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Gegenstand
der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Decursin zur Herstellung eines
Arzneimittels für
die Behandlung von Nephrotoxizität.
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Hintergrund
der Erfindung
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Da
eine große
Anzahl der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Vorbeugung
oder zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden,
eine Anzahl von Nebenwirkungen einschließlich Nephrotoxizität (d. h.
toxisch auf die Niere wirkend) aufweisen, sollte hinsichtlich des
klinischen Einsatzes gebührende
Sorgfalt verwendet werden. Insbesondere ist der klinische Einsatz
antineoplastischer oder antibiotischer Zusammensetzungen aufgrund
ihres schwerwiegendes Nebenwirkungsprofil einschließlich Nephrotoxizität stark
eingeschränkt.
Cisplatin beispielsweise ist ein Antineoplastikum, das bei der Behandlung
einer Anzahl von Tumoren in den Hoden, in der Speiseröhre, in
Magen, Blase, Prostata, Lunge, Gebärmutterhals, und beim Osteosarkom,
insbesondere bei Tumoren im Genitalbereich, eingesetzt wird. Jedoch
liegen Berichte über seine
schwerwiegenden Nebenwirkungen auf Nieren, Ohren, Gastrointestinalbereich,
Knochenmark sowie das Auftreten von Allergien vor. Eine dieser Nebenwirkungen,
die Nephrotoxizität,
kann bei Langzeitanwendung von hochdosiertem Cisplatin bis zu Nierenversagen
führen,
was den klinischen Einsatz von Cisplatin weitgehend einschränkt. Von
klinischer Bedeutung ist demzufolge die Verminderung der Auswirkungen
des Einsatzes von Cisplatin bei der Behandlung verschiedener Krebsarten
auf das Knochenmark, den Gastrointestinalbereich und vor allem auf
die Nieren.
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Die
Verminderung der Cisplatin-assoziierten Nephrotoxizität ist eingehend
untersucht worden. Es kommen die herkömmlichen Verfahren zur Verminderung
der Nephrotoxizität
zum Einsatz: Ein Verfahren besteht in der Herstellung von Platinderivaten
mit einer gegenüber
Cisplatin reduzierten Toxizität;
ein Beispiel hiervon ist Carboplatin. Jedoch ist seine Knochenmarktoxizität außerordentlich
stark, wenn auch seine Nephrotoxizität weniger stark ausgeprägt ist als
bei Cisplatin. Ein anderes Verfahren zur Verminderung der Toxizität besteht
in der Beschleunigung der Ausscheidung des Arzneimittels. Zu diesem
Zweck wird gleichzeitig Mannit oder hypertonische Salzlösung verwendet.
Jedoch kann dieses Verfahren die Halbwertzeit des Cisplatins und
damit auch seine antineoplastische Wirkung verringern. Ein drittes
Verfahren besteht in der gemeinsamen Gabe eines Antineoplastikums
mit einem Antidot mittels Zweiweg-Chemotherapie, um so die Toxizität des Cisplatins
zu verringern. Zu diesem Zweck werden Bismutsubnitrat oder Selen
gleichzeitig eingesetzt. Dieses Verfahren kann jedoch unerwünschte Nebenwirkungen
wie beispielsweise eine Ansammlung von Schwermetallen im Körper hervorrufen.
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Nun
werden alle gesunde Zellen im Körper
in gewissem Maße
mittels Proliferation gebildet, der sich notwendigerweise eine Differenzierung
anschließt.
Man nimmt an, dass eine solche Proliferation und Differenzierung
auf der genetischen Ebene gesteuert wird. Im Gegensatz zu gesunden
Zellen bestehen Krebszellen aus unreifen Zellen, die ohne Differenzierung
proliferieren, ungeachtet der Tatsache, dass diese Zellen aus gesundem
Gewebe stammen. Daher unterscheiden sich Krebszellen von gesunden
Zellen hinsichtlich Stoffwechsel, Enzymmuster und der Zelloberflächenstruktur
(Raymond W. Ruddon, Cancer: A disease of abnormal differentiation,
Cancer Biology, 2. Auflage: 69, 1987).
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Über den
Entstehungsmechanismus dieser undifferenzierten Krebszellen liegen
noch keinerlei Darstellungen vor. Die Hauptdebatte über die
Entstehung von Krebszellen wird mit dem Schwerpunkt geführt, ob nun
die reifen Zellen nach der Differenzierung ihre Fähigkeit
zur Differenzierung verlieren, oder ob nicht-differenzierte Zellen ihre Fähigkeit
zur Differenzierung verlieren. Nach bisherigem vorliegenden Erkenntnisstand
ist bekannt, dass die Transformation zu Krebszellen nur in gesunden,
proliferationsfähigen
Zellen auftritt; bei der Differenzierung von Zellen ist die kurzfristige
Differenzierung entlang eines vorprogrammierten Mechanismus unumkehrbar,
die endgültige
Differenzierung selbst ist umkehrbar (D. Yaffe, Cellular aspect
of muscle differentiation in vitro. Current Topics in Developmental
Biology, 4: 39, 1969).
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Pierce
et al. berichteten, dass gesunde Gewebsstammzellen mit der Fähigkeit
zur Selbsterneuerung der Ursprung maligner Tumoren seien (G. B.
Pierce, Differentiation of normal and malignant cells, Fed. Proc. 29:
1248, 1970). Die Stammzellen haben mit Krebszellen gemein, dass
sie die Produkte undifferenzierter Zellen mit aufrechterhaltener
Proliferationsfähigkeit
sind. Neuere Studien zeigten jedoch, dass die Anomalie in Krebszellen
nicht vollständig
irreversibel ist. Das übliche
Verfahren, welches bei Leukämie,
Hepatozyten und Fibroblasten Anwendung findet, besteht aus der Induktion
einer Differenzierung von Krebszellen zu gesunden oder vergleichbaren
Zellen mit Hilfe eines Differenzierungsinduktors (Alphonse Krystosek
und Leo Sachs, Control of lysozyme induction in the differentitation
of myeloid leukemia cells, Cell, 9: 675–684, 1976; Shinichi Murao,
M. Anne Gemmell, Michael F. Callaham, N. Leigh Anderson und Eliezer
Huberman, Control of macrophage cell differentiation in human promyelocytic
U-937 leukemia cells by 1,25-dihydroxy vitamin D3 and phorbol-12
myristate-13-acetate, Cancer Research, 43, 4989–4996, 1983). Im Gegensatz
zu den herkömmlichen Antineoplastika,
die mittels eines zytotoxischen Mechanismus wirken, unterscheidet
sich dieses Verfahren darin, dass es die neoplastischen Tumoren
mittels einer neuen Wirkweise behandelt. Darüber hinaus wurde von einigen
der üblichen
Antineoplastika berichtet, dass ihre Wirkung als Differenzierungsinduktoren
bei Konzentrationen eintritt, die unter der zytotoxischen Konzentration
liegt, was insofern von Vorteil ist, dass die Nebenwirkungen dieser
Antineoplastika verringert werden können, indem sehr niedrige Konzentrationen
eingesetzt werden.
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In
der Tat findet Vitamin A, von dem bekannt ist, dass es die Differenzierung
induziert, klinische Anwendung bei der Behandlung akuter Promyelozyten-Leukämie (APL),
die bisher überwiegend
durch Kombinationstherapien mit Daunomycin-haltigen Kombinationspräparaten
behandelt worden ist. Laut dem im November 1988 erschienenen Journal
of American Blood Association liegt ein Bericht vor, dass nach Gabe
von hochdosierter Retinolsäure
bei 22 Patienten mit APL sich 96% der Patienten in vollständiger Remission
befanden. Dieses Verfahren wurde danach von vielen medizinischen
Einrichtungen in den Vereinigten Staaten, Frankreich, Japan, usw.
eingeführt
und erzielte eine durchschnittliche Remissionsrate von über 80%
mit einer durchschnittlichen Remissionszeit von 29 Tagen. Es wurden
darüber
hinaus Nebenwirkungen einschließlich
Austrocknung der Haut sowie gastrointestinale Störungen beobachtet, doch waren
diese weitaus milder als bei jedem anderen Antineoplastikum. Daher
kann gesagt werden, dass Differenzierungsinduktoren als antineoplastischer
Wirkstoff in signifikantem Maße
von der medizinischen Fachwelt weltweit anerkannt wurden.
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Der
therapeutische Wirkmechanismus der üblichen Antineoplastika steht
in Beziehung zur Zytotoxizität,
dem Abtöten
der schnell wachsenden Krebszellen durch die Inhibition der DNA-Replikation,
Verminderung des intrazellulären
Stoffwechsels und die Biosynthese oder Erzeugung freier Radikaler.
Daher war immer eine hohe Dosis dieses Wirkstoffs vonnöten. In
diesem Falle werden Nebenwirkungen in verschiedenen Organen erwartet,
die eine hohe Zellproliferationsrate aufweisen, wie zum Beispiel
im Knochenmark, sowie in Organen, die das Mittel verstoffwechseln
und ausscheiden, wie zum Beispiel der Gastrointestinaltrakt, Leber,
Niere und kardiovaskuläres
Gewebe. Diese schweren Nebenwirkungen schränken den Einsatz solcher Antineoplastika in
der Tat stark ein. Entsprechend entstand ein starker Bedarf an der
Entwicklung eines neuen Antineoplastikums mit einem verminderten
Nebenwirkungsprofil, d. h. ein Mittel, das als Differenzierungsinduktor
bei Krebszellen fungiert.
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Decursin
ist ein Naturstoff, welcher erstmalig 1966 in Japan aus Angelica
decursiva isoliert wurde (Fr. et Sav.). In den Jahren 1967 und 1969
wurde berichtet, dass Angelica gigas Nakai eine beträchtliche
Menge an Decursin enthält
(J. Pharm. Soc. Korea, 11: 22–26,
1967, und 13: 47–50,
1969). Darüber
hinaus wurde Decursin auch aus der Frucht des Peucedanum terebinthaceum
(Fischer und Turcz) isoliert (Korea Pharmacology Journal 30(2):
73–78,
1986). Was die pharmazeutische Wirkung von Decursin betrifft, konnten
die Autoren im Jahr 1993 eine toxische Wirkung des Decursins auf
verschiedene Krebszelllinien von Gebärmutterkrebs, Leukämie, Hepatom,
oder Dickdarmkrebs bei Konzentrationen von mehr als 10 ppm feststellen
(Siehe koreanische Patentanmeldung Nr. 93–17935).
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Offenbarung
der Erfindung
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Durch
intensive Untersuchungen über
einen langen Zeitraum hinweg entdeckten die Autoren, dass sich Decursin
zur Herstellung eines Arzneimittels für die Hemmung von Nephrotoxizität eignet.
Ein Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung
zur Nephrotoxizitäts-Hemmung,
die Decursin als wirksamen Bestandteil sowie einen pharmazeutisch
verträglichen
Trägerstoff
umfasst.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung einer antineoplastischen
Zusammensetzung, die Decursin als Nephrotoxizitäts-Hemmer, ein Antineoplastikum
und einen pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoff
enthält.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung einer antidiabetischen
Zusammensetzung, die Decursin als Nephrotoxizitäts-Hemmer, ein Antidiabetikum
sowie einen pharmazeutisch verträglichen
Trägerstoff
umfasst.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die Decursin als Nephrotoxizitäts-Hemmer enthält, kann medikamentös verursachte
Nephrotoxizität
wirksam hemmen.
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Insbesondere
kann Decursin, wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich, die
Nephrotoxizität
von Cisplatin, einem Beispiel eines Neoplastikums, sowie die des
Alloxans, einem Beispiel eines Diabetesinduktors, wirksam hemmen.
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Daher
kann die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung in Form einer Nephrotoxizitäts-Hemmer-haltigen Zusammensetzung
vorliegen, die Decursin als Wirkstoff enthält.
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Darüber hinaus
kann die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung in Form einer antineoplastisch wirksamen Zusammensetzung
vorliegen, die Decursin als Nephrotoxizitäts-Hemmer enthält. In diesem
Fall können
pro Mol Antineoplastikum zwischen 1~5 Mol Decursin eingesetzt werden;
Cisplatin kann beispielhaft als Antineoplastikum eingesetzt werden.
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Darüber hinaus
kann die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung in Form einer antidiabetisch wirksamen Zusammensetzung
vorliegen, die Decursin als Nephrotoxizitäts-Hemmer enthält. In diesem
Fall können
pro Mol Antidiabetikum zwischen 0,2~10 Mol Decursin eingesetzt werden.
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Die
Dosierung der Zusammensetzung, die Decursin als Nephrotoxizitäts-Hemmer enthält, kann
stark vom Einsatzzweck abhängen;
die Zusammensetzung kann im Dosierungsbereich von 1~500 mg pro kg
Körpergewicht
verabreicht werden.
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Wenn
auch der Wirkmechanismus der Nephrotoxizitäts-Hemmung des Decursins noch
nicht aufgeklärt
worden ist, scheint dieses durch einen Radikalfänger-Effekt aufgrund seiner
großen
antioxidativen Kapazität
begründet
zu sein. Die Nephrotoxizität
des Cisplatins wird beispielsweise als typischer Entzündungsprozess
erklärt,
der dadurch entsteht, dass Cisplatin, welches schon im ganzen Körper verteilt
ist, während
der schnellen Ausscheidung von den proximalen renalen Tubuli aufgenommen
werden. Anschließend
werden Neutrophile induziert und mittels Chemotaxis stimuliert,
und schädigen
letztendlich das umliegende gesunde Gewebe durch Ausschüttung von
Sauerstoffradikalen. Daher nimmt man an, dass Antioxidantien, die
als Radikalfänger
wirken, in der Lage sein sollten, die von Cisplatin verursachte
Nephrotoxizität
zu verhindern. Zu diesem Zweck müssen
jedoch die folgende Voraussetzungen erfüllt sein. Erstens müssen die
Antioxidantien während
des oben aufgeführten
Vorgangs ausreichend im Körper
verteilt sein. Zweitens sollten die Antioxidantien nicht aus den
körpereigenen
Substanzen bestehen, die im Körper
hergestellt und von dem Körpergewebe, einschließlich der
Nieren, benötigt
werden, damit sich die Krebszellen nicht durch Aufnahme der Antioxidantien selbst
schützen
können.
Drittens sollen die Antioxidantien nicht leicht zu unwirksamen Metaboliten
verstoffwechselt werden oder eine starke Affinität zur Leber aufweisen, was
zu einer verzögerten
Verteilung der Antioxidantien in der Leber oder zu einer verringerten
Verteilungsmenge führen
kann. Anders ausgedrückt
geht man davon aus, dass Decursin die oben aufgeführten Voraussetzungen
erfüllt
und als Radikalenfänger
Nephrotoxizität
wirksam hemmt.
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Die
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung, die Decursin enthält, kann in verschiedenen Verabreichungsformen
formuliert werden, die pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Hilfsstoffe und/oder
Additive enthält.
Genauer gesagt kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung Hilfsstoffe
enthalten wie beispielsweise Lactose, Stärke, usw., Gleitmittel wie
beispielsweise Magnesiumstearat, Emulgatoren, Suspensionsmittel
und isotonische Mittel, und nach Wunsch Süßungsmittel und/oder Geschmacksstoffe.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung kann in oralen oder peripheren Verabreichungsformen
formuliert werden; orale Verabreichungsformen schließen Tabletten,
Kapseln, und Flüssigkeiten
ein, wohingegen periphere Verabreichungsformen intravenöse, intraperitoneale
und subkutane Injektionen einschließen.
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Die
Erfindung wird anhand folgender Beispiele näher erläutert, ohne dass diese die
Erfindung einschränken.
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Beispiel 1: Wirkung von
Decursin bei der Hemmung von Cisplatin-verursachter Nephrotoxizität
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Um
die hemmende Wirkung von Decursin auf Nebenwirkungen wie beispielsweise
Gewichtsverlust, Nephrotoxizität
oder Hepatotoxizität,
die Cisplatin zugeschrieben werden, zu bestimmen, wurde gesunden SD-Ratten
eine Mischung von Cisplatin und Decursin verabreicht, wobei die
Dosismenge, der Dosiszeitraum und die Dosisfrequenz verändert wurde.
Die ausführlichen
Versuchsbeschreibungen wurden nachstehend zusammengefasst. BUN (Blut-Harnstoff-Stickstoff),
und Creatinin als Nephrotoxizitäts-Marker
aus dem Blut; sGPT als Hepatotoxizitäts-Marker, okkultes Blut aus Urin, Bilirubin,
Urobilinogen, Keton, Protein, Nitrit, Glucose, pH und die spezifische
Dichte wurden wie folgt bestimmt.
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1) Messung von BUN
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BUN
wurde mit dem BUN-Bestimmungskit (Youngdong Phar. Co. Ltd., Korea)
nach folgendem Verfahren bestimmt:
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Es
wurden 0,1 ml Urease zu einer 20 ml Pufferlösung gegeben, um so eine enzymatische
Pufferlösung zu
erhalten. Die Lösung
wurde auf jeweils zwei Teströhrchen
verteilt. Dann wurden 0,02 ml einer zu bestimmenden Serumprobe in
das eine Röhrchen
gegeben, wohingegen 0,02 ml einer Vergleichslösung (die 60 mg/100 ml Harnstoff-N
enthielt) als Kontrolle in das andere Röhrchen gegeben wurde. Die beiden
Röhrchen wurden
15 Minuten bei 37°C
inkubiert. Dann wurde in jedes Röhrchen
jeweils 2 ml einer farbgebenden Lösung gegeben und weitere 5
Minuten bei 37°C
inkubiert. Die Extinktion wurde für die BUN-Bestimmung bei 570
nm gemessen.
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2) Messung von Creatinin
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Der
Creatininwert wurde mit einen Creatininbestimmungskit (Youngdong
Pharm. Co. Ltd., Korea) nach folgendem Verfahren bestimmt.
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Zu
0,5 ml einer zu bestimmenden Serumprobe wurden 4 ml einer wolframhaltigen
Lösung
gegeben und nach gründlichem
Vermischen 10 Minuten stehen gelassen. Zur Isolierung des Überstandes
wurde die Mischung 10 Minuten bei 1500 × g zentrifugiert. Es wurden
dann jeweils 3 ml Überstand,
Creatinin- Kontrolllösung oder
destilliertes Wasser (für
die Blank-Bestimmung) in getrennte Teströhrchen gegeben. Darauf folgte
die Zugabe von jeweils 1 ml einer Pikrat-Lösung.
Dann wurden 0,5 ml einer 1,4 N NaOH-Lösung zu jedem Röhrchen hinzugefügt und gerührt. Die
Extinktion wurde bei genau 515 nm nach dem entsprechenden Zeitintervall
von 15 Minuten gemessen.
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3) Messung von sGPT
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sGPT
wurde mit einem sGPT-Bestimmungskit (Youngdong Pharm. Co. Ltd.,
Korea) nach folgendem Verfahren bestimmt.
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Es
wurden jeweils 1 ml einer GPT-Substrat-Lösung 3 Minuten bei 37°C inkubiert.
Dann wurden 0,2 ml Serumprobe zu der Substrat-Lösung gegeben und weitere 30
Minuten bei 37°C
inkubiert. 1 ml 2,4-Dinitrophenol wurde in die kultivierte Lösung gegeben,
20 Minuten stehen gelassen und anschließend 0,4 N NaOH (10 ml) dazugegeben
und gut gerührt.
Die Extinktion wurde bei 505 nm gemessen.
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4) Urinbestimmung
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Der
Urin wurde mit Urinteststreifen (Gen 9, Youngdong Pharm. Co. Ltd.,
Korea) nach folgendem Verfahren bestimmt.
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Die
Teststreifen wurden unmittelbar nach Gewinnen des Urins aus Ratten
mit diesem benetzt und innerhalb einer Minute auf Farbumschlag hin
beobachtet.
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Insgesamt
wurden bei diesem Experiment 10 männliche SD-Ratten (200 g Körpergewicht)
eingesetzt. Die Tiere wurden in zwei Gruppen zu je 4 Tiere aufgeteilt;
während
von den verbleibenden zwei Ratten eine als behandelte Kontrolle
(als Gruppe, der ausschließlich
Cisplatin in einer Dosis von 5,8 mg/kg intraperitoneal verabreicht)
und die andere als unbehandelte Kontrolle (als Gruppe ohne Arzneimittelverabreichung)
gewählt wurde.
Der ersten Gruppe (Vorbehandlungsgruppe) wurde eine auf drei Dosen
aufgeteilte Gesamtmenge von 17,4 mg/kg Cisplatin im Molverhältnis von
Decursin zu Cisplatin (3 : 1) in Intervallen von 1, 24 und 48 Stunden vor
der intraperitonealen Gabe von Cisplatin (5,8 mg/kg) intraperitoneal
verabreicht. Der zweiten Gruppe (Nachbehandlungsgruppe) wurde eine
auf drei Dosen aufgeteilte Gesamtmenge Cisplatin zu je 5,8 mg/kg
im Molverhältnis
von Decursin zu Cisplatin (3 : 1) in Intervallen von 1, 24 und 48
Stunden nach der intraperitonealen Gabe von Decursin (17,4 mg/kg)
intraperitoneal verabreicht. Die Körpergewichte der Ratten wurden
am Anfang der Versuche (Tag 0) gemessen. Die Ratten wurden 4 Tagen
nach der Verabreichung getötet
und ihr jeweiliges Gewicht gemessen. Die Urinbestimmung wurde nach
der Anwendung von Cisplatin durchgeführt, um die von Cisplatin induzierte
Nephrotoxizität
zu messen. Die Ratten wurden 4 Tage nach Beendigung der Versuche
getötet.
Die gesammelten Blutproben wurden zur Isolierung der Seren 30 Minuten
stehen gelassen. Die Serenisolate wurden zur Bestimmung von BUN
und der Creatininwerte als ein Marker für die Nephrotoxizität einschließlich des
sGPT-Wertes als Marker für
die Hepatotoxizität
nach den oben beschriebenen Verfahren verwendet. Die Ergebnisse
werden in den folgenden Tabellen 1 bis 3 gezeigt.
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Tabelle
1. Messung von GPT, BUN und Creatinin
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Wie
in Tabelle 1 dargestellt zeigt das Cisplatin-behandelte Tier (Kontrolle)
schwerwiegende Nephrotoxizität,
wie die Werte von BUN und Creatinin als Nephrotoxizität-Marker
zeigen, die bei 69,50 mg/dl beziehungsweise 3,68 mg/dl bestimmt
wurden. In der Decursin-behandelten Gruppe hingegen lag der BUN-Wert der
vorbehandelten Gruppe bei 15,7 ± 2,8 mg/dl (Normwert: unter
20); der BUN-Wert der nachbehandelten Gruppe lag bei 55,2 ± 2,1 mg/dl.
In der Vorbehandlungsgruppe erreichte der BUN-Wert wieder vollständig den Normbereich;
in der Nachbehandlungsgruppe wurden jedoch signifikante Unterschiede
beobachtet, wenn auch die Nephrotoxizität leicht gemildert wurde.
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Die
Creatinin-Werte der Vorbehandlungsgruppe lagen bei 0,74 ± 0,29
mg/dl (Normwert: unter 1) und zeigten hiermit eine vollständige Erholung
bis in den Normbereich an. Die Creatinin-Werte in der Nachbehandlungsgruppe
lagen hingegen bei 2,08 ± 0,52
mg/dl, was auf eine Verringerung der Nephrotoxizität um etwa 40%
im Vergleich zur Cisplatin-behandelten Kontrollgruppe hinwies.
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Darüber hinaus
wurden Veränderungen
bei den sGPT-Werten im Blut verfolgt, um Aufschluss darüber zu gewinnen,
ob die Abnahme der Nephrotoxizität
nach der Gabe von Decursin auf eine Verlagerung der Cisplatin-Aufnahme
von der Niere auf die Leber zurückzuführen ist.
Es zeigten sowohl die Behandlungs- wie auch die Nichtbehandlungsgruppe
Werte im Normbereich: 10,8 ± 4,9
beziehungsweise 19,0 ± 5,3.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass bei der Verabreichung von
Cisplatin keine Hepatotoxizität
auftrat, was mit den Ergebnissen in der Literatur übereinstimmt.
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Tabelle
2. Urinbestimmung
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Wie
die Ergebnisse der oben aufgeführten
Tabelle bestätigen,
wurde bei der Kontrolle ein signifikanter Anstieg in Bezug auf verschiedene
Parameter beobachtet, beispielsweise beim Okkultblut im Urin, beim
Bilirubin, Urobilinogen, Keton, Protein, bei der Glucose und der
spezifischen Dichte. Die oben aufgeführten Parameter lagen in der
Vorbehandlungsgruppe hingegen bei Werten bis in den Normbereich
erniedrigt vor. Im Vergleich zur Cisplatin-behandelten Gruppe war
die Nephrotoxizität
in der Nachbehandlungsgruppe jedoch hinsichtlich einiger Parameter
erniedrigt.
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Wie
die Ergebnisse der oben aufgeführten
Tabelle bestätigen,
waren die Körpergewichte
in sowohl der Vorbehandlungs- wie auch in der Nachbehandlungsgruppe
erniedrigt, in denen Ratten drei Decursin-Dosen im Abstand von 1,
24, und 48 Stunden erhielten. Jedoch fiel der Gewichtsverlust niedriger
aus als bei der nur mit Cisplatin behandelten Gruppe.
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Die
oben aufgeführten
Ergebnisse zeigen, dass die Gabe von Decursin 1, 24, und 48 Stunden
vor der Behandlung mit Cisplatin das Auftreten von Nephrotoxizität wirksam
hemmte, ohne dass es zum Auftreten eine Hepatotoxizität kam.
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Beispiel 2: Die Wirkung
von Decursin bei der Hemmung von mit diabetischen Komplikationen
assoziierten Nierenversagen
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Zwei
Tage nach Gabe von Alloxan an ICR-Mäuse (75 mg/kg i. v.) wurden
ihre Nüchtern-Glucoseblutspiegel
gemessen, um so Mäuse
mit hohen Glucosespiegeln zu bestimmen. Die Mäuse mit hohen Glukosespiegeln
wurden auf zwei Gruppen aufgeteilt; die eine Gruppe erhielt eine
physiologische Salzlösung,
die andere Gruppe erhielt 10 Tage lang oral verabreichtes Decursin
in einer Dosis von 50 mg/kg. Eine Alloxan-freie Gruppe wurde ebenfalls
10 Tage mit einer physiologischen Salzlösung behandelt. Ihre Körpergewichte
wurden regelmäßig gemessen
und Urinbestimmungen durchgeführt.
Für die
Entnahme der Seren und Nieren wurden Mäuse mit Äther leicht betäubt und
ihre Unterleiber freigelegt. Die Seren wurden aus Blutproben gewonnen, die
aus dem Herz entnommen wurden. Die Niere wurde mit 0,9%iger NaCAl
perfundiert und nach dem Ausspülen
des Blutes entnommen. Anschließend
wurde das Gewicht der rechten Niere bestimmt. Des weiteren wurde
für die
Bestimmung der Proteinmenge aus Nierengewebe dieses Gewebe mit einem Bio-Rad
Proteinassay-Kit nach der Bradford-Methode in Anwesenheit von bovinem
Serumalbumin als Vergleichssubstanz bestimmt. Für die Messung von MDA im Nierengewebe
wurden 0,4 ml einer 10%igen Dodecylsulfatlösung zu 0,5 ml einer 10%igen
homogenisierten Nierengewebe-Lösung
zugegeben und 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37°C stehen
gelassen. Nach der anschließenden
Zugabe von 0,1 N HCl (2 ml) und 0,67% Thiobarbitursäure (TBA)
(1 ml) wurde die Mischung vortexiert und 30 Minuten in einem kochenden
Wasserbad stehen gelassen. Die Mischung wurde anschließend 2 bis
3 Minuten in ein Eisbad gestellt, um so die Reaktion zu stoppen. Dann
wurden 2 ml n-Butanol zu der Mischung gegeben und diese gut vermischt
und 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und
darin die Extinktion bei 532 nm gemessen. Als Referenz wurde 10 μg/ml Tetraethoxypropan
(TEP) verwendet. Für
die Messung von MDA aus Serum wurden 0.8% Thiobarbitursäure (TBA)
zu 0,5 ml Serum gegeben und 30 Minuten in ein kochendes Wasserbad
gestellt. Die Mischung wurde anschließend 2 bis 3 Minuten in ein
Eisbad gestellt, um so die Reaktion zu stoppen. Der Überstand
wurde entnommen und darin die Extinktion bei 532 nm gemessen. Als
Referenz wurde 10 μg/ml
TEP verwendet.
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Mäusen wurde
10 Tage kontinuierlich Decursin (50 mg/kg) oral verabreicht. Dann
wurden zuzüglich zur
Urinbestimmung verschiedene Parameter aus dem Blut wie beispielsweise
BUN und MDA als Marker für Nierenversagen
gemessen. Bei der Messung des MDA-Wertes mittels Isolierung des
Nierengewebes (Tabelle 4) erholte sich der BUN-Wert der ausschließlich mit
Alloxan behandelten Gruppe (17,4 ± 3,7 mg/dl) durch die Behandlung
mit Decursin auf den Normwert (4,8 ± 0,6 mg/dl). Die MDA-Werte
der ausschließlich
mit Alloxan behandelten Gruppe (0,51 ± 0,07) wurde durch die Behandlung
mit Decursin auf 0,36 ± 0,03
gesenkt, was dem Wert einer normalen Kontrollgruppe entsprach. Somit
wurde festgestellt, dass die Nierenschädigungen vollständig reversibel
waren. Da der Abfall beider MDA-Werte sowohl im Blut als auch im
Nierengewebe klinisch vernünftig
und auch wünschenswert
erscheint, wurden die MDA-Werte im Nierengewebe gemessen. Als Ergebnis
wurde der MDA-Wert im Nierengewebe der ausschließlich mit Alloxan behandelten
Gruppe (13,24 ± 5,93)
durch die Behandlung mit Decursin auf 5,63 ± 0,99 gesenkt, was unter
dem Wert der normalen Kontrollgruppe lag (8,44 ± 1,01). Somit konnte gezeigt
werden, dass Decursin das Nierengewebe recht wirksam schützte.
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Tabelle
2. BUN- und MDA-Werte aus Blut und MDA-Werte aus Nierengewebe
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Wie
die Ergebnisse der unten aufgeführten
Tabelle 5 bestätigen,
zeigen die Urinbestimmungen, dass nach der Behandlung mit Alloxan
die ausgeschiedenen Mengen an Okkultblut, Bilirubin, Urobilinogen
und Glucose signifikant erhöht
waren ebenso wie der sichtbare Anstieg der spezifischen Dichte.
Alle Parameter waren hingegen nahezu normal in der mit Decursin
behandelten Gruppe. Die Ergebnisse stimmten mit den Messwerten von
BUN und MDA aus Blutproben überein.
Der Gewichtsverlust der Alloxan-behandelten Gruppe wurde durch Behandlung
mit signifikant erniedrigt.
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Tabelle
5. Urinbestimmungen
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Beispiel 3: Prüfung der
Toxizität
von Decursin bei gesunden Zellen
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Für die Bestimmung
der zytotoxischen Wirkung von Decursin auf gesunde Zellen wurden
diese in Medium-199 mit 3% fetalem Rinderserum (FBS), Penicillin
(100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml)
alle 3 bis 4 Tage subkultiviert. Eine Zellsuspension wurde durch
Behandlung der Zellen mit Trypsin hergestellt. Ein Milliliter der
Zellsuspension wurde auf einer 24-Well-Platte bei einer Konzentration
von 2 × 105 Zellen/ml aufgetragen und einen Tag lang
in Kontakt mit dem Kulturmedium belassen. Nach Entfernen des Überstandes
wurde 1 ml Decursin in geeigneten Konzentrationen auf das Zellkulturmedium
gegeben und 3 Tage lang inkubiert, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt. Die
Ergebnisse der Tabelle 6 bestätigen,
dass bis zu einer Konzentration von 10–6 M
keine zytotoxische Wirkung auf gesunde Zellen (LLC-PK1) beobachtet wurde.
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Tabelle
6. Zytotoxizitätstest
bei gesunden Zellen
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Wie
oben beschrieben konnte Decursin als wirksamer Nephrotoxizitäts-Hemmer Nephrotoxizität senken.
Decursin kann wirksam in Antineoplastika oder in Antidiabetika Verwendung
finden.
