DE69923322T2 - Verwendung von propionyl-l-carnitin und acetyl-l-carnitin zur herstellung von arzneimittel mit antikrebs wirkung - Google Patents

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Description

  • Die hierin beschriebene Erfindung betrifft die Verwendung von Propionyl-L-carnitin und Acetyl-L-carnitin zur Herstellung von Medikamenten in Kombination mit Antikrebsmitteln für die Behandlung von Tumoren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist gutbekannt, daß die Verwendung von Antikrebsmitteln bei der Therapie von Menschen eine große Anzahl von toxischen oder Nebenwirkungen verursacht, die für die Patienten lebensbedrohlich sein können. Diese Komplikationen können tatsächlich zu einer Verminderung der Dosis der Mittel und gegebenenfalls zum Absetzen der Therapie selbst führen.
  • Die Verminderung der Dosis oder das Absetzen der Therapie verursacht in vielen Fällen eine Verschlechterung des Allgemeinzustandes des Individuums, weil es die Entwicklung von Rückfällen mit Konsequenzen favorisiert, die manchmal für den Patienten fatal sind.
  • Ein anderer sehr wichtiger und stark gefühlter Aspekt in der Krankenhausumgebung und bei den Familien von Onkologiepatienten ist das Konzept der "Verbesserung der Lebensqualität" der behandelten Patienten.
  • Es ist gleichermaßen gutbekannt, daß Patienten, die eine reguläre Polychemotherapie wegen Krebses erhalten, einen wesentlichen Gewichtsverlust erleiden.
  • Die wachsende Anzahl und die Wichtigkeit der Antikrebsmittel, die bei der menschlichen Therapie verwendet werden, deren hauptsächliche Begrenzung das Auftreten von toxischen oder Nebenwirkungen darstellt, bedeutet, daß dieses Problem noch stark zu berücksichtigen ist.
  • Somit ist die Entdeckung von neuen Mitteln oder neuen, angemessenen Kombinationen von verschiedenen Mitteln, die in der Lage sind, die toxischen oder Nebenwirkungen wesentlich zu reduzieren, die durch Antikrebsmittel, die bei der menschlichen Therapie verwendet werden, verursacht werden, stark erwünscht.
  • Frühere Verwendungen von L-Carnitin in Kombination mit Antikrebsmitteln sind bereits bekannt.
  • Bei experimentellen Tiermodellen wurde bewiesen, daß Ratten, die mit Doxorubicin alleine behandelt wurden, einen größeren Gewichtsverlust zeigen als eine Gruppe von Ratten, die mit der gleichen Substanz in Kombination mit L-Carnitin behandelt werden (Senekowitsch R., Lohninger A., Kriegel H., Staniek H., Krieglsteiner HP., Kaiser E., Protective effects of carnitine on adriamycin toxicity to heart. In: Kaiser E., Lohninger A. (Hrsgb.). Carnitine: its role in lung and heart disorders: 126-137. Karger, Basel-New York, 1987).
  • Das US-Patent 4 713 370 beschreibt die Verwendung von Carnitin in Kombination mit cytostatischen Mitteln wie Daunomycin, N-Acetyl-daunomycin und Daunomycinoxim zur Verminderung Herztoxizität dieser Verbindungen. Das US-Patent 4 267 163 beschreibt die Verwendung von Carnitin in Kombination mit cytostatischen Mitteln wie Adriamycin, Adriamycin-14-octanoat, 4'-Epiadriamycin, Adriamycin-beta-anomer und 4'-Epi-adriamycin-gamma-anomer zur Verminderung der Herztoxizität dieser Verbindungen. Das US-Patent 4 751 242 beschreibt die Verwendung von Acetyl-L-carnitin für die therapeutische Behandlung von peripheren Neuropathien.
  • Andere Studien betreffen die Evaluierung der Schutzwirkungen von Carnitinen auf Anthracyclin-induzierte Herztoxizitäten (Neri B., Comparini T., Milani A., Torcia M., Clin. Trial J. 20, 98-103, 1983; De Leonardis V., De Scalzi M., Neri B. et al., Int. J. Clin. Pharm. Res. 70, 307-311, 1987).
  • Die oben angegebenen Patent- und bibliographischen Referenzen beweisen, daß viele Bemühungen durchgeführt wurden, um die toxischen oder Nebenwirkungen von Antikrebsmitteln zu reduzieren, ohne daß jedoch dieses ernsthafte Problem zufriedenstellend gelöst wurde.
  • Taxol ist ein natürlicher Extrakt, der zunächst von der Rinde von Taxus brevifolia isoliert wurde, mit Antikrebseigenschaften und erwies sich als neurotoxisch und myelotoxisch bei menschlichen Subjekten. Er wird für die Behandlung von Tumoren verwendet, die für die Platintherapie resistent sind, führt aber zu einer stärkeren kumulativen Toxizität im peripheren Nervensystem. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß Taxol Neutropenie in den behandelten Subjekten induziert (Rowinsky et al.; Semin. Oncol. (20. Aug. 1993 (4 Ergänz. 3), 1-15; Onetto et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (1993); (15):131-9).
  • Bleomycin wird typischerweise bei jungen Patienten mit Hodenkrebs, Lymphomen und anderen Tumorarten verwendet. Die pulmonare Toxizität von Bleomycin ist gekennzeichnet durch die Zerstörung der alveolären epithelialen Sperre und konsequente intraalveolare Proliferation von Fibroblasten und Niederschlag von extrazellulären Matrixkomponenten (Karam H. et al.; Cell Biol. Toxicol. (Feb. 1988); 14(1):13-22). Pneumozyten vom Typ 2 sind nicht in der Lage, das geschädigte oder verlorengegangene Epithelium zu regenerieren.
  • Eines der allgemeinen Probleme der pharmakologischen Therapie ist der pharmakologische Index der Mittel, d.h. das Verhältnis der therapeutisch wirksamen Dosis zu der toxischen Dosis oder bei jeglicher Rate der Dosis, die zum Beginn von Nebenwirkungen führt.
  • Die medizinische Allgemeinheit erkennt noch das Bedürfnis für therapeutische Behandlungen, die ermöglichen, daß der Patient die Behandlung auf sich nimmt, die bei einer Antikrebs-Chemotherapie besonders hart auszuhalten ist, während gleichzeitig eine akzeptable Lebensqualität beibehalten wird. Diese Überlegungen betreffen ebenfalls die therapeutische Behandlung von Tieren, beispielsweise den sogenannten Haustieren.
  • Die natürliche Tendenz, die Dosen zu reduzieren und somit die Verwendung von pharmazeutischen Formen, die für therapeutisch nützliche Verabreichungen geeignet sind, ohne daß der Patient verpflichtet ist, die Mittel zu häufig zu nehmen, steht im Gegensatz zu den minimalen wirksamen Dosen, die für jedes Antikrebsmittel typisch sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die koordinierte Verwendung – dieser Ausdruck wird nachfolgend präzise definiert – eines Antikrebsmittels und von Propionyl-L-carnitin oder Acetyl-L-carnitin, wie unten definiert, eine unerwartete synergistische Wirkung auf die Aktivität des Antikrebsmittels ausübt.
  • Im Zusammenhang mit der hierin beschriebenen Erfindung wurde ebenfalls auf vollkommen unerwartete Weise festgestellt, daß die koordinierte Verwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines Antikrebsmittels, insbesondere Taxol und Bleomycin und einer entgiftenden Menge an Acetyl-L-carnitin oder einem der pharmakologisch akzeptablen Salze davon, eine deutlich schützende Wirkung gegenüber der Toxizität und Nebenwirkungen des Antikrebsmittels ergibt, ohne daß die Wirksamkeit davon beeinträchtigt wird, wodurch neben anderen Dingen eine wesentliche Verbesserung der Lebensqualität und eine Verlängerung des Lebens selbst bei den behandelten Subjekten, egal ob menschliche Subjekte oder Tiere erhalten wird.
  • Es wurde ebenfalls festgestellt, daß die koordinierte Verwendung eine Inhibitionswirkung auf Tumormetastasen ausübt.
  • Daher liegt ein Ziel der hierin beschriebenen Erfindung in der Verwendung von Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon zur Herstellung eines Medikamentes, umfassend ein Antikrebsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine synergistische Wirkung auf die Aktivität des Antikrebsmittels erzeugt. Ein Ziel der hierin beschriebenen Erfindung liegt ebenfalls in der koordinierten Verwendung von Acetyl-L-carnitin, gemäß der die Nebenwirkungen des Antikrebsmittels in dem Medikament im wesentlichen reduziert sind.
  • Ein weiteres Ziel der hierin beschriebenen Erfindung liegt in der Verwendung von Acetyl-L-carnitin zur Erzeugung eines Medikamentes, das zur Inhibition von Metastasen nützlich ist.
  • Ein noch weiteres Ziel der hierin beschriebenen Erfindung sind Kombinationen von Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin mit Antikrebsmitteln und den entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen.
  • Der gutbekannte Mangel an toxischen oder Nebenwirkungen der obigen Alkanoyl-L-carnitine macht die Verwendung dieser Verbindungen besonders sicher, selbst für lange Behandlungsperioden, zur Vorbeugung oder Behandlung von toxischen oder Nebenwirkungen wie Gewichtsverlust, Schädigung des peripheren Nervensystems, insbesondere Neuropathie oder Neutropenie, die durch Taxol verursacht wird, oder Lungenschädigung, die durch Bleomycin verursacht wird.
  • Die Implementierung der hierin beschriebenen Erfindung trägt ebenfalls zur Verbesserung der Lebensqualität der behandelten Patienten bei; man muß nur an das physikalische Leiden denken, das durch periphere Neuropathie, Neutropenie, Atemkomplikationen verursacht wird.
  • Diese und andere Ziele der hierin beschriebenen Erfindung werden detailliert in den Ausführungsformen der Erfindung ebenfalls mit Hilfe von Beispielen beschrieben.
  • In dem Zusammenhang der hierin beschriebenen Erfindung sollen die Ausdrücke "antineoplastisch", "Antikrebs" und "antiproliferativ" als im wesentlichen synonym zueinander verstanden werden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In dem Kontext der hierin beschriebenen Erfindung ist mit koordinierter Verwendung der genannten Verbindungen unabhängig entweder (i) die gemeinsame Verabreichung, das heißt die im wesentlichen gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung von Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin oder einem seiner pharmakologisch akzeptablen Salze und eines Antikrebsmittels oder (ii) die Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend die erwähnten aktiven Bestandteil in Kombination und in einer Mischung zusätzlich zu wahlweise pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und/oder Träger gemeint.
  • Die hierin beschriebene Erfindung umfaßt somit sowohl die Co-Verabreichung von Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin oder einem der pharmakologisch akzeptablen Salze davon als auch des Antikrebsmittels und pharmazeutische Zusammensetzungen, die oral, parenteral oder nasal verabreicht werden können, einschließlich Formeln mit kontrollierter Freisetzung, umfassend die beiden aktiven Bestandteile in einer Mischung.
  • Wie aufgrund der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung klar wird, kann man die koordinierte Verwendung von Taxol und Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin oder von Bleomycin und Acetyl-L-carnitin ins Auge fassen.
  • Die Co-Verabreichung bedeutet ebenfalls eine Packung oder ein hergestellter Gegenstand, umfassend unterschiedliche Verabreichungsformen von einem der genannten Alkanoyl-L-carnitinen oder einem ihrer pharmakologisch akzeptablen Salze und des Antikrebsmittels, begleitet durch Instruktionen für die koordinierte gleichzeitige oder zeitlich geplante Aufnahme der aktiven Bestandteile entsprechend einer Dosierungsroute, die durch den hauptsächlich behandelnden Arzt auf der Basis des Zustandes des Patienten verordnet wird. Mit einem pharmakologisch akzeptablen Salz der obigen Alkanoyl-L-carnitine ist irgendein Salz der zuletztgenannten mit einer Säure gemeint, die keine toxischen oder Nebenwirkungen ergibt. Diese Säuren sind dem Pharmakologen und dem Experten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technologie bekannt.
  • Beispiele von pharmakologisch akzeptablen Salzen von Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin sind, obwohl nicht exklusiv: Chlorid, Bromid, Iodid, Aspartat, saures Aspartat, Citrat, saures Citrat, Tartrat, saures Tartrat, Phosphat, saures Phosphat, Fumarat, saures Fumarat, Glycerophosphat, Glucosephosphat, Lactat, Maleat, saures Maleat, Mucat, Orotat, Oxalat, saures Oxalat, Sulfat, saures Sulfat, Trichloracetat, Trifluoracetat, Methansulfonat, Pamoat und saures Pamoat.
  • Eine bevorzugte Form der täglichen Dosierung von Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin für die klinische Verwendung ist eine Zusammensetzung, umfassend eine Menge von Acetyl-L-carnitin oder Propionyl-L-carnitin, die äquivalent zu 0,1 bis 3 g und bevorzugt 0,5 bis 3 g ist.
  • Die hierin beschriebene Erfindung ist vorteilhaft für die Vorbeugung oder Behandlung von toxischen oder Nebenwirkungen, peripherer Neuropathie und insbesondere Myelosuppression und Lungenschädigung, die durch die oben erwähnten Antikrebsmittel verursacht werden.
  • Mit einer wesentlichen Schutzwirkung ist die Verhinderung, Reduzierung oder Eliminierung von Nebenwirkungen in einem statistisch signifikanten Ausmaß gemeint.
  • Das Ausführungsbeispiel der hierin beschriebenen Erfindung trägt ebenfalls zur Heilung und zur Verlängerung der Lebensdauer des Patienten aufgrund der Zunahme des therapeutisches Erfolges aufgrund der Möglichkeit bei, die beabsichtigten Behandlungsprotokolle beizubehalten oder die Dosen des chemotherapeutischen Mittels zu erhöhen, ohne daß die Behandlung aufgrund von Kontraindikationen abgesetzt werden muß.
  • Ein weiterer Vorteil, der mit der hierin beschriebenen Erfindung erhalten wird, hängt mit der Lebensqualität der behandelten Subjekte zusammen; tatsächlich favorisiert, wie bereits erwähnt, die Eliminierung oder Reduzierung der physikalischen Leiden, die durch eine periphere Neuropathie verursacht werden, die Fähigkeit des Patienten, selbständig zu sein. Vom ökonomischen Standpunkt her gibt es naheliegende Ersparnisse angesichts der Kosten, die durch Krankenhauseinrichtungen oder die Familien für die Pflege des Patienten getragen werden.
  • Myelosuppression ist eine der toxischen Nebenwirkungen, die sich selbst als Ergebnis der Verabreichung von Taxol manifestieren kann, einem chemotherapeutischen Mittel, das in der Therapie von verschiedenen Tumoren, beispielsweise der Brust, Ovarien, Lungen (kleine Zelle und sonstige), Kopf und Nacken verwendet wird (Slichenmeyer und Von Hoff: J. Clin. Pharmacol. (1990), 30, 770-778). Der für Taxol verwendete Vehikel ist ebenso in kommerziellen pharmazeutischen Formen (TAXOL®, Bristol Myers Squibb) ein Derivat von polyethoxyliertem Castoröl, kommerziell bekannt als Cremophor® EL und ist in der Lage, die Histamin-Freisetzung und anaphylaktoide Reaktionen im Hund und bei menschlichen Subjekten zu induzieren (Slichenmeyer und Von Hoff: ibid; Bury et al.: Allergy (1992), 47, 624-629; Hershkoviz et al.: J. Leukoc. Biol. (1994), 56, 495-501; Inokuma et al.: J. Vet. Med. Sci. (1994), 56, 45-49). Angesichts der Tatsache, daß das verkaufte Arzneimittel in Cremophor® EL getragen wird, wird das Problem der Myelotoxizität, das mit dem bei der Therapie verwendeten Präparat im Zusammenhang steht, angegriffen).
  • Eines der ernsthaftesten Probleme bei dem Verlauf von proliferativen Erkrankungen ist die Metastasenstreuung des Tumors, die manchmal in einem solchen Ausmaß abläuft, daß die Behandlung des Primärtumors nutzlos gemacht wird und selbst die Ursache für den Tod wird.
  • In einem ersten Ausführungsbeispiel der hierin beschriebenen Erfindung zeigt Acetyl-L-carnitin ein unerwartetes Ausmaß der Schutzwirkung gegenüber Taxol-induzierten Nebenwirkungen wie periphere Neuropathie, Myelosuppression und Gewichtsverlust.
  • In einem zweiten Ausführungsbeispiel der hierin beschriebenen Erfindung zeigt Acetyl-L-carnitin eine überraschende antimetastatische Aktivität, wenn es gleichzeitig mit Taxol verabreicht wird, insbesondere bei Lungenkrebs.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel der hierin beschriebenen Erfindung zeigt Propionyl-L-carnitin eine unerwartete synergistische Wirkung in Kombination mit Taxol.
  • Es wurde festgestellt, daß Taxol eine ernsthafte Neutropenie mit einem Tiefstpunkt nach der 3. bis 4. Injektion der Verbindung induziert.
  • Wenn ALC gemäß der hierin beschriebenen Erfindung verwendet wird, werden keine nachteiligen Wirkungen auf die Antikrebswirkung des Arzneimittels festgestellt.
  • ALC kann angemessen oral verabreicht werden, ohne daß aus diesem Grund andere Verabreichungsrouten ausgeschlossen werden, die ein Experte auf dem Gebiet als angemessen anzuwenden ansieht, insbesondere durch Injektion, zur gleichzeitigen Verabreichung beispielsweise in der gleichen Infusionsampulle mit dem Antikrebsmittel zusammen oder in Folge, wie es durch den Experten auf dem Gebiet festgestellt wird.
  • Gleichermaßen zeigt Propionyl-L-carnitin (PLC) eine synergistische Wirkung mit der therapeutischen Aktivität von Taxol.
  • In einem anderen Ausführungsbeispiel ist es in jedem Fall vorteilhaft, eine binäre Kombination von Acetyl-L-carnitin als Schutzmittel und Bleomycin anzugeben.
  • Im Hinblick auf solche Aspekte, die die industrielle Anwendbarkeit betreffen, gibt die hierin beschriebene Erfindung in einem der möglichen Ausführungsbeispiele auch einen Kit für die Behandlung von Krebs an, umfassend (a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge von Taxol, (b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Propionyl-L-carnitin wie oben definiert in einer Menge, die zur Erzeugung einer synergistischen Wirkung mit dem Taxol geeignet ist.
  • Der Kit gemäß der hierin beschriebenen Erfindung kann ebenfalls in der Form von (a) einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge von Taxol, (b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Propionyl-L-carnitin in einer Menge, die zur Erzeugung einer synergistischen Wirkung mit dem Taxol geeignet ist, präsentiert sein. Alternativ kann der Kit gemäß der hierin beschriebenen Erfindung ebenfalls in der Form (a) einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge von Taxol oder Bleomycin und (b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Acetyl-L-carnitin in einer Menge präsentiert sein, die für Erzeugung einer im wesentlichen Schutzwirkung gegenüber den Nebenwirkungen von Taxol oder Bleomycin geeignet ist.
  • Wir beschreiben nachfolgend die Wege zum Implementieren der hierin beschriebenen Erfindung.
  • Es ist zu verstehen, daß der Experte auf dem Gebiet die experimentellen Protokolle mit seinem oder ihrem allgemeinen Fachwissen auf dem Gebiet, auf dem er oder sie arbeitet, vervollständigen kann, wobei gegebenenfalls die Nachbargebiete berücksichtigt werden.
  • Wir berichten nachfolgend über die Ergebnisse der signifikantesten Experimente, die für die Demonstration der unerwarteten und überraschenden Schutzwirkung geeignet sind, erhalten durch die Kombination von Acetyl- oder Propionyl-L-carnitin mit den oben erwähnten Antikrebsmitteln.
  • Beispiel 1
  • Schutzwirkung von Acetyl-L-carnitin bei einem experimentellen Modell von Taxol-induzierter peripherer Neuropathie
  • Der Zweck dieser Studie besteht darin, die Schutzeigenschaften von Acetyl-L-carnitin zu beweisen und auszuwerten, das eine Woche vor Taxol in zwei verschiedenen Dosen des zuletztgenannten (16 mg/kg und 8 mg/kg) verabreicht wird, indem die Empfindungsnerv-Leitgeschwindigkeit (SNCV) gemessen wird, bestimmt am Schwanz und mit Hilfe des H-Reflexes.
  • Weibliche Wistar-Ratten mit einem Alter von 3 Monaten (Charles River) wurden verwendet, bei 22 ± 2°C bei einer relativen Feuchtigkeit von 50 ± 15 % und einem 12 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus gehalten.
  • Die Ratten wurden unmittelbar vor der Behandlung mit Hilfe von progressiven Zahlen an ihren Schwänzen identifiziert und mit Wasser gehalten und "ad libitum" gefüttert.
  • Die verwendeten Substanzen waren Acetyl-L-carnitin und Taxol.
  • Die folgenden experimentellen Gruppen wurden gebildet.
    • 1. Kontrollen.
    • 2. Schein (Gruppe, die Taxollösung-Lösungsmittel erhält).
    • 3. Taxol 16 mg/kg.
    • 4. Acetyl-L-carnitin + Taxol 16 mg/kg.
    • 5. Taxol 8 mg/kg.
    • 6. Acetyl-L-carnitin + Taxol 8 mg/kg.
  • Das folgende Behandlungsschema wurde angewandt: die "Schein-Tiere" erhielten Taxollösung-Lösungsmittel (Cremophor/Ethanol) intraperitoneal (i.p.); Taxol wurde i.p. einmal pro Woche für 5 Wochen verabreicht; die Behandlungen mit L-Carnitin, 200 mg/kg, wurden oral (os) einmal täglich über ein Magenrohr verabreicht, wobei eine Woche vor der ersten Taxol-Verabreichung begonnen und weitere 4 Wochen (insgesamt 5 Wochen) fortgesetzt wurde.
  • Das folgende Verfahren wurde angewandt: die Tiere, anästhetisiert mit einer gasförmigen Mischung, die sich zusammensetzte aus 0,45 Halothan, Stickstoffprotoxid und Sauerstoff, wurden in der Stimulationszone depiliert und auf einem Operationstisch angeordnet. Die Aufzeichnungen und Stimulationen der Empfindungsantworten erfolgten unter Verwendung eines Ote Biomedica Phasis II-Elektromyographen. Angesichts der Berichte in der Literatur der Nervenleitgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Körpertemperatur des Tieres war es notwendig, die zuletztgenannte während des Experimentes konstant zu halten, wobei mit einer rektalen Probe mit Hilfe eines Thermoregulators vom BM 70002-Typ für Tiere (Biomedica Mangoni) gemessen wurde.
  • Die Messung der Empfindungsfaserleitgeschwindigkeit wurde an dem Schwanz mit der Stimulation vom Stahlring-Typ und Meßelektroden mit einer Länge von 46 cm (Modelec digitale Ringelektroden) unter Verwendung einer Stimulationsintensität, die einem Schwellenwert gleich ist, mit einer Dauer von 100 μs erhalten.
  • Der Mittelwert von 300 Antworten wurde als Potential verwendet.
  • Die Empfindungsnervleitgeschwindigkeit, ausgedrückt in ms, wurde als Verhältnis des Abstandes zwischen den beiden Stimulationspunkten, ausgedrückt in mm, zum Unterschied der Latenz der Wellen, die durch die proximale (die nächste) und distale (von dem Dorsalspinus am weitesten entfernt) Stimulation erzeugt war, ausgedrückt in ms, berechnet.
  • Die Geschwindigkeit wurde bei allen Tiergruppen sowohl beim Grundzustand (vor jeglicher Verabreichung) und nach 5-wöchiger Behandlung gemessen.
  • Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt; eine Signifikanz wurde unter Verwendung des "t"-Tests sowohl für die unabhängigen als auch die gepaarten Daten untersucht, wobei ein statistischer Signifikanzschnitt von p<0,05 erfolgte.
  • Die Empfindungsnervleitgeschwindigkeitsdaten am Schwanznerv sind unten in Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 1 Taxol-induzierte Neuropathie: Empfindungsnervleitgeschwindigkeit (ms), gemessen an den Schwänzen der Tiere im Grundzustand und nach der Behandlung mit L-Carnitin
    Figure 00100001
  • Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung.
  • In den Klammern ist die Anzahl der verwendeten Tiere angegeben.
  • t-Test (unabhängige Daten) ** = p<0,01 gegenüber Kontrolle; n = P<0,01 gegenüber dem entsprechenden Taxol.
  • t-Test (gepaarte Daten) Δ = p<0,01 gegenüber Grundwert.
  • Im Grundzustand präsentieren alle Tiergruppen gutpassende Nervenleitwerte.
  • Die Messung bei 5 Wochen ergibt eine statistisch signifikante Erhöhung (p<0,01) bei der Empfindungsnervleitgeschwindigkeit in allen Gruppen im Vergleich zum Grundzustand.
  • Die Behandlung mit dem Taxol-Lösungsmittel (Scheingruppe) modifizierte nicht die Nervenleitgeschwindigkeitswerte im Vergleich zur Kontroll gruppe. Die Verabreichung von Taxol induzierte eine signifikante Reduktion (P<0,01) bei der Empfindungsnervleitgeschwindigkeit im Vergleich zur Kontrollgruppe; diese Reduktion war dosisabhängig: -17 % mit der 16 mg/kg Dosis und -9 % mit der 8 mg/kg Dosis.
  • Die Behandlung mit Acetyl-L-carnitin induzierte eine statistisch signifikante Erhöhung (p<0,01) bei der Empfindungsnervleitgeschwindigkeit in beiden Gruppen; 9 % im Vergleich zu der 16 mg/kg Taxol-Gruppe und 5 % im Vergleich zu der 8 mg/kg Taxol-Gruppe.
  • Auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse ist festzustellen, daß Acetyl-L-carnitin in der Lage ist, einen statistisch signifikanten Schutz gegenüber Taxol-induzierter Neurotoxizität zu ergeben.
  • Beispiel 2
  • Schutzwirkung von Acetyl-L-carnitin auf den Taxol-induzierten Gewichtsverlust.
  • Die bei dem vorhergehenden experimentellen Modell verwendeten Tiere wurden vor Beginn (Basalwerte) und am Ende der Behandlung gewogen.
  • Die unten in Tabelle 2 angegebenen Daten beweisen die wesentliche und unerwartete Schutzwirkung, die durch Acetyl-L-carnitin bezüglich des Verlustes des Körpergewichtes, verursacht durch die Taxol-Behandlung, ausgeübt wird. Tabelle 2 Körpergewicht von Tieren, die mit Taxol alleine oder in Kombination mit Acetyl-L-Carnitin behandelt sind
    Figure 00110001
    • Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung.
    • In den Klammern ist die Anzahl der verwendeten Tiere angegeben.
    • t-Test (unabhängige Daten)
      Figure 00120001
      = p<0,001 gegenüber Schein.
    • t-Test (gepaarte Daten) * p<0,001; ** p<0,01, *** p<0,05 gegenüber Grundwerte.
  • Beispiel 3
  • Schutzwirkung von Acetyl-L-carnitin auf Taxol-induzierte Neutropenie
  • Es wurde durch die Erfinder der hierin beschriebenen Erfindung sichergestellt, daß die Neutropenie-Wirkung von Taxol einen Fußpunkt nach der dritten bis vierten Injektion erreicht.
  • Zur Auswertung der Wirkung von ALC in Kombination mit Taxol, sowohl bezüglich der Quantität der Zirkulation von Neutrophilen als auch bezüglich des Tumorwachstums wurde das Ausmaß des ALC-induzierten Schutzes sowohl bei der Behandlung mit Taxol alleine als auch bei Tieren, die mit einem Mäusekrebs der Brust (L-MM3) geimpft waren, untersucht, und das Tumorwachstum wurde bei den mit ALC und Taxol und mit ALC alleine behandelten Tieren ausgewertet. Die Taxol-Behandlung verursachte eine signifikante Reduktion der Polymorphonukleate. Die orale Verabreichung von Acetyl-L-carnitin, kombiniert mit der Taxol-Behandlung, erwies sich in der Lage, die Reduktion bei neutrophilen Granulozyten, induziert durch das Antikrebsmittel, signifikant zu verhindern. Bezüglich des Tumorwachstums wurde festgestellt, daß Taxol bei Injektion entsprechend dem gleichen Schema, das für die Auswertung von neutrophilen Granulozyten verwendet wurde, signifikant das Wachstum von L-MM3 inhibierte, was aufgezeichnet wurde, bis der Tumor eine Größe von ungefähr 2 cm erreichte. Die kombinierte Behandlung mit Taxol und ALC für 14 Tage beeinträchtige die Antikrebswirkung von Taxol nicht.
  • Als Schlußfolgerung verursachte bei diesem Tumormodell ebenfalls Taxol eine ernsthafte Neutropenie und ALC, das kontinuierlich während der Periode verabreicht wurde, bei der diese Art von Knochenmarktoxizität auftritt, war in der Lage die Taxol-induzierte Reduktion bei Polymorphonukleaten zu verhindern. Gleichzeitig beeinträchtigte die Wirkung von ALC nicht die Antikrebsaktivität von Taxol.
  • Beispiel 4
  • Wirkung der Verabreichung von Acetyl-L-carnitin (ALC) in Kombination mit Taxol i.p. auf Neutropenie in der Maus
  • Bei einer Studie, die entsprechend Good Laboratory Practice (GLP) durchgeführt wurde, um die Wirkung von Acetyl-L-carnitin (ALC) in Kombination mit Taxol bei der Taxol-induzierten Neutropenie auszuwerten, wurden die Tiere mit ALC plus Taxol und mit Taxol oder ALC alleine behandelt. Bei diesem Modell wurde die Menge der zirkulierenden Neutrophile gemessen.
  • Es wurde festgestellt, daß Taxol eine signifikante Reduktion bei neutrophilen Granulozyten innerhalb von nur 6 Stunden nach der dritten Injektion induziert und somit eine ernsthafte Neutropenie mit einem Fußpunkt nach der 3. bis 4. Injektion auftritt.
  • Das innere Salz von Acetyl-L-carnitin (sterile Ampulle), löslich gemacht in Wasser für injizierbare Präparate, wurde verwendet. Jede Ampulle von ALC wird in 4 ml Wasser für Injektionen aufgelöst (Lösung 0). 2 ml von (0) werden mit sterilem PBS (Sigma) bis zu 25 ml gebracht, unter Erhalt von 10 mg/ml für die subkutane Verabreichung (100 mg/kg/10 ml); 0,8 ml von (0) werden auf 50 ml mit PBS gebracht, unter Erhalt von 2 mg/ml für die orale Verabreichung (100 mg/kg/50 ml).
  • Taxol (Paclitaxel (INDENA)) wird gewogen, in dem zuvor hergestellten spezifischen Vehikel (Cremophor® EL (BASF), 1:1 mit Ethanol verdünnt) löslich gemacht und bei +4°C gelagert und vor Licht geschützt. Bei der Verwendung wird die 12 mg/ml-Lösung 1:4 mit Saline in Phosphatpuffer (PBS) (SIGMA) verdünnt und i.p. injiziert (30 mg/kg/10 ml).
  • Die essentiellen experimentellen Indikationen werden nachfolgend angegeben.
    Tiere: weibliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 18-20 g (Harlan)
    Bedingungen zum Halten der Tiere: 4 bis 5 Mäuse pro Käfig, Temperatur 22 ± 2°C, relative Feuchtigkeit 55 ± 15 %, Luftänderungen 15-20/h; 12 h Licht/Dunkel-Zyklus (7,00 a.m. bis 7.00 p.m. Licht); Makrolon-Käfige (26,7 × 20,7 × 14 cm) mit nicht-rostenden Streifenabdeckungen; entstaubt, steril, Maiskolbenschälabfälle.
    Diät: 4RF21-Futter (Firma: Mucedola), Nahrung und Wasser erhältlich "ad libitum".
  • Die Randomisierung ist in Blöcken von Tieren zwanglos, d.h. der Tiergehäusebegleiter transferiert die Mäuse von den Boxen zu den Käfigen, wobei ein Käfig zu einem Zeitpunkt vervollständigt wird. In einer zweiten Phase identifiziert der Begleiter provisorisch alle Mäuse, wiegt diese und wenn die Gewichte signifikante Unterschiede zwischen Gruppen präsentieren, bewegt er die Tiere von einem Käfig zum anderen, wobei die Zahl der Tiere pro Käfig unverändert bleibt, so daß die Gesamtgewichte zwischen einem Käfig und einem anderen gut zusammenpassen. Jeder Käfig wird mit einer Karte, die die Zahl der Gruppe aufweist, der Art der Behandlung (injizierte Substanz und/oder Substanzen, Dosis, Verabreichungsroute) markiert. Jedes Tier wird mit einer Zahl von 1 bis 5 identifiziert, die an dem Schwanz mit unauslöschlicher Tinte geschrieben ist.
  • Tiergewicht: die Mäuse werden vor Beginn der Behandlung und am Tag 5 oder 7 und am Tag 11 gewogen.
  • Die Tiere wurden vom Tag 1 bis zum Tag 10 mit den Molekülen behandelt; Taxol oder der Vehikel wurden an alternierenden Tagen an den Tagen 5, 7, 9 und 11 verabreicht.
  • Die Gruppen sind: 1) Blanko, 2) Vehikel + PBS, 3) Taxol, 4) Taxol + ALC), 5) ALC, 6) ALC + Vehikel. Die Tiere werden 6 Stunden nach der letzten Taxol-Injektion getötet.
  • Blut- und Knochenmarksproben werden 6 Stunden nach der letzten Behandlung mit Taxol oder Vehikel gezogen. Die Mäuse werden mit CO2 anästhetisiert; Blut wird von dem retroorbitalen Plexus (0,5 ml Blut/Maus) gezogen und in Eppendorf-Teströhren mit 10 μl Visterheparin (5000 U/ml) gegeben. Die Tiere werden durch Zervikaldislokation getötet. Später werden die Knochenmarksproben gezogen.
  • Eine Blutprobe und eine Knochenmarksprobe pro Maus werden bei verschiedenen Zeiten gezogen.
  • Blutzellzählung
  • Vor dem Beginn der WBC (weiße Blutzellen)-Zählung wird das Instrument durch Messen der EMACHECK-Blutprobenparameter (menschlicher Check), geliefert von Delcon, überprüft.
  • Das Instrument wird entsprechend den Instruktionen verwendet, die in dem Bedienhandbuch angegeben sind. Das Blut (25 μl) wird von dem Verdünner gezogen und auf ein Volumen mit 10 ml mit isotonischer Lösung (PLTA-Salin, Delcon) in ein Becherglas (verdünnt 1:400) gebracht (Lösung A). Von der Lösung A nimmt der Verdünner 100 μl und bringt diese auf 10 ml (Verdünnung 1:100) in einem anderen Becherglas (Lösung B). Zu der Lösung A werden 3 Tropfen Lysemittel (Emosol, Delcon) gegeben, die Lösung wird von Hand gemischt und für ungefähr 2 Minuten wirken gelassen, so daß die roten Blutzellen lysiert werden und HBG (Hämoglobin) freigesetzt wird. Die Lösung A, die das Lysemittel umfaßt, wird für die WBC- und Hämoglobin (HGB)-Ablesungen verwendet. Die Lösung B wird für die RBC- und Plättchen (PLT)-Ablesungen verwendet.
  • Doppelablesungen erfolgen bei jeder Probe, und zwischen einer Probe und der nächsten wird das Instrument unter Verwendung von isotonischer Lösung gewaschen.
  • Superfrost plus-Objektträger (25 × 75 × 10 mm) (Mensel-Glaser), fertig für die Verwendung, werden verwendet. Das Blut (8 μl) wird auf der rechten Seite des Objektträgers niedergeschlagen, ein anderer Objektträger, angeordnet bei einem Winkel von 45° zur Linken des Blutes, wird zurückgezogen, bis es mit dem Tropfen in Kontakt gelangt, der sich schnell entlang der Kontaktlinie zwischen den beiden Objektträgern verteilt; der Objektträger wird vorwärts mit einer glatten, schnellen Bewegung bewegt, unter Erhalt eines dünnen Blutfilmes. Der Objektträger wird an Luft getrocknet, mit Diff-Quick (DADE)-Farbstoff entsprechend den beigefügten Instruktionen gefärbt und erneut an Luft getrocknet.
  • Die Objektträger werden in Histolemon-Lösung (Carlo Erba) 2 s getaucht; 1 Tropfen eines synthetischen Aufziehklebers (Shandon) wird an der Mitte des Objektträgers niedergeschlagen und ein Abdeck-Objektträger wird darübergelegt, wobei der gesamte Blutflecken abgedeckt wird, wobei dafür Sorge getragen wird, daß keine Blasen zwischen den beiden Objektträgern auftreten. Die Objektträger werden getrocknet und dann erfolgt die WBC-Zählung bis zu 100 mit einem optischen Mikroskop nach Niederschlagen eines Tropfens Zedernöls auf dem Objektträger.
  • Die Quantität von WBC/ml, ermittelt unter Verwendung des Hämocytometers, wird mit dem Prozentsatz der entsprechenden neutrophilen Granulozyten der Leukozytenformel multipliziert. Dieser Parameter, dividiert durch 100, drückt den Wert der Neutrophilen/mm3 Blut aus.
  • Die folgenden werte werden als normale Parameterwerte angesehen: für WBC, gezählt auf dem Hämocytometer, Werte von bis 18 000/mm3; für den Prozentsatz der Neutrophilen, gezählt auf dem Objektträger, Werte von bis zu 18 %; für die absoluten gezählten Neutrophilen, Werte von bis zu 1800.
  • Die Daten werden als Mittelwerte ± SE ausgedrückt. Der Vergleich zwischen den neutrophilen Granulozyten-Werten, erhalten für die unterschiedlichen Gruppen, erfolgt unter Verwendung von ANOVA. Abnormale Werte werden dem Dixon-Test unterworfen.
  • Die Taxol-Behandlung (30 mg/kg i.p. alle 2 Tage für insgesamt 4-mal) verursachte eine signifikante Neutropenie 6 Stunden nach der letzten Injektion des Mittels (-90 % neutrophile Granulozyten im Vergleich zu blanko, p<0,001). Es wurde festgestellt, daß die orale oder subkutane Verabreichung von Acetyl-L-carnitin (100 mg/kg) die Polymorphonukleate gegenüber Taxol-induzierter Schädigung schützte (8-43 % sc; -23 % Os) (Tabelle 4).
  • Bei einem anderen Experiment verursachte die Kombination von ALC + Taxol eine 73%ige Reduktion bei Neutrophilen im Vergleich zur 98%igen Reduktion, erhalten nach Verabreichung von Taxol alleine. Die Verabreichung von ALC oder einem Vehikel + ALC verursachte keine Änderung bei Neutrophilen im Vergleich zu dem Vehikel alleine oder zu den unbehandelten Tieren (blanko) Tabelle 3.
  • 3 Tage nach der letzten Verabreichung von Taxol begannen die neutrophilen Granulozyten sich wiederzugewinnen (-64 % gegenüber Vehikel), aber die Wirkung ist noch deutlicher nach einer kombinierten Behandlung mit ALC + Taxol (-26 % gegenüber Vehikel). In diesem Fall verursachte ebenfalls die Verabreichung von ALC oder von Vehikel + ALC keine Änderungen bei den Neutrophilen im Vergleich zum Vehikel alleine oder unbehandelten Tieren (blanko) (Tabelle 4). Tabelle 3 Wirkung von ALC auf Taxol-induzierte Neutropenie bei BALB/c-Mäusen Tötung 6 Stunden nach der letzten Taxol-Verabreichung
    Figure 00160001
    • Die Daten sind Mittelwerte ± SE.
    • **** P<0,0001 gegenüber Vehikel; °° P<0,05 gegenüber Taxol (ANOVA).
    Tabelle 4 Wirkung von ALC auf Taxol-induzierte Neutropenie bei BALB/c-Mäusen Tötung 3 Tage nach der letzten Taxol-Verabreichung
    Figure 00170001
    • Die Daten sind Mittelwerte ± SE.
    • **** P<0,0001; ** P<0,01 gegenüber Vehikel; °°° P<0,01 gegenüber Taxol (ANOVA).
  • Taxol, das viermal an alternierenden Tagen verabreicht wurde, induziert eine ernsthafte Neutropenie. Die orale Verabreichung von ALC ist in der Lage, einen signifikanten Schutz gegenüber der schädigenden Wirkung von Taxol zu ergeben.
  • Beispiel 5
  • Wirkung der Verabreichung von Acetyl-L-carnitin (ALC) in Kombination mit Taxol i.v. auf die Neutropenie in der Maus
  • Im wesentlichen wurde Beispiel 4 wiederholt mit Ausnahme der Taxol-Verabreichungsroute, die in diesem Fall intravenös war, d.h. unter den tatsächlichen klinischen Anwendungsbedingungen.
  • Die experimentellen Schemata und Messungen waren gleich wie sie bei dem vorhergehenden Beispiel beschrieben sind.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 und 6 angegeben. Tabelle 5 Wirkung von ALC auf Taxol-induzierte Neutropenie bei BALB/c-Mäusen Tötung 6 Stunden nach der vierten Taxol-Verabreichung
    Figure 00180001
    • Die Daten sind Mittelwerte ± SE.
    • **** P<0,0001 und P<0,01 gegenüber Vehikel; °°°° P<0,0001 gegenüber Taxol (ANOVA).
    Tabelle 6 Wirkung von ALC auf Taxol-induzierte Neutropenie bei BALB/c-Mäusen Tötung nach 3-tägiger Wiedergewinnung von der letzten Taxol-Verabreichung (54 mg/kg/15 ml)
    Figure 00180002
    • Die Daten sind Mittelwerte ± SE.
    • **** P<0,0001 und P<0,01 gegenüber Vehikel; °°°° P<0,0001 gegenüber Taxol (ANOVA).
  • Diese Ergebnisse bestätigen die Schutzwirkung von oral verabreichtem ALC.
  • Beispiel 6
  • Wirkung der Verabreichung von Acetyl-L-carnitin (ALC) in Kombination mit Taxol auf die Neutropenie in Mäusen mit L-MM3-Carcinoma der Brust und Auswertung der Antikrebswirkung
  • In einer Studie, durchgeführt entsprechend Good Laboratory Practice (GLP) zur Auswertung der Wirkung von Acetyl-L-carnitin (ALC) in Kombination mit Taxol auf das Tumorwachstum, wurden Balb/c-Mäuse mit Mäuse-Krebs der Brust (L-MM3) geimpft und die Tiere wurden sowohl mit ALC plus Taxol als auch mit Taxol oder ALC alleine behandelt. Zusätzlich wurde bei diesem Tumormodell die Menge der zirkulierenden Neutrophile gemessen.
  • Das innere Salz von Acetyl-L-carnitin (sterile Ampulle), löslich gemacht in Wasser für injizierbare Präparate, wurde verwendet. Jede Ampulle von ALC wird in 4 ml Wasser für Injektionen (Lösung 0) aufgelöst. 0,8 ml (O) werden auf 50 ml mit sterilem PBS (Sigma) gebracht, zur Durchführung der oralen Verabreichung (100 mg/kg/50 ml).
  • Taxol (Paclitaxel (INEDNA)) wird gewogen, in dem zuvor hergestellten spezifischen Vehikel (Cremophor® EL (BASF), 1:1 verdünnt mit Ethanol) löslich gemacht und bei +4°C geschützt von Licht gelagert. Zum Zeitpunkt der Verwendung wird die 12 mg/ml-Lösung 1:4 mit Saline in Phosphat-Puffer (PBS) (SIGMA) verdünnt und i.p. (30 mg/kg/10 ml) injiziert.
  • Die essentiellen experimentellen Indikationen werden nachfolgend angegeben:
    Tiere: 120 weibliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 18-20 g (Harlan),
    Tiergehäusebedingungen: 5 Mäuse pro Käfig; Temperatur 22 ± 2°C;
    relative Feuchtigkeit 55 ± 15 %; Luftänderungen 15-20/h; 12 h Licht/Dunkel-Zyklus (7.00 a.m. bis 7.00 p.m. Licht); Makrolon-Käfige (26,7 × 20,7 × 14 cm) mit nicht-rostenden Streifenabdeckungen; entstaubt, steril, Maiskolben-Schälreste.
    Diät: 4RF21-Futter (Firma: Mucedola), Futter und Wasser erhältlich "ad libidum".
  • Die Randomisierung ist in Blöcken von Tieren zwanglos, d.h. der Tiergehäusebegleiter transferiert die Mäuse von Boxen in die Käfige, wobei ein Käfig zu einem Zeitpunkt vervollständigt wird. In einer zweiten Phase identifiziert der Begleiter provisorisch alle Mäuse, wiegt diese und wenn die Gewichte signifikante Unterschiede zwischen Gruppen präsentieren, bewegt er die Tiere von einem Käfig in einen anderen, wobei die Zahl der Tiere pro Käfig beibehalten wird. Dieser Käfig wird mit einer Karte, die die Anzahl der Gruppe, die Art der Behandlung (injizierte Substanz und/oder Substanzen, Dosis, Verabreichungsroute) trägt. Jedes Tier wird mit einer Zahl von 1 bis 5 identifiziert, die auf dem Schwanz mit unauslöschlicher Tinte geschrieben ist.
  • Tiergewicht: Die Mäuse werden vor dem Beginn der Behandlung und am Tag der letzten Taxol-Injektion gewogen.
  • Behandlungsschema 1: Die transplantierbaren Mäusebrustkrebszellen (L-MM3) mit Balb/c-Ursprung werden bei 37°C in Plastikkolben in einem 5 % CO2 angefeuchteten Inkubator in DMEM-Medium mit 5 % wärmeinaktiviertem FCS, L-Glutamin 2 mM und Gentamicin 80 μg/ml zum Wachsen gebracht. Zum Zeitpunkt der Impfung werden die Zellen mit Trypsin-EDTA abgelöst und in dem gleichen Medium ohne PBS resuspendiert.
  • Nicht-anästhetisierte weibliche Balb/c-Mäuse erhielten subkutane Injektionen in die Flanke von 4 × 105 Zellen in 0,2 ml DMEM.
  • Vier Tage nach der Impfung des Tumors wurden die Tiere mit den Molekülen entsprechend dem folgenden Schema zur Auswertung der Neutropenie behandelt:
    Figure 00200001
  • ALC wird dann 10 Tage verabreicht, die Tiere werden nach 6 Stunden getötet.
  • Die experimentellen Gruppen, jeweils bestehend aus 15 Mäusen, sind:
    Figure 00200002
  • Behandlungsschema 2: Die gleichen experimentellen Gruppen, die oben erwähnt sind, jeweils bestehend aus 15 Mäusen (mit unterschiedlichen Käfignummern) werden wie folgt zu Auswertung der Überlebensrate und der Tumorgröße behandelt.
  • Figure 00200003
  • Die ALC-Verabreichung dauert 14 Tage (in den Gruppen 16, 17, 18) und der Tumor wird gemessen, bis er eine Größe von ungefähr 2 cm erreicht. Die Tiere werden 100 Tage am Leben gelassen.
  • Die experimentellen Gruppe, jeweils aus 15 Mäusen bestehend sind:
    Gruppe Käfig Nr.
    - Tumor + Vehikel 13, 14, 15
    - Tumor + Taxol + ALC 16, 17, 18
    - Tumor + Taxol 19, 20, 21
    - Tumor + Vehikel + ALC 22, 23, 24
    Tabelle der Behandlungen und Tötungen
    Tag Käfig
    1 Impfung: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22
    2 Impfung: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23
    3 Impfung: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24
    4 ALC: 4, 16, 10, 22
    5 ALC: 4, 5, 16, 17, 10, 22, 11, 23
    6 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24
    7 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24
    8 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24 Vehikel: 1, 13, 10, 22 Taxol: 4, 7, 16, 19
    9 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24 Vehikel: 2, 14, 11, 23 Taxol: 5, 8, 17, 20
    10 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24 Vehikel: 1, 3, 13, 15, 10, 22, 12, 24 Taxol: 4, 6, 7, 9, 16, 18, 19, 21
    11 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24 Vehikel: 2, 14, 11, 23 Taxol: 5, 8, 17, 20
    12 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24 Vehikel: 1, 3, 13, 15, 10, 22, 12, 24 Taxol: 4, 6, 7, 9, 16, 18, 19, 21
    13 ALC: 4, 5, 6, 16, 17, 18, 10, 22, 11, 23, 12, 24 Vehikel: 2, 14, 11, 23 Taxol: 5, 8, 17, 20
    14 ALC: 5, 6, 17, 18, 11, 23, 12, 24, 16, 22 Vehikel: 1, 3, 13, 15, 10, 22, 12, 24
    Taxol: 4, 6, 7, 9, 16, 18, 19, 21 Tötung 6 h nach der letzten Taxol-Verabreichung in: 1, 4, 7, 10 + 3 Blanko-Tiere
    15 ALC: 6, 18, 12, 24, 16, 22, 17, 23 Vehikel: 2, 14, 11, 23 Taxol: 5, 8, 17, 20 Tötung 6 h nach der letzten Taxol-Verabreichung in: 2, 5, 8, 11 + 3 Blanko-Tiere
    16 ALC: 16, 22, 17, 23, 18, 24 Taxol: 6, 9, 18, 21 Vehikel: 3, 15, 12, 24 Tötung 6 h nach der letzten Taxol-Verabreichung in: 3, 6, 9, 12 + 4 Blanko-Tiere
    17 ALC: 16, 22, 17, 23, 18, 24
    18 ALC: 17, 23, 18, 24
    19 ALC: 18, 24
  • Die Tumorgröße (Länge und Breite) wird zweimal pro Woche mit einem Zirkel von dem Zeitpunkt an gemessen, wenn der Tumor meßbar ist. Die Tumorgröße wird in cm ausgedrückt und entsprechend der folgenden Formel ausgewertet: √ (Länge × Breite). Tumormeßschema
    Tag nach der Impfung Käfig (umfassend 5 Mäuse)
    22 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24,
    23 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24
    28 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24,
    30 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24,
    35 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24
    36 13, 16, 19, 22,
    14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24
    42 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24
    44 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24
    49 13, 16, 19, 22, 14, 17, 20, 23, 15, 18, 21, 24
  • Blut- und Knochenmarkproben werden von den Tieren des ersten Behandlungsschemas gezogen. An dem Tag, an dem sie getötet werden, werden die Mäuse mit CO2 anästhetisiert; Blut wird von dem retroorbitalen Plexus (0,5 ml Blut/Maus) gezogen und in Eppendorf-Teströhren mit 10 μl Vister-Heparin (5000 U/ml) angeordnet. Die Tiere werden durch Zervikaldislokation getötet. Später werden die Knochenmarksproben gezogen.
  • Eine Blutprobe und eine Knochenmarksprobe pro Maus werden zu verschiedenen Zeitpunkten gezogen.
  • Blutzellzählung
  • Vor Beginn der WBC-Zählung wird das Instrument durch Messen der EMACHECK-Blutproben-Parameter (menschlicher Check), geliefert von Delcon, überprüft.
  • Das Instrument wird entsprechend den Anweisungen gemäß Bedienhandbuch verwendet. Das Blut (25 μl) wird von dem Verdünner gezogen und auf ein Volumen von 10 ml mit isotonischer Lösung (PLTA Saline, Delcon) in einem Becherglas (Verdünnung 1:400) (Lösung A) gebracht. Von der Lösung A nimmt der Verdünner 100 μl und bringt diese auf 10 ml (Verdünnung 1:100) in einem anderen Becherglas (Lösung B). Zu der Lösung A werden drei Tropfen Lysemittel (Emosol, Delcon) gebracht, die Lösung wird von Hand gemischt und kann ungefähr 2 Minuten agieren, so daß die roten Blutzellen lysiert werden und HGB (Hämoglobin) freigelassen wird. Die Lösung A mit dem Lösemittel wird für die WBC- und Hämoglobin (HGB)-Ablesungen verwendet. Die Lösung B wird für RBC- und Plättchen (PLT)-Ablesungen verwendet.
  • Doppelablesungen erfolgen bei jeder Probe, und zwischen einer Probe und der nächsten wird das Instrument unter Verwendung von isotonischer Lösung gewaschen.
  • Superfrost plus-Objektträger (25 × 75 × 1) (Mensel-Glaser), die für die Verwendung fertig sind, werden verwendet. Das Blut (8 μl) wird auf der rechten Seite des Objektträgers niedergeschlagen; ein anderer Objektträger wird mit einem Winkel von 45° zu der linken Seite des Blutes angeordnet, zurückgezogen, bis es mit dem Tropfen in Kontakt gelangt, der sich schnell entlang der Kontaktlinie zwischen den beiden Objektträgern verteilt; der Objektträger wird vorwärts mit einer glatten, schnellen Bewegung bewegt, unter Erhalt eines dünnen Blutfilms. Der Objektträger wird an Luft trocknen gelassen, mit Diff-Quick (DADE)-Farbstoff entsprechend den beigefügten Instruktionen gefärbt und erneut an Luft getrocknet.
  • Die Objektträger werden in Histolemon-Lösung (Carlo Erba) 2 Sekunden getaucht; ein Tropfen eines synthetischen Aufziehklebers (Shandon) wird an der Mitte des Objektträgers niedergeschlagen, und ein Abdeck-Objektträger wird darüber angeordnet, so daß der gesamte Blutflecken abgedeckt wird, wobei dafür Sorge getragen wird, daß zwischen den beiden Objektträgern keine Blasen entstehen. Die Objektträger werden getrocknet, und dann erfolgt die WBC-Zählung bis zu 100 mit einem optischen Mikroskop nach Niederschlagen eines Tropfens Zedernöl auf dem Objektträger.
  • Die Menge an WBC/ml, untersucht unter Verwendung des Hämocytometers, wird mit dem Prozentsatzwert der entsprechenden neutrophilen Granulocyten der Leukozytenformel multipliziert. Diese Parameter, dividiert durch 100, drückt den Wert von Neutrophilen/mm3 Blut aus.
  • Ein Vergleich zwischen den neutrophilen Granulozyten-Werten, erhalten für die unterschiedlichen Gruppen, erfolgt unter Verwendung von ANOVA. Tumorgrößen werden unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney-Tests für ungepaarte Daten verglichen.
  • Die Taxol-Behandlung (30 mg/kg i.p. alle 2 Tage insgesamt 4-mal) verursachte eine signifikante Reduktion der Polymorphonukleate (-93 % gegenüber Vehikel, p<0,0001) in der Maus, die mit L-MM3-Mausbrustkrebs geimpft ist. Die orale Verabreichung von Acetyl-L-carnitin (100 mg/kg einmal täglich für 10 Tage), kombiniert mit der Behandlung mit Taxol erwies sich als in der Lage, der Taxol-induzierten Reduktion bei neutrophilen Granulozyten signifikant gegenzuwirken (335/mm3 gegenüber 65/mm3, °°p<0,01) (Tabelle 7).
  • Es wurde festgestellt, daß Taxol, injiziert entsprechend dem gleichen Schema, das für die Auswertung der neutrophilen Granulozyten (30 mg/kg i.p. alle zwei Tage für insgesamt 4-mal) injiziert wurde, signifikant das L-MM3-Tumorwachstum injibiert, das aufgezeichnet wurde, bis die Tumorgröße unge fähr 2 cm in der Kontrollgruppe erreichte (0,56 cm gegenüber 1,8 cm, p<0,0001). Die kombinierte Behandlung mit oral verabreichtem ALC für 14 Tage (100 mg/kg einmal täglich) plus Taxol (30 mg/kg i.p. alle 2 Tage für insgesamt 4-mal) beeinflußte die Antikrebsaktivität von Taxol nicht. Als Zusammenfassung verursachte bei diesem Tumormodell ebenfalls Taxol eine ernsthafte Neutropenie und ALC, das kontinuierlich über einen Zeitraum verabreicht wurde, bei dem diese Art von Knochenmarkstoxizität auftritt, war in der Lage, die Taxol-induzierte Reduktion von Polymorphonukleaten zu verhindern. Gleichzeitig beeinflußte die Wirkung von ALC nicht die Antikrebsaktivität von Taxol. Tabelle 7 Wirkung von ALC auf Taxol-induzierte Neutropenia in BALB/c-Mäusen, geimpft mit Mäusekarzinom der Brust (L-MM3) Tötung 6 Stunden nach der letzten Taxol-Verabreichung
    Figure 00250001
    • Die Daten sind Mittelwerte ± SE.
    • **** P<0,0001 *** P<0,001 gegenüber Vehikel; °° P<0,01; °°° P<0,001 gegenüber Taxol (ANOVA).
  • Auswertung der Wirkung von Acetyl-L-carnitin (ALC) auf die Antikrebswirkung von Taxol bei M109-Mäuselungenkrebs
  • Taxol erwies sich als wirksam bei der Behandlung von Krebs der Ovarien, Brust und Lunge und bei anderen Krebsarten (Rowinsky, E.K. und R.C. Donehower (1991); Pharmacol. Ther. 52:35). Die Antikrebswirkung dieser Verbindung hängt hauptsächlich mit ihrer Fähigkeit zusammen, die Depolymerisation von Mikrotubuli in Tubulin-Monomeren zu inhibieren (Schiff, P.B., J. Fant, und S.B. Horwitz 1979, Nature); diese Wirkung blockiert die proliferierenden Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus, d.h. zwischen der letzten Stufe der Interphase, bei der die DNA-Synthese vollendet wird, und der anschließenden Periode der Zellunterteilung oder Mitose, und dies führt in der Zelle zum Beginn einer Kaskade von Ereignissen, die für den apoptotischen Prozeß typisch sind. Taxol ist darüber hinaus wie andere Chemotherapeutika mit Nebenwirkungen wie Neuropathien und Myelosuppression verbunden.
  • Beim Vergleich der statistischen Daten, erhalten in den Gruppen der Tiere, die mit Vehikel alleine behandelt sind, und solchen, die mit Taxol in Kombination mit oral verabreichtem Acetyl-L-carnitin behandelt sind, wurde eine statistisch signifikante Reduktion der Tumormasse in der zuletzt genannten bei allen Beobachtungszeiträumen festgestellt. Im Gegensatz dazu ergab der Vergleich der Gruppe, die mit Vehikel alleine behandelt ist, und der, die mit Vehikel in Kombination mit der Verabreichung von Acetyl-L-carnitin behandelt wurde, keine statistisch signifikanten Unterschiede beim Tumormassenwachstum zu irgendeinem Beobachtungszeitraum. Die Analysen der Daten, die sich auf dem Vergleich zwischen der mit Taxol behandelten Gruppe und der mit Taxol in Kombination mit Acetyl-L-carnitin behandelten Gruppe bezogen, zeigte keine signifikanten Unterschiede bei Tumorgewicht. Im Hinblick auf die Analyse der Zahl der Metastasen zeigen die erhaltenen Daten eine statistisch signifikante Reduktion der Zahl bei den Gruppen, die mit Taxol, mit Taxol in Kombination mit Acetyl-L-carnitin und mit Vehikel in Kombination mit Acetyl-L-carnitin behandelt wurden, im Vergleich zu der Gruppe, die mit Vehikel alleine behandelt wurden. Insbesondere zeigten die Mäuse, die mit Taxol oder mit Taxol in Kombination mit Acetyl-L-carnitin behandelt wurden, ebenfalls eine Reduktion beim Durchmesser der Metastasen im Vergleich zu den Gruppen, die mit Vehikel alleine oder mit Vehikel in Kombination mit Acetyl-L-carnitin behandelt wurden. Auf der Basis der Analyse der folgenden Daten können wir daher angeben, daß Acetyl-L-carnitin mit der Antikrebswirkung von Taxol bezüglich der Inhibition der Tumormasse nicht interferiert. Zusätzlich zeigte Acetyl-L-carnitin eine signifikante Inhibitionswirkung auf die Bildung von Lungenmetastasen.
  • Die folgenden Beispiele erläutern diesen weiteren Aspekt der Erfindung.
  • Beispiel 7
  • Auswertung der Wirkung von Acetyl-L-carnitin (ALC) auf die Antikrebswirkung von Taxol bei Mäusen mit M109-Lungenkrebs
  • In einer Studie, die entsprechend Good Laboratory Practice (GLP) durchgeführt wurde, zur Auswertung der Wirkung von Acetyl-L-carnitin (ALC) in Kombination mit Taxol auf das Tumorwachstum wurden Balb/c-Mäuse mit Mauslungenkrebs (M109) geimpft und die Tiere wurden sowohl mit ALC plus Taxol als auch mit Taxol oder ALC alleine behandelt. Zusätzlich wurde bei diesem Tumormodell die Menge der zirkulierenden Neutrophile gemessen.
  • Das innere Salz von Acetyl-L-carnitin (sterile Ampulle, 0,5 g), löslich gemacht in Wasser für injizierbare Präparate, wurde verwendet. Jede Ampulle wird in 4 ml des vorbereiteten Lösungsmittels aufgelöst (Lösung 0). Genauer ausgedrückt werden 1,6 ml Lösung 0 auf 40 ml mit steriler Pufferlösung (PBS, Sigma P-4417) gebracht und dann oral verabreicht (100 mg/kg/20 ml).
  • Taxol (Paclitaxel (INDENA), Cod. 3926570) wird gewogen, in dem spezifischen Vehikel (Cremophor® EL (BASF), 1:1 verdünnt mit Ethanol) gelöst und bei +4°C abgeschirmt vor Licht gelagert. Vor dem Zeitpunkt der Verwendung werden die 12 mg/ml Lösung 1:4 mit Saline in Phosphatpuffer (PBS) (SIGMA) verdünnt und i.p. injiziert (30 mg/kg/10 ml).
    Tiere: 60 weibliche Balb/c-Mäuse mit einem Gewicht von 18 g (Harlan). Tierhausbedingungen: 5 Mäuse pro Käfig; Temperatur 22 ± 2°C; relative Feuchtigkeit 55 ± 15 %; Luftänderungen 15-20 /h; 12 h Licht/Dunkelzyklus (7.00 a.m. bis 7.00 p.m. Licht); Makrolon-Käfige (26,7 × 20,7 × 14 cm) mit nicht-rostenden Streifenabdeckungen; entstaubt, steril, Maiskolbenschälreste.
    Diät: 4RF21-Futter (Firma: Mucedola), Futter und Wasser "ad libidum" erhältlich.
    Randomisierung: In Tierblöcken zwanglos.
    Tiergewicht: Die Mäuse werden in der Behandlung und dann eine Woche bis zum Ende des Experimentes gewogen.
  • M109 Tumorzellen, isoliert vom festen Tumor.
  • Die von E. Kedar, B. Ikejiri, G.D. Bannard und R.B. Herberman (Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18; 991: 1982) beschriebene Vorgehensweise wird mit Modifizierungen angewandt. Eine Balb/c-Maus (Donor) wurde durch Zervikaldislokation getötet und nach Waschen des Rückens mit denaturiertem Alkohol wurde die Dorsalhaut longitudinal in zwei Lappen geschnitten, die abgelöst wurden, zur Entfernung der Tumormasse. Die zuletztgenannte wurde auf sterile Gaze angeordnet, wo sie von anhaftenden Gewebeadhäsionen und nekrotischen und hämorrhagischen Teilen befreit wurde. Das Untersuchungsgewebe wurde in eine Platte mit PBS mit Ca++ und Mg++ (Gibco) bei pH 7,2 angeordnet und gekühlt, in Stücke mit 2 bis 3 mm gebrochen und in einer Lösung (15 ml Lösung/g Tumor) PBS mit Ca++ und Mg++ resuspendiert, pH 7,2, umfassend 2 mg/ml Trypsin (Typ III, 10000 U/mg Protein, Sigma-Aldrich), 2 mg/ml Collagenase (Typ I-S 180 U/mg Feststoff, Sigma), 0,2 mg/ml DNAse (Typ I 1548 U/mg Protein, Sigma) und 25 μg/ml Gentamicin (Sigma) und 15 Minuten bei 37°C unter konstantem Rühren inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann mit Hilfe eines Potters (B. Braun) 2 Minuten lang homogenisiert, bei 37°C 10 Minuten lang inkubiert und mild mehrere Male mit einer Spritze mit einer sterilen Nadel mit Nr. 21 aspiriert. Nach Zugabe von 30 ml RPM2-1640 (Eurobio), umfassend 10 % FBS (Eurobio), gehalten bei 4°C, wurde die Zellsuspension auf steriler Gaze filtriert und dann bei 700 g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mild in RPMI-1640, umfassend 10 % FBS und 0,2 mg/ml DNAse (Sigma) resuspendiert und dann 10 Minuten bei 700 g zentrifugiert. Das Pellet wurde aufeinanderfolgend zweimal mit RPMI-1640 gewaschen; am Ende des letzten Waschens wurde das Pellet mild in RPM2-1640 resuspendiert, zur Durchführung der Zählung, zur Ermittlung der Zellkonzentration.
  • Zellzählung unter dem Mikroskop: Die Zellzählung wird durch den Trypan-Blue-Vitalflecken-Exklusionstest durchgeführt; die Tumorzellen werden geeignet mit 0,4 % Trypan-Blue (Sigma), einem zentralen Färbemittel verdünnt, das es ermöglicht, zwischen lebensfähigen und toten Zellen zu unterscheiden. Die Verdünnung, umfassend die zu zählenden Zellen, wurde mild gerührt, 10 μl wurden entfernt und zum Aufbauen in einer Burker-Kammer verwendet. Ein Quadratgitter, abgegrenzt durch die drei Dreifachlinien wurde verwendet, umfassend 16 kleine Quadrate (4 × 4), die voneinander durch Doppellinien abgetrennt waren, wurde verwendet. Sowohl lebensfähige Zellen (die ein durchsichtiges Aussehen aufweisen) als auch tote Zellen (die blau aussehen und die Färbung aufgenommen haben) wurden im Inneren des Quadrates, das durch die Mittellinie und die Dreifachlinien gebildet war, oder auf der Linie selbst ermittelt. Der Vorgang wurde für weitere drei Quadrate wiederholt, und danach wurde die Summe der in jedem Quadrat gezählten Zellen berechnet und der arithmetische Mittelwert wurde für die Ablesungen bestimmt, die in den vier Quadraten erfolgten. Der arithmetische Mittelwert der lebensfähigen Zellen wurde mit dem verwendeten Verdünnungsfaktor und den spezifischen Leistungsfaktor für die Art der für die Zählung verwendeten Kammer (104) multipliziert, unter Erhalt der Zahl der lebensfähigen Zellen, die in 1 ml enthalten sind. Das Verhältnis des arithmetischen Mittelwertes der lebensfähigen Zellen zu dem arithmetischen Mittelwert der Gesamtzellen, multipliziert mit 100, drückt den Prozentsatz der Zellebensfähigkeit aus.
  • Impfbedingungen: 60 nicht-anästhetisierte Balb/c-Mäuse mit einem Gewicht von ungefähr 18 g (Harlan) erhielten i.m. Injektionen von 3 × 105 M109 Lungenkrebszellen in 0,1 ml RPMI-1640 (Sigma) in die rechte Hinterpfote.
  • Behandlungsschema: Zur Auswertung der Tumorgröße bei den experimentellen Studiengruppen, jeweils bestehend aus 15 Balb/c-Mäusen, wurden 3 × 105 M109 Lungenkrebszellen geimpft, und die Studienmoleküle wurden bei den vorgesehenen Zeiten verabreicht. ALC wurde bei der Dosis von 100 mg/mk (os) vom Tag 4 bis zum Tag 17 verabreicht. Der Vehikel, 1:4 verdünnt mit PBS von der Mutterlösung wurde i.p. an den Tagen 8, 10, 12 und 14 verabreicht. Taxol wurde mit der Dosis von 30 mg/kg (i.p.) an den Tagen 8, 10, 12 und 14 wie in dem folgenden Schema beschrieben verabreicht:
    Figure 00290001
  • Die Tiere wurden bis zum Tag 22 nach Impfung der M109-Mäuselungenkrebszellen unter Beobachtung gehalten und wurden dann getötet, und die Lungen wurden entfernt zur Bestimmung der Anzahl der Metastasen.
  • Die experimentellen Gruppen, die jeweils 15 Mäuse umfaßten, sind:
    Gruppe Käfig Nr.
    Tumor + Vehikel + ALC 1, 2, 3
    Tumor + Taxol + ALC 4, 5, 6
    Tumor + Taxol 7, 8, 9
    Tumor + Vehikel 10, 11, 12
    Behandlungstabelle:
    Tag Behandlung Käfig Nr.
    1 Zellinokulation 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12
    2 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    3 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    4 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    5 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    6 ALC TAX VEHIC 1, 2, 3, 4, 5, 6 4, 5, 6, 7, 8, 9 1, 2, 3,10, 11, 12
    7 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    8 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    TAX VEHIC 4, 5, 6, 7, 8, 9 1, 2, 3, 10, 11, 12
    9 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    10 ALC TAX VEHIC 1, 2, 3, 4, 5, 6 4, 5, 6, 7, 8, 9 1, 2, 3, 10, 11, 12
    11 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    12 ALC TAX VEHIC 1, 2, 3, 4, 5, 6 4, 5, 6, 7, 8, 9 1, 2, 3, 10, 11, 12
    13 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    14 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    15 ALC 1, 2, 3, 4, 5, 6
    Tumormeßschema:
    Tag nach der Impfung Käfig Nr.
    4 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
    8 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
    11 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
    13 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
    15 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
    18 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
    20 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
  • Tumormessung: Der Tumor wurde mit einem Zirkel dreimal pro Woche gemessen, sobald er offensichtlich wurde. Die Tumormasse wird auf der Basis der Messungen der beiden Dimensionen (Länge und Breite), ausgedrückt in mm, entsprechend der folgenden Formel berechnet:
    Figure 00300001
  • Wenn wir konventionell eine Tumordichte gleich 1 betrachten, resultiert daraus, daß das Tumorvolumen, ausgedrückt in mm3, gleich zum Gewicht des Tumors ist, ausgedrückt in mg.
  • Bestimmung der Anzahl der Lungenmetastasen: Am Tag 22 nach Impfung von M109 Mauslungenkrebs wurden die Studientiere durch Zervikaldislokation getötet. Ihre Lungen wurden dann entfernt und ungefähr 5 bis 7 Tage in 5 ml Bouin-Lösung mit der folgenden Zusammensetzung gehalten. 71 % als gesättigte Picrinsäure-Lösung (Merck) und 24 % als 10 % Formaldehyd (Fluka). Wenn Lugenmetastasen evident waren, wurden ihre Zahlen gezählt.
  • Die statistische Analyse für die Daten der Tumorgröße und die Anzahl der Lungenmetastasen wurde unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney-Tests für ungepaarte Daten durchgeführt.
  • Die Analyse der in den verschiedenen Gruppen der Studientieren erhaltenen Daten zeigt eine Inhibition des Tumormassenwachstums in der Gruppe von Mäusen, behandelt mit 30 mg/kg Taxol, i.p. verabreicht, im Vergleich zu den Mäusen in der Gruppe, die mit Vehikel alleine behandelt wurden (Tabelle 8). Dieses Phänomen ist bereits nach der ersten Verabreichung des Mittels deutlich, und der Unterschied des Gewichtes der Tumoren zwischen der Gruppe, behandelt mit Taxol, und der anderen, behandelt mit dem Vehikel alleine, erwies sich als statistisch signifikant mit p<0,01. Nach der zweiten Verabreichung wird die beobachtete Reduktion der Tumormasse beibehalten, mit einem statistisch signifikanten Unterschied (p<0,0001) im Vergleich zu der Gruppe, die mit Vehikel alleine behandelt ist, und diese Inhibition der Tumormasse wird nach den folgenden Verabreichungen aufrechterhalten. Die Gruppe von Tieren, behandelt mit Taxol, i.p. mit der Dosis von 30 mg/kg verabreicht, in Kombination mit Acetyl-L-carnitin, oral bei der Dosis von 100 mg/kg verabreicht, zeigt bereits eine Reduktion des Tumormassenwachstums im Vergleich zum Vehikel alleine nach der ersten Behandlung, und zwar mit einer Signifikanz von p<0,05. Dieser Trend wird ebenfalls nach den anschließenden Verabreichungen aufrechterhalten. An allen Tagen wurde die Analyse durchgeführt, die mit Vehikel in Kombination mit Acetyl-L-carnitin behandelte Gruppe zeigte keinen hochsignifikanten Unterschied beim Tumormassenwachstum im Vergleich zu der Gruppe, die mit Vehikel alleine behandelt ist. Darüber hinaus ergab der Vergleich zwischen der Gruppe, die mit Taxol alleine behandelt wurde, und der Gruppe, die die kombinierte Behandlung mit Taxol plus Acetyl-L-carnitin erhielt, keine statistisch signifikanten Unterschiede der Tumormassengröße an irgendeinem der analysierten Tage. Auf der Basis der Analyse der folgenden Daten können wird daher angeben, daß Acetyl-L-carnitin nicht mit der Antikrebswirkung von Taxol bezüglich der Inhibition der Tumormasse interferiert.
  • Im Hinblick auf die Analyse der Anzahl der Metastasen am Ende des Experimentes zeigen die erhaltenen Daten eine statistische signifikante Reduktion ihrer Anzahl bei den Gruppen, die mit Taxol, mit Taxol kombiniert mit Acetyl-L-carnitin und mit Vehikel, kombiniert mit Acetyl-L-carnitin behandelt wurden, im Vergleich zu der Gruppe, die mit Vehikel alleine behandelt wurde. Insbesondere zeigten die Mäuse, die mit Taxol oder mit Taxol, kombiniert mit Acetyl-L-carnitin behandelt wurden, ebenfalls eine Reduktion des Durchmessers der Metastasen im Vergleich zu den Gruppen, die mit Vehikel alleine oder mit Vehikel plus Acetyl-L-carnitin behandelt wurden (siehe Tabelle 10). Auf der Basis der Analyse der erhaltenen Daten kann vermutet werden, daß Acetyl-L-carnitin eine milde Inhibitionswirkung auf die Bildung von Lungenmetastasen hat.
  • Tabelle 8 Wirkung der kombinierten ALC + Taxol-Behandlung auf das Wachstum von M109-Mauslungenkrebs in BALB/c-Mäusen
    Figure 00320001
  • Weibliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von ungefähr 20 g erhielten i.m. Injektionen von M109-Mauslungenkrebs (3 × 105 Zellen pro Maus). Die Tumoren wurden an den angegebenen Nachimpfungstagen gemessen. Die Tiere wurden mit ALC und Taxol entsprechend dem Behandlungsschema behandelt.
  • Die Signifikanz wurde durch Vergleich der verschiedenen Behandlungsgruppen gegenüber der Gruppe untersucht, die mit Vehikel alleine behandelt wurde. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001.
  • Die Daten wurden statistisch unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests für gepaarte Daten analysiert.
  • Tabelle 9 Bestimmung der Anzahl der Lungenmetastasen am Tag 22 nach Impfung des M109-Mauslungenkrebes in BALB/c-Mäusen nach der kombinierten Behandlung mit Taxol + ALC
    Figure 00320002
  • Weibliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von ungefähr 20 g erhielten i.m. Injektionen von M109-Mauslungenkrebs (3 × 105 Zellen/Maus). Die Tiere wurden mit ALC und Taxol entsprechend dem Behandlungsschema behandelt. Am Tag 22 nach der Impfung des Tumors wurden die Tiere getötet, ihre Lungen wurden entfernt und in Bouins-Lösung gelagert. Die Anzahl der Metastasen wurden 10 Tage nach Ziehen der Probe ausgewertet.
    ♦ Signifikanz wurde durch Vergleich der verschiedenen Behandlungsgruppen gegenüber der Gruppe, die mit Vehikel alleine behandelt wurde, untersucht.
    *P<0,05 gegenüber Vehikel, **P<0,01, ***P<0,001.
  • Taxol gegenüber Taxol + ALC war signifikant (P<0,05).
  • Die Daten wurden statistisch unter Anwendung des Mann-Whitney-Tests für gepaarte Daten analysiert.
    M = Medium (Durchmesser 1-2 mm); S = klein (<1 mm Durchmesser).
  • ALC interferiert nicht mit der therapeutischen Wirkung von Taxol, und dieser Aspekt wurde ebenfalls in einem menschlichen Tumormodell ausgewertet, wie in dem folgenden Beispiel erläutert ist.
  • Beispiel 9
  • Studie des Einflusses der Acetyl-L-carnitin (ALC)-Behandlung auf die Antikrebsaktivität von Taxol in einem menschlichen Tumormodell Zellkulturen von LOVO menschlichem Kolonkrebs, transplantiert in haarlose Mäuse, wurden verwendet.
  • Der Tumor wurde in festen Fragmenten in beide Flanken der Mäuse geimpft (Tag 0).
  • Die geimpften Tumoren wurden mit einem Zirkel gemessen, und wenn ein mittleres Tumorgewicht von 100 mg erreicht war (Tag 7), wurden die Tiere in vier Gruppen mit 5 Tieren jeweils entsprechend dem folgenden Schema unterteilt:
    Gruppe 1 Kontrolle
    Gruppe 2 Taxol
    Gruppe 3 ALC
    Gruppe 4 Taxol + ALC
  • Am gleichen Tag wurde die ALC-Behandlung initiiert und 18 aufeinanderfolgende Tage (qd × 18) (Gruppen 3 und 4) fortgesetzt. ALC wurde bei der Dosis von 100 mg/kg mit einem Verabreichungsvolumen von 25 ml/kg verabreicht.
  • Taxol (54 mg/kg/15 ml/kg) wurde i.v. entsprechend einem Schema verabreicht, das insgesamt aus 4 Verabreichungen bei 4-Tagesintervallen (g4d × 4; Tage 10, 14, 18, 22) bestand (Gruppen 2 und 4).
  • Während der Behandlung und in den folgenden drei Wochen bei 14-tägigen Intervallen wurden die Tumoren gemessen und die Inhibition des Tumorvolumens wurde berechnet (TVI%, berechnet als 100-(Mittelgewicht der behandelten Tumoren/Mittelgewicht der Kontrolltumoren × 100)), erhalten durch die verschiedenen Behandlungen.
  • Die Taxol-Behandlung verursachte eine Inhibition des Tumorwachstums (TVI = 88 %). Die Behandlung mit ALC hatte keine Wirkung auf das Tumorwachstum, was ähnlich war wie bei den Tumoren der Kontrollgruppe. Die kombinierte Behandlung mit Taxol plus ALC zeigte eine Antikrebswirksamkeit (TVI = 90 %), die nahezu identisch war zu der, die mit Taxol alleine erzielt wurde, wobei bestätigt wurde, daß ALC mit der cytotoxischen Aktivität von Taxol nicht interferiert.
  • Beispiel 9
  • Studie des Einflusses der Acetyl-L-carnitin (ALC)-Behandlung auf Bleomycin-induzierte pulmonare Toxizität
  • Hamster mit einem Gewicht von 120 g wurden mit Bleomycin (1 Einheit) durch die Intratracheal-Route (IT) oder mit einem äquivalenten Volumen Saline behandelt. Zusätzlich wurden die Tiere mit ALC (200 mg/kg) oder Saline intraperitoneal unmittelbar vor der Einflößung von Bleomycin vorbehandelt, mit täglichen Injektionen für eine Woche. Die Tiere konnten sich drei Wochen vor dem Ziehen der Gewebeproben regenerieren. Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Gewebeproben gezogen wurden (Tag 22), wurde eine Lunge eines jeden Tieres für die histologische Untersuchung und die andere Lunge für die quantitative Bestimmung von Hydroxyprolin präpariert.
  • Die experimentellen Gruppen wurden wie folgt organisiert:
    • 1. Vorbehandlung mit Saline/Saline IT
    • 2. Vorbehandlung mit Saline/Bleomycin IT
    • 3. Vorbehandlung mit ALC/Saline IT
    • 4. Vorbehandlung mit ALC/Bleomycin IT
  • Drei Experimente wurden bei insgesamt 41 Tieren durchgeführt.
  • Die Lungen wurden durch Insufflation bei 20 cm H2O ex vivo mit 10 % Formaldehyd in PBS (pH 7) fixiert, eingebettet in Paraffin, sektioniert und mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt. Sektionen mit ähnlicher Orientierung von dem Bereich des Pulmonarlappens – oberer, mittlerer bzw. unterer – wurden untersucht, zur Verifizierung des Vorhandenseins und des Ausmaßes des Ent zündungsinfiltrate, Ödems und der interstitialen und intraalveolaren Fibrose.
  • Die Lungen, die Saline oder eine Vorbehandlung mit ALC/Saline IT erhielten, präsentierten eine normale alveolare Architektur. Die Tiere, die mit Bleomycin IT oder mit der Vorbehandlung mit Saline alleine behandelt wurden, präsentierten dichte Fibrose, alveolare Atelektase und Ödema. Bei den Tieren, die mit ALC vorbehandelt waren, gab es eine Anzahl von fibrotischen Flächen, die jedoch dünner mit weniger dichten Flächen von Kollaps erschienen.
  • Der Hydroxyprolin-Gehalt (eine der Hauptbestandteile von Collagen) wurde unter Anwendung des bekannten Wöessner-Verfahrens gemessen. Lungenproben wurden homogenisiert, mit NaOH hydrolysiert und dann vor Zugabe des Erlich-Aldehyd-Reagens oxidieren gelassen. Duplikataliquote einer jeden Probe wurden durch Spektrophotometrie untersucht und mit einer Standardkalibrierungskurve, erhalten mit gereinigtem Hydroxyprolin, verglichen. Der Hydroxyprolin-Gehalt (HYP) wird als mg/Lunge ausgedrückt.
  • Die nicht-behandelten Hamster oder solche, die mit ALC alleine behandelt wurden, präsentierten HYP-Gehalte, die mit normalen akzeptierten Werten kompatibel waren. Die mit Bleomycin behandelten Tiere präsentierten eine Erhöhung in HYP, was mit dem erhöhten Niederschlag von Collagen während der fibrotischen Reaktion konsistent war. Die mit ALC behandelten Tiere zeigten eine Reduktion bei HYP im Vergleich zu solchen, die mit Bleomycin behandelt waren, was mit der Verbesserung bei der fibrotischen Antwort konsistent ist.
  • Figure 00350001
  • ALC verursacht eine Reduktion der fibrotischen Antwort bei mit Bleomycin behandelten Tieren.
  • Beispiel 10
  • Die Erhöhung der Antikrebsaktivität von Taxol beim Vorhandensein von Propionyl-L-carnitin (PLC) in vivo
  • Zellkulturen und Tumorimpfungsbedingungen
  • Zellkulturen von L-MM3-Mausbrustkrebszellen wurden verwendet, bei 37°C in Kunststoffbehältern in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wuchsen in DMEM, ergänzt mit 10 % FCS und in der Gegenwart von 2 mM L-Glutamin und 80 μg/ml Gentamicin. Die subkonfluenten Zellen wurden während der exponentiellen Wachstumsphase unter Verwendung von Trypsin-EDTA gesammelt und in DMEM resuspendiert. Sie wurden dann subkutan bei weiblichen Balb/c-Mäusen mit einem Gewicht von 20 g bei einer Dichte von 4 × 105 injiziert.
  • Tumormeßverfahren
  • Der Tumor wurde mit einem Zirkel dreimal pro Woche gemessen, sobald er meßbar war. Die Tumormasse wird auf der Basis der Messung der beiden Dimensionen (Länge und Breite), ausgedrückt in mm, entsprechend der folgenden Formel berechnet:
    Figure 00360001
  • Wenn wir konventionell eine Tumordichte gleich 1 ansehen, ist das Ergebnis, daß das Volumen gleich (mm3 = mg) ist.
  • Taxol-Herstellungsverfahren
    • Verwendetes Mittel: Taxol (Paclitaxel INDENA). Das Mittel wird gewogen, im spezifischen Vehikel (12 mg/ml) löslich gemacht und bei +4°C geschützt vor Licht gelagert. Zum Zeitpunkt der Verwendung wird es 1:4 mit Saline-Lösung in Phosphatpuffer (PBS, SIGMA) verdünnt und injiziert.
    • Vehikel des Mittels: Cremophor EL (BASF).
  • Cremophor wird 1:1 mit Ethanol verdünnt und vor Licht geschützt gelagert. Am Tag der Behandlung wird es 1:4 mit PBS verdünnt.
  • Die Tiere wurden ausgewählt und wie in den vorhergehenden Beispielen behandelt.
  • Behandlungsbedingungen
  • Schema A). Die Mäuse wurden i.p. mit 30 mg/kg Taxol und s.c. mit 100 mg/kg PLC entsprechend dem folgenden Schema behandelt.
    A) Tag Behandlung
    0 Impfung von 400 000 Zellen/Maus
    12 Verabreichung von 100 mg/kg s.c. PLC
    13 PLC
    14 PLC
    15 PLC + Taxol (30 mg/kg)
    16 PLC
    17 PLX + Taxol
    18 PLC
    19 PLC + Taxol
    20 PLC
    21 PLC + Taxol
    22 PLC
    23 PLC
    24 PLC
    B) Tag Behandlung
    0 Impfung von 400 000 Zellen/Maus
    4 Verabreichung von 100 mg/kg s.c. PLC
    5 PLC
    6 PLC
    7 PLC
    8 PLC + Taxol 30 mg/kg i.p.
    9 PLC
    10 PLC + Taxol
    11 PLC
    12 PLC + Taxol
    13 PLC
    14 PLC + Taxol
    15 PLC
    59 PLC
  • In beiden Behandlungsschemata wurden die Kontroll-, Taxol- und PLC-Gruppen mit der gleichen Anzahl von Zellen geimpft.
  • Zusätzlich wurde die Taxol-Behandlung entsprechend der gleichen Vorgehensweise und zur gleichen Zeit sowohl bei der Gruppe, die mit Taxol alleine behandelt wurde als auch bei der, die mit Taxol und PLC behandelt wurde, verabreicht.
  • Die Behandlung mit PLC, ob alleine oder in Kombination mit Taxol, bei dem Behandlungsschema A) beginnt am Tag 12 (nach der Impfung des Tumors) und endet am Tag 24; bei Behandlungsschema B) beginnt die Behandlung am Tag 5 nach der Impfung des Tumors und endet am Ende des Experimentes, d.h. am Tag 59.
  • Ergebnisse
  • Experiment A) Tiere mit Tumoren/Gesamtzahl der Tiere
    Figure 00380001
  • Tumorgröße
    Figure 00380002
  • Bei Anwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney-Tests für ungepaarte Daten wurden signifikante Unterschiede bei allen Beobachtungszeiten in der Taxol + PLC-Gruppe gegenüber der Kontroll-Gruppe mit p<0,003 festgestellt, und nur am letzten Beobachtungstag (Tag 46) fiel das Signifikanzniveau auf p<0,034. Es sollte festgestellt werden, daß die Werte für Taxol-Gruppe am Tag 46 nicht von den Werten der Kontrollgruppe signifikant verschieden waren.
  • Experiment B) Tiere mit Tumoren/Gesamttiere
    Figure 00380003
  • Tumorgröße
    Figure 00390001
  • Der statistische Wilcoxon-Test wurde bei diesem Experiment angewandt und ergab, daß nur die Kontrollgruppe von der Taxol + pLC-Gruppe mit p<0,05 signifikant verschieden war.

Claims (18)

  1. Verwendung von Propionyl-L-carnitin oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon zur Erzeugung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs, wobei das Medikament weiterhin Taxol umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß Propionyl-L-carnitin eine synergistische Wirkung mit der Aktivität von Taxol erzeugt.
  2. Verwendung von Acetyl-L-carnitin oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon für die Herstellung eines Medikamentes, das bei der Reduktion von Metastasen wirksam ist, wobei das Medikament weiterhin Taxol umfaßt.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, worin der behandelte Tumor ein Lungentumor ist.
  4. Verwendung von Acetyl-L-carnitin oder einem seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze zur Erzeugung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs, wobei das Medikament weiterhin Taxol umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament im wesentlichen keine Nebenwirkungen aufweist, die für Taxol typisch sind.
  5. Verwendung von Acetyl-L-carnitin oder einem seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs, wobei das Medikament weiterhin Bleomycin umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament im wesentlichen frei ist von Pulmonartoxizität die typisch für das Bleomycin ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Nebenwirkung Neutropenie ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Nebenwirkung periphere Neuropathie ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Nebenwirkung Lungenschädigung ist.
  9. Kombination für die Behandlung von Krebs, umfassend Taxol und Acetyl-L-carnitin oder eines seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze.
  10. Verwendung der Kombination nach Anspruch 9 zur Erzeugung eines Medikamentes mit Antikrebsaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament eine synergistische Wirkung aufweist und im wesentlichen frei von Nebenwirkungen ist oder nur begrenzte Nebenwirkungen entfaltet.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Kombination nach Anspruch 9 in einer Mischung mit pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln und/oder Exzipienten.
  12. Kombination für die Behandlung von Krebs, umfassend Bleomycin und Acetyl-L-carnitin.
  13. Verwendung der Kombination nach Anspruch 12 zur Herstellung eines Medikamentes mit Antikrebsaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament im wesentlichen frei von Nebenwirkungen ist oder nur begrenzte Nebenwirkungen entfaltet.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Kombination nach Anspruch 12 in einer Mischung mit pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln und/oder Exzipienten.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, umfassend eine therapeutisch effektive Menge an Bleomycin zusammen mit einer schützenden Menge an Acetyl-L-carnitin in einer Mischung mit pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln und Exzipienten.
  16. Kit für die Behandlung von Krebs, umfassend: a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge von Taxol; b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Propionyl-L-carnitin oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon in einer Menge, die für die Erzeugung einer synergistischen Wirkung mit dem Taxol geeignet ist.
  17. Kit für die Behandlung von Krebs, umfassend: a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge an Taxol; b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Acetyl-L-carnitin oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon in einer Menge, die für die Erzeugung einer im wesentlichen schützenden Wirkung gegenüber den Nebenwirkungen von Taxol geeignet ist.
  18. Kit für die Behandlung von Krebs, umfassend: a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge an Bleomycin; b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Acetyl-L-carnitin oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon in einer Menge, die für den Erhalt einer im wesentlichen schützenden Wirkung gegenüber der Pulmonartoxizität von Bleomycin geeignet ist.
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