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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Calciumtrifluoracetat
zur Herstellung von Medikamenten mit cytotoxischer und antitumoraler
Aktivität.
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Calciumsalze,
insbesondere Calciumgluconat, wurden für eine gewisse Zeit in der
Humanmedizin zur Behandlung von Osteoporose und allen Zuständen, in
welchen ein Anstieg in den Blutcalciumgehalt angezeigt ist, verwendet.
Die Verwendung von Calciumsalzen zur Behandlung von tumoralen und
hyperproliferativen Fehlfunktionen wurde bis zum heutigen Tag nicht
beschrieben; allerdings wurden vor Chemotherapie schützende Wirkungen
für einige
Calciumsalze postuliert, insbesondere für Calciumglucarat (siehe z.B.
Webb T. et al., Biochem. Pharmacol., Vol. 47 (9), 1994, 1655–1660).
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Es
wurde nun herausgefunden, dass Calciumtrifluoracetat eine überraschende
cytotoxische Aktivität aufweist,
welche für
Tumorzellen selektiv ist. Diese Aktivität wurde an Zelllinienkulturen
von humanen Tumoren und Tumoren von Mäusen verschiedener Herkunft
(Dickdarm, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Brust, Prostata, Leber,
Magen und Eierstöcken),
wie HT 29-, Kato-, C-26-, H G C 27- und PA-1 -Zellen, gezeigt.
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Calciumtrifluoracetat,
welches ausgehend von Trifluoressigsäure und Calciumoxid oder -hydroxid
unter Verwendung von herkömmlichen
Methoden hergestellt wird, und in jeder Vertiefung (ungefähr 10000
Zellen) zu einer wässrigen
Lösung
in Mengen, welche zwischen 0,001 und 1,5 mg liegen, zugegeben wurde,
bewirkt den Tod von 90 bis 95% oder mehr der Tumorzellen. Unter
den identischen Bedingungen sind normale menschliche Zelllinien
annährend
unempfindlich oder zumindest deutlich weniger empfindlich gegenüber der cytotoxischen
Wirkung, welche Calciumtrifluoracetat zugewiesen wird. Gleiche Wirkungen
wurden mit anderen Calciumsalzen von pharmazeutisch verträglichen
Säuren
wie Acetat, Nitrat, Chlorid und dergleichen gleichwohl in einem
geringeren Ausmaß erhalten.
Dennoch scheint Trifluoracetat im Hinblick auf seine positiven toxikologischen
Eigenschaften bevorzugt zu sein.
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Für die Verwendung
in der Behandlung von Tumoren wird Calciumtrifluoracetat vorzugsweise
parenteral, z.B. über
den intramuskulären,
intravenösen
oder subkutanen Weg, mit Dosierungen, welche zwischen 0,1 und 10
mg/kg/Tag liegen, verabreicht. Zu diesem Zweck wird das Calciumsalz
geeigneterweise in der Form von sterilen Suspensionen oder Lösungen,
gegebenenfalls mit Hilfe von konventionellen Vehikeln oder Lösemitteln,
formuliert. Darüber
hinaus sind auch andere Verabreichungswege möglich, wie der orale Weg oder
die topische Infusion am Mutationsort der Tumorläsion. Calciumtrifluoracetat
kann in Kombination mit anderen antitumoral wirkenden Arzneimitteln,
welche eine komplementäre,
synergistische oder anders artige verwendbare Aktivität zeigen,
verwendet werden.
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Die
Ergebnisse von Experimenten, welche mit Calciumtrifluoracetat durchgeführt wurden,
sind unten beschrieben.
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Toxizität In Maus
und Ratte
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Calciumtrifluoracetat,
welches mit einer akuten Dosis von 200 mg/kg Balb/c-Mäusen über den
intraperitonalen Weg verabreicht wurde, führt zu keinen bemerkenswerten
toxischen Wirkungen.
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Eine
subchronische Behandlung mit einer Dosis von 100 mg/kg ebenfalls über den
intraperitonalen Weg für
4 Wochen führte
zu keinen pathologischen Wirkungen. Eine ähnliche Behandlung über den
subkutanen Weg für
4 Wochen wurde bei der Dosis von 10 mg/kg ebenfalls toleriert.
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In
Sprague-Dawley-Ratten wurden keine toxischen Wirkungen nach einer
akuten oder subakuten Verabreichung von 200 mg/kg von Calciumtrifluoracetat über den
intravenösen
Weg beobachtet.
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In vitro-Cytotoxizität
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Die
Cytotoxizität
von Calciumtrifluoracetat wurde an 13 Zelllinien von bösartigen
humanen Tumoren und 4 Linien von gutartigen Tumoren bestimmt.
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20 μl an Ca(CF3COO)2-Lösungen bei
Konzentrationen von 100, 50, 37,5, 25, 15, 12,5, 10 und 6,25 mg/ml
wurden zu Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, welche jeweils 10000
Zellen/Vertiefung in 100 μl
eines Kulturmediums enthielten.
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Sie
wurden über
Nacht bei 37°C
stehen gelassen, wonach 40 μl
an MTT (Dimethylthiazol-0,2 g/100 ml PBS) zugegeben und für 4 Stunden
bei 37°C
stehen gelassen wurde.
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Nach
der Aspiration werden 100 μl
an SDS zugegeben und es wird bei 37°C für 1 Stunde stehen gelassen.
Die Platte wird bei 540 nm und 690 nm analysiert.
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Die
Toxizität
der Probe wird als das Verhältnis
zwischen dem Absorptionswert in der Vertiefung mit den behandelten
Zellen und dem Absorptionswert in der Vertiefung mit den Kontrollzellen
bestimmt.
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Der
MTT-Test ist ein quantitatives kolorimetrisches Verfahren, welches
ausschließlich
lebende Zellen misst, da die mitochondrischen Enzyme von lebenden
Zellen in der Lage sind, MIT-Tetrazoliumsalze in unlösliches
Formazan zu überführen.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle
1 Biologische
Aktivität
von Ca(CF
3COO)
2 in
vitro
- Normaler
Typ: bösartige
Zelllinien
- Fett/kursiver Ty: gutartige Zelllinien
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Ergebnisse
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Bösartige
menschliche Zelllinien von verschiedenen histologischen Arten und
Herkünften
zeigen, dass die cytotoxische Antwort auf Calciumtrifluoracetat
zwischen den verschiedenen Linien variiert, jedoch abhängig von
der Dosis immer eine hohe Zelltodrate erreicht: 8/14 erreichten
100% Mortalität
und 6/14 erreichten Werte zwischen 80% und 90%.
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Diese
Ergebnisse wurden nach 24 Stunden Inkubation erhalten. Weitere Überprüfungen wurden
hinsichtlich des möglichen
schnellen Turnovers des Salzes aufgrund dessen sehr geringen Molekulargewichtes nach
6 Stunden durchgeführt.
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Die
gesammelten Daten zeigen, dass die antitumorale Wirkung in einem
kurzen Zeitraum bei niedrigen Konzentrationen stattfindet, Wenn
die Konzentration erhöht
wird, entwickelt sich eine nicht spezifische Toxizität des Salzes,
was dessen geringe Toxizität
gegenüber
normalen Zellen bei hohen Dosen erklärt.
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Experimentelle Tumore
von Mäusen
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Mäusen von
Typ Balb/c wurden mit 25000 Zellen/Maus von C26 (Dickdarm-Adenokarzinom
einer Maus) geimpft.
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Vier
Tage nach der Impfung wurden die Tiere subkutan mit 5 mg/kg an Calciumtrifluoracetat
behandelt, Die Kontrollgruppe erhielt nur eine Salzlösung. Die
Behandlung wurde jeden Tag durchgeführt. Der Tumordurchmesser wurde
mit einer Schieblehrenanzeige gemessen. An dem 20. Tag nach der
Impfung wurden die Tiere getötet
und die Tumore entfernt und gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
2 dargestellt. Das mittlere Gewicht und die mittlere Größe der Tumore
in der Kontrollmaus waren viermal größer als diejenigen der behandelten
Gruppe. Die Daten, welche sich auf den Ausbruch der Tumore beziehen,
waren ebenso signifikant; 100% für
die Kontrollen im Verhältnis
zu 40% für
die behandelte Maus.
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Behandlung von spontan
auftretenden Hundetumoren
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Experimente,
welche an spontan auftretenden Tumoren in Haustieren, insbesondere
Hunden, durchgeführt,
werden, werden als verlässliches
Modell für
Voraussagen der Aktivität
in Menschen betrachtet (D.M. Vail et al., Spontaneously occurring
tumors in companion animals as models for drug development. Anticancer drug
development giude: preclinical screening, clinical trials and approval;
herausgegeben von B. Teicher Humana Press Inc., Totowa, NJ). Tumore
in Tieren sind gegenüber
menschlichen Tumoren im Hinblick auf Größe, Zellkinetik und Verhalten ähnlicher
als Tumore von Nagetieren.
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Sechs
Hunde, welche unter Brusttumoren leiden, und ein Hund mit einem
bösartigen
Lymphon wurden behandelt. Die Behandlung wurde intravenös mit einer
Dosierung, welche zwischen 100 und 10 mg/kg/Tag an Calciumtrifluoracetat
variierte, durchgeführt.
Trotz einiger Schwankungen unter den Tieren, abhängig von dem Auftreten von
Nebenwirkungen, insbesondere Erbrechen, wurde die höchste Dosis
(100 mg/kg) anfänglich
für ein
bis drei Tage, gefolgt von der niedrigsten Dosis (10 mg/kg) für einige
Tage verabreicht. Die höchste
Dosis wurde dann erneut, jedoch nur zweimal jede Woche verabreicht.
Einige Tiere wurden immer mit der höchsten Dosis behandelt, jedoch
mit einer niedrigeren Häufigkeit
(9 bis 10 Verarbeichungen in ungefähr 20 Tagen).
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Obwohl
die Ergebnisse von vorläufiger
Natur sind und nur mit einer beschränkten Anzahl an Tieren erhalten
wurden, zeigen sie die bemerkenswerte antitumorale Wirksamkeit von
Calciumtrifluoracetat. So zeigen die Experimente:
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Eine Reduktion der Haupttumormasse von 20% bis über 50%, bezogen auf dessen
Anfangsvolumen, Diese Reduktion war nach den ersten Verabreichungen
evident und erreichte am Ende des Behandlungszyklus ein Maximum
(im allgemeinen 3 Wochen),
- 2. Das reduzierte Volumen wurde im allgemeinen von anderen Phänomenen
begleitet, welche die Tumormasse bedingen, wie kollikative Nekrosis,
Kontaktverlust mit dem umgebenden Gewebe (Adhäsion) und schließlich die
Verkapselung oder Zusammenbruch der Wände mit dem Auslaufen von nikrotischem
Material nach außen.
- 3. Zum Stillstand gebrachte Entwicklung von Metastasen und in
einigen Fällen
Nekrosis und deren Verschwinden (Resorption oder Verkalkung).
- 4. Ca(CF3COO)2 zeigte
sich als absolut sicher, selbst bei täglichen intravenösen Dosen
von 100 mg/kg; die einzige Nebenwirkung, welche bei zwei Tieren
beobachtet wurde, war ein unmittelbares Erbrechen nach der Verabreichung
des Arzneimittels und ein geringfügiger Anstieg der Temperatur
(1°C nicht übersteigend).
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Die
Toxizitätstests,
welche unter besonderer Vorsicht durch Beobachten der Leber und
Nierenfunktionsparameter und Koagulationszeiten durchgeführt wurden,
zeigten keine pathologischen Modifikationen dieser Parameter in
den behandelten Tieren.
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Klinische
Versuche
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Calciumtrifluoracetat
wurde subkutan mit Dosen, welche zwischen 10 und 200 mg pro Tag
variieren, fünf
Patienten im Alter von 56 bis 63 verabreicht, welche unter Brustkrebs
(ein Fall), Darmkrebs (drei Fälle)
und Gebärmutterkrebs
(ein Fall) im fortgeschrittenen Stadium der Krankheiten und unter
diffusen Metastasen litten, verabreicht. Mit der Ausnahme von einem
Fall eines Dickdarmkrebses, welcher zu dem Tod des Patienten aufgrund
einem hochgradig fortgeschrittenen Stadium der Krankheit führte (alle
Fälle wurden
auf der Basis eines Härtefallprotokolls
für offensichtliche
ethische Gründe
durchgeführt),
war die therapeutische Wirkung überraschend,
sowohl hinsichtlich objektiver Bewertungen (ungefähr 10 bis
40% Reduktion der Tumormasse, Reduktion oder Verschwinden von Asciten
und Metastasen bildenden Knoten und Reduktion von Tumormarkern wie CA19.9
und alpha-Fetoprotein)
als auch subjektiver Bewertungen (verbesserte Gemütsverfassung,
Reduktion und Verschwinden von Schmerzen und Rückkehr zum Arbeiten und sozialen
Leben). Selbst in dem Fall des Patienten, welcher starb, wurde eine
Reduktion in der Tumormasse beobachtet, der Patient starb allerdings aufgrund
neoplastischen Kräfteverlustes
und kardiorespiratorischen Komplikationen.
