DE60028996T2

DE60028996T2 - Behandlung von krebs durch erhöhung des malonyl-coa-spiegels

Info

Publication number: DE60028996T2
Application number: DE60028996T
Authority: DE
Inventors: S. Ellen Columbia PIZER; A. Craig Baltimore TOWNSEND; P. Francis Lutherville KUHAJDA
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2020-11-14
Also published as: AU2006203005A1; KR20090130151A; EP1227810B1; KR20070106648A; DK1227810T3; EP1227810A1; JP2003513920A; AU784495B2; AU1600701A; ES2267587T3; KR20090031957A; DE60028996D1; ATE330598T1; CA2391277A1; US20020187534A1; EP1227810B8; WO2001034145A1; AU2009227836A1; KR20020060736A; PT1227810E

Description

Überblick über den Stand der Technik
Mehrere Untersuchungen zeigten überraschenderweise hohe Expressionsraten der Fettsäuresynthase (FAS, E. C. 2.3.1.85) bei bösartigem humanen Brustkrebs (Alo, P. L., Visca, P., Marci, A., Mangoni, A., Botti, C. und Di Tondo, U. "Expression of fatty acid synthase (FAS0 as predictor of recurrence in stage I breast carcinoma patients", Cancer, 77: 474–482, 1996; Jensen, V., Ladekarl, M., Holm-Nielsen, P., Melsen, F. und Soerensen, F. B., "The prognostic value of oncogenic antigen 519 (OA-519) expression and proliferative activity detected by antibody MIB-1 in node-negative breast cancer", Journal of Pathology, 176: 343–352, 1995), sowie bei anderen Krebsarten (Rashid, A., Pizer, E. S., Moga, M., Milgraum, L. Z., Zahurak, M., Pasternack, G. R., Kuhajda, F. P. und Hamilton, S. R., "Elevated expression of fatty acid synthase and fatty acid synthetic activity in colorectal neoplasia", American Journal of Pathology, 150: 201–208, 1997; Pizer, E., Lax, S., Kuhajda, F., Pasternack, G. und Kurman, R., "Fatty acid synthase expression in endometrial carcinoma: correlation with cell proliferation and hormone receptors", Cancer, 83: 528–537, 1998). Die FAS-Expression wurde auch in intraduktalen und lobulären in situ-Brustkarzinomen identifiziert; die Läsionen sind mit einem erhöhten Risiko zur Entwicklung von infilitrierendem Brustkrebs verbunden (Milgraum, L. Z., Witters, L. A., Pasternack, G. R. und Kuhajda, F. P., "Enzymes of the fatty acid synthesis pathway are highly expressed in in situ breast carcinoma", Clinical Cancer Research, 3: 2115–2120, 1997). FAS ist das hauptsächliche Synthese-Enzym bei der Fettsäuresynthese (FA-Synthese), das die NADPH-abhängige Kondensation von Malonyl-CoA und Acetyl-CoA katalysiert, um vorwiegend die aus 16 Kohlenstoffatomen bestehende, gesättigte, freie Fettsäure Palmitat, herzustellen (Wakil, S., "Fatty acid synthase, aproficient multifunctional enzyme"; Biochemistry, 28: 4523–4530, 1989). Ex vivo-Messungen im Tumorgewebe haben sowohl hohe FAS-Syntheseraten als auch hohe FA-Syntheseraten ergeben, was darauf hindeutet, dass das gesamte genetische Programm, das aus etwa 25 Enzymen von der Hexokinase bis zur FAS besteht, hochaktiv ist.
Kultivierte humane Krebszellen, die mit FAS-Inhibitoren, einschließlich dem fungalen Produkt Cerulenin und der neuen Verbindung C75 behandelt wurden, zeigten eine schnell absinkende FA-Synthese mit anschließender Reduktion der DNA-Synthese und einem Zellzyklusarrest, was zu einer erhöhten Apoptose führte (Pizer, E. S., Jackisch, C., Wood, F. D., Pasternack, G. R., Davidson, N. E. und Kuhajda, F., "Inhibition of fatty acid synthesis induces programmed cell death in human breast cancer cells", Cancer Research, 56: 2745–2747, 1996; Pizer, E. S., Chrest, F. J., DiGiuseppe, J. A. und Han, W. F., "Pharmacological inhibitors of mammalian fatty acid synthase suppress DNA replication and induce apoptosis in tumor cell lines", Cancer Research, 58: 4611–4615, 1998). Die pharmakologische Inhibierung der Fettsäuresyntheseaktivität in Säugetieren führt zur Inhibierung der DNA-Replikation innerhalb von etwa 90 Minuten nach Verabreichung des Medikaments. Diese Ergebnisse legten eine vitale biochemische Verbindung zwischen der FA-Synthese und dem Wachstum von Krebszellen nahe. Während ein großes Interesses für dieses Thema aufkam, blieb die Frage offen, wie die Inhibierung der Fettsäuresynthase dieses Phänomen auslöst. Es ist wichtig anzumerken, dass diese Effekte trotz des Vorhandenseins exogener Fettsäuren im Kulturmedium, die aus fötalem Kälberserum stammten, auftreten. Während es möglich war, den zytotoxischen Effekt von Cerulenin auf bestimmte Zellen in fettsäurefreien Kulturbedingungen durch Zugabe von exogenem Palmitat aufzuheben, wurden die meisten Krebszellen nicht von der Inhibierung der FA-Synthese durch das Endprodukt des Stoffwechselweges gerettet (Daten nicht gezeigt) (Pizer, E. S., Wood, F. D., Pasternack, G. R. und Kuhajda, F. P., "Fatty acid synthase (FAS): A target for cytotoxic antimetabolites in HL60 promyelotic leukemia cells", Cancer Research, 1996: 745–751, 1996). Aus diesem Grunde liegen bis jetzt keine Kenntnisse darüber vor, ob der zytotoxische Effekt der Inhibierung der FA-Synthese auf die meisten Krebszellen von einem Mangel des Endprodukts oder von einem anderen biochemischen Mechanismus herrührte.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines MCD-Inhibitors, der einen Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA verursacht, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen in einem Organismus zur Verfügung gestellt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung, die einen Anstieg an intrazellulärem Malonyl-CoA in Tumorzellen eines Organismus verursacht, wobei der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA einer verstärkten Synthese von Malonyl-CoA entspricht, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen im Organismus zur Verfügung gestellt.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Abtötung von Krebszellen durch die akute Erhöhung des zellulären Malonyl-Coenzyms A (Malonyl-CoA) zur Verfügung, was zur Apoptose führt. Die durch die Inhibierung der Fettsäuresynthase (FAS) induzierte Erhöhung von Malonyl-CoA entspricht sowohl einer Inhibierung der Fettsäuresynthese als auch einer Inhibierung der Carnitin-Palmitoyltransferase-1 (CPT-1). Eine beliebige Kombination von Medikamenten, die einen analogen physiologischen Effekt ausübt, führt bei empfänglichen Tumorzellen erwartungsgemäß zu den gleichen Effekten. Erwartungsgemäß induziert beispielsweise eine Kombinationstherapie mit (einem) Medikament/en, das/die die Fettsäuresynthese durch Inhibierung der Acetyl-CoA-Carboxylase (das erste Enzym des Fettsäuresynthese-Stoffwechselwegs) inhibiert/inhibieren, und (einem) Medikament/en, das/die CPT-1 inhibiert/en, Apoptose in Tumorzellen. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur systemischen Inhibierung der CPT-1-Aktivität in Krebszellen zur Verfügung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, einer direkten Inhibierung von CPT-1 durch Inhibitoren aus kleinen Molekülen wie Etomoxir, sowie einer Inhibierung von CPT-1 durch die Erhöhung der Menge an Malonyl-CoA in Krebszellen.
Dieser therapeutische Ansatz führt zu neuartigen chemotherapeutischen Mitteln für ein breites Spektrum von humanen Krebsarten. Da dies ein neuartiger zur Apoptose führender Weg ist, der nicht von anderen Medikamenten gegen Krebs beschritten wird, kann ferner davon ausgegangen werden, dass eine Induktion von großen Mengen an Malonyl-CoA und/oder eine Inhibierung von CPT-1 die Wirkung anderer gewöhnlich eingesetzter Therapeutika gegen Krebs potenzieren kann.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen in einem Organismus bereit, bei welchem dem Organismus eine Zusammensetzung verabreicht wird, die einen Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA in Tumorzellen des Organismus verursacht. Das intrazelluläre Malonyl-CoA steigt wenigstens in den Tumorzellen des Organismus abrupt (d.h. akut oder scharf) an, und besonders bevorzugt steigt das intrazelluläre Malonyl-CoA vor einer signifikanten Zunahme der Verbrauchsgeschwindigkeit von Malonyl-CoA an. Üblicherweise steigt das intrazelluläre Malonyl-CoA innerhalb von 3 Stunden während der Verabreichung an, und man kann erwarten, dass das intrazelluläre Malonyl-CoA vor der Inhibierung des Wachstums der Zellen ansteigt.
Vorzugsweise entspricht der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA einem abnehmenden Verbrauch von Malonyl-CoA. Der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA entspricht beispielsweise einer verminderten intrazellulären Aktivität der Malonyl-CoA-Decarboxylase (MCD) oder einer verminderten intrazellulären Aktivität der Fettsäuresynthase; und gegebenenfalls kann die Zusammensetzung einen MCD-Inhibitor umfassen. Danen entspricht der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA vorzugsweise einer erhöhten Malonyl-CoA-Synthese und/oder einer erhöhten intrazellulären Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC).
Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verfügung, die ein Mittel enthält, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Aktivator der ACC, einen Inhibitor der 5'-AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) und/oder einem Inhibitor der Acyl-CoA-Synthase. Die Zusammensetzung kann einen Inhibitor der Carnitin-Palmitoyltransferase-1 (CPT-1) umfassen, welcher Etoxomir sein kann und vorzugsweise in Kombination mit einem Mittel der vorhergehenden Gruppe verabreicht werden kann. Alternativ dazu wird dem Organismus ein zweites chemotherapeutisches Mittel verabreicht, das die Fettsäuresynthese nicht inhibiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise dazu eingesetzt, Organismen zu behandeln, die, vor Verabreichung der Zusammensetzung, eine Menge von intrazellulärem Malonyl-CoA in Tumorzellen aufweisen, die wenigstens zweimal höher als die normale Menge an Malonyl-CoA in nicht malignen Zellen ist. Besonders bevorzugt wird das Verfahren dazu eingesetzt, Organismen zu behandeln, wobei die Geschwindigkeit der Fettsäuresynthese in einigen dieser Zellen wenigstens zweimal höher als in normalen Zellen vor Verabreichung der Zusammensetzung ist, und die Verabreichung der Zusammensetzung für diese Zellen zytotoxisch ist. Der Organismus umfasst vorzugsweise Tumorzellen mit einer erhöhten Geschwindigkeit der Fettsäuresynthese, und die Anzahl dieser Tumorzellen wird als Folge der Verabreichung einer solchen Zusammensetzung reduziert. Nach der Behandlung ist die intrazelluläre Menge an Malonyl-CoA vorzugsweise erhöht und die intrazellulären Mengen an Acetyl-CoA und an freiem CoA sind bezogen auf die Mengen vor der Behandlung bevorzugt reduziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung (a) eines Inhibitors der Fettsäuresynthese in Tumorzellen eines Organismus; und (b) eines Inhibitors der Fettsäureoxidation in diesen Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen im Organismus zur Verfügung gestellt.
Der Inhibitor der Fettsäureoxidation wird vorzugsweise in einer Menge eingesetzt, die CPT-2 nicht signifikant inhibiert. Besonders bevorzugt werden der Inhibitor der Fettsäuresynthese und der Inhibitor der Fettsäureoxidation in Mengen eingesetzt, die ausreichend dafür sind, wenigstens das gleiche oder ein höheres Ausmaß der entsprechenden Inhibierung zu erreichen, als es bei zytotoxischen Dosierungen von Cerulenin zu beobachten ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Screeningverfahren zur Unterstützung der Erkennung von für Tumorzellen selektiv zytotoxisch wirkenden Zusammensetzungen zur Verfügung, umfassend das Verabreichen einer Zielzusammensetzung an eine Zelle mit einer erhöhten Menge an intrazellulärem Malonyl-CoA, das Monitoring von intrazellulärem Malonyl-CoA in der Zelle nach der Verabreichung, wobei ein abrupter Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA indikativ für selektive Zytotoxizität ist. Vorzugsweise umfasst dieses Verfahren weiterhin den Vergleich des Musters der Veränderungen der intrazellulären Malonyl-CoA-Spiegel in der Gegenwart und in der Abwesenheit von TOFA, wobei reduzierte Veränderungen des Malonyl-CoA-Spiegels in der Gegenwart von TOFA für eine selektive Zytotoxizität selektiv ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Screeningverfahren zur Verfügung, um bei der Detektion von Zusammensetzungen zu helfen, welche eine wachstumsinhibierende Wirkung auf Tumorzellen haben, umfassend das Verabreichen einer Zielzusammensetzung an eine tumorabgeleitete Zellinie und das Aufzeichnen der CPT-1-Aktivität in der Zelle im Anschluss an diese Verabreichung, wobei ein Absinken der CPT-1-Aktivität für ein wachstumsinhibierendes Potential indikativ ist. Vorzugsweise wird das Verfahren ausgeführt, wenn die Zelle permeabel gemacht wurde. Alternativ umfasst das Verfahren weiterhin das Überwachen der Zellen hinsichtlich Apoptose, und das Überwachen hinsichtlich Apoptose kann ein Verfahren umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Messen des mitochondrialen Transmembranpotentials, dem Färben mit Vitalfarbstoffen, dem Verfolgen der Caspaseaktivierung in Gesamtzellen unter Verwendung eines Western Blots und das Messen von Cytochrom C, das aus den Mitochondrien freigesetzt wird, unter Verwendung eines Western Blots besteht.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt den Syntheseweg für Fettsäuren und die Wirkung von verschiedenen Fettsäuresynthaseinhibitoren auf die Fettsäuresynthese und auf das Tumorzellwachstum.
2 zeigt Malonyl-CoA-Niveaus unter verschiedenen Bedingungen.
3 zeigt die Ergebnisse von klonogenen Assays und von Apoptoseassays mit Brustkrebszellen, die mit verschiedenen Inhibitoren behandelt wurden.
4 zeigt verschiedene Parameter in Tumorzellen und Leberzellen.
5 zeigt Malonyl-CoA-Niveaus in Tumorzellen und Leberzellen.
6 zeigt den biochemischen Weg für die zelluläre Oxidation von Fettsäuren. CPT-1 regelt die Oxidation von Fettsäuren in dem Mitochondrion durch Kontrollieren der Passage von langkettigen Acyl-CoA-Derivaten wie Palmitoyl-CoA durch die äußere mitochondriale Membran in das Mitochondrion und beugt somit dem nutzlosen Oxidationszyklus von endogen synthetisierten Fettsäuren vor.
7 zeigt die Wirkung von Etomoxir auf das Wachstum von MCF-7-Zellen mit und ohne C-75.
8 zeigt die Wirkung von Cerulenin auf die Fettsäureoxidation in MCF-7-Zellen.
9 zeigt die Wirkung von Etomoxir, TOFA und Cerulenin auf die CPT-1-Aktivität.
10 zeigt die Wirkung von Etomoxir auf die Fettsäureoxidation in MCF-7-Zellen.
11 zeigt die Wirkung von Etomoxir auf das Wachstum von MCF-7-Zellen.
12 zeigt die Ergebnisse des klonogenen Assays mit MCF-7-Zellen, die sowohl mit Etomoxir als auch mit TOFA behandelt wurden.
13 zeigt die Wirkung von Etomoxir und/oder von C-75 auf das Wachstum von MCF-7-Zellen.
Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen
Wenn die zytotoxischen Wirkungen von Cerulenin und C75 durch einen Mangel an Fettsäuren zu erklären sind, dann sollte jeder andere FA-Syntheseinhibitor mit ähnlicher Potenz ähnliche Wirkungen zur Verfügung stellen. Um diese Idee zu testen, haben die Erfinder die Wirkungen der Inhibierung von Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC, E. C. 6.4.1.2), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der Fettsäuresynthese, mit den Wirkungen von FAS-Inhibitoren auf Krebszellen verglichen. Die Erfinder haben entdeckt, dass die Inhibierung von FAS zu hohen Spiegeln an Malonyl-CoA führt und dass diese innerhalb einer Stunde C75-Behandlung auftreten. Diese superphysiologischen Niveaus von Malonyl-CoA, eher als die nur niedrigen Spiegel von endogen synthetisierten Fettsäuren, sind für die Brustkrebszellapoptose verantwortlich. Zusätzlich ist dies ein neuer Weg, welcher zu einer selektiven Apoptose von Krebszellen führt.
1A fasst den Teil des Fettsäuresyntheseweges zusammen, der die Zielenzyme der Inhibitoren, die in dieser Studie verwendet werden, enthält. Die Inhibierung der Fettsäuresynthase resultiert in hohen Spiegeln an Malonyl-CoA, die zu der Zytotoxizität gegenüber humanen Brustkrebszellen beitragen (ref). Zusätzlich zu seiner Rolle als ein Substrat für die Fettsäuresynthese ist Malonyl-CoA ein potenter Inhibitor von Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1 (CPT-1), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der Fettsäureoxidation. CPT-1 ist ein integrales äußeres Membranprotein des Mitochondrions, das eine Transveresterung von langkettigen Fettsäureacyl-CoAs mit L-Carnitin ausführt und so Acylcarnitin herstellt. Acylcarnitin wird über die mitochondrialen Membranen transportiert, wo es wiederum zu Acyl-CoA durch CPT-2 verestert wird. Physiologisch wird die CPT-1-Aktivität durch die Inhibierung durch Malonyl-CoA reguliert, ein Substrat der Fettsäuresynthese. Malonyl-CoA ist das enzymatische Produkt von Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC, E. C. 6.4.1.2), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym für die Fettsäuresynthese. Zytoplasmatische Malonyl-CoA-Spiegel sind während der Fettsäuresynthese aufgrund einer erhöhten Aktivität von ACC erhöht. Die hohen Malonyl-CoA-Spiegel inhibieren wiederum CPT-1 und blockieren den Zugang von langkettigen Acyl-CoAs in das Mitochondrion. Dies verhindert den nutzlosen Zyklus des gleichzeitigen Synthetisierens von Fettsäuren und deren Oxidation. Im Muskel, in dem im Wesentlichen kein FAS vorkommt, regulieren ACC und Malonyl-CoA die Fettsäureoxidation, eine wichtige Energiequelle für Herz- und Skelettmuskel.
TOFA (5-(Tetradecyloxy)-2-Furoesäure) ist ein allosterischer Inhibitor von Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC, E. C. 6.4.1.2.), der die Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA blockiert. Sobald es mit dem Coenzym-A verestert ist, inhibiert TOFA-CoA allosterisch ACC mit einem Mechanismus, der dem von langkettigen Acyl-CoAs ähnelt, den physiologischen Endproduktinhibitoren von ACC (Halvorson, D. L., und McCune, S. A. Inhibition of fatty acid synthesis in isolated adipocytes by 5-(Tetradecyloxy)-2-furoic acid., Lipids. 19: 851–856, 1984). Sowohl Cerulenin (Funabashi, H., Kawaguchi, A., Tomoda, H., Omura, S., Okuda, S. und Iwasaki, S. Binding site of cerulenin in fatty acid synthetase., J. Biochem. 105: 751–755, 1989) als auch C75 (Pizer, et al., 1998) sind FAS-Inhibitoren, die die Kondensation von Malonyl-CoA und Acetyl-CoA zu Fettsäuren verhindern. Cerulenin ist ein Suizidinhibitor, der ein kovalentes Addukt mit FAS bildet (Moche, M., Schneider, G., Edwards, P., Dehesh, K. und Lindquist, Y. Structure of the complex between the antibiotic cerulenin and its target, beta-ketoacyl carrier protein synthase., J. Biol. Chem. 274: 6031–6034, 1999), während C75 wahrscheinlich ein langsam bindender Inhibitor ist (Kuhajda, F. P., Pizer, E. S., Mani, N. S., Pinn, M. L., Han, W. F., Chrest, F. J. und CA. T., Synthesis and anti-tumor activity of a novel inhibitor of fatty acid synthase, Proceeding of the American Association for Cancer Research, 40: 121, 1999). Unter Verwendung von TOFA haben die Erfinder eine Fettsäuresyntheseinhibierung in humanen Brustkrebszelllinien erreicht, die vergleichbar ist mit der Inhibierung durch Cerulenin oder C75. Überraschenderweise war jedoch TOFA im Wesentlichen bei klonogenen Assays von humanen Brustkrebszelllinien nicht zytotoxisch. Diese Daten zeigen an, dass der Mangel an Fettsäuren nicht eine Hauptquelle der Zytotoxizität für Krebszellen in einer angereicherten Serumkultur ist. Eine alternative Wirkung der FAS-Inhibierung (hohe Spiegel des Substrats, Malonyl-CoA, die spezifisch aus der Inhibierung von FAS resultieren) scheint die Zytotoxizität von Cerulenin und C75 zu vermitteln.
Malonyl-CoA, das enzymatische Produkt von Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC, E. C. 6.4.1.2), ist ein Regulationsschlüsselmolekül beim zellulären Metabolismus. Zusätzlich zu seiner Rolle als Substrat bei der Fettsäuresynthese reguliert Malonyl-CoA die β-Oxidation von Fettsäuren durch dessen Interaktion mit Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1 (CPT-1) an der äußeren Membran der Mitochondrien. Carnitin-Palmitoyl-Transferase (CPT-1) ist das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym der mitochondrialen Fettsäureoxidation (siehe 6). Es ist ein integrales äußeres Membranprotein des Mitochondrions, das eine trans-Veresterung von langkettigen Fettsäureacyl-CoAs mit L-Carnitin ausführt und so Acylcarnitin produziert. Acylcarnitin wird über die mitochondrialen Membranen transportiert, wo es wiederum mit Acyl-CoA durch CPT-2 verestert wird.
Viele Krebszellarten haben hohe Spiegel an Fettsäuresynthese. Wie erwartet, haben Zellen mit hohen Niveaus an Fettsäuresynthese Steady-State-Niveaus an Malonyl-CoA, wobei diese Steady-State-Niveaus wenigstens das Sechsfache der normalen Niveaus in normalen Zellen betragen (siehe Beispiel 6). Die Behandlung von Tumorzellen mit FAS-Inhibitoren wird selektiv und abrupt die Spiegel von Malonyl-CoA auf überphysiologische Spiegel in Krebszellen erhöhen. Dieses Manöver erhöht die Malonyl-CoA-Spiegel sowohl durch Blockieren der Verwendung von Malonyl-CoA als ein Substrat bei der Fettsäuresynthese als auch gleichzeitig durch Stimulieren der Malonyl-CoA-Synthese durch Freisetzen von Fettsäureacyl-CoA-Inhibierung von ACC (1A). Da FAS vorzugsweise in Krebszellen exprimiert wird, ist der Malonyl-CoA-Anstieg im Wesentlichen auf Tumorzellen begrenzt. Dies führt zu Krebszellapoptose und zum Aussparen von normalem Gewebe, wie es in humanen Krebsheterotransplantaten auftritt, die mit FAS-Inhibitoren behandelt werden (siehe Beispiel 5).
CPT-1 hat zwei Isoformen, CPT-1 des Lebertyps (L-CPT-1) und CPT-1 des Muskeltyps (M-CPT-1) (Swanson, S. T., Foster, D. W., McGarry, J. D. und Brown, N. F. Roles of the N- and C-terminal domains of carnitine palmitoyltransferase I isoforms in malonyl-CoA sensitivity of the enzymes: insights from expression of chimaeric proteins and mutation of conserved histidine residues., Biochem. J. 335: 513–519, 1998). Diese Isoformen haben deutlich unterschiedliche kinetische Eigenschaften hinsichtlich ihres K_m für Carnitin (500 μM für M-CPT-1 und ~30 μM für L-CPT-1) und unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber einer Malonyl-CoA-Inhibierung (M-CPT-1 ist 100-fach mehr empfindlich, K_i = 0,07 μM gegenüber 7 μM). Während der Regulationsort von Malonyl-CoA sich in dem N-terminalen Bereich befindet, wurde der exakte Bindeort bis jetzt nicht bestimmt (Swanson, et al., 1998). Wichtigerweise bindet Etomoxir, ein kovalenter Inhibitor von CPT-1, der hierin als ein beispielhafter CPT-1-Inhibitor verwendet wird, an einem anderen Ort als dem Bindeort von Malonyl-CoA.
CPT-1 wurde in humanen Krebszellen nicht studiert. Daher ist die Isoform, die in humanen Krebszellen exprimiert wird, unbekannt. Konzeptuell sollte die Leberisoform in Tumoren mit Epitheldifferenzierung exprimiert werden, was alle Carcinoma beinhaltet, während die Muskelisoform in Nichtepitheltumoren wie Sarcoma exprimiert werden würde. Jedoch haben ACC-Studien mit Leber- und Muskelisoformen herausgefunden, dass jede der beide Isoformen oder beide Isoformen in humanen Brustkrebszellen exprimiert werden können (Witters, L., Widmer, J., King, A., Fassihi, K und Kuhajda, F. Identification of human acetyl-CoA carboxylase isozymes in tissue and in breast cancer cells., International Journal of Biochemistry, 26: 589-594, 1994). Auf ähnliche Weise könnten humane Karzinomzellen die Fähigkeit haben, jede einzelne oder beide CPT-1-Isoformen zu exprimieren.
Kürzlich wurde gezeigt, dass die Inhibierung von CPT-1 Zellen gegenüber fettsäureinduzierter Apoptose empfindlicher macht (Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramatsu, M., Yamamoto, M. und Honjo, T. Inhibition of carnitine palmitoyltransferase I augments sphingolipid synthesis and palmitate-induced apoptosis., J. Biol. Chem. 272: 3324–3329, 1997). Darüber hinaus sind erhöhte Malonyl-CoA-Spiegel, die durch die Inhibierung der Fettsäuresynthase (FAS) induziert werden, für humane Krebszellen zytotoxisch (siehe Beispiele 4 und 5). Zusammengenommen suggerieren diese Daten, dass humane Krebszellen für die Induktion von Apoptose über Veränderungen im Fettsäuremetabolismus empfänglich sind. Es wurde ebenso gezeigt, dass CPT-1 direkt mit BCL-2, dem Anti-Apoptose-Protein, an der äußeren mitochondrialen Membran interagiert (Paumen, M. B., Ishisa, Y., Han, H., Muramatsu, M., Eguchi, Y., Tsujimoto, Y. und Honjo, T. Direct interaction of the mitochondrial membrane protein carnitine palmitoyltransferase I mit Bcl-2, Biochem. Biophys. Res. Commun. 231: 523–525, 1997). Potentiell kann die Interaktion von CPT-1 mit BCL-2 einen Downstream-Mechanismus zur Verfügung stellen, der durch Modulation der anti-apoptotischen Wirkungen von BCL-2 zur Apoptose führt.
Zusätzlich zu seiner Rolle als Substrat für FAS agiert Malonyl-CoA an der äußeren mitochondrialen Membran, um die Fettsäureoxidation durch Inhibierung der Carnitin-Palmitoyl-Transferase I (CPT-1) zu regulieren. Es wurde gezeigt, dass die Inhibierung von CPT-1 Zellen gegenüber fettsäureinduzierter Apoptose empfänglich macht; CPT-1 könnte ebenso direkt mit BCL-2, dem Anti-Apoptose-Protein, an den Mitochondrien interagieren. Die FAS-Inhibierung führt zu hohen Niveaus von Malonyl-CoA, die CPT-1 inhibieren, was eine Krebszellapoptose induziert. Da die meisten proliferierenden und nichtproliferierenden normalen Zellen keine hohen FAS-Spiegel haben, werden sie durch diese therapeutische Strategie nicht beeinflusst werden.
Die Malonyl-CoA-Spiegel können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren und Zielenzymen manipuliert werden. Die Beispiele demonstrieren die Anhebung von Malonyl-CoA-Spiegeln durch die reduzierte Verwendung und die gleichzeitig erhöhte Produktion. Ein akuter Anstieg der Malonyl-CoA-Spiegel führt zu der selektiven Zerstörung von Krebszellen über Apoptose, wobei normale Zellen unbetroffen bleiben. Verfahren zum Induzieren von Apoptose gemäß der vorliegenden Erfindung zerfallen in zwei breite Kategorien: die direkte Induktion eines akuten Malonyl-CoA-Anstiegs (z. B. durch Inhibieren von FAS) und die Verwendung einer Kombinationstherapie, um sowohl Fettgsäureoxidation als auch Fettsäuresynthese zu inhibieren (z. B. durch einen nicht-FAS-inhibierenden Modus). Diese therapeutische Strategie identifiziert potentielle neu Ziele und Strategien für eine Krebschemotherapie basierend auf einer Veränderung des Fettsäuremetabolismus.
Fettsäureoxidation kann über die CPT-1-Inhibierung direkt durch inhibierende Mittel wie Etomoxir inhibiert werden. Spezifische Inhibitoren für die CPT-1-Isoformen können ebenso entwickelt werden. Alternativ könnte man die Carnitinniveaus manipulieren, um die CPT-1-Aktivität durch Reduktion von dessen Substrat zu reduzieren. Auch könnte man die CPT-1-Expressionsniveaus entweder durch genetische Manipulation oder durch Reduzieren von exogenen Fettsäuren reduzieren. Beispiel 7 hierunter ist ein Beispiel des Verfahrens des direkten Inhibierens von CPT-1 unter Verwendung von Etomoxir in humanen Brustkrebszellen.
Andere Strategien zum Inhibieren der Fettsäuresynthese und der Fettsäureoxidation beinhalten jegliches Verfahren zur Erhöhung der Malonyl-CoA-Niveaus von erhöhter Synthese, vermindertem Abbau oder vorzugsweise von beidem. Die Malonyl-CoA-Niveaus können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren und Zielenzymen manipuliert werden. Die Beispiele 4–5 demonstrieren die Erhöhung von Malonyl-CoA-Niveaus durch eine reduzierte Verwendung und gleichzeitig durch eine verstärkte Produktion. Ein akuter Anstieg der Malonyl-CoA-Niveaus führt zu der selektiven Zerstörung von Krebszellen über Apoptose, wobei normale Zellen nicht beeinflusst werden. Andere Beispiele demonstrieren zusätzliche Wege, eine Inhibierung des Krebszellwachstums oder einen Krebszelltod zu verursachen.
Vorzugsweise wird die Manipulation des Fettsäuremetabolismus gemäß der Erfindung durch das Verabreichen einer Zusammensetzung (oder mehreren Zusammensetzungen) an einen Organismus erreicht, der einen Bedarf hierfür hat. Die Zusammensetzung, die an den Organismus verabreicht werden soll, wird ein Mittel enthalten, das wenigstens eine biologische Wirkung auf die Wege des Fettsäuremetabolismus hat, beispielsweise durch Erhöhen von intrazelluläreren Malonyl-CoA-Niveaus. Typischerweise wird der Organismus ein Säugetier sein, so wie eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Meerschweinchen, eine Katze, ein Hund, ein Pferd, eine Kuh, ein Schaf, eine Ziege, ein Schwein, oder ein Primat, so wie ein Schimpanse, ein Pavian, oder vorzugsweise ein Mensch. Normalerweise wird der Organismus neoplastische (maligne) Zellen enthalten. Das Verfahren der Erfindung ist auf das selektive Beeinflussen von malignen Zellen gerichtet und darauf, einen geringeren Effekt (oder vorzugsweise keinen Effekt) auf normale (nichtmaligne) Zellen zu haben.
Das Mittel in der Zusammensetzung, die dem Organismus verabreicht werden soll, wird vorzugsweise die intrazellulären Malonyl-CoA-Niveaus in wenigstens einem Teil der malignen Zellen im Organismus erhöhen. Vorzugsweise wird das Malonyl-CoA-Niveau um das wenigstens 2-fache erhöht, mehr bevorzugt um das wenigstens 5-fache. Vorzugsweise wird das Mittel die intrazelluläre Malonyl-CoA-Konzentration in den malignen Zellen auf ein Niveau erhöhen, das höher ist als das Niveau in den umgebenden normalen Zellen.
Geeignete Mittel können die Malonyl-CoA-Spiegel durch eine Anzahl von Verfahren erhöhen (siehe alternative Mechanismen, hierunter aufgeführt). Bevorzugte Mittel induzieren typischerweise einen plötzlichen oder abrupten Anstieg des Malonyl-CoA-Spiegels. In einigen Ausführungsformen werden zwei oder mehr Mittel verabreicht, und einige oder alle dieser Mittel können Malonyl-CoA-Niveaus durch einen unterschiedlichen Mechanismus beeinflussen. Alternativ kann eine Kombination von Mitteln verwendet werden, um die Fettsäuresynthese abzusenken und um simultan eine niedrigere Fettsäureoxidation zu erzielen. Vorzugsweise werden die Niveaus der Fettsäuresynthese und der Fettsäureoxidation auf Niveaus abgesenkt, die vergleichbar sind zu denjenigen, die durch zytotoxische Behandlung mit Cerulenin erzielt werden. Mittel, die nach einem der Modi agieren, die in der folgenden Liste aufgeführt sind, können in Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Assays für die folgenden Aktivitäten sind in der Literatur erhältlich, und die Bestimmung, ob ein bestimmtes Mittel eine dieser Aktivitäten aufweist, befindet sich im Können des Fachmanns.
Erhöhen der Malonyl-CoA-Produktion
Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC)-Effektoren. Mittel, welche die ACC-Aktivität erhöhen, die ACC-Inhibierung reduzieren oder die Masse an aktivem ACC-Enzym erhöhen, werden zu erhöhten Malonyl-CoA-Spiegeln führen.
5f'-AMP-Proteinkinase-Effektoren: 5'-AMP-Proteinkinase inhibiert ACC durch Phosphorylierung, was zu einer akuten Reduktion von Malonyl-CoA führt. Inhibitoren dieser Kinase würden zu akut erhöhten Malonyl-CoA-Spiegeln durch Freisetzen der Inhibierung von ACC führen.
Citratsynthaseeffektoren: Das Erhöhen von mitochondrialem Citrat würde ein Substrat für die Fettsäuresynthese zur Verfügung stellen, und Citrat agiert ebenso als ein "feed-forward"-Aktivator von ACC und verursacht eine erhöhte Malonyl-CoA-Synthese.
Acyl-CoA-Synthase-Effektoren: Die Inhibierung von Acyl-CoA-Synthase würde die zelluläre Fettsäure-Acyl-CoA-Konzentration reduzieren, was die Inhibierung von ACC vermindert. Dieses würde in einer erhöhten ACC-Aktivität und in erhöhten Malonyl-CoA-Spiegeln resultieren.
Absenken des Malonyl-CoA-Verbrauchs:
Malonyl-CoA-Decarboxylase (MCD)-Effektoren: Dieses Enzym katalysiert eine ATP-abhängige Decarboxylierung von Malonyl-CoA zurück zu Acetyl-CoA. Die Inhibierung von MCD würde akut die Malonyl-CoA-Spiegel erhöhen.
Gleichzeitiges Absenken des Malonyl-CoA-Verbrauchs und erhöhte Produktion von Malonyl-CoA:
Fettsäuresynthase (FAS)-Effektoren: Die Inhibierung von FAS führt zu einem abgesenkten Verbrauch an Malonyl-CoA durch Blockieren von dessen Einbeziehung in Fettsäuren. Die Inhibierung von FAS führt ebenso zu reduzierten Fettsäure-Acyl-CoA-Niveaus, was ACC aktivieren wird. Beispielhafte FAS-Inhibitoren können erhalten werden, wie es in US-Patent Nrn. 5,759,837 und 5,981,575 beschrieben ist.
Diese Strategien zum Modifizieren des Fettsäuremetabolismus und insbesondere zum akuten Erhöhten von Malonyl-CoA-Spiegeln können gemeinsam oder zusammen mit anderen Medikamenten verwendet werden, um die Apoptose von Krebszellen zu verstärken. Bevorzugt erhöht wenigstens ein Mittel in den Zusammensetzungen dieser Erfindung das Niveau von Malonyl-CoA durch einen anderen Mechanismus als das Inhibieren von FAS.
VERABREICHUNG DER BESTANDTEILE
Therapeutische Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert, die das Mittel und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann andere Bestandteile enthalten, solange die anderen Bestandteile die Wirksamkeit des Mittels dieser Erfindung nicht so weit reduzieren, dass keine Therapie mehr stattfindet. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik gut bekannt, und Fachleute auf dem Pharmaziefach können leicht Träger auswählen, die für bestimmte Verabreichungswege geeignet sind (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985).
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die irgendeines der Mittel der Erfindung enthalten, können durch parenterale (subkutan, intramuskulär, intravenös, intraperitoneal, intrapleural, intravesikulär oder intrathekal), topische, orale, rektale oder nasale Verabreichung, wie durch die Wahl des Medikaments erforderlich, verabreicht werden. Die Konzentrationen des aktiven Mittels in den pharmazeutisch akzeptablen Trägern kann von 0,01 mM bis 1 M oder höher reichen, solange die Konzentration nicht ein akzeptables Maß an Toxizität zum Zeitpunkt der Verabreichung überschreitet.
Die Dosis und Dauer der Therapie werden von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich des therapeutischen Indexes der Medikamente, der Art der Erkrankung, des Alters und Gewichts des Patienten und der Toxizitätstoleranz. Die Dosis wird im Allgemeinen so ausgewählt werden, dass man Serumkonzentrationen von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 100 μg/ml erreicht. Vorzugsweise werden die initialen Dosierungsniveaus basierend auf deren Fähigkeit, Umgebungskonzentrationen zu erreichen, von denen gezeigt ist, dass sie in in-vitro-Modellen wirksam sind, so wie solchen, die hierin beschrieben sind, und in-vivo-Modellen und in klinischen Versuchen, bis zu maximal tolerierten Spiegeln ausgewählt werden. Die klinische Standardprozedur bevorzugt, dass die Chemotherapie an den individuellen Patienten angepasst wird und dass die systemische Konzentration des chemotherapeutischen Mittels regelmäßig überwacht wird. Die Dosis eines bestimmten Medikaments und die Therapiedauer für einen bestimmten Patienten können durch den Fachmann unter Verwendung von pharmakologischen Standardherangehensweisen hinsichtlich der obigen Faktoren bestimmt werden. Die Antwort auf die Behandlung kann durch die Analyse der Spiegel des erfindungsgemäßen Mittels im Blut oder in Körperflüssigkeiten, durch Messen der Aktivität des Mittels oder von dessen Spiegeln in relevanten Geweben oder durch Überwachen des Erkrankungszustands des Patienten überwacht werden. Der klinische Fachmann wird die Dosis und die Dauer der Therapie basierend auf der Antwort auf die Behandlung, die sich durch diese Messungen ergibt, anpassen.
BEISPIELE
Um ein vollständigeres Verständnis der Erfindung zu vereinfachen, werden eine Anzahl von Beispielen hierunter zur Verfügung gestellt. Jedoch ist der Umfang der Erfindung nicht auf bestimmte Ausführungsformen begrenzt, die in diesen Beispielen offenbart sind, welche nur zur Illustrationszwecken angegeben sind.
Beispiel 1. Inhibierung von FAS in Zellen in vitro
TOFA, Cerulenin und C75 haben alle die Fettsäuresynthese in humanen Brustkrebszellen inhibiert. Die humanen Brustkrebszelllinien SKBR3 und MCF7 wurden in RPMI mit 10%igem fötalem Rinderserum behalten. Die Zellen wurden periodisch hinsichtlich einer Mycoplasma-Kontamination (Gensonde) gescreent. Alle Inhibitoren wurden als 5-mg/ml-Stammlösungen in DMSO hinzugefügt. Zur Bestimmung der Aktivität der Fettsäuresynthese wurden 5 × 10⁴ Zellen/well in 24-well-Platten in Pulsen mit [U-¹⁴C]-Acetat nach deren Aussetzung gegenüber dem Medikament markiert, und Lipide wurden extrahiert und quantifiziert, wie vorher beschrieben (Pizer, et al., 1988). Für MCF7-Zellen wurde die Aktivität des biochemischen Wegs 2 Stunden nach der Aussetzung gegenüber dem Inhibitor bestimmt. Die SKBR3-Zellen zeigten eine schwächere Antwort auf FAS-Inhibitoren, möglicherweise wegen deren extrem hohem FAS-Gehalt, so dass eine Aktivität auf diesem biochemischen Weg 6 Stunden nach der Aussetzung gegenüber dem Inhibitor bestimmt wurde.
Bei Standardpulslabelingexperimenten, bei welchen die Brustkrebszelllinien SKBR3 und MCF7 2 Stunden nach dem Aussetzen gegenüber FA-Syntheseinhibitoren markiert wurden, inhibierten TOFA, C75 und Cerulenin alle die [U¹⁴C-Acetat]-Inkorporation in Lipide in ähnlichem Ausmaß (1B und D). In einer Vielzahl von ähnlichen Experimenten (nicht gezeigt) inhibierte TOFA die FA-Synthese in dem Dosisbereich von 1 bis 5 μg/ml in allen getesteten Zelllinien maximal, und Cerulenin und C75 inhibierten die FA-Synthese im Bereich von 10 μg/ml maximal.
Beispiel 2. Wirkung derselben Inhibitoren auf das Zellwachstum
TOFA, Cerulenin und C75 inhibierten alle die Fettsäuresynthese in humanen Brustkrebszellen, aber zeigten eine unterschiedliche Zytotoxizität. Die Zellen und die Inhibitoren waren wie in Beispiel 1 beschrieben. Für die klonogenen Assays wurden 4 × 10⁵ Zellen in 25-cm³-Flaschen ausplattiert, wobei die Inhibitoren 6 Stunden in den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt wurden. Gleiche Anzahlen von behandelten Zellen und Kontrollen wurden in 60-mm-Platten ausplattiert. Die Klone wurden gefärbt und nach 7 bis 10 Tagen gezählt.
Auch wenn alle Inhibitoren die FA-Synthese in einem ähnlichen Ausmaß reduzierten, war TOFA nichttoxisch oder stimulatorisch für das Krebszellwachstum im Dosisbereich für die ACC-Inhibierung, wie gemessen durch die klonogenen Assays, während Cerulenin und C75 signifikant zytotoxisch in diesem Dosisbereich für die FAS-Inhibierung waren (1C und E). Der profunde Unterschied zwischen den zytotoxischen Effekten von ACC-und FAS-Inhibierung demonstriert, dass die akute Reduktion der Fettsäureproduktion per se nicht die Hauptquelle der Zellverletzung nach der FAS-Inhibierung ist.
Beispiel 3. Messungen von Malonyl-CoA.
Der offensichtlichste Unterschied bei den erwarteten Ergebnissen beim Inhibieren dieser zwei Enzyme war, dass die Malonyl-CoA-Spiegel nach der ACC-Inhibierung fallen sollten, aber nach der FAS-Inhibierung ansteigen sollten. Auch wenn dies bisher in Eukaryoten nicht untersucht wurde, haben jüngere Daten in E. coli erhöhte Spiegel von Malonyl-CoA gezeigt, die aus dem Aussetzen gegenüber Cerulenin resultierten (Chohnan, et al., 1997, "Changes in the size and composition of intracellular pools of non-esterified coenzyme A and coenzyme A thioesters in aerobic and facultativly anaerobic bacteria," Applied and Environmental Microbiology, 63: 555–560). Malonyl-CoA-Spiegel wurden in Zellen gemessen, die einer FAS- Inhibierung und einer Inhibierung durch TOFA unter den Bedingungen ausgesetzt wurden, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
Die Malonyl-CoA-Spiegel wurden in MCF-7-Zellen unter Verwendung des HPLC-Verfahrens von Corkey, et al. gemessen (1988, "Analysis of acyl-coenzyme A esters in biological samples", Methods in Enzymology, 166: 55–70). Kurz zusammengefasst wurden 2,5 × 10⁵ Zellen/well in 24-well-Platten gegenüber 1,2 ml einer 10%igen TCA-Lösung bei 4°C nach verschiedenen Medikamentenbehandlungen ausgesetzt. Die Pelletmasse wurde aufgezeichnet und der Überstand wurde sechsmal mit 1,2 ml Ether gewaschen und zur Trockne unter Verwendung einer Vakuumzentrifugation bei 25°C reduziert. Coenzym-A-Ester wurden abgetrennt und unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC auf einer 5 μ Supelco C18-Säule mit einem Waters HPLC-System unter Verwendung von Millenium³² Software und unter Aufzeichnung von 254 nm als der maximalen Absorption für Coenzym-A quantifiziert. Die folgenden Gradienten und Puffer wurden verwendet: Puffer A: 0,1 M Kaliumphosphat, pH 5,0, Puffer B: 0,1 M Kaliumphosphat, pH 5,0, mit 40% Acetonitril. Folgend auf einen 20-minütigen isokratischen Durchlauf mit 92% A, 8% B bei 0,4 ml/min wurde der Fluss auf 0,8 ml/min über eine Minute erhöht, wonach ein linearer Gradient auf 10% B bis zur 24. Minute laufen gelassen wurde, dann wurde das System bei 10% B bis zur 50. Minute belassen, wonach ein linearer Gradient bis auf 100% B bei Minute 55 laufen gelassen wurde, der bei Minute 60 abschloss. Die folgenden Coenzym-A-Ester (Sigma) wurden als Standards laufen gelassen: Malonyl-CoA, Acetyl-CoA, Glutathion-CoA, Succinyl-CoA, HMG-CoA und freies CoA. Die Proben und die Standards wurden in 50 μl Puffer A gelöst. Die Coenzym-A-Ester eluierten nacheinander wie folgt: Malonyl-CoA, Glutathion-CoA, freies CoA, Succinyl-CoA, HMG-CoA und Acetyl-CoA. Die Quantifizierung von Coenzym-A-Estern wurde mit der Millenium³² Software ausgeführt.
Die direkte Messung von Coenzym-A-Derivaten in MCF-7-Zellen durch Umkehrphasen-HPLC von sauren löslichen Extrakten aus medikamentenbehandelten Zellen bestätigte, dass sowohl Cerulenin als auch C75 einen starken Anstieg der Malonyl-CoA-Niveaus verursachen, während TOFA die Malonyl-CoA-Niveaus reduziert. 2A ist ein repräsentatives Chromatogramm, das die Trennung und die Identifizierung von Coenzym-A-Derivaten, die im zellulären Metabolismus wichtig sind, demonstriert. Malonyl-CoA ist das Erste dieser Derivate, das eluiert, und zwar mit einer Säulenretentionszeit von 19–22 Minuten. Die Überlagerung der Chromatogramme in 2B zeigt, dass die Ceruleninbehandlung zu einem betonten Anstieg von Malonyl-CoA verglichen mit der Kontrolle führte, während TOFA eine signifikante Reduktion verursachte. Die chemische Identität des Malonyl-CoA wurde unabhängig durch Spikeproben mit Standards bestätigt (nicht gezeigt).
Die Malonyl-CoA-Niveaus waren mit FAS-Inhibition deutlich erhöht und durch TOFA reduziert. Die Analyse von vielen Experimenten in 2C demonstrierte, dass folgend auf eine einstündige Aussetzung gegenüber Cerulenin oder C75 bei 10 μg/ml die Malonyl-CoA-Spiegel sich um 930% bzw. 370% verglichen mit den Kontrollen erhöhten, während die TOFA-Behandlung (20 μg/ml) zu einer 60%igen Reduktion der Malonyl-CoA-Spiegel führte. Die TOFA-Konzentration, die für die maximale Reduktion der Malonyl-CoA-Spiegel erforderlich war, war viermal höher als die Dosis für die Inhibierung des biochemischen Wegs in 1B und D. Jedoch hatten optimale Kulturen für die Extraktion von CoA-Derivaten eine 5-fach höhere Zelldichte als die Kulturen, die in anderen biochemischen und Viabilitätsassays, die präsentiert wurden, verwendet wurden.
Der bemerkenswerte Malonyl-CoA-Anstieg nach der FAS-Inhibierung kann teilweise der Befreiung von der Inhibierung von ACC durch langkettiges Fettsäure-Acyl-CoA zugeschrieben werden, was zu einem Anstieg der ACC-Aktivität führt (1A). Darüber hinaus trat der Cerulenin-induzierte Anstieg der Malonyl-CoA-Spiegel innerhalb von 30 Minuten Behandlungszeit auf (930 ± 15% Anstieg gegenüber der Kontrolle, nicht gezeigt), innerhalb des Zeitrahmens der FA-Syntheseinhibierung und deutlich vor dem Beginn der DNA-Syntheseinhibierung oder von frühen apoptotischen Ereignissen. Somit waren hohe Malonyl-CoA-Niveaus eine charakteristische Wirkung von FAS-Inhibitoren und gingen zeitlich den anderen zellulären Antworten, einschließlich der Apoptose, voran.
Die Cerulenin- oder C75-Niveaus, welche hohe Malonyl-CoA-Spiegel induzieren, sind für humane Brustkrebszellen zytotoxisch, wie durch klonogene Assays und durch flusszytometrische Analyse von Apoptose unter Verwendung von Merocyanin 450-Färben gemessen. Die FAS-Inhibierung verursacht hohe Malonyl-CoA-Spiegel durch Inhibieren von dessen Verbrauch durch FAS-Inhibierung unter gleichzeitiger Stimulation der Malonyl-CoA-Synthese durch Befreien der inhibitorischen Wirkung von langkettigen Acyl-CoAs nach der ACC-Aktivität (2).
Beispiel 4. TOFA-Rettung von FAS Inhibierung
Die TOFA-Rettung von FAS-Inhibierung zeigt, dass hohe Malonyl-CoA-Spiegel für die Krebszellzytotoxizität verantwortlich sind. Wenn die erhöhten Malonyl-CoA-Spiegel, die aus der FAS-Inhibierung resultieren, für die Zytotoxizität verantwortlich wären, dann sollte es möglich sein, Zellen von einer FAS-Inhibierung durch Reduzieren der Malonyl-CoA-Akkumulation mit TOFA zu retten. Die gleichzeitige Verabreichung von TOFA und Cerulenin an SKBR3-Zellen (3A) hob die zytotoxische Wirkung von Cerulenin alleine bei klonogenen Assays auf, die wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt wurden. In MCF7-Zellen (3C) produzierte TOFA eine gewisse Rettung von sowohl Cerulenin als auch von C75 unter ähnlichen experimentellen Bedingungen.
Repräsentative flusszytometrische Analysen von SKBR3-Zellen (3B) und MCF7-Zellen (3D) substantierten diese Erkenntnisse, da TOFA die Zellen vor Cerulenin-induzierter Apoptose rettete. Die Apoptose wurde durch eine Multiparameterflusszytometrie unter Verwendung eines FACStar^Plus Flusszytometers, ausgerüstet mit Argon- und Krypton-Lasern (Becton Dickinson) gemessen. Die Apoptose wurde unter Verwendung von Merocyanin 540-Färbung, direkt hinzugefügt zu den Kulturzellen (Pizer, et al., 1998; Mower, et al., 1994, "Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis, J. Immunol., 152: 4832–4842). (Sigma) quantifiziert, welche eine veränderte Plasmamembranphospholipid-Verpackung detektiert, die früh bei der Apoptose auftritt. In einigen Experimenten wurden konformationale Chromatinveränderungen der Apoptose gleichzeitig als ein abgeschwächtes Färben mit LDS-751 (Exciton) (Frey, et al., 1995, "Nucleic acid dyes for detection of apoptosis in live cells", Cytometry, 21: 265–274) gemessen. Merocyanin 540 [10 μg/ml] wurde als eine 1-mg/ml-Stammlösung in Wasser hinzugefügt. Die Zellen wurden mit LDS-751 in einer finalen Konzentration von 100 nM aus einer 1-mM-Stammlösung in DMSO gefärbt. Die Merocyanin 540-positiven Zellen wurden durch einen Anstieg an roter Fluoreszenz markiert, gesammelt bei 575 ± 20 nm, 0,5 bis 2 logs über Merocyanin 540-negativen Zellen. Auf ähnliche Weise zeigten die trüben LDS-751-Zellen eine Fluoreszenzreduktion von 0,5 bis 1,5 logs relativ zu normalen Zellen, gesammelt bei 660 nm mit einem DF20-Bandpassfilter. Die Daten wurden gesammelt und analysiert unter Verwendung von CellQuest Software (Becton Dickinson).
Bei diesen Experimenten waren alle trüben LDS-751-Zellen Merocyanin 540-leuchtend, jedoch wurde eine Population von Merocyanin 540-leuchtenden Zellen detektiert, die nicht bereits LDS-751 trüb waren. Alle Merocyanin 540-leuchtenden Zellen wurden als apoptotisch identifiziert. Diese Experimente bestätigten ebenso die differentielle Zytotoxizität zwischen TOFA (< 5% Apoptose-Anstieg; keine Reduktion der Klonogenizität) verglichen mit Cerulenin (> 85% Apoptose; 70% Reduktion der Klonogenizität). Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass die hohen Malonyl-CoA-Spiegel eine Rolle bei der zytotoxischen Wirkung von FAS-Inhibitoren bei Krebszellen spielen.
Beispiel 5. Wirkung von FAS-Inhibitoren auf das Tumorzellwachstum in vivo
Um zu bestimmen, ob die Wirkungen der FAS-Inhibierung, die in vitro gesehen wurden, ebenso auf eine in-vivo-Umgebung übertragen werden können, die eine systemische Aktivität erfordert, wurde C75 gegen subkutane MCF-7-Heterotransplantate in athymischen Nacktmäusen getestet, um die Wirkungen der FA-Synthese und das Wachstum des etablierten festen Tumors zu quantifizieren. Vorangegangene Studien haben eine lokale Wirksamkeit von Cerulenin gegen ein humanes Krebsheterotransplantat gezeigt (Pizer, et al., 1996, "Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a xenograft model of ovarian cancer", Cancer Res., 56: 1189–1193), aber sie waren dahingehend limitiert, dass Cerulenin nicht in der Lage war, systemisch zu wirken. Die ähnlichen Antworten von Brustkrebszellen auf Cerulenin und C75 in vitro suggerierten, dass C75 in vivo gegen heterotransplantierte Brustkrebszellen effektiv sein könnte.
Subkutane Flankenheterotransplantate der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7 in nu/nu weiblichen Mäusen (Harlan) wurden verwendet, um die Antitumorwirkungen von C75 in vivo zu studieren. Alle Tierexperimente entsprachen den institutionellen Richtlinien für die Tierfürsorge. Alle Mäuse erhielten ein subkutanes Östrogenpellet mit einer 90-tägigen langsamen Freisetzung (Innovative Research) in die hintere Flanke 7 Tage vor der Tumorinokulation. 10⁷ MCF-7-Zellen wurden aus der Kultur in DMEM, angereichert mit 10% FBS und Insulin 10 μg/ml, heterotransplantiert.
Die Behandlung begann, wenn messbare Tumore sich etwa 10 Tage nach der Inokulation entwickelten. Elf Mäuse (unterteilt in zwei getrennte Experimente mit 5 und 6 Mäusen) wurden intraperitoneal mit wöchentlichen Dosen von C75 in einer Konzentration von 30 mg/kg in 0,1 ml RPMI behandelt. Die Dosierung basierte auf einer Einzeldosen-LD₁₀-Bestimmung von 40 mg/kg in BALB/c-Mäusen; 30 mg/kg wurden in Outbred-Nacktmäusen gut toleriert. Elf Kontrollmäuse (auf die gleiche Weise unterteilt wie die Behandlungsgruppen) erhielten RPMI allein. Das Tumorvolumen wurde mit Schublehren in drei Dimensionen gemessen. Das Experiment wurde beendet, wenn die Kontrollen einen Surrogatendpunkt erreichten.
In einem parallelen Experiment wurde eine Gruppe MCF-7-heterotransplantierter Mäuse mit C75 oder einem Vehikel in den obigen Dosen behandelt und nach 3 Stunden geopfert, um die Fettsäuresyntheseaktivität in behandelten und Kontrolltumoren zu bestimmen. Tumor- und Lebergewebe wurde ex vivo mit [U¹⁴-C]-Acetat behandelt, die Lipide wurde extrahiert und gezählt wie beschrieben (Pizer, et al., 1996).
In einem zusätzlichen Parallelexperiment wurden 6 C75-behandelte und 6 Vehikelkontrollmäuse 6 Stunden nach der Behandlung geopfert, um behandelte und Kontrolltumore histologisch zu untersuchen. Die Tumorgewebe und die normalen Gewebe wurden in neutral gepuffertem Formalin fixiert, für eine routinegemäße Histologie weiterverarbeitet, und eine Immunohistochemie wurde für FAS ausgeführt. Die Immunohistochemie für FAS wurde mit den MCF-7-Heterotransplantaten unter Verwendung eines monoklonalen Maus-FAS-Antikörpers (Alo, et al., 1996) mit einer Verdünnung von 1:2000 auf dem Dako Immunostainer unter Verwendung des LSAB2-Detektionskits ausgeführt.
Die Aktivität des biochemischen Fettsäuresynthesewegs in Geweben von heterotransplantierten Mäusen wurde durch ex vivo-Pulsmarkieren mit [U¹⁴C]-Acetat bestimmt. Die Tumorheterotransplantate hatten eine 10-fach höhere FA-Syntheseaktivität als die Leber, was den Unterschied in der Aktivität auf dem biochemischen Weg zwischen benignen und malignen Geweben unterstreicht (4A). Die FAS-Expression in dem MCF-7-Heterotransplantat entsprach dem hohen Niveau der FA-Syntheseaktivität (4B). Intraperitoneale Injektionen von C75 mit 30 mg/kg reduzierte die Fettsäuresynthese in ex vivo markierter Leber um 76% und in den MCF-7-Heterotransplantaten um 70% innerhalb von 3 Stunden (4A). Diese Veränderungen in der Fettsäuresynthese gingen dem histologischen Nachweis einer Zytotoxizität in dem Heterotransplantat voraus, was 6 Stunden nach der Behandlung offensichtlich wurde (4C und 4D). Die mit C75 behandelten Heterotransplantate zeigten eine Vielzahl von apoptotischen Körpern im gesamten Tumorgewebe, welche in Tumoren, die mit dem Vehikel behandelt wurden, nicht gesehen wurden. Eine histologische Analyse der Leber und von anderen Wirtsgeweben, folgend auf eine C75-Behandlung, ergab keinen Nachweis von irgendeiner kurzfristigen oder langfristigen Toxizität (nicht gezeigt).
Die C75-Behandlung der Heterotransplantate führt zu einer Zytotoxizität und einer Reduktion des Tumorwachstums ohne eine Verletzung von normalen Geweben. Die Tumorhistologie nach 6 Stunden, folgend auf eine 30-mg/kg-Dosis C75, zeigt eine signifikante Zytotoxizität verglichen mit einem Kontrolltumor (4C und 4D, angehängter Vorabzug). Bemerken Sie den Nachweis von apoptotischen Körpern in dem mit C75 behandelten Heterotransplantat, während die Untersuchung von Leber und anderen Organen keinen Nachweis einer Gewebeverletzung ergab (Daten nicht gezeigt). Wöchentliche intraperitoneale C75-Behandlung verzögerte das Wachstum von etablierten subkutanen MCF-7-Tumoren verglichen mit Vehikelkontrollen, was einen systemischen Antitumoreffekt zeigt (4E). Nach 32 Tagen wöchentlicher Behandlungen gab es einen mehr als achtfachen Unterschied in Bezug auf das Tumorwachstum in der Behandlungsgruppe, verglichen mit den Vehikelkontrollen. Vergleichbar mit Cerulenin war eine transienter reversibler Gewichtsverlust die einzige bemerkte Toxizität (Pizer, et al., 1996).
Die systemische pharmakologische Aktivität von C75 stellte die erste Analyse des Ergebnisses einer systemischen Behandlung mit einem FAS-Inhibitor zur Verfügung. Die signifikante Antitumorwirkung von C75 auf ein humanes Brustkrebstransplantat in der Umgebung von physiologischen Niveaus von umgebenden Fettsäuren war ähnlich zu dem in vitro-Resultat in einer mit Serum angereicherten Kultur und befand sich in Übereinstimmung mit einem zytotoxischen Mechanismus, unabhängig von einem Fettsäuremangel.
Beispiel 6. Humane Krebszellen haben hohe Steady-State-Niveaus an Malonyl-CoA in vivo.
Das Ergebnis aus Beispiel 5 suggerierte, dass die Malonyl-CoA-Akkumulation kein signifikantes Problem in normalen Geweben sein könnte, möglicherweise weil die Aktivität auf dem FA-Syntheseweg normalerweise niedrig ist, sogar in lipogenen Organen wie der Leber. Es ist von weiterem Interesse, dass, während Malonyl-CoA das vorwiegende niedermolekulargewichtige CoA-Konjugat war, das in Brustkrebszellen in diesen Experimenten detektiert wurde, andere Studien berichteten, dass vorwiegend Succinyl-Co-A und Acetyl-CoA in kultivierten Hepatozyten vorhanden waren (Corkey, 1988). Das hohe Niveau von Malonyl-CoA in den Tumorgeweben spiegelt das hohe Niveau der Fettsäuresynthese in den Tumorzellen wider, verglichen mit der Leber (Pizer, et al., 1996).
Unter Verwendung des humanen MCF7-Brustkrebstransplantationsmodells von Beispiel 5 wurden Malonyl-CoA-Spiegel in den Tumorheterotransplantaten und der Leber von demselben Tier unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen. 3 hierunter zeigt hohe Niveaus von Malonyl-CoA in der Tumorprobe verglichen mit der Leber. Zusätzlich war die Verteilung von anderen CoA-Derivaten bemerkenswert verändert. Beispielsweise hat die Leber etwa 10-fach weniger Malonyl-CoA verglichen mit dem Heterotransplantat, sie hat jedoch etwa 10-fach höhere Niveaus an Acetyl-CoA und höhere Niveaus an anderen CoA-Derivaten, insbesondere an Succinyl-CoA. Die Unterschiede zwischen den CoA-Derivatprofilen können für größere Unterschiede im Energiemetabolismus zwischen Krebszellen und Hepazozyten indikativ sein.
Beispiel 7. Inhibierung des Zellwachstums durch CPT-1-Inhibitoren
Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1 wird durch Etomoxir inhibiert (Paumen, M. B., Ishida, Y., Muramatsu, M., Yamamoto, M. und Honjo, T. Inbition of carnitine palmitoyltransferase I augments sphingolipid synthesis and palmitate-induced apoptosis., J. Biol. Chem. 272: 3324–3329, 1997; Ratheiser, K., Schneeweib, B., Waldhausl, W., Fasching, P., Korn, A., Nowotny, P., Rohac, M. und Wolf, H. P. O. Inhibition of etomoxir of carnitine palmitoyltransferase I reduces hepatic glucose production and plasma lipids in non-insulin-dependent diabetes mellitus., Metabolism. 40: 1185–1190, 1191).
7A illustriert, dass Etomoxir allein einen signifikanten wachstumsinhibierenden Effekt verursachte, größer als der von C75 nm. C75 inhibiert indirekt CPT-1 durch Erhöhen der Malonyl-CoA-Konzentration. 7B zeigt, dass die Etomoxir-Wachstumsinhibierung von MCF-7-Zellen mit C75 additiv ist. In Tafel 7A produziert Etomoxir eine dosisabhängige Wachstumsinhibierung von MCF-7-Zellen im Verlauf von 72 h, die größer als die von C75 bei 5 μg/ml ist. In Tafel 7B haben Etomoxir und C75 einen größeren wachstumsinhibierenden Effekt als beide Substanzen alleine. 5 × 10⁴ MCF-7-Zellen wurden in 24-well-Platten ausplattiert, die mit den Inhibitoren in den Konzentrationen 18 h nach dem Ausplattieren behandelt wurden, die in der Figur angegeben sind. Die Zellen werden mit Ethanol fixiert, mit Kristallviolett gefärbt, mit SDS lösbar gemacht und bei 490 ausgelesen. Wichtigerweise ist die Konzentration von Etomoxir ähnlich zu der, die bei isolierten Hepatozyten verwendet wird, um CPT-1 zu inhibieren; nichtspezifische Wirkungen wurden bei Dosen > 400 μM in vitro identifiziert (Paumen, et al., 1977). Kombiniert produzierten Etomoxir und C75 einen additiven wachstumsinhibierenden Effekt. Da Malonyl-CoA und Etomoxir beides CPT-1-Inhibitoren sind und unterschiedliche Bindeorte an CPT-1 haben, ist der potenzierende Effekt von Etomoxir und C75 nicht überraschend. Etomoxir wurde verwendet, um Diabetes in Menschen ohne signifikante Toxizität oder Gewichtsverlust zu behandeln (Ratheiser, et al., 1991). Mit dieser Geschichte kann CPT-1 ein Mittel zur Verfügung stellen, um diese Arbeit schneller in die Klinik zu befördern.
Beispiel 8. Cerulenin inhibiert die Fettsäureoxidation.
Da erhöhte Malonyl-CoA-Spiegel, die aus der FAS-Inhibierung resultieren, in humanen Brustkrebszellen zytotoxisch sind, haben wir versucht, zu bestimmen, ob die CPT-1-Inhibierung durch Malonyl-CoA ebenso eine Rolle bei dem Mechanismus des Krebszelltods spielt.
Humane MCF-7-Brustkrebszellen wurden mit Cerulenin, einem bekannten FAS-Inhibitor, behandelt, um zu bestimmen, ob Cerulenin eine verminderte Fettsäureoxidation in Dosen produziert, von denen bekannt ist, dass sie Apoptose in MCF-7-Zellen induzieren, bevor die tatsächliche Apoptose einsetzt. Die Fettsäureoxidation wurde durch Trapping und Zählen des ¹⁴CO₂, das aus der Oxidation von [¹⁴C]-Palmitat in Basen freigesetzt wird, gemessen.
1 × 10⁶ MCF-7-Zellen wurden in T-25-Flaschen dreifach ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Testverbindung (Cerulenin) wurde dann wie angezeigt hinzugefügt, verdünnt aus einer 5-mg/ml-Stammlösung in DMSO. Nach 2 Stunden wurde das Medium mit den Medikamenten entfernt, und die Zellen wurden 30 Minuten mit 1,5 ml des folgenden Puffers präinkubiert: 114 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, Glucose 11 mM. Nach der Präinkubation wurden 200 μl Assaypuffer hinzugefügt, enthaltend: 114 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, Glucose 11 mM, 2,5 mM Palmitat (enthaltend 100 μCi [1-¹⁴C]-Palmitat) gebunden an Albumin, 0,4 mM L-Carnitin, und die Zellen wurden bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Folgend auf die Inkubation wurden 400 μl Benzothoniumhydrochlorid in das Zentrum eines well hinzugefügt, um freigesetztes ¹⁴CO₂ zu sammeln. Augenblicklich wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 500 μl 7%iger Perchlorsäure zu den Zellen gestoppt. Die Flaschen mit wells wurden dann 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert, wonach das Benzothoniumhydrochlorid entfernt und das ¹⁴C gezählt wurde. Blindproben wurden durch Hinzufügen von 500 μl 7%iger Perchlorsäure zu den Zellen vor der Inkubation mit dem Probenpuffer für 2 Stunden hergestellt.
8 zeigt die Fettsäureoxidation in MCF-7-Zellen, behandelt mit Cerulenin bei den angezeigten Dosen für 2 Stunden, deutlich bevor die Apoptose in diesem System auftrat.
Cerulenin verursacht eine dosisabhängige Inhibierung der Fettsäureoxidation in MCF-7-Zellen. Bei einer Dosis von 10 μg/ml, von welcher bekannt ist, dass sie einen annährend neunfachen Anstieg der Malonyl-CoA-Konzentration und eine > 50%ige Reduktion der Fettsäuresynthese innerhalb von 2 Stunden verursacht, verursacht Cerulenin ungefähr eine 50%ige Reduktion der Fettsäureoxidation verglichen mit der Kontrolle (p = 0,0007; 2-tailed t-Test).
Beispiel 9. Inhibierung von Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1.
Cerulenin ist dafür bekannt, einen Anstieg der Malonyl-CoA-Spiegel in Zellen zu verursachen, wenn die Fettsäuresynthase (FAS) inhibiert wird, und Malonyl-CoA ist dafür bekannt, die Fettsäureoxidation aufgrund seiner Wirkung auf die Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1 (CPT-1) zu inhibieren. CPT-1 vermittelt den Transfer von langkettigen Fettsäuren in die Mitochondrien zur β-Oxidation. Sie führt eine Transveresterung von langkettigen Fettsäure-CoAs an L-Carnitin unter Herstellung von Acylcarnitin aus. Durch diese Umsetzung wird das wasserlösliche L-Carnitin organisch nach der Veresterung mit der Fettsäure löslich. Um zu testen, ob die Cerulenin-induzierte Reduktion bei der Fettsäureoxidation an dem erhöhten Malonyl-CoA-Niveau liegt oder an einer direkten Inhibierung von CPT-1 durch Cerulenin, wurde Cerulenin mit anderen inhibierenden Verbindungen in einem CPT-1-Assay in MCF-7-Zellen verglichen.
Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1 (CPT-1)-Assay: MCF-7-Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10%igem fötalem Rinderserum in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen in 6-well-Platten dreifach ausplattiert. Folgend auf eine Inkubation über Nacht bei 37°C wurde Medium entfernt und durch 700 μl eines Assaymediums ersetzt, das aus den folgenden Bestandteilen bestand: 50 mM Imidazol, 70 mM KCl, 80 mM Sucrose, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM KCN, 1 mM ATP, 0,1% fettsäurefreiem Rinderserumalbumin, 70 μM Palmitoyl-CoA, 0,25 μCi [Methyl-¹⁴C]L-Carnitin, 40 μg Digitonin mit oder ohne 20 μM Malonyl-CoA oder anderen angezeigten Inhibitoren.
Nach einer 3- oder 6-minütigen Inkubation bei 37°C wurde die Umsetzung durch die Hinzufügung von 500 μl eiskalter 4 M-Perchlorsäure gestoppt. Die Zellen wurden dann geerntet und bei 10.000 × g für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 μl eiskalter Perchlorsäure gewaschen und erneut zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 800 μl dH₂O resuspendiert und mit 150 μl Butanol extrahiert. Die Butanolphase wurde durch Flüssigszintillation gezählt und stellt das Acylcarnitinderivat dar.
9 zeigt die Wirkung von drei Verbindungen auf CPT-1: Etomoxir (ein bekannter Inhibitor von CPT-1), TOFA (dafür bekannt, dass es die Fettsäuresynthese dadurch inhibiert, dass es Acetyl-CoA-Carboxylase, ein Enzym in dem Fettsäuresyntheseweg, inhibiert) und Cerulenin.
9 zeigt, dass Cerulenin CPT-1 nicht direkt in MCF-7-Zellen inhibiert. Tatsächlich verursacht Cerulenin bei 10 μg/ml einen leichten, aber statistisch nicht signifikanten Anstieg der CPT-1-Aktivität im Vergleich zur Vehikelkontrolle. Somit ist das Absinken der Fettsäureoxidation, die durch Cerulenin induziert wird, wahrscheinlich in dem gleichzeitigen Anstieg der Malonyl-CoA-Konzentration begründet, eher als in einer direkten Wirkung von Cerulenin auf CPT-1.
Beispiel 10. Wirkung der CTP-1-Inhibierung auf das Zellwachstum.
Da Cerulenin einen Anstieg der Malonyl-CoA-Konzentration und eine abgesenkte Fettsäureoxidation verursacht, wurden Tests entworfen, um zu sehen, ob die CPT-1-Inhibierung in das Triggern von Apoptose involviert war. Zu diesem Zweck wurden MCF-7-Zellen mit Etomoxir, einem bekannten direkten Inhibitor von CPT-1, behandelt, und die Fettsäureoxidation der Zellen wurde wie in Beispiel 8 beschrieben gemessen. 10 zeigt, dass Etomoxir die Inhibierung der Fettsäureoxidation in MCF-7-Zellen verursacht.
Bei einer Dosis von 50 μg/ml ist die Fettsäureoxidation um > 50% abgesenkt, verglichen mit der Kontrolle (p = 0,012; 2-tailed t-Test). (9 zeigt, dass Etomoxir mit einer Dosis von 10 μg/ml CPT-1 direkt inhibiert, was eine 75%ige Reduktion der CPT-1-Aktivität verursacht, p = 0,023; 2-tailed t-Test.)
Zellwachstumsinhibierungsassay: Auch wenn Etomoxir ein potenter Inhibitor von CPT-1 ist, gibt es keine signifikante Wachstumsinhibierung oder Zytotoxizität, wenn MCF-7-Zellen mit Etomoxirdosen behandelt werden, von denen bekannt ist, dass sie CPT-1 und die Fettsäureoxidation inhibieren. MCF-7-Zellen wurden in 24-well- Platten in Konzentrationen von 5 × 10⁴ Zellen pro well in RPMI 1640 mit 10%igem fötalem Rinderserum (Hyclone) ausplattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurde Etomoxir aus 5-mg/ml-Stammlösungen in DMSO hinzugefügt. Die finale DMSO-Konzentration in den Kulturen war bei oder geringer als 0,2%. Nach entweder 48 oder 72 h wurde das Medium entfernt, und die wells wurden dreimal mit Hank's gepufferter Salzlösung gewaschen. Die wells wurden mit Kristallviolett gefärbt, dann getrocknet und in 10% SDS solubilisiert. 100-μl-Aliquots wurden auf eine 96-well-Platte transferiert und auf einem Molecular Dynamics Plattenleser bei 490 nm ausgelesen. Die Daten sind als Absorptionseinheiten mit Fehlerbalken angegeben, die einen mittleren Standardfehler zeigen. Die Statistik und die graphische Auftragung wurden in Prism 2,0 (Graph Pad) ausgeführt.
11 zeigt die Wirkung von Etomoxir auf die Wachstumsinhibierung in MCF-7-Zellen.
Nur die 200-μg/ml-Dosis verursachte eine signifikante Wachstumsreduktion (p = 0,006, 2-tailed t-Test). Somit ist die CPT-1-Inhibierung allein für humane Brustkrebszellen signifikant wachstumsinhibierend.
Während der Ceruleninbehandlung wird jedoch CPT-1 inhibiert, und die Fettsäureoxidation wird während der Fettsäuresyntheseinhibierung reduziert; dies ist eine nichtphysiologische Antwort. Physiologisch sinken die Malonyl-CoA-Spiegel, wenn die Fettsäuresynthese reduziert wird, was die Inhibierung von CPT-1 löst, was einen Anstieg der Fettsäureoxidation verursacht. Somit ist es möglich, dass die CPT-1-Inhibierung ebenso die Zytotoxizität in der Umgebung der Fettsäuresyntheseinhibierung induziert.
Beispiel 11. Zytotoxische Wirkung der CPT-1-Inhibierung und der Fettsäuresyntheseinhibierung in Kombination
TOFA ist ein Inhibitor der Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC), dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym in der Fettsäuresynthese. Die Inhibierung von ACC durch TOFA verursacht eine Reduktion der Malonyl-CoA-Konzentration und eine anschließende Inhibierung der Fettsäuresynthese. Während sowohl TOFA als auch Cerulenin die Inhibierung der Fettsäuresynthese verursachen, inhibiert Cerulenin FAS, was zu einem Anstieg der Malonyl-CoA-Konzentration führt, während TOFA ACC inhibiert, welches ein Absinken der Malonyl-CoA-Konzentration verursacht.
In diesem Beispiel wurden Zellen mit TOFA behandelt, um die Fettsäuresynthese zu inhibieren, und mit Etomoxir, um die Fettsäureoxidation zu inhibieren. Die Wirkung dieser kombinierten Inhibierung auf die Zytotoxizität wurde in einem klonogenen Assay gemessen.
Klonogener Assay: Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden 1 × 10⁶ MCF-7-Zellen für 6 h gegenüber Medikamenten ausgesetzt wie angezeigt, gewaschen und durch Trypsinverdau gelöst, gezählt und dreifach in einer Konzentration von 1000 oder 500 Zellen/60-mm-Platte ausplattiert. Die Kolonien wurden mit Kristallviolett gefärbt und 4–6 Tage nach dem Plattieren ausgezählt. Die Kontrollen bestanden aus Zellen, die mit DMSO ohne Medikamente inkubiert wurden. Die Fehlerbalken stellen den mittleren Standardfehler dar.
12 zeigt einen klonogenen Assay mit MCF-7-Zellen, die sowohl mit Etomoxir als auch mit TOFA behandelt wurden.
Die Behandlung der Zellen mit TOFA in einer Konzentration von 5 μg/ml ist nicht signifikant zytotoxisch; dies ist ähnlich zu unseren bereits publizierten Studien (ref). 9 zeigt ebenso, dass TOFA keine CPT-1-Inhibierung verursacht, und TOFA verursacht ebenso keine signifikanten Veränderungen bei der Fettsäureoxidation (Daten nicht gezeigt). Die Etomoxirbehandlung ist ebenfalls nicht signifikant zytotoxisch, was die Wachstumsinhibierungsstudien in 11 komplementiert. Jedoch ist die Kombination von TOFA und Etomoxir signifikant zytotoxischer als TOFA allein (p = 0,004, 2-tailed t-Test) oder Etomoxir allein (p = 0,002, 2-tailed t-Test).
Diese Daten zeigen, dass die CPT-1-Inhibierung für Krebszellen während der Fettsäuresyntheseinhibierung toxisch ist. Daher könnten CPT-1-Inhibitoren gemeinsam mit Fettsäuresyntheseinhibitoren verwendet werden, um die Antitumorantwort zu erhöhen.
Beispiel 12. Additive Effekte eines Fettsäuresynthaseinhibitors und eines CPT-1-Inhibitors auf die Zytotoxizität.
Bei Wachstumsinhibierungsassays unter Verwendung des Verfahrens, das in Beispiel C beschrieben ist, wurden MCF-7-Zellen mit C75, einem FAS-Inhibitor allein oder mit Etomoxir behandelt und 48 Stunden nach der Behandlung analysiert. Sowohl Etomoxir als auch C75 verursachten eine signifikante Wachstumsinhibierung gegenüber der Kontrolle (p = 0,0001, p = 0,005, 2-tailed t-Test). 13 hierunter zeigt, dass Etomoxir ebenso die zytotoxische Wirkung der FAS-Inhibierung verstärken kann.
Die Kombination von Etomoxir und C75 verursachte eine signifikantere Wachstumsinhibierung als Etomoxir allein (p = 0,004, 2-tailed t-Test) und einen starken Trend in Richtung einer erhöhten Wachstumsinhibierung verglichen mit C75 allein (p = 0,054, 2-tailed t-Test). Diese Daten suggerieren, dass die CPT-1-Inhibierung ebenso die Antitumorwirkung von FAS-Inhibitoren verstärken könnte.
Zum Zwecke der Klarheit beim Verständnis wurde die vorangehende Erfindung etwas detaillierter mittels Illustration und durch Beispiele gemeinsam mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben, auch wenn andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen Fachleuten offensichtlich sein werden, an welche sich die Erfindung wendet. Die vorangegangene Beschreibung und die Beispiele sind dafür vorgesehen, den Umfang der Erfindung zu illustrieren, nicht aber, um ihn zu limitieren. Modifikationen an den oben beschriebenen Modi zum Ausführen der Erfindung, die Fachleuten auf dem Gebiet der Medizin, der Biochemie, der Pharmakologie und/oder auf verwandten Gebieten offensichtlich sind, sind durch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung mit umfasst, der nur durch die angehängten Ansprüche limitiert ist.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, sind indikativ für das Niveau des Fachmanns, an den sich die Erfindung wendet.

Claims

Verwendung eines einen Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA in Tumorzellen eines Organismus verursachenden MCD-Inhibitors (Malonyl-CoA-Decarboxylase) zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen im Organismus.
Verwendung einer einen Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA in Tumorzellen eines Organismus verursachenden Zusammensetzung, wobei dieser Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA einer verstärkten Synthese von Malonyl-CoA entspricht, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen im Organismus.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA einer erhöhten intrazellulären Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) entspricht.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Zusammensetzung ein Mittel umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Aktivator der ACC, einem Inhibitor der 5'-AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) und/oder einem Inhibitor der Acyl-CoA-Synthase.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA in den Zellen des Organismus plötzlich auftritt.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA vor irgendeiner signifikanten Zunahme der Verbrauchsgeschwindigkeit von Malonyl-CoA erhöht.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA in den Zellen des Organismus innerhalb von 3 Stunden während der Verabreichung auftritt.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA vor der Inhibierung des Wachstums der Zellen auftritt.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA einem abnehmenden Verbrauch von Malonyl-CoA entspricht.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA einer verminderten intrazellulären Aktivität der Fettsäuresynthase entspricht.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Organismus ein zweites chemotherapeutisches Mittel verabreicht wird, das die Fettsäuresynthese nicht inhibiert.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Behandlung von Tumorzellen eingesetzt wird, in denen die Menge an intrazellulärem Malonyl-CoA vor der Verabreichung der Zusammensetzung wenigstens zweimal höher als die normale Menge an Malonyl-CoA in nicht malignen Zellen ist.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die intrazelluläre Menge an Malonyl-CoA nach der Verabreichung des Medikaments erhöht ist und die intrazellulären Mengen an Acetyl-CoA und freiem CoA, bezogen auf die Mengen vor der Behandlung, reduziert sind.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Behandlung von Tumorzellen eingesetzt wird, wobei die Geschwindigkeit der Fettsäuresynthese in einigen dieser Zellen wenigstens zweimal höher als die normale Geschwindigkeit vor Verabreichung der Zusammensetzung ist, und die Verabreichung der Zusammensetzung für die Zellen zytotoxisch ist.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Behandlung von Tumorzellen eingesetzt wird und der Organismus Tumorzellen mit erhöhter Geschwindigkeit der Fettsäuresynthese umfasst und die Anzahl dieser Tumorzellen nach der Verabreichung des Medikaments reduziert wird.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ferner einen Inhibitor der Carnitin-Palmitoyl-Transferase (CPT-1) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der CPT-1-Inhibitor Etomoxir ist.
Verwendung a) eines Inhibitors der Fettsäuresynthese in Tumorzellen eines Organismus; und b) eines Inhibitors der Fettsäureoxidation in diesen Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen im Organismus.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei der Inhibitor der Fettsäureoxidation in einer Menge verabreicht wird, die CPT-2 nicht signifikant inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei der Inhibitor der Fettsäuresynthese und der Inhibitor der Fettsäureoxidation in Mengen verabreicht werden, mit denen sich ähnliche Ausmaße ihrer jeweiligen Inhibierungen erreichen lassen, wie mit denjenigen, die sich bei zytotoxischen Dosierungen von Cerulenin beobachten lassen.
Screeningverfahren zur Unterstützung des Nachweisens von für Tumorzellen selektiv zytotoxisch wirkenden Zusammensetzungen, umfassend das Verabreichen einer Zielzusammensetzung an eine Zelle mit erhöhter Menge an intrazellulärem Malonyl-CoA, das Monitoring von intrazellulärem Malonyl-CoA in der Zelle nach der Verabreichung und das Vergleichen des Musters von Änderungen der Menge an intrazellulärem Malonyl-CoA, wobei ein plötzlicher Anstieg von intrazellulärem Malonyl-CoA auf eine selektive Toxizität schließen lässt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Änderungen der Menge an intrazellulärem Malonyl-CoA in An- und Abwesenheit von 5-(Tetradecyloxy)-2-furoesäure (TOFA) gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Zelle aus einer Tumorzelllinie stammt und wobei das Monitoring der CPT-1-Aktivität in der Zelle nach der Verabreichung durchgeführt wird, wobei ein Abfall der CPT-1-Aktivität auf ein für das Wachstum inhibitorisches Potential schließen lässt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Zelle permeabilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, ferner umfassend das Monitoring der Zelle auf Apoptose.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Monitoring auf Apoptose ein Verfahren umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Messen des mitochondrialen Transmembranpotentials, Färben mit Vitalfarbstoffen, Monitoring der Caspase-Aktivierung in ganzen Zellen mit Western Blot und Messen des in den Mitochondrien entstandenen Cytochroms C mit Western Blot.
Produkt zur Verabreichung an einen Organismus mit Tumorzellen, wobei das Produkt enthält: a) einen Inhibitor der Fettsäuresynthese; und b) einen Inhibitor der Fettsäureoxidation zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen im Organismus.