil-CoA aumentaron en un 930% y en un 370% respectivamente respecto a los controles, mientras que el tratamiento con TOFA (20 \mug/ml) dio lugar a una reducción del 60% en los niveles de malonil-CoA. La concentración de TOFA requerida para la reducción máxima de los niveles de malonil-CoA era 4 veces mayor que las dosis para inhibir la vía de las figuras 1B y D. Sin embargo, los cultivos óptimos para la extracción de los derivados de la CoA tenían una densidad celular 5 veces mayor que los cultivos usados en los otros ensayos bioquímicos y de viabilidad presentados.

El notable aumento de la malonil-CoA tras la inhibición de la FAS puede atribuirse en parte a la liberación de la inhibición de la lipoacil-CoA de cadena larga de la ACC, que da lugar a un aumento en la actividad de la ACC (Figura 1A). Además, el aumento inducido por la cerulenina en los niveles de malonil-CoA se produjo a los 30 minutos de tratamiento (aumento del 930 \pm 15% respecto al control, no mostrado), en el marco temporal de la inhibición de la síntesis de AG, y bastante antes del inicio de la inhibición de la síntesis de DNA (ADN) o de eventos apoptóticos tempranos. Por lo tanto, los altos niveles de malonil-CoA eran un efecto característico de los inhibidores de la FAS y precedían en el tiempo a las otras respuestas celulares, incluyendo la apoptosis.

Los niveles de cerulenina o de C75 que inducen altos niveles de malonil-CoA son citotóxicos para las células de cáncer de mama humano, según se mide mediante ensayos clonogénicos y análisis citométricos de flujo de la apoptosis usando una tinción con merocianina 450. La inhibición de la FAS provoca altos niveles de malonil-CoA al inhibir su consumo mediante la inhibición de la FAS, con una estimulación concomitante de la síntesis, aliviando el efecto inhibidor de la lipoacil-CoA de cadena larga sobre la actividad de la ACC (Figura 2).

Ejemplo 4 Liberación por parte del TOFA de la inhibición de la FAS

La liberación por parte del TOFA de la inhibición de la FAS demuestra que los altos niveles de malonil-CoA son responsables de la citotoxicidad en células cancerosas. Si los elevados niveles de malonil-CoA resultantes de la inhibición de la FAS fueran responsables de la citotoxicidad, entonces sería posible liberar a las células de la inhibición de la FAS reduciendo la acumulación de malonil-CoA con TOFA. La coadministración de TOFA y cerulenina a células SKBR3 (Figura 3A) anuló el efecto citotóxico de la cerulenina sola en ensayos clonogénicos realizados según se describe en el Ejemplo 2. En las células MCF7 (Figura 3C), el TOFA produjo una modesta liberación tanto de cerulenina como de C75 en unas condiciones experimentales similares.

Los análisis citométricos de flujo representativos de las células SKBR3 (Figura 3B) y MCF7 (Figura 3D) verificaron estos hallazgos, dado que el TOFA liberó a las células de una apoptosis inducida por cerulenina. La apoptosis se midió mediante una citometría de flujo multiparamétrica usando un citómetro de flujo FACStar^{Plus} equipado con láseres de argón y criptón (Becton Dickinson). La apoptosis se cuantificó usando una tinción con merocianina 540 (Sigma), que detecta el empaquetamiento alterado de los fosfolípidos de la membrana plasmática que se produce tempranamente en la apoptosis, añadida directamente a las células del cultivo (Pizer, y col., 1998; Mower, y col., 1994, "Decreased membrane pospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis", J. Immunol., 152: 4832-4842). En algunos experimentos se midieron simultáneamente los cambios conformacionales en la cromatina de la apoptosis según disminuía la tinción con LDS-751 (Exciton) (Frey, y col., 1995, "Nucleic acid dyes for detection of apoptosis in live cells", Cytometry, 21: 265-274). Se añadió merocianina 540 [10 \mug/ml] como una disolución madre de 1 mg/ml en agua. Las células se tiñeron con LDS-751 a una concentración final de 100 nM a partir de una disolución madre 1 mM en DMSO. Las células positivas a la merocianina 540 se reconocieron por un aumento en la fluorescencia roja, se recogieron a 575 \pm 20 nm, de 0,5 a 2 logs sobre las células negativas a la merocianina 540. De forma similar, las células LDS-751 dim mostraron una reducción en la fluorescencia de 0,5 a 1,5 respecto a las células normales, recogidas a 660 nm con un filtro de paso de banda DF20. Los datos se recogieron y se analizaron usando el programa informático CellQuest (Becton Dickinson).

En estos experimentos, todas las células LDS-751 dim brillaban con la merocianina 540, sin embargo, se detectó una población de células brillantes con la merocianina 540 que todavía no eran LDS-751 dim. Todas las células brillantes con merocianina 540 se clasificaron como apoptóticas. Estos experimentos también confirmaron la citotoxicidad diferencial entre el TOFA (<5% de aumento en la apoptosis; ninguna reducción en la clonogenicidad) en comparación con la cerulenina (>85% de apoptosis; 70% de reducción en la clonogenicidad). Conjuntamente, estos estudios demuestran que unos elevados niveles de malonil-CoA juegan un papel en el efecto citotóxico de los inhibidores de la FAS sobre las células cancerosas.

Ejemplo 5 Efecto de los inhibidores de la FAS sobre el crecimiento de células tumorales in vivo

Para determinar si los efectos de la inhibición de la FAS observados in vitro se traducirían a un escenario in vivo que requiriera una actividad sistémica, se probó el C75 frente a xenotransplantes subcutáneos de MCF-7 en ratones atímicos, para cuantificar los efectos sobre la síntesis de FA y el crecimiento del tumor sólido establecido. Estudios previos han demostrado la eficacia local de la cerulenina frente a un xenotransplante canceroso humano (Pizer, y col., 1996, "Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a xenograft model of ovarian cancer", Cancer Res., 56: 1189-1193), pero estaban limitados por el fracaso de la cerulenina para actuar sistémicamente. Las respuestas similares de células cancerosas de mama frente a la cerulenina y el C75 in vitro sugirieron que el C75 podría ser eficaz in vivo frente a células de cáncer de mama xenotransplantadas.

Se usaron xenotransplantes lumbares subcutáneos de la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 en ratones hembras nu/nu (Harlan) para estudiar los efectos antitumorales del C75 in vivo. Todos los experimentos con animales cumplían las normativas institucionales de cuidado animal. Todos los ratones recibieron un pellet de estrógenos subcutáneo de liberación lenta de 90 días (Innovative Research) en la zona lumbar anterior 7 días antes de la inoculación del tumor. Se xenotransplantaron 10^{7} células MCF-7 a partir de un cultivo en DMEM complementado con FBS al 10% y 10 \mug/ml de insulina.

El tratamiento comenzó cuando se desarrollaron tumores medibles, aproximadamente 10 días después de la inoculación. Se trataron once ratones (divididos en dos experimentos por separado de 5 y 6 ratones cada uno) intraperitonealmente con dosis semanales de C75 a 30 mg/kg en 0,1 ml de RPMI. La dosificación se basó en la determinación de la DL_{10} a una sola dosis de 40 mg/kg en ratones BALB/c; 30 mg/kg ha sido bien tolerada en ratones atímicos exogámicos. Once ratones de control (divididos de la misma forma que los grupos de tratamiento) recibieron sólo RPMI. El volumen del tumor se midió con calibres en sus tres dimensiones. El experimento terminó cuando los controles alcanzaron el criterio indirecto de valoración.

En un experimento paralelo para determinar la actividad de síntesis de ácidos grasos en tumores tratados y de control, se trató un grupo de ratones, xenotransplantados con MCF 7, con C75 o con vehículo en las dos anteriores y se sacrificaron después de 3 horas. El tejido tumoral y hepático se marcó ex vivo con [U^{14}-C] acetato, se extrajeron los lípidos y se contaron según se describe (Pizer, y col., 1996).

En un experimento paralelo adicional para examinar histológicamente los tumores tratados y de control, se sacrificaron 6 ratones tratados con C75 y 6 ratones con vehículo de control, 6 horas después del tratamiento. Los tejidos tumorales y los normales se fijaron en formalina tamponada neutra, se trataron para una histología rutinaria y se realizó una inmunohistoquímica de la FAS. La inmunohistoquímica de la FAS se realizó sobre los xenotransplantes con MCF-7 usando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-FAS (Alo, y col., 1996) a 1:2.000 en el Dako Immunostainer usando el kit de detección LSAB2.

La actividad de la vía de síntesis de ácidos grasos en los tejidos de los ratones xenotransplantados se determinó mediante un marcaje por impulsos ex vivo con [U^{14}C]-acetato. Los xenotransplantes tumorales tenían una actividad de síntesis de FA 10 veces mayor que el hígado, destacando la diferencia en la actividad de la vía entre los tejidos benignos y malignos (Figura 4A). La expresión de la FAS en el xenotransplante MCF-7 era comparable al alto nivel de actividad de síntesis de FA (Figura 4B). Inyecciones intraperitoneales de C75 a 30 mg/kg redujeron la síntesis de ácidos grasos en hígado marcado ex vivo en un 76% y en los xenotransplantes de MCF-7 en un 70% en 3 horas (Figura 4A). Estos cambios en la síntesis de FA preceden a una evidencia histológica de citotoxicidad en el xenotransplante, que se hizo evidente 6 horas después del tratamiento (Figuras 4C y 4D). Los xenotransplantes tratados con C75 mostraron numerosos cuerpos apoptóticos por todo el tejido tumoral, que no se observaron en los tumores tratados con vehículo. Los análisis histológicos del hígado y de otros tejidos del hospedador tras el tratamiento con C75 no mostraron ninguna evidencia de toxicidad a corto o a largo plazo (no mostrado).

El tratamiento con C75 de los xenotransplantes dio lugar a citotoxicidad y a una reducción en el crecimiento del tumor, sin lesión en los tejidos normales. La histología del tumor 6 horas después de una dosis de 30 mg/kg de C75 muestra una citotoxicidad significativa en comparación con el tumor de control (Figuras 4C y 4D, preimpresión anexa). Nótese la evidencia de los cuerpos apoptóticos en el xenotransplante tratado con C75, mientras que el examen del hígado y otros órganos no mostró ninguna evidencia de lesión tisular (datos no mostrados). Un tratamiento semanal intraperitoneal con C75 retardó el crecimiento de tumores subcutáneos establecidos de MCF-7 en comparación con los controles del vehículo, demostrando un efecto antitumoral sistémico (Figura 4E). Después de 32 días de tratamientos semanales, había una diferencia mayor de ocho veces en el crecimiento del tumor en el grupo en tratamiento en comparación con los controles de vehículo. De forma similar a la cerulenina, la única de toxicidad apreciada fue una pérdida de peso reversible y temporal (Pizer, y col., 1996).

La actividad farmacológica sistémica de C75 proporcionó el primer análisis de los resultados del tratamiento sistémico con el inhibidor de la FAS. El significativo efecto antitumoral del C75 sobre un xenotransplante de cáncer de mama humano en el escenario de niveles fisiológicos de ácidos grasos ambientales era similar al resultado in vitro en cultivo complementado con suero, y era coherente con un mecanismo citotóxico independiente del agotamiento de ácidos grasos.

Ejemplo 6 Células cancerosas humanas con altos niveles en equilibrio de malonil-CoA in vivo

El resultado del Ejemplo 5 sugirió que la acumulación de malonil-CoA puede no ser un problema significativo en tejidos normales, posiblemente porque la actividad de la vía de síntesis de FA es normalmente baja, incluso en órganos lipogénicos tales como el hígado. Es de dicional interés el que, mientras que la malonil-CoA era el conjugado de CoA de bajo peso molecular predominante detectado en las células de cáncer de mama en estos experimentos, otros estudios han indicado predominantemente la succinil-CoA y acetil-CoA en hepatocitos cultivados (Corkey, 1988). El alto nivel de malonil-CoA en los tejidos tumorales refleja el alto nivel de síntesis de ácidos grasos en las células tumorales en comparación con el hígado (Pizer, y col., 1996).

Usando el modelo de xenotransplante de cáncer de mama humano MCF7 del Ejemplo 5, se midieron los niveles de malonil-CoA en el xenotransplante del tumor y en el hígado del mismo animal usando una cromatografía líquida de alta resolución. La Figura 3, a continuación, muestra altos niveles de malonil-CoA en el tejido tumoral en comparación con el hígado. Además, la distribución de otros derivados de la CoA está notablemente alterada. Por ejemplo, mientras que el hígado tiene aproximadamente 10 veces menos malonil-CoA en comparación con el xenotransplante, tiene un nivel aproximadamente 10 veces mayor de acetil-CoA, y mayores niveles de otros derivados de la CoA, particularmente de succinil-CoA. Las diferencias en los perfiles de los derivados de la CoA pueden ser indicativas de diferencias mayores en el metabolismo energético entre las células cancerosas y los hepatocitos.

Ejemplo 7 Inhibición del crecimiento celular por parte de los inhibidores de la CPT-1

La palmitoiltransferasa-1 de carnitina es inhibida por el etomoxir (Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramatsu, M., Yamamoto, M. y Honjo, T. Inhibition of carnitine palmitoyltransferase I augments sphingolipid synthesis and palmitate-induced apoptosis., J. Biol. Chem. 272: 3324-3329, 1997; Ratheiser, K., Schneeweib, B., Waldhausl, W., Fasching, P., Korn, A., Nowotny, P., Rohac, M. y Wolf, H. P. O. Inhibition of etomoxir of carnitine palmitoyltransferse I reduces hepatic glucose production and plasma lipids in non-Insulin-dependent diabetes mellitus., Metabolism. 40: 1185-1190, 1991).

1

La Figura 7A ilustra que el etomoxir solo causó un significativo efecto inhibidor del crecimiento mayor que el C75nm. El C75 inhibe indirectamente la CPT-1 aumentando la malonil-CoA. La Figura 7B muestra que la inhibición por el etomoxir del crecimiento de las células MCF-7 es aditiva con C75. En el panel 7A, el etomoxir produce una inhibición del crecimiento de las células MCF-7 dependiente de la dosis durante 72 h mayor que la del C75 a 5 \mug/ml. En el panel 7B, el etomoxir y el C75 tienen un efecto inhibidor del crecimiento mayor que cualquiera de ellos por separado. Se colocaron en placas 5 x 10^{4} células MCF-7 en placas de 24 pocillos tratadas con inhibidores a las concentraciones de la figura, 18 h después de colocarlas en las placas. Las células se fijaron con etanol, se tiñeron con violeta de cristal, se solubilizaron con SDS y se leyeron a 490. Importantemente, la concentración de etomoxir es similar a la usada en los hepatocitos aislados para inhibir la CPT-1; se identificaron efectos no específicos a unas dosis > 400 \muM in vitro (Paumen, y col., 1997). Cuando se combinaron, el etomoxir y el C75 produjeron un efecto inhibidor del crecimiento aditivo. Dado que la malonil-CoA y el etomoxir son ambos inhibidores de la CPT-1, y tienen diferentes sitios de unión en la CPT-1, el efecto potenciador del etomoxir y del C75 no es sorprendente. El etomoxir se ha usado para tratar la diabetes en seres humanos sin una toxicidad o una pérdida de peso significativa (Ratheiser, y col., 1991). Con estos antecedentes, la CPT-1 puede proporcionar un medio para trasladar este trabajo más rápidamente a la clínica.

Ejemplo 8 La cerulenina inhibe la oxidación de ácidos grasos

Dado que se ha demostrado que el aumento en los niveles de malonil-CoA resultante de la inhibición de la FAS es citotóxico en las células de cáncer de mama humano, se buscó determinar si la inhibición de la CPT-1 por la malonil-CoA también juega un papel en el mecanismo de la muerte de las células cancerosas.

Se trataron células MCF-7 de cáncer de mama humano con cerulenina, un conocido inhibidor de la FAS, para determinar si la cerulenina provoca un descenso en la oxidación de los ácidos grasos a unas dosis de las que se sabe que inducen apoptosis en células MCF-7, pero antes del inicio de la apoptosis actual. La oxidación de los ácidos grasos se midió captando y contando el ^{14}CO_{2} liberado a partir de la oxidación del [^{14}C] palmitato de base.

Se colocaron en placas 1 x 10^{6} células MCF-7 en matraces T-25 por triplicado y se incubaron hasta el día siguiente a 37°C. Entonces se añadió el compuesto de prueba (cerulenina) según se indicó, diluido a partir de una disolución madre de 5 mg/ml en DMSO. Después de 2 horas, el medio con fármacos se eliminó y las células se preincubaron durante 30 minutos con 1,5 ml del siguiente tampón: NaCl 114 mM, KCl 4,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, glucosa 11 mM. Tras la preincubación, se añadieron 200 \mul de tampón de ensayo que contenía: NaCl 114 mM, KCl 4,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, glucosa 11 mM, palmitato 2,5 mM (que contenía 100 \muCi de [1-^{14}C] palmitato) unido a albúmina, L-carnitina 0,4 mM, y las células se incubaron a 37°C durante 2 horas. Tras la incubación se añadieron 400 \mul de clorhidrato de benzotonio al centro de cada pocillo para recoger el ^{14}CO_{2} liberado. Inmediatamente la reacción se detuvo añadiendo 500 \mul de ácido perclórico al 7% a las células. Los matraces con los pocillos se incubaron entonces durante 2 horas a 37°C, tras lo cual se eliminó el clorhidrato de benzotonio y se contó el ^{14}C. Se prepararon blancos añadiendo 500 \mul de ácido perclórico al 7% a las células antes de la incubación con el tampón de ensayo durante 2 horas.

La Figura 8 muestra la oxidación de ácidos grasos en células MCF-7 tratadas con cerulenina a las dosis indicadas durante 2 horas, bastante antes del inicio de la apoptosis en este sistema.

La cerulenina provoca una inhibición que responde a la dosis de la oxidación de los ácidos grasos en células MCF-7. A una dosis de 10 \mug/ml, que se sabe que provoca un aumento de casi nueve veces en la malonil-CoA y una reducción >50% en la síntesis de ácidos grasos en 2 horas, la cerulenina provoca una reducción de aproximadamente el 50% en la oxidación de los ácidos grasos en comparación con el control (p = 0,0007; prueba de la t de 2 vías).

Ejemplo 9 Inhibición de la palmitoiltransferasa-1 de carnitina

Se sabe que la cerulenina induce un aumento en los niveles de malonil CoA en las células cuando se inhibe la sintasa de ácidos grasos (FAS), y se sabe que la malonil CoA inhibe la oxidación de ácidos grasos a través de su efecto sobre la palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT1). La CPT-1 media en la transferencia de ácidos grasos de cadena larga hacia la mitocondria para la \beta-oxidación. Realiza una transesterificación de lipoacil CoA de cadena larga a L-carnitina, produciendo acilcarnitina. Mediante esta reacción, la L-carnitina soluble en agua se vuelve orgánicamente soluble tras la esterificación del ácido graso. Para verificar si la reducción en la oxidación de los ácidos grasos inducida por la cerulenina es debida a un aumento en la malonil-CoA o es a través de una inhibición directa de la cerulenina sobre la
CPT-1, se comparó la cerulenina con otros compuestos inhibidores en un ensayo con la CPT-1 en células MCF-7.

Ensayo con la palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT-1): se colocaron en placas células MCF-7 en RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% a 1 x 10^{6} células en placas de seis pocillos por triplicado. Después de una incubación hasta el día siguiente a 37°C, se eliminó el medio, se sustituyó por 700 \mul de medio de ensayo consistente en: imidazol 50 mM, KCl 70 mM, sacarosa 80mM, EGTA 1 mM, MgCl_{2} 2 mM, DTT 1 mM, KCN 1 mM, ATP 1 mM, albúmina de suero bovino exenta de ácidos grasos al 0,1%, palmitoil-CoA 70 \muM, 0,25 \muCi de [metil-^{14}C] L-carnitina, 40 \mug de digitonina con o sin malonil-CoA 20 \muM u otros inhibidores indicados.

Tras la incubación durante 3 ó 6 minutos a 37°C, la reacción se detuvo mediante la adición de 500 \mul de ácido perclórico 4 M enfriado en hielo. Entonces las células se recogieron y se centrifugaron a 10.000 x g durante 5 min. El sedimento se lavó con 500 \mul de ácido perclórico enfriado en hielo y se centrifugó de nuevo. El sedimento resultante se resuspendió en 800 \mul de dH_{2}O y se extrajo con 150 \mul de butanol. La fase de butanol se contó con líquido de centelleo y representa el derivado de acilcarnitina.

La Figura 9 muestra el efecto de otros compuestos sobre la CPT-1: etomoxir (un conocido inhibidor de la CPT-1), TOFA (del que se sabe que inhibe la síntesis de ácidos grasos inhibiendo la acetil CoA carboxilasa, una enzima de la vía de síntesis de ácidos grasos) y cerulenina.

La Figura 9 muestra que la cerulenina no inhibe directamente la CPT-1 en células MCF-7. De hecho, 10 \mug/ml de cerulenina provocan un aumento leve, pero no estadísticamente significativo, en la actividad de la CPT-1 por encima del vehículo de control. Por lo tanto, la disminución en la oxidación de los ácidos grasos inducida por la cerulenina se debe probablemente al aumento concomitante en la malonil-CoA, más que a un efecto directo de la cerulenina sobre la CPT-1.

Ejemplo 10 Efecto de la inhibición de la CPT-1 sobre el crecimiento celular

Dado que la cerulenina provoca un aumento en la malonil-CoA y una disminución en la oxidación de los ácidos grasos, se diseñaron pruebas para comprobar si la inhibición de la CPT-1 estaba implicada en el desencadenamiento de la apoptosis. Con ése propósito se trataron células MCF-7 con etomoxir, un conocido inhibidor directo de la CPT-1, y se midió la oxidación de los ácidos grasos en las células según se describe en el Ejemplo 8. La Figura 10 muestra que el etomoxir provoca una inhibición de la oxidación de los ácidos grasos en células MCF-7.

A una dosis de 50 \mug/ml, la oxidación de los ácidos grasos disminuye >50% respecto al control (p = 0,012; prueba de la t de 2 vías). (La Figura 9 demuestra que el etomoxir inhibe directamente la CPT-1, causando una dosis de 10 \mug/ml una reducción del 75% en la actividad de la CPT-1, p = 0,023; prueba de la t de 2 vías.)

Ensayo de inhibición del crecimiento celular: aunque el etomoxir es un potente inhibidor de la CPT-1, cuando se tratan células MCF-7 con dosis de etomoxir que se saben que inhiben la CPT-1 y la oxidación de los ácidos grasos, no hay una inhibición del crecimiento ni una citotoxicidad significativa. Se colocaron en placas de 24 pocillos células MCF-7 a 5 x 10^{4} células por pocillo en RPMI 1640 con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone). Tras una incubación hasta el día siguiente a 37°C, se añadió etomoxir a partir de disoluciones madre de 5 mg/ml en DMSO. La concentración final del DMSO en los cultivos era igual o inferior al 0,2%. Después de 48 o de 72 h se eliminó el medio, y los pocillos se lavaron tres veces con disolución salina tamponada de Hank. Los pocillos se tiñeron con violeta de cristal y después se secaron y se solubilizaron en SDS al 10%. Se transfirieron alícuotas de 100 \mul a una placa de 96 pocillos y se leyeron en un lector de placas Molecular Dynamics a 490 nm. Los datos se presentan como unidades de absorbancia, mostrando las barras de error el error típico de la media. El análisis gráfico y estadístico se realizó con Prism 2.0 (Graph Pad).

La Figura 11 muestra el efecto del etomoxir sobre la inhibición del crecimiento de células MCF-7.

Sólo la dosis de 200 \mug/ml provocó una reducción significativa en el crecimiento (p = 0,006, prueba de la t de 2 vías). Por lo tanto, la sola inhibición de la CPT-1 es significativamente inhibidora del crecimiento de células de cáncer de mama humano.

Sin embargo, durante el tratamiento con cerulenina se inhibe la CPT-1, y la oxidación de los ácidos grasos se reduce durante la inhibición de la síntesis de ácidos grasos; esta es una respuesta no fisiológica. Fisiológicamente, cuando se reduce la síntesis de ácidos grasos, los niveles de malonil-CoA caen, aliviando la inhibición de la CPT-1 y provocando un aumento en la oxidación de los ácidos grasos. Por lo tanto, es posible que la inhibición de la CPT-1 induzca también citotoxicidad en el escenario de la inhibición de la síntesis de ácidos grasos.

Ejemplo 11 Efecto citotóxico de la inhibición de la CPT-1 y de la síntesis de ácidos grasos en combinación

El TOFA es un inhibidor de la carboxilasa de acetil-CoA (ACC), la enzima limitante de la tasa de la síntesis de ácidos grasos. La inhibición por parte del TOFA de la ACC provoca una reducción en la malonil-CoA y la subsiguiente inhibición de la síntesis de ácidos grasos. Mientras que tanto el TOFA como la cerulenina provocan una inhibición de la síntesis de ácidos grasos, la cerulenina inhibe la FAS, lo que da lugar a un aumento en la malonil-CoA, mientras que el TOFA inhibe la ACC, lo que provoca una disminución en la malonil-CoA.

En este Ejemplo se trataron las células con TOFA para inhibir la síntesis de los ácidos grasos, y con etomoxir para inhibir la oxidación de los ácidos grasos. Se midió el efecto de esta inhibición combinada sobre la citotoxicidad en un ensayo clonogénico.

Ensayo clonogénico: tras una incubación hasta el día siguiente a 37°C, se expusieron 1 x 10^{6} células MCF-7 a los fármacos según se indica durante 6 h, se lavaron, se desprendieron mediante digestión con tripsina, se contaron y se colocaron en placas a 1.000 ó 500 células/placa de 60 mm por triplicado. Las colonias se tiñeron con violeta de cristal y se contaron 4-6 días después de colocarlas en las placas. Los controles consistieron en células incubadas con DMSO sin fármacos. Las barras de error representan el error típico de la media.

La Figura 12 muestra un ensayo clonogénico con células MCF-7 tratadas con etomoxir y TOFA.

El tratamiento de las células con TOFA a 5 \mug/ml no es significativamente citotóxico; esto es similar a nuestros estudios previamente publicados (ref). La Figura 9 también muestra que el TOFA no provoca una inhibición de la CPT-1 ni cambios significativos en la oxidación de ácidos grasos (datos no mostrados). El tratamiento con etomoxir tampoco es significativamente citotóxico, complementando los estudios de inhibición del crecimiento de la Figura 11. Sin embargo, la combinación de TOFA y etomoxir es significativamente más citotóxica que el TOFA solo (p = 0,004, prueba de la t de 2 vías) o el etomoxir solo (p = 0,002, prueba de la t de 2 vías).

Estos datos indican que la inhibición de la CPT-1 es tóxica para las células cancerosas durante la inhibición de la síntesis de los ácidos grasos. Por lo tanto, podrían usarse inhibidores de la CPT-1 junto con inhibidores de la síntesis de ácidos grasos para aumentar la respuesta antitumoral.

Ejemplo 12 Efectos aditivos sobre la citotoxicidad de un inhibidor de la sintasa de ácidos grasos y un inhibidor de la CPT-1

En los ensayos de inhibición del crecimiento usando el procedimiento descrito en el Ejemplo C se trataron células MCF-7 con C75, un inhibidor de la FAS, solo con etomoxir, y se analizaron 48 horas después del tratamiento. Tanto el etomoxir como el C75 provocaron una inhibición del crecimiento significativa respecto al control (p = 0,0001, p = 0,005, prueba de la t de 2 vías). La Figura 13, a continuación, muestra que el etomoxir también puede incrementar el efecto citotóxico de la inhibición de la FAS.

\newpage

La combinación de etomoxir y C75 provocó una inhibición del crecimiento más significativa que el etomoxir solo (p = 0,004, prueba de la t de 2 vías) y una fuerte tendencia a un aumento en la inhibición del crecimiento que el C75 solo (p = 0,054 prueba de la t de 2 vías). Estos datos sugieren que la inhibición de la CPT-1 también puede incrementar el efecto antitumoral de los inhibidores de la FAS.

Con el propósito de claridad y de comprensión, la anterior invención se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo, junto con formas de realización específicas, aunque los expertos en la materia apreciarán otros aspectos, ventajas y modificaciones aplicables a la invención. La anterior descripción y ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, el alcance de la invención. Las modificaciones de las formas de llevar a cabo la invención descritas anteriormente que sean apreciables por las personas expertas en medicina, bioquímica, farmacología y/o campos relacionados, pretenden estar en el alcance de la invención, que está limitada únicamente por las reivindicaciones anexas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la materia a quien se refiere esta invención.

Claims (27)

1. El uso de un inhibidor de la MCD (malonil-CoA descarboxilasa), que provoca un aumento en la malonil CoA intracelular en las células tumorales de un organismo, en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de las células tumorales en el organismo.

2. El uso de una composición que provoca un aumento en la malonil CoA intracelular en las células tumorales de un organismo, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular está correlacionado con un aumento en la síntesis de malonil CoA, en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de las células tumorales en el organismo.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular está correlacionado con un aumento en la actividad intracelular de la acetil-CoA carboxilasa (ACC).

4. El uso de la reivindicación 2 ó 3, en el que dicha composición comprende un agente seleccionado del grupo constituido por un activador de la ACC, un inhibidor de la cinasa de proteína activada por 5'-AMP (AMPK), y/o un inhibidor de la sintasa de acil CoA.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular en las células de dicho organismo se produce bruscamente.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular aumenta antes de cualquier aumento significativo en la tasa de consumo de malonil CoA.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular en las células de dicho organismo se produce en las 3 horas posteriores a dicha administración.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular se produce antes de la inhibición del crecimiento de las células.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular está correlacionado con un consumo reducido de malonil CoA.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho aumento en la malonil CoA intracelular está correlacionado con una actividad intracelular reducida de la sintasa de ácidos grasos.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se administra un segundo agente quimioterapéutico al organismo, siendo dicho segundo agente quimioterapéutico no inhibidor de la síntesis de ácidos grasos.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de células tumorales en las que el nivel intracelular de malonil CoA en las células tumorales antes de la administración de dicha composición está al menos 2 veces por encima del nivel normal de malonil CoA en células no
malignas.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que tras la administración de dicho medicamento, el nivel intracelular de malonil CoA es elevado, y el nivel intracelular de acetil CoA y CoA libres se reducen respecto a los niveles previos al tratamiento.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de células tumorales en las que la tasa de síntesis de ácidos grasos en algunas células de dicho organismo está al menos 2 veces por encima de lo normal antes de la administración de dicha composición, y la administración de dicha composición es citotóxica para dichas células.

15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de células tumorales, y en el que dicho organismo comprende células tumorales con elevadas tasas de síntesis de ácidos grasos, y el número de células de dichas células tumorales se reduce subsiguientemente a la administración de dicho medicamento.

16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha composición comprende adicionalmente un inhibidor de la palmitoiltransferasa-1 de carnitina (CPT-1).

17. El uso de la reivindicación 16, en el que dicho inhibidor de la CPT-1 es etomoxir.

18. El uso de

a)

un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos en las células tumorales de un organismo; y

b)

un inhibidor de la oxidación de ácidos grasos en dichas células

en la preparación del medicamento para la inhibición del crecimiento de células tumorales en el organismo.

19. El uso de la reivindicación 18, en el que dicho inhibidor de la oxidación de ácidos grasos se administra en una cantidad que no inhibe significativamente la CPT-2.

20. El uso de la reivindicación 18, en el que dicho inhibidor de la síntesis de ácidos grasos y dicho inhibidor de la oxidación de ácidos grasos se administran en unas cantidades que consiguen unos niveles similares de sus respectivas inhibiciones según se observa para las dosis citotóxicas de cerulenina.

21. Un procedimiento de cribado para ayudar a detectar composiciones que son selectivamente citotóxicas para células tumorales, que comprende administrar una composición objetivo a una célula que tiene un elevado nivel intracelular de malonil CoA, monitorizar la malonil CoA intracelular en dichas células subsiguientemente a dicha administración, y comparar el patrón de los cambios en el nivel de malonil CoA intracelular, en el que un aumento brusco de la malonil CoA intracelular es indicativo de una toxicidad selectiva.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, el que dichos cambios en el nivel intracelular de malonil CoA se miden en presencia y ausencia del ácido 5-(tetradeciloxi)-2-furoico (TOFA).

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicha célula proviene de una línea celular derivada de un tumor, y se monitoriza la actividad de la CPT-1 en dicha célula subsiguientemente a dicha administración, en el que una disminución en la actividad de la CPT-1 es indicativa de un potencial inhibidor de crecimiento.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicha célula está permeabilizada.

25. El procedimiento de la reivindicación 23, que comprende además monitorizar la apoptosis de dicha célula.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la monitorización de la apoptosis comprende un procedimiento seleccionado del grupo constituido por la medición del potencial transmembranal mitocondrial, la tinción con colorantes vitales, la monitorización de la activación de la caspasa en células completas usando una transferencia del tipo Western, y la medición del citocromo C elaborado a partir de las mitocondrias usando una transferencia del tipo Western.

27. Un producto para su administración a un organismo con células tumorales, conteniendo el producto:

a)

un inhibidor de la síntesis de ácidos grasos; y

b)

un inhibidor de la oxidación de ácidos grasos

para su uso para inhibir el crecimiento de las células tumorales en el organismo.