DE69816493T2

DE69816493T2 - Extrakt aus entzündetem Gewebe als Inhibitor der Stickstoffmonoxid-Produktion

Info

Publication number: DE69816493T2
Application number: DE69816493T
Authority: DE
Inventors: Kousaku Yashiro-cho Ohno; Jin-emon Yashiro-cho Konishi; Seishi Yashiro-cho Suehiro
Original assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-01-08
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2018-01-09
Also published as: EP0852950A1; EP0852950B1; JPH10194978A; CA2226478A1; DE69816493D1; KR100516827B1; CN1155406C; TW542720B; JP4033936B2; ATE245426T1; US6051613A; KR19980070290A; CN1187369A; ES2202665T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue pharmazeutische Wirkung eines Extrakts aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde. Genauer betrifft sie die Verwendung zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels, wie einem Suppressor der Stickstoffmonoxid-Produktion, die Verwendung zur Herstellung eines therapeutischen Mittels bei Sepsis, die Verwendung zur Herstellung als ein Antiendotoxinmittel und die Verwendung zur Herstellung eines therapeutischen Mittels bei Endotoxinschock, enthaltend den Extrakt aus entzündetem Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, als wirksame Komponente.
Stand der Technik
Es ist bekannt, dass der lebende Körper gegen eine Invasion durch Viren usw. von Außen und gegen das Fortschreiten von inneren Erkrankungszuständen verschiedene biofunktionsregulierende Substanzen zur Aufrechterhaltung der Hämostase und zur Regulierung und Normalisierung der Biofunktionen herstellt, durch zwei Phasen, bestehend aus einer Unterdrückung der überschießenden Reaktionen und einer verstärkenden Wirkung bei der Unterdrückung von Funktionen. Es gibt z. B. verschiedene Berichte über biofunktionsregulierende Substanzen, die in mit Vacciniavirus angeimpften Gewebe hergestellt werden, Verfahren zur Extraktion dieser Substanzen aus den kranken Geweben und deren pharmakologische Wirkungen (siehe z. B. geprüfte Japanische Patentveröffentlichungen Sho-63/039,572 B, Sho-63/025,600 B und Hei-03/043,279 B).
Als ein z. Zt. erhältliches Arzneimittel gibt es eine Arzneimittelpräparation eines Extrakts aus entzündeter Kaninchenhaut, die mit Vacciniavirus geimpft wurde. Wie auf Seite 1.434 von "Drugs in Japan, Ethical Drugs" (veröffentlicht im August 1994; herausgegeben von Japan Pharmaceutical Information Center; veröffentlicht von Yakugyo Jiho Co., Ltd.) angemerkt, ist diese Präparation ein Arzneimittel, das wirksame Substanzen enthält, die keine Proteine sind, extrahiert und isoliert aus entzündetem Gewebe von Kaninchen, die mit Vacciniavirus angeimpft wurden, diese wurden zugelassen zur Verwendung gegen Schmerzen im unteren Rücken, Nacken-Schulter-Arm-Syndrome, Periarthritis scapulohumeralis, Osteoarthritis, symptomatische Neuralgie, Juckreiz, verbunden mit Hautstörungen (wie Ekzeme, Dermatitis und Urticaria), allergische Rhenititis, Folgen von subakuter Myelo-Optico-Neuropathie (wie Kälte, Schmerz und Parästhesie/Dysesthäsie) usw., diese wurden als verschreibungspflichtiges Arzneimittel in Form von Injektionen (subkutan, intramuskulär und intravenös) und als Tabletten anerkannt und sind kommerziell erhältlich.
Wie oben erwähnt ist es bekannt, dass ein Extrakt aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus geimpft wurde, verschiedene pharmakologische Wirkungen hat, wie eine analgetische Wirkung, seditative Wirkung, antiallergische Wirkung und eine Wirkung der Verbesserung der peripheren Zirkulation. Es gibt allerdings keinen Bericht über die neuen pharmazeutischen Wirkungen gemäß der vorliegenden Erfindung, wie einer unterdrückenden Wirkung der Stickstoffmonoxid-Herstellung, eine therapeutische Wirkung bei Sepsis, einer Antiendotoxinwirkung, einer therapeutischen Wirkung bei Endotoxinschock usw.
Durch die Erfindung zu lösende Probleme
Bei Sepsis und anderen schweren bakteriellen Infektionserkrankungen wird Endotoxin (ein intrazelluläres Toxin) hergestellt und als Ergebnis hiervon finden Schocksymptome statt. Endotoxin zeigt eine Vielzahl von Wirkungen auf den lebenden Organismus, wie Fieber, Leukozytose, Aktivierung des Komplements und des Kininsystems, Induktion von disseminierter intravaskulärer Coagulopathie (DIC) und Suppression des Knochenmarks. Wenn das Schocksyndrom durch Endotoxin fortschreitet, werden eine überschießende Hypotension, eine Verringerung des Herzausstoßes, kleine urinäre Exkretion, eine Störung des Bewusstseins usw. induziert, dadurch gerät der Körper in einen bedrohlichen Zustand. Es wurde angenommen, dass die schnelle Hypotension nach Endotoxinschock in überschüssigem Stickstoffmonoxid, das unnatürlich durch die Wirkung von Endotoxin auf vaskuläre Endothelzellen hergestellt wird, begründet ist und es wurden Untersuchungen zu Inhibitoren der Stickstoffmonoxid synthetisierenden Enzyme, wie Algininderivate mit dem Ziel des Erhaltens von therapeutischen Mitteln gegen Hypotension nach Endotoxinschock, gemacht.
Die Erfinder haben verschiedene Tests und Studien auf die pharmazeutische Wirkung eines Extrakts aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, gemacht und haben als Ergebnis gefunden, dass dieser Extrakt eine supprimierende Wirkung auf den Zelltod und auf eine überschüssige Produktion von Stickstoffmonoxid, die durch Endotoxin induziert wurde, aufzeigt und ebenfalls eine verbessernde Wirkung auf Endo toxin-induzierte Hypotension zeigt, so wurde die vorliegende Erfindung erzielt.
Mittel zur Lösung der Probleme
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend ein Extrakt aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus geimpft wurde, wie die Verwendung zur Herstellung eines Suppressors der Stickstoffmonoxid-Produktion, eines therapeutischen Mittels gegen Sepsis, eines Antiendotoxinmittels und eines therapeutischen Mittels gegen Endotoxinschock.
Ausführungsformen der Erfindung
Die wirksame Komponente der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist eine biofunktionsregulierende Substanz, die kein Protein ist, extrahiert aus Entzündungsgeweben, die mit Vacciniavirus angeimpft wurden. Eine Arzneimittelpräparation eines Extrakts aus entzündeter Kaninchenhaut, die mit Vacciniavirus angeimpft wurde, wie sie in den obengenannten "Drugs in Japan, Ethical Drugs" grnsnnz wird, ist als pharmazeutisches Mittel anerkannt und in Japan auf dem Markt erhältlich sind. Weiterhin können verschiedene Extrakte aus entzündetem Gewebe, die mit Vacciniavirus verwendet werden, wie in verschiedenen Referenzen, wie den obengenannten Patentveröffentlichungen genannt, ausgeführt, als wirksame erfindungsgemäße Substanz verwendet werden und ihre Herstellungsverfahren und bevorzugten Dosen sind in den genannten Referenzen ebenfalls dargestellt.
Im Hinblick auf den Verabreichungsweg beim Patienten wurden subkutane, intramuskuläre und intravenöse Verabreichungen durch Injektion und orale Verabreichung durch Tabeletten bei dem kommerziell erhältlichen Mittel zugelassen, es ist aber auch möglich, andere als die obengenannten pharmazeutischen Dosisformen zu verabreichen, die optimal für die Therapie in Abhängigkeit der Erkrankungsart sind. Die Dosis wird entsprechend ausgewählt in Abhängigkeit von dem Extrakt aus entzündlichem Gewebe, angeimpft mit Vacciniavirus, die zugelassene Dosis bei der kommerziell erhältlichen Präparation gemäß dem obigen "Drugs in Japan, Ethical Drugs" (Seite 1,434) ist grundsätzlich 16 Neurotropineinheiten pro Tag und 3,6 bis 7,2 Neurotropineinheiten pro Tag bei oraler Verabreichung bzw. bei Injektion. Die Dosis kann aber entsprechend erhöht oder erniedrigt werden in Abhängigkeit von der Erkrankungsart, der Schwere der Erkrankung, den individuellen Unterschieden bei den Patienten, dem Verabreichungsverfahren, dem Verabreichungszeitraum usw.
Im folgenden sind die Ergebnisse von pharmakologischen Tests betreffend die neue pharmakologische Wirkung eines Extraks aus entzündetem Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, dargestellt.
(1) Zellschützende Wirkung
Endotoxin (Lipopolysaccharid: LPS) in verschiedenen Konzentrationen wurden zu 2 × 10⁴ humane Nabelschnur-Endothelzellen, die auf eine 3,5 cm Inkubationsplatte aufgebracht werden und auf die die Endothelzellen ausgesät waren, zugegeben. Sieben Tage nach aussäen wurde die Zellzahl mit Hilfe eines Hämozytometers gemessen und eine Messung, ob die Zellen tot oder lebend waren wurde mit einer Trypan-Blau-Färbung durchgeführt. Die erfindungsgemäße Substanz wurde mit zu dem System gegeben und die Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf den Tod der Endothelzellen durch LPS wurde untersucht. Ein Beispiel dieser Ergebnisse ist in 1 gezeigt.
Wie in der 1 gezeigt, schädigt LPS in einer Konzentration von größer als 0,1 μg/ml die Endothelzellen in einer dosisabhängigen Weise, dies führt zu dem Tod der Zellen. Gegen solch einen LPS-induzierten Zelltod zeigte die erfindungsgemäße Substanz, hergestellt durch ein Herstellungsverfahren, wie es im Beispiel 1 der Japanischen geprüften Patentveröffentlichung Sho-63/039,572 B dargestellt ist, eine hervorragende zellschützende Wirkung, wobei die Überlebensrate der Zellen signifikant verbessert war.
(2) Hemmende Wirkung gegenüber Stickstoffmonoxid-Produktion
Menschliche Nebelschnur-Endothelzellen (2 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) wurden in 96 Loch-Multi-Platten in 200 ml Kulturmedium kultiviert, bis die Zellen konfluent waren. Anschließend wurde das Medium entfernt, frisches Medium mit LPS (0,001 bis 100 mg/ml) und die obengenannte erfindungsgemäße Substanz wurden hinzugegeben und nach 24 Stunden wurde die Menge an hergestelltem Stickstoffmonoxid mit Hilfe einer Farbentwicklungsanalyse mit dem Griessreagenz gemessen. 100 ml der inkubierten Zellen wurden aus jeder inkubierten Vertiefung gesammelt und 100 ml Griessreagenz (eine 2%ige Phosphorsäurelösung, enthaltend 1% Sulfanilamid und 0,1 N-1-Naphthylethylendiamindihydrochlorid) wurden hinzugegeben, die Mischung wurde bei 25°C über 10 Minuten inkubiert und die Absorbtion (optische Dichte: 540 nm) wurde gemessen. Eine wässrige Lösung von Natriumnitrit wurde als Standardlösung für die Untersuchung der hemmenden Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf die Stickstoffmonoxidherstellung verwendet und ein Beispiel davon ist in 2 gezeigt.
Als eine der Wirkungsmechanismen der zellschützenden Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf die LPS-induzierte Zellschädigung wurde eine hemmende Wirkung auf die Stickstoffmonoxidproduktion durch LPS untersucht. Wie in der 2 gezeigt, nimmt die Produktion von Stickstoffmonoxid in Anwesenheit von LPS bei höheren Dosen als 0,1 μg/ml signifikant zu und die erfindungsgemäße Substanz zeigt unzweifelhaft eine hemmende Wirkung auf diese durch LPS induzierte Stickstoffmonoxid-Produktion. Weiterhin zeigt die erfindungsgemäße Substanz (die gleichzeitig mit der Verabreichung von LPS verabreicht wurde) eine unterdrückende Wirkung auf die Zunahme einer NADPH-Diaphorase-positiven Substanz und einer induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase in Lunge, Leber und Niere von LPS-behandelten Mäusen. Entsprechend wird hier angenommen, dass die hemmende Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf die Stickstoffmonoxid-Produktion begründet ist in der Hemmung der Expression der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase.
(3) Unterdrückende Wirkung auf die LPS-induzierte lethale Toxizität
Eine Lösung der erfindungsgemäßen Substanz oder eine physiologische Salzlösung, gepuffert mit Phosphat wurde intraperitoneal männlichen DDY-Mäusen (25 bis 30 g) zusammen mit LPS (0,75 mg/Maus) injiziert. Nach der ersten Injektion wurde eine Lösung der erfindungsgemäßen Substanz (40 Einheiten/kg) oder einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (Kontrolle) alle 12 Stunden für 5 Tage injiziert. Die Sterblichkeit der Mäuse wurde zweimal am Tag für über 5 Tage aufgezeichnet. Ein Beispiel für ein Ergebnis ist in der 3 gezeigt.
Wie in der 3 gezeigt, ist die Überlebensrate der Mäuse, denen LPS injiziert wurde, über die Zeit verschlechtert, während in der Gruppe, in die die erfindungsgemäße Substanz (eine Arzneipräparation eines Extrakts aus entzündeter Kaninchenhaut, die mit Vacciniavirus angeimpft wurde; Handelsname: Neurotropin), eine signifikant unterdrückende Wirkung auf die LPS-induzierte lethale Toxizität zu erkennen ist. Somit wurde, wie bei dem Test der inkubierten Endothelzellinie, dargestellt in 1, die unterdrückende Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf LPS-induzierte lethale Toxizität bestätigt.
(4) Verbesserte Wirkung auf LPS-induzierte Hypotension
Männliche Fischer-Ratten (230 bis 250 g) wurden mit intraperitonealer Injektion von Pentobarbital (40 mg/kg) narkotisiert und Katheter wurden in die Arterie zur Messung des Blutdrucks und des Herzschlags eingeführt und ebenfalls zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz. Nachdem der Blutdruck und der Herzschlag stabilisiert wurden, wurde die erfindungsgemäße Substanz (60 mg/kg) oder eine physiologische Salzlösung (Kontrolle) intravenös injiziert. Nach 30 Minuten wurde LPS (15 mg/kg) injiziert und der Blutdruck wurde alle 10 Minuten über 3 Stunden gemessen.
Der durchschnittliche aterielle Blutdruck der LPS ausgesetzten Ratten nahm ca. 10 Minuten nach Verabreichung von LPS ab und nach nach 1,5 bis 2,5 Stunden wurde eine Abnahme von ca. 20% festgestellt. Andererseits fand bei der Gruppe, denen eine Arzneipräparation eines Extrakts aus entzündeter Kaninchenhaut, geimpft mit Vacciniavirus, injiziert wurde, keine Hypotension statt, vielmehr wurde eine leichte Hypertension beobachtet (ca. 5%).
Vorzug der Erfindung
Es ist von den obigen Ergebnissen der pharmakologischen Tests klar, dass ein Extrakt aus entzündetem Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde und eine Komponente einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist, eine hervorragende schützende Wirkung gegenüber dem Zelltod oder dem Tod von Tieren, induziert durch Endotoxin (Lipopolysaccharid: LPS) aufzeigt und es zeigt ebenfalls eine sichtbare hemmende Wirkung gegenüber einer überschüssigen Produktion von Stickstoffmonoxid, induziert durch Endotoxin. Es wurde bereits vorgeschlagen, dass eine plötzliche Hypotension nach Endotoxinschock begründet ist in einer überschüssigen Produktion von Stickstoffmonoxid der vaskulären Endothelzellen, induziert durch Endotoxin und in den oben gezeigten pharmakologischen Tests bei der LPS-induzierten Hypotension zeigte die erfindungsgemäße Substanz, die eine hemmende Wirkung auf die Stickstoffmonoxid-Produktion hat, eine bevorzugte Wirkung zur Aufrechterhaltung des normalen Blutdrucks gegenüber der Hypotension nach Verabreichung von LPS. In den obengenannten pharmakologischen Tests (betreffend die unterdrückende Wirkung des Endotoxinzelltodes, der hemmenden Wirkung der Stickstoffmonoxid-Produktion und der verbessernden Wirkung der LPS-induzierten Hypotension) ist ein Beispiel dieser Testergebnisse beispielhaft dargestellt und solche Wirkungen wurden nicht nur durch das kommerziell erhältliche Extrakt aus entzündetem Kaninchengewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, gefunden, sondern auch von den Extrakten, wie sie in den Beispielen der Japanischen geprüften Patentveröffentlichung (JP) Sho-63/039,572 B genannt sind, durch die Extrakte, die in den Beispielen von JP Sho-63/025,600 B gezeigt sind und durch die Extrakte, genannt in den Beispielen von JP Hei-03/043,279 B, genauso wie durch verschiedene Extrakte aus entzündetem Gewebe, die mit Vacciniavirus angeimpft wurden.
Bei Sepsis und anderen schweren bakteriellen Infektionserkrankungen wird Endotoxin (ein intrazelluläres Toxin) hergestellt und ein Schocksymptom wird durch dessen Wirkung induziert. Entsprechend ist die erfindungs gemäße Substanz mit einer hervorragenden hemmenden Wirkung der Endotoxin-induzierten Toxizität, wie oben dargestellt, sehr nützlich für die Behandlung oder Vorbeugung von Endotoxin-induziertem Schocksymptom, Sepsis und verschiedenen, diese begleitenden Symptome. Weiterhin hat die erfindungsgemäße Substanz eine hemmende Wirkung auf unnormale Stickstoffmonoxid-Produktion während des Erkrankungszustandes und ist daher ebenfalls sehr nützlich als ein therapeutisches und vorbeugendes Mittel bei Erkrankungen, wo eine überschüssige Stickstoffmonoxid-Produktion vorkommt, wie akuter Hypotension.
Beispiele
Ein Extrakt aus entzündetem Gewebe, z. B. Hautgewebe, insbesondere Hautgewebe von Säugetieren, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, das eine wirksame Komponente der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist, kann in verschiedene pharmazeutische Zusammensetzungen verarbeitet werden durch eine geeignete Kombination mit verschiedenen pharmazeutischen Trägern oder Verdünnern durch herkömmliche Mittel, wobei feste, halbfeste, flüssige oder Aerosolpräparationen zur oralen oder parenteralen Verwendung in der Formulierung erhalten werden, die erfindungsgemäße Substanz kann alleine oder zusammen mit anderen pharmazeutisch aktiven Komponenten verwendet werden.
Im Falle von Injektionen ist es möglich, die Lösungen oder Suspensionen in wässrigen oder nicht wässrigen Lösungsmitteln, wie destilliertem Wasser zur Injektion, physiologischer Salzlösung, Ringer's Lösung, Pflanzenöl, synthetischen Fettsäureglyceriden, höheren Fettsäureestern, Propylenglycol, usw. herzustellen.
Im Falle von Präparationen zur oralen Verabreichung wird die erfindungsgemäße Verbindung wie sie ist oder zusammen mit herkömmlich verwendeten Exzipienten, wie geeigneten Zusatzmitteln (z. B. Lactose, Mannitol, Maisstärke, Kartoffelstärke, usw.) mit Bindemitteln, wie kristalliner Cellulose, Cellulose, Gummi arabicum, Maisstärke, Gelatine usw., zersetzenden Mitteln, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Kaliumcarboxymethylcellulose usw., Schmiermitteln, wie Talcum, Magnesiumstearat usw. und anderen, einschließlich Füllmitteln, Feuchtigkeitsmitteln, Puffern, Konservierungsmitteln, Duftmitteln und dergleichen vermischt, um Tabletten, verdünnte Pulver, Körnchen oder Kapseln zu ergeben.
Es ist ebenfalls möglich, in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung, pharmazeutische Präparationen herzustellen, die anders sind als die oben genannten und die für die Therapie geeignet sind wie z. B. Zäpfchen, Inhalationen, Aerosol-Präparationen, Collyriums, Salben, Umschläge usw.
Kurze Beschreibung der Abbildungen:
1 zeigt die hemmende Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz gegenüber dem Zelltod von Endothelzellen, verursacht durch LPS.
2 zeigt die hemmende Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf eine überschüssige Produktion von Stickstoffmonoxid, hervorgerufen durch LPS.
3 zeigt die hemmende Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf die durch Verabreichung von LPS hervorgerufene lethale Toxizität bei Mäusen.

Claims

Verwendung eines Extrakts aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, als wirksame Komponente zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Unterdrückung der Produktion von Stickstoffmonoxid, die durch Endotoxin induziert wird.
Verwendung eines Extrakts aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, als wirksame Komponente zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung die als Antiendotoxinmittel wirksam ist.
Verwendung eines Extrakts aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, als wirksame Komponente zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Sepsis.
Verwendung eines Extrakts aus einem entzündeten Gewebe, das mit Vacciniavirus angeimpft wurde, als wirksame Komponente zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Endotoxinschocks.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das entzündete Gewebe ein Hautgewebe ist.
Verwendung gemäss Anspruch 5, wobei das entzündete Gewebe ein Hautgewebe von Säugern ist.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Injektion formuliert ist.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung formuliert ist.