ES2235499T3 - Uso de derivados de propionil l-carnitina y de acetil l-carnitina en la preparacion de medicamentos con actividad anticancerigena. - Google Patents
Uso de derivados de propionil l-carnitina y de acetil l-carnitina en la preparacion de medicamentos con actividad anticancerigena.Info
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Abstract
Uso de propionil L-carnitina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, conteniendo además dicho medicamento taxol, caracterizado porque dicha propionil L-carnitina produce un efecto sinérgico con la actividad del taxol.
Description
Uso de derivados de propionil
L-carnitina y de acetil L-carnitina
en la preparación de medicamentos con actividad anticancerígena.
La invención descrita en este documento se
refiere al uso de propionil L-carnitina y de acetil
L-carnitina en la preparación de medicamentos en
combinación con agentes anticancerígenos para el tratamiento de
tumores.
Es bien conocido que el uso de agentes
anticancerígenos en la terapia de seres humanos causa una gran
cantidad de efectos tóxicos o de efectos secundarios que pueden
poner en peligro la vida de los pacientes. Estas complicaciones, de
hecho, pueden conducir a una reducción en las dosis de agentes y,
ocasionalmente, el cese de la propia terapia.
La disminución de la dosis o el cese de la
terapia causa en muchos casos un deterioro del estado general de los
individuos debido a que esto favorece el desarrollo de recaídas, con
consecuencias que algunas veces son fatales para el paciente.
Otro aspecto muy importante y fuertemente
considerado en el ámbito hospitalario y entre las familias de los
pacientes oncológicos, es el concepto de "mejora de la calidad de
vida" de los pacientes bajo tratamiento.
Igualmente, es bien conocido que los pacientes
que experimentan poliquimioterapia regular para el cáncer son
propensos a una sustancial pérdida de peso.
El número creciente y la importancia de los
agentes anticancerígenos usados en la terapia humana, la principal
limitación de los cuales continua siendo la aparición de efectos
tóxicos o de efectos secundarios, significa que este problema aún es
una cuestión de considerable interés.
Así, el descubrimiento de nuevos agentes o de
combinaciones apropiadas, nuevas, de distintos agentes capaces de
reducir sustancialmente los efectos tóxicos o los efectos
secundarios causados por los agentes anticancerígenos usados en la
terapia humana es muy deseable.
Los usos anteriores de la
L-carnitina en combinación con agentes
anticancerígenos ya se conocen.
En modelos experimentales animales, se ha
demostrado que las ratas tratadas sólo con doxorubicina muestran una
mayor pérdida de peso que un grupo de ratas tratado con la misma
sustancia en combinación con L-carnitina
(Senekowitsch R, Lohninger A, Kriegel H., Staniek H., Krieglsteiner
H. P., Kaiser E. Protective effects of carnitine on adriamycin
toxicity to heart. En: Kaiser E., Lohninger A., (eds.). Carnitine:
its role in lung and heart disorders: 126-137.
Karger, Basel-New York, 1987).
La patente de EE.UU. Nº 4.713.370 describe el uso
de carnitina en combinación con agentes citostáticos tales como
daunomicina, N-acetil-daunomicina y
oxima de daunomicina para reducir la toxicidad cardiaca de estos
compuestos. La patente de EE.UU. Nº 4.267.163 describe el uso de
carnitina en combinación con citostáticos tales como adriamicina,
adriamicina-14-octanoato,
4'-epi-adriamicina, anómero beta de
adriamicina y anómero gamma de
4'-epi-adriamicina para reducir la
toxicidad cardiaca de estos compuestos. La patente de EE.UU. Nº
4.751.242 describe el uso de acetil L-carnitina para
el tratamiento terapéutico de neuropatías periféricas.
Otros estudios han dirigido la evaluación de los
efectos protectores de las carnitinas sobre la toxicidad cardiaca
inducida por antraciclina (Neri B., Comparini T., Milani A., Torcia
M., Clin. Trial J. 20, 98-103, 1983; De Leonardis
V., De Scaizi M., Neri B. y col. Int. J. Clin. Pharm. Res. 70,
307-311, 1987).
La patente y las referencias bibliográficas
citadas anteriormente demuestran que se han hecho muchos esfuerzos
en un intento de reducir los efectos tóxicos o los efectos
secundarios de los agentes anticancerígenos, sin, no obstante,
resolver este serio problema de una forma satisfactoria.
El taxol es un extracto natural, aislado por
primera vez a partir de la corteza de Taxus breuifolia, con
propiedades anticancerígenas y que ha probado ser neurotóxico y
mielotóxico en sujetos humanos. Se usa para el tratamiento de
tumores resistentes a la terapia basada en platino, aunque da lugar
a una mayor toxicidad acumulativa en el sistema nervioso periférico.
También se ha constatado que el taxol induce neutropenia en los
sujetos tratados (Rowinsky y col.; Semin. Oncol. (1993, Ag. 20, (4
suppl 3), 1-15; Onetto y col. J. Natl. Cancer Inst.
Monogr. (1993); (15):
131-9).
131-9).
La bleomicina se usa típicamente en pacientes
jóvenes con cáncer testicular, linfoma y otros tipos de tumores. La
toxicidad pulmonar de la bleomicina se caracteriza por la
destrucción de la barrera epitelial alveolar y la consecuente
proliferación intra-alveolar de fibroblastos y la
deposición de componentes de la matriz extracelular (Karam H y col.;
Cell Biol. Toxicol (1998 Feb); 14(1):13-22).
Los pneumocitos de tipo 2 no son capaces de regenerar el epitelio
dañado o perdido.
Uno de los problemas generales de la terapia
farmacológica es el índice terapéutico de los agentes, es decir, la
proporción de la dosis terapéuticamente eficaz a la dosis tóxica o,
en cualquier caso, la dosis que da lugar a la aparición de efectos
secundarios.
La comunidad médica aún percibe la necesidad de
regímenes terapéuticos que permitan al paciente hacer frente al
tratamiento, el cual, en el caso de la quimioterapia anticancerígena
es especialmente difícil de soportar, mientras que al mismo tiempo
conserve una calidad de vida aceptable. Estas consideraciones
también se aplican al tratamiento terapéutico de animales, por
ejemplo, las denominadas mascotas.
La tendencia natural a reducir las dosis y así el
uso de formas farmacéuticas adecuadas para las administraciones
terapéuticamente útiles sin obligar al paciente a tomar los agentes
demasiado a menudo, se contrapone con las dosis mínimas eficaces
típicas de cada agente anticancerígeno.
Sorprendentemente, se ha descubierto que el uso
coordinado -este término se definirá de forma precisa a
continua-
ción- de un agente anticancerígeno y de propionil L-carnitina o de acetil L-carnitina, tal como se define a continuación, ejerce un inesperado efecto sinérgico sobre la actividad del agente anticancerígeno.
ción- de un agente anticancerígeno y de propionil L-carnitina o de acetil L-carnitina, tal como se define a continuación, ejerce un inesperado efecto sinérgico sobre la actividad del agente anticancerígeno.
En el contexto de la invención descrita en este
documento, también se ha descubierto, de una forma totalmente
inesperada, que el uso coordinado de una cantidad terapéuticamente
eficaz de un agente anticancerígeno, en especial taxol y bleomicina
y de una cantidad detoxificadora de acetil
L-carnitina, o de una de sus sales
farmacológicamente aceptables, proporciona un potente efecto
protector frente a la toxicidad y frente a los efectos secundarios
del agente anticancerígeno, sin empeorar su eficacia, dando lugar
así, entre otras cosas, a una mejora sustancial en la calidad de
vida y a una prolongación de la misma vida en los sujetos tratados,
ya sean sujetos humanos o animales.
También se ha descubierto que dicho uso
coordinado tiene un efecto inhibitorio sobre la metástasis
tumoral.
Por consiguiente, un objetivo de la invención
descrita en este documento es el uso de acetil
L-carnitina o de propionil
L-carnitina o de una de sus sales farmacéuticamente
aceptables, para la preparación de un medicamento que comprende un
agente anticancerígeno caracterizado porque dicho compuesto produce
un efecto sinérgico sobre la actividad del agente
anticancerígeno.
Además, un objetivo de la invención descrita en
este documento es el uso coordinado de acetil
L-carnitina de acuerdo con el que se reducen
sustancialmente los efectos secundarios del agente anticancerígeno
en dicho medicamento.
Un objetivo adicional de la invención descrita en
este documento es el uso de acetil L-carnitina en la
preparación de un medicamento útil para la inhibición de la
metástasis.
Otro objetivo adicional de la invención descrita
en este documento son las combinaciones de acetil
L-carnitina o de propionil
L-carnitina con agentes anticancerígenos y las
composiciones farmacéuticas relacionadas.
La bien conocida falta de efectos tóxicos o de
efectos secundarios de las alcanoil L-carnitinas
anteriores hace especialmente seguro el uso de estos compuestos
incluso durante largos periodos de tratamiento, para la prevención o
el tratamiento de efectos tóxicos o de efectos secundarios, tales
como la pérdida de peso, daños en el sistema nervioso periférico,
especialmente neuropatía o neutropenia causadas por el taxol, o
lesiones pulmonares inducidas por la bleomicina.
La puesta en práctica de la invención descrita en
este documento contribuye a mejorar la calidad de vida de los
pacientes tratados; uno sólo necesita pensar en el sufrimiento
físico causado por la neuropatía periférica, la neutropenia, las
complicaciones respiratorias.
Estos y otros objetivos de la invención descrita
en este documento se describirán en detalle en las formas de
realización de la presente invención, también por medio de
ejemplos.
En el contexto de la invención descrita en este
documento, los términos "antineoplásico",
"anticancerígeno" y "antiproliferativo" se han de entender
como que son esencialmente sinónimos.
En el contexto de la invención descrita en este
documento, lo que se entiende por "uso coordinado" de los
compuestos antes citados es, de forma indiferente, o (i)
coadministración, es decir, la administración sustancialmente
simultánea o secuencial de acetil L-carnitina o de
propionil L-carnitina o de una de sus sales
farmacológicamente aceptables y de un agente anticancerígeno, o (ii)
la administración de una composición que comprende los ingredientes
activos antes citados en combinación y en una mezcla, además de
excipientes y/o vehículos farmacológicamente aceptables.
La invención descrita en este documento cubre a
la vez la coadministración de acetil L-carnitina o
de propionil L-carnitina o de una de sus sales
farmacológicamente aceptables y del agente anticancerígeno y las
composiciones farmacéuticas, que se pueden administrar por vía oral,
parenteral o nasal, incluyendo formas de liberación controlada, que
comprenden los dos ingredientes activos en una mezcla.
Tal como se hará evidente a partir de la
siguiente descripción detallada de la presente invención, uno puede
prever el uso coordinado de taxol y de acetil
L-carnitina o de propionil
L-carnitina, o de bleomicina y acetil
L-carnitina.
Coadministración también significa un paquete, o
un artículo fabricado, que comprende distintas formas de
administración de una de las alcanoil L-carnitinas
antes citadas, de una de sus sales farmacológicamente aceptables y
del agente anticancerígeno, acompañados por instrucciones para la
toma coordinada simultánea o programada en el tiempo de los
ingredientes activos de acuerdo con un régimen de dosificación
establecido por el médico de atención primaria, sobre la base del
estado del paciente.
Lo que se entiende por una sal farmacológicamente
aceptable de las alcanoil L-carnitinas anteriores
es cualquier sal de las últimas con un ácido que no da lugar a un
aumento de los efectos tóxicos o secundarios. Estos ácidos son bien
conocidos por los farmacólogos y por los expertos en la tecnología
farmacéutica.
Ejemplos de sales farmacológicamente aceptables
de acetil L-carnitina o de propionil
L-carnitina, aunque no son exclusivamente estas, son
cloruro; bromuro; yoduro; aspartato; aspartato de ácido; citrato;
citrato de ácido; tartrato; tartrato de ácido; fosfato; fosfato de
ácido; fumarato; fumarato de ácido; glicerofosfato; glucosa fosfato;
lactato; maleato; maleato de ácido; mucato; orotato, oxalato;
oxalato de ácido; sulfato; sulfato de ácido; tricloroacetato;
trifluoroacetato; metano sulfonato; pamoato y pamoato de ácido.
Una forma preferida de dosificación diaria de
acetil L-carnitina o de propionil
L-carnitina para uso clínico es una composición que
comprende una cantidad de acetil L-carnitina o de
propionil L-carnitina equivalente a entre 0,1 y 3 g
y preferentemente entre 0,5 y 3 g.
La invención descrita en este documento es
provechosa en la prevención o el tratamiento de efectos tóxicos o de
efectos secundarios, de neuropatía periférica y especialmente de la
mielosupresión y de las lesiones pulmonares causadas por los agentes
anticancerígenos mencionados anteriormente.
Lo que se quiere decir por efecto sustancialmente
protector es la prevención, reducción o eliminación del efecto
secundario hasta una extensión estadísticamente significativa.
La realización de la invención descrita en este
documento también contribuye a la curación y a la prolongación de
las vidas de los pacientes gracias al aumento del éxito terapéutico
debido a la posibilidad de mantener los protocolos de tratamiento
programados o debido a la posibilidad de incrementar las dosis del
agente quimicoterapéutico, sin tener que suspender el tratamiento
debido a las contraindicaciones.
Un beneficio adicional que se obtiene con la
invención descrita en este documento está relacionada con la calidad
de vida de los sujetos tratados; de hecho, tal como ya se mencionó,
la eliminación o la reducción del sufrimiento físico causado por una
neuropatía periférica favorece la capacidad de los pacientes de ser
autosuficientes. Desde el punto de vista económico, hay unos ahorros
evidentes en términos de los costes sobre la base de las
infraestructuras del hospital o sobre la base de las familias para
el cuidado de los pacientes.
La mielosupresión es uno de los efectos tóxicos
secundarios que se pueden manifestar en sí mismos como resultado de
la administración de taxol, un agente quimicoterapéutico usado en la
terapia de varios tumores, por ejemplo de tumores de mama, ovarios,
pulmones (de células pequeñas y otros), cabeza y cuello
(Slichenmeyer y Von Hoff: J. Clin. Pharmacol. (1990), 30,
770-778). El vehículo adoptado para el taxol,
también en las formas farmacéuticas comerciales (TAXOL®, Bristol
Myers Squibb), es un derivado de aceite de ricino polietoxilado,
conocido comercialmente como Cremophor® EL y es capaz de inducir la
liberación de histamina y las reacciones anafilactoides en el perro
y en sujetos humanos (Slichenmeyer y Von Hoff: ibid; Bury y col.:
Allergy (1992), 47, 624-629; Hershkoviz y col.: J.
Leukoc. Biol. (1994), 56, 495-501; Inokuma y col.:
J. Vet. Med. Sci. (1994), 56, 45-49). En vista del
hecho de que en el fármaco comercializado se usa como vehículo
Cremophor® EL, se ha abordado el problema de la mielotoxicidad
relacionado con la preparación usada en la terapia.
Uno de los problemas más serios encontrados en el
curso de las enfermedades proliferativas es la propagación
metastática del tumor, que algunas veces avanza hasta una extensión
tal como para hacer inútil el tratamiento del tumor primario y se
convierte en sí mismo en la causa de la muerte.
En una primera forma de realización de la
invención descrita en este documento, la acetil
L-carnitina ha mostrado un inesperado grado de
actividad protectora frente a los efectos secundarios inducidos por
el taxol, tales como la neuropatía periférica, la mielosupresión y
la pérdida de peso.
En una segunda forma de realización de la
invención descrita en este documento, la acetil
L-carnitina ha mostrado una sorprendente actividad
antimetastática cuando se administró de forma simultánea con taxol,
especialmente en el cáncer de pulmón.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida de la invención descrita en este documento, la propionil
L-carnitina ha mostrado un inesperado efecto
sinérgico en combinación con el taxol.
Se ha descubierto que el taxol induce neutropenia
severa con un nadir después de la 3ª-4ª inyección del compuesto.
Cuando se usa ALC (acetil
L-carnitina) de acuerdo con la invención descrita en
este documento, no se encuentran efectos adversos sobre la acción
anticancerígena del medicamento.
La ALC se puede suministrar convenientemente por
vía oral, sin, por esa razón, excluir otras rutas de administración
que un experto en la materia puede considerar conveniente adoptar,
especialmente mediante inyección, para administrarse de forma
simultánea, por ejemplo, en el mismo vial de infusión, con el agente
anticancerígeno, o secuencialmente, tal como se establezca por el
experto en la materia.
De igual modo, la propionil
L-carnitina (PLC) ha mostrado un efecto sinérgico
con la actividad terapéutica del taxol.
En una forma de realización diferente, es
ventajoso en cualquier caso proporcionar una combinación binaria de
acetil L-carnitina, como agente protector y de
bleomicina.
En lo que respecta a aquellos aspectos
relacionados con la aplicabilidad industrial, la invención descrita
en este documento también proporciona, en una de sus posibles formas
de realización, un kit para el tratamiento del cáncer que contiene
a) una composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de taxol; b) una composición farmacéutica
que comprende propionil L-carnitina, tal como se
definió anteriormente, en una cantidad adecuada para producir un
efecto sinérgico con dicho taxol. El kit de acuerdo con la invención
descrita en este documento también se puede presentar en la forma de
a) una composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de taxol; b) una composición farmacéutica
que comprende propionil L-carnitina en una cantidad
adecuada para producir un efecto sinérgico con dicho taxol. De forma
alternativa, el kit de acuerdo con la invención descrita en este
documento también se puede presentar en la forma de a) una
composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de taxol o de bleomicina y b) una composición farmacéutica
que comprende acetil L-carnitina en una cantidad
adecuada para producir una acción sustancialmente protectora frente
a los efectos secundarios de dicho taxol o de dicha bleomicina.
Ahora, describiremos las formas de poner en
práctica la invención descrita en este documento.
Debe seguir entendiéndose que el o la experto/a
en la materia puede completar los protocolos experimentales con su
propio conocimiento general de la materia en la que él o ella opera,
posiblemente recurriendo a sectores afines en caso de necesidad.
Aquí informamos a continuación los resultados de
los experimentos más significativos adecuados para demostrar el
inesperado y sorprendente efecto protector obtenido mediante la
combinación de acetil o de propionil L-carnitina con
los agentes anticancerígenos anteriormente mencionados.
El propósito de este estudio es demostrar y
evaluar las propiedades protectoras de la acetil
L-carnitina administrada una semana antes del taxol
en dos dosis diferentes del último (16 mg/kg y 8 mg/kg), por medio
de la medida de la velocidad de conducción del nervio sensorial
(VCNS), determinada sobre la cola y por medio del reflejo H.
Se usaron ratas Wistar hembra de 3 meses de edad
(Charles River), alojadas a 22 \pm 2ºC, con una humedad relativa
del 50 \pm 15% y con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas.
Las ratas se identificaron justo antes del
tratamiento por medio de números progresivos en sus colas y se
mantuvieron con agua y alimento "ad libitum".
Las sustancias usadas fueron acetil
L-carnitina y taxol.
Se formaron los siguientes grupos
experimentales:
1. Controles.
2. Falsos (grupo que recibe el disolvente de la
disolución de taxol).
3. 16 mg/kg de taxol.
4. Acetil L-carnitina + 16 mg/kg
de taxol.
5. 8 mg/kg de taxol.
6. Acetil L-carnitina 8 mg/kg de
taxol.
Se usó el siguiente programa de tratamiento: los
animales falsos recibieron el disolvente de la disolución de taxol
(cremophor/etanol) por vía intraperitoneal (i.p.); el taxol se
administró por vía i.p. una vez a la semana durante 5 semanas; los
tratamientos con L-carnitina, 200 mg/kg, se
administraron por vía oral (os) una vez al día a través de un tubo
gástrico, comenzando una semana antes de la primera administración
de taxol y continuando durante otras 4 semanas (5 semanas en
total).
Se usó el siguiente procedimiento: los animales,
anestesiados con una mezcla gaseosa compuesta por 0,45 halotano,
protóxido de nitrógeno y oxígeno, se depilaron en la zona de
estimulación y se pusieron sobre una mesa de operación. Los
registros y las estimulaciones de las respuestas sensoriales se
hicieron usando un electromiógrafo Ote Biomedica Phasis II. En vista
de los informes existentes en la bibliografía de que la velocidad de
conducción del nervio depende de la temperatura corporal del animal,
fue necesario mantener ésta última constante a lo largo del
experimento, midiéndola con una sonda rectal, con la ayuda de un
termorregulador para animales BM tipo 70002 (Biomedica
Mangoni).
Mangoni).
La medida de la velocidad de conducción de las
fibras sensoriales se obtuvo en la cola con una estimulación de tipo
anillo de acero y con electrodos de medida, de 46 cm de longitud
(electrodos digitales de anillo Modelec), usando una intensidad de
estimulación igual al valor umbral con una duración de 100
microsegundos.
El valor medio de 300 respuestas se tomó como
valor posible.
La velocidad de conducción del nervio sensorial,
expresada en m/s, se calculó como la proporción de la distancia
entre los dos puntos de estimulación, expresada en mm, y la
diferencia en el tiempo de latencia de las ondas producidas por la
estimulación proximal (la más próxima) y distal (la más lejana de la
espina dorsal), expresada en ms.
En todos los grupos de animales la velocidad se
midió tanto en condiciones basales (antes de cualquier
administración) como después de 5 semanas de tratamiento.
Los resultados se expresaron como medias \pm
desviación típica; la significación estadística se evaluó usando la
prueba de la "t", tanto para los datos independientes como para
los emparejados, con un corte de significación estadística de p <
0,05.
Los datos de velocidad de conducción del nervio
sensorial medidos sobre el nervio caudal se dan aquí a continuación
en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ Los valores son medias \pm desviaciones típicas.\cr \+ Entre
paréntesis figura el número de animales usados.\cr \+ Prueba de la
t (datos independientes) ** = p < 0,01 vs CONTR.; \ding{115} =
P < 0,01 vs el taxol correspondiente.\cr \+ Prueba de la t
(datos emparejados) \Delta = p < 0,01 vs
basal.\cr}
En condiciones basales, todos los grupos de
animales presentan valores de conducción del nervio muy
similares.
La medida a las 5 semanas revela un aumento
estadísticamente significativo (p < 0,01) en la velocidad de
conducción del nervio sensorial en todos los grupos comparada con
las condiciones basales.
El tratamiento con el disolvente del taxol (grupo
de falsos) no modificó los valores de velocidad de conducción del
nervio en comparación con el grupo de control. La administración de
taxol indujo una reducción significativa (P < 0,01) en la
velocidad de conducción del nervio sensorial comparado con el grupo
de control; esta reducción fue dependiente de la dosis: -17% con la
dosis de 16 mg/kg y -9% con la dosis de 8 mg/kg.
El tratamiento con acetil
L-carnitina indujo un aumento estadísticamente
significativo (p < 0,01) en la velocidad de conducción del nervio
sensorial en ambos grupos; el 9% comparado con el grupo de 16 mg/kg
de taxol y el 5% comparado con el grupo de 8 mg/kg de taxol.
Sobre la base de los resultados obtenidos se
observará que la acetil L-carnitina es capaz de
proporcionar una protección estadísticamente significativa frente a
la neurotoxicidad inducida por el taxol.
Los animales usados en el modelo experimental
anterior se pesaron antes de comenzar el tratamiento (valores
basales) y al finalizar el tratamiento.
Los datos proporcionados a continuación aquí en
la Tabla 2 demuestran el sustancial e inesperado efecto protector
ejercido por la acetil L-carnitina sobre la pérdida
de peso causada por el tratamiento con taxol.
| Los valores son medias \pm desviaciones típicas. | |
| Entre paréntesis figura el número de animales usados. | |
| Prueba de la t (datos independientes) \bullet = p < 0,001 vs falsos. | |
| Prueba de la t (datos emparejados) *p < 0,001; **p < 0,01; ***p < 0,05 vs basal. |
También se ha constatado por los inventores de la
invención descrita en este documento que el efecto neutropénico del
taxol alcanza un nadir después de la 3ª-4ª inyección.
Para evaluar la acción de la ALC en combinación
con el taxol, tanto sobre la cantidad de neutrófilos que circulan
como sobre el crecimiento tumoral, se examinó el grado de protección
inducido por la ALC tanto en el tratamiento sólo con taxol, como en
animales inoculados con cáncer de mama de roedor
(L-MM3) y se evaluó el crecimiento tumoral en
animales tratados con ALC y con taxol o sólo con taxol. El
tratamiento con taxol causó una significativa reducción en los
polimorfonucleares. La administración por vía oral de acetil
L-carnitina combinada con el tratamiento con taxol
probó ser capaz de prevenir significativamente la reducción en los
granulocitos neutrófilos inducida por el agente anticancerígeno. En
lo que respecta al crecimiento tumoral, se encontró que el taxol,
cuando se inyecta de acuerdo con el mismo programa usado para la
evaluación de los granulocitos neutrófilos, inhibe
significativamente el crecimiento de L-MM3, que se
controló hasta que el tumor alcanzó un tamaño de aproximadamente 2
cm. El tratamiento combinado con taxol y con ALC durante 14 días no
afectó a la acción anticancerígena del
taxol.
taxol.
En conclusión, en este modelo de tumor, asimismo,
el taxol causó neutropenia severa y la ALC, administrada de forma
continua durante el periodo en el que tiene lugar este tipo de
toxicidad para la médula ósea, fue capaz de prevenir la reducción
de polimorfonucleares inducida por el taxol. Al mismo tiempo, la
acción de la ALC no afectó a la actividad anticancerígena del
taxol.
En un estudio conducido de acuerdo con la Buena
Práctica de Laboratorio (BPL), para evaluar la acción de la acetil
L-carnitina (ALC) en combinación con taxol sobre la
neutropenia inducida por el taxol, los animales se trataron tanto
con ALC más taxol, como sólo con taxol o sólo con ALC. En este
modelo, se midió la cantidad de neutrófilos que circulaban.
Se encontró que el taxol induce una significativa
reducción en los granulocitos neutrófilos en el espacio de sólo 6
horas de la tercera inyección y así tiene lugar una neutropenia
severa con un nadir después de la 3ª-4ª inyección.
Se usó la sal interna de acetil
L-carnitina (ampolla estéril), disuelta en agua para
preparados inyectables. Cada ampolla de ALC se disuelve en 4 ml de
agua para inyección (disolución O). Se llevan dos ml de (O) hasta 25
ml con PBS estéril (Sigma), de manera que se tengan 10 mg/ml para
administración por vía subcutánea (100 mg/kg/10 ml); se llevan 0,8
ml de (O) hasta 50 ml con PBS para tener 2 mg/ml para administración
por vía oral (100 mg/kg/50 ml).
Se pesa taxol (paclitaxel (INDENA)), se disuelve
en el vehículo específico preparado anteriormente (Cremophor® EL
(BASF), diluido 1:1 con etanol) y se almacena a +4ºC resguardado de
la luz. En el momento de su uso, la disolución de 12 mg/ml se diluye
a 1:4 con solución salina en tampón de fosfato (PBS) (SIGMA) y se
inyecta por vía i.p. (30 mg/kg/10 ml).
Las indicaciones experimentales esenciales se
proporcionan aquí a continuación:
Animales: ratones BALB/c hembra que pesan
18-20 g (Harlan)
Condiciones de alojamiento de los animales:
4-5 ratones por jaula; temperatura 22 \pm 2ºC;
humedad relativa 55 \pm 15%; 15-20 cambios de
aire/h; ciclo de luz/oscuridad de 12 h (luz de 7,00 a.m. - 7,00
p.m.); jaulas de makrolon (26,7 x 20,7 x 14 cm) con tapas de rejilla
de acero inoxidable; camas de virutas de mazorca de maíz,
desempolvadas, estériles.
Dieta: pienso 4RF21 (compañía: Mucedola), comida
y agua disponibles "ad libitum".
La aleatorización es casual en bloques de
animales, es decir, el encargado del alojamiento de los animales
transfiere el ratón desde las cajas a las jaulas, completando una
jaula cada vez. En una segunda fase, el encargado identifica de
forma provisional todos los ratones, los pesa y, si los pesos
presentan diferencias significativas entre grupos, mueve los
animales de una jaula a otra, manteniendo invariable el número de
animales por jaula, para tener muy similares los pesos globales
entre una jaula y otra. Cada jaula se etiqueta con una tarjeta que
lleva el número del grupo, el tipo de tratamiento (sustancia y/o
sustancias inyectadas, dosis, vía de administración). Cada animal se
identifica con un número entre 1 y 5, escrito sobre la cola con
tinta indeleble.
Peso de los animales: los ratones se pesan antes
de comenzar el tratamiento y en el día 5 ó 7 y en el día 11.
Los animales se trataron entre el día 1 y el día
10 con las moléculas; se administraron taxol o el vehículo en días
alternos, en los días 5, 7, 9 y 11.
Los grupos son: 1) blancos; 2) vehículo + PBS; 3)
taxol; 4) taxol + ALC; 5) ALC; 6) ALC + vehículo. Los animales se
sacrificaron 6 horas después de la última inyección de taxol.
Se toman muestras de sangre y de médula ósea 6
horas después del último tratamiento con taxol o con vehículo. Los
ratones se anestesian con CO_{2}; la sangre se toma del plexo
retro-orbital (0,5 ml de sangre/ratón) y se deposita
en tubos de ensayo Eppendorf que contienen 10 \mul de heparina
Vister (5000 U/ml). Los animales se sacrifican mediante dislocación
cervical. Después, se toman las muestras de médula ósea.
Se toman a diferentes tiempos una muestra de
sangre y una muestra de médula ósea.
Antes de comenzar el conteo de WBC (células
sanguíneas blancas), se examina el instrumento mediante la medida de
los parámetros de muestra de sangre EMACHECK (examen humano)
proporcionada por Delcon.
El instrumento se usa de acuerdo con las
instrucciones suministradas en el manual de instrucciones. La sangre
(25 \mul) se extrae del diluidor y se lleva hasta un volumen de 10
ml con solución isotónica (solución salina PLTA, Delcon) en un vaso
de precipitados (dil. 1:400) (disolución A). A partir de la
disolución A, el diluidor toma 100 \mul y los lleva hasta 10 ml
(dil. 1:100) en otro vaso de precipitados (disolución B). Se añaden
a la disolución A 3 gotas de agente lisogénico (Emosol, Delcon), la
disolución se mezcla a mano y se deja que actúe durante
aproximadamente 2 minutos de manera que se produce la lisis de las
células rojas y se libera la HGB (hemoglobina). La disolución A que
contiene el agente lisogénico se usa para las lecturas de WBC y de
hemoglobina (HGB). La disolución B se usa para las lecturas de RBC y
de plaquetas (PLT).
Se hacen lecturas dobles en cada muestra y entre
una muestra y la siguiente se lava el instrumento usando solución
isotónica.
Se usan portaobjetos Superfrost plus (25 x 75 x 1
mm) (Mensel-Glaser), listos para su uso. La sangre
(8 \mul) se deposita sobre el lado derecho del portaobjetos; otro
portaobjetos, colocado en un ángulo de 45º, sobre el lado izquierdo
de la sangre se echa hacia atrás hasta que entra en contacto con la
gota, que se esparce rápidamente a lo largo de la línea de contacto
entre los dos portaobjetos; el portaobjetos se mueve hacia delante
con un movimiento suave, rápido, de manera que se obtiene una fina
película de sangre. El portaobjetos se deja secar al aire, se tiñe
con colorante Diff-Quick (DADE), de acuerdo con las
instrucciones adjuntas y se seca de nuevo en aire.
Los portaobjetos se sumergen en disolución
Histolemon (Carlo Erba) durante 2 s; se deposita una gota de medio
de montaje sintético (Shandon) en el centro del portaobjetos y se
coloca un cubreobjetos cubriendo por completo la mancha de sangre,
teniendo la precaución de no formar burbujas entre las dos láminas.
Los portaobjetos se secan y a continuación se lleva a cabo el conteo
de las WBC, hasta 100, con un microscopio óptico, después de
depositar una gota de aceite de cedro sobre el portaobjetos.
La cantidad de WBC/ml, evaluada usando el
hemocitómetro, se multiplica por el valor del porcentaje de los
granulocitos neutrófilos correspondientes de la fórmula
leucocitaria. Este parámetro, dividido entre 100, expresa el valor
de neutrófilos/mm^{3} de sangre.
Los siguientes se consideran como valores de
parámetros normales: para las WBC, contadas sobre el hemocitómetro,
valores de hasta 18000/mm^{3}; para el porcentaje de neutrófilos,
contados sobre el portaobjetos, valores de hasta el 18%; para los
neutrófilos absolutos calculados, valores de hasta 1800.
Los datos se expresan como medias \pm EE. La
comparación entre los valores de granulocitos neutrófilos obtenidos
para los diferente grupos se hace usando el análisis ANOVA. Los
valores anormales se sometieron a la prueba de Dixon.
El tratamiento con taxol (30 mg/kg por vía i.p.
cada 2 días durante un total de 4 veces) causó una neutropenia
significativa 6 horas después de la última inyección del agente
(-90% de granulocitos neutrófilos comparado con los blancos, p <
0,001). Se encontró que la administración por vía oral o por vía
subcutánea de acetil L-carnitina (100 mg/kg)
protegía a los polimorfonucleatos frente al daño inducido por el
taxol (8-43% por vía sc; -23% por vía os) (Tabla
4).
En otro experimento, la combinación de ALC +
taxol causó una reducción del 73% en los neutrófilos, en oposición a
la reducción del 98% obtenida después de la administración sólo de
taxol. La administración de ALC o de vehículo + ALC no causó cambios
en los neutrófilos en comparación con la administración sólo del
vehículo o con animales sin tratar (blancos) (Tabla 3).
Tres días después de la última administración de
taxol, los granulocitos neutrófilos comenzaron a recuperarse
(-64% vs vehículo), aunque el efecto es incluso más marcado después del tratamiento combinado con ALC + taxol (-26% vs vehículo). Además, en este caso la administración de ALC o de vehículo + ALC no causó cambios en los neutrófilos en comparación con la administración sólo del vehículo o con animales sin tratar (blancos) (Tabla 4).
(-64% vs vehículo), aunque el efecto es incluso más marcado después del tratamiento combinado con ALC + taxol (-26% vs vehículo). Además, en este caso la administración de ALC o de vehículo + ALC no causó cambios en los neutrófilos en comparación con la administración sólo del vehículo o con animales sin tratar (blancos) (Tabla 4).
El taxol, administrado 4 veces en días alternos,
induce neutropenia severa. La administración por vía oral de ALC es
capaz de proporcionar una protección significativa frente al efecto
nocivo del taxol.
Esencialmente, se repitió el ejemplo 4, excepto
para la vía de administración del taxol, que en este caso fue por
vía intravenosa, es decir, en las condiciones de aplicación clínica
reales.
Los programas y las medidas experimentales fueron
iguales a los descritos en el ejemplo anterior.
Los resultados se dan en las Tablas 5 y 6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Estos resultados confirman el efecto protector de
la ALC administrada por vía oral.
En un estudio conducido de acuerdo con la Buena
Práctica de Laboratorio (BPL), para evaluar la acción de la acetil
L-carnitina (ALC) en combinación con taxol sobre
crecimiento tumoral, se inocularon ratones Balb/c con cáncer de mama
de roedor (L-MM3) y se trataron los animales tanto
con ALC más taxol, como sólo con taxol o con ALC. Además, en este
modelo tumoral, se midió la cantidad de neutrófilos que
circulaban.
Se usó la sal interna de acetil
L-carnitina (ampolla estéril), disuelta en agua para
preparados inyectables. Cada ampolla de ALC se disuelve en 4 ml de
agua para inyección (disolución O). Se llevan 0,8 ml de (O) hasta 50
ml con PBS estéril (Sigma) a fin de llevar a cabo la administración
por vía oral (100 mg/kg/50 ml).
Se pesa taxol (paclitaxel (INDENA)), se disuelve
en el vehículo específico preparado anteriormente (Cremophor® EL
(BASF), diluido 1:1 con etanol) y se almacena a +4ºC resguardado de
la luz. En el momento de su uso, la disolución de 12 mg/ml se diluye
a 1:4 con solución salina en tampón de fosfato (PBS) (SIGMA) y se
inyecta por vía i.p. (30 mg/kg/10 ml).
Las indicaciones experimentales esenciales se
proporcionan aquí a continuación:
Animales: 120 ratones BALB/c hembra que pesan
18-20 g (Harlan)
Condiciones de alojamiento de los animales: 5
ratones por jaula; temperatura 22 \pm 2ºC; humedad relativa 55
\pm -15%; 15-20 cambios de aire/h; ciclo de
luz/oscuridad de 12 h (luz de 7,00 a.m. - 7,00 p.m.); jaulas de
makrolon (26,7 x 20,7 x 14 cm) con tapas de rejilla de acero
inoxidable; camas de virutas de mazorca de maíz, desempolvadas,
estériles.
Dieta: pienso 4RF21 (compañía: Mucedola), comida
y agua disponibles "ad libitum".
La aleatorización es casual en bloques de
animales, es decir, el encargado del alojamiento de los animales
transfiere el ratón desde las cajas a las jaulas, completando una
jaula cada vez. En una segunda fase, el encargado identifica de
forma provisional todos los ratones, los pesa y, si los pesos
presentan diferencias significativas entre grupos, mueve los
animales de una jaula a otra, manteniendo invariable el número de
animales por jaula. Cada jaula se etiqueta con una tarjeta que lleva
el número del grupo, el tipo de tratamiento (sustancia y/o
sustancias inyectadas, dosis, vía de administración). Cada animal se
identifica con un número entre 1 y 5, escrito sobre la cola con
tinta indeleble.
Peso de los animales: los ratones se pesan antes
de comenzar el tratamiento y en el día de la última inyección de
taxol.
Programa de tratamiento 1: las células de cáncer
de mama de roedor transplantables (L-MM3) de origen
Balb/c se cultivan a 37ºC, en matraces de plástico, en un incubador
humidificado con el 5% de CO_{2} en medio DMEM que contiene el 5%
de SFB inactivado por calor, L-glutamina 2 mM y 80
\mug de gentamicina/ml. En el momento de la inoculación, las
células se despegaron con tripsina-EDTA y se
pusieron de nuevo en suspensión en el mismo medio sin PBS.
Los ratones Balb/c hembra sin anestesiar
recibieron inyecciones subcutáneas en el costado de 4 x 10^{5}
células en 0,2 ml de DMEM.
Cuatro días después de la inoculación del tumor,
los animales se trataron con las moléculas de acuerdo con el
siguiente programa, para los propósitos de evaluación de la
neutropenia:
La ALC se administra a continuación durante 10
días; los animales se sacrifican después de 6 horas.
Los grupos experimentales, constituido cada uno
por 15 ratones, son:
Programa de tratamiento 2: a fin de evaluar la
supervivencia y el tamaño tumoral, se trataron como sigue los mismos
grupos experimentales mencionados anteriormente, constando cada uno
de 15 ratones (con números de jaula distintos).
La administración de ALC dura 14 días (en los
grupos 16, 17, 18) y el tumor se mide hasta que alcanza un tamaño de
aproximadamente 2 cm. Los animales se mantienen vivos durante 100
días.
Los grupos experimentales, constituido cada uno
por 15 ratones, son:
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Jaula Nº | |
| Tumor + Vehículo | 13, 14, 15 | |
| Tumor + Taxol - ALC | 16, 17, 18 | |
| Tumor + Taxol | 19, 20, 21 | |
| Tumor + Vehículo - ALC | 22, 23, 24 |
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla de tratamientos y
sacrificios
El tamaño del tumor (longitud y anchura) se mide
dos veces a la semana con un compás, desde que el tumor es medible.
El tamaño del tumor se expresa en cm y se evalúa de acuerdo con la
siguiente fórmula: \surd (longitud x anchura).
Para el primer programa de tratamiento de los
animales, se toman muestras de sangre y de médula ósea. En los días
en los que se sacrifican, los ratones se anestesian con CO_{2}; la
sangre se toma del plexo retro-orbital (0,5 ml de
sangre/ratón) y se deposita en tubos de ensayo Eppendorf que
contienen 10 \mul de heparina Vister (5000 U/ml). Los animales se
sacrifican mediante dislocación cervical. Después, se toman las
muestras de médula ósea.
Se toman a diferentes tiempos una muestra de
sangre y una muestra de médula ósea.
Antes de comenzar el conteo de WBC, se examina el
instrumento mediante la medida de los parámetros de muestra de
sangre EMACHECK (examen humano) proporcionada por Delcon.
El instrumento se usa de acuerdo con las
instrucciones suministradas en el manual de instrucciones. La sangre
(25 \mul) se extrae del diluidor y se lleva hasta un volumen de 10
ml con solución isotónica (solución salina PLTA, Delcon) en un vaso
de precipitados (dil. 1:400) (disolución A). A partir de la
disolución A, el diluidor toma 100 \mul y los lleva hasta 10 ml
(dil. 1:100) en otro vaso de precipitados (disolución B). Se añaden
a la disolución A 3 gotas de agente lisogénico (Emosol, Delcon), la
disolución se mezcla a mano y se deja que actúe durante
aproximadamente 2 minutos de manera que se produce la lisis de las
células rojas y se libera la HGB (hemoglobina). La disolución A que
contiene el agente lisogénico se usa para las lecturas de WBC y de
hemoglobina (HGB). La disolución B se usa para las lecturas de RBC y
de plaquetas (PLT).
Se hacen lecturas dobles en cada muestra y entre
una muestra y la siguiente se lava el instrumento usando solución
isotónica.
Se usan portaobjetos Superfrost plus (25 x 75 x 1
mm) (Mensel-Glaser), listos para su uso. La sangre
(8 \mul) se deposita sobre el lado derecho del portaobjetos; otro
portaobjetos, colocado en un ángulo de 45º, sobre el lado izquierdo
de la sangre se echa hacia atrás hasta que entra en contacto con la
gota, que se esparce rápidamente a lo largo de la línea de contacto
entre los dos portaobjetos; el portaobjetos se mueve hacia delante
con un movimiento suave, rápido, de manera que se obtiene una fina
película de sangre. El portaobjetos se deja secar al aire, se tiñe
con colorante Diff-Quick (DADE), de acuerdo con las
instrucciones adjuntas y se seca de nuevo en aire.
Los portaobjetos se sumergen en disolución
Histolemon (Carlo Erba) durante 2 s; se deposita una gota de medio
de montaje sintético (Shandon) en el centro del portaobjetos y se
coloca un cubreobjetos cubriendo por completo la mancha de sangre,
teniendo la precaución de no formar burbujas entre las dos láminas.
Los portaobjetos se secan y a continuación se lleva a cabo el conteo
de las WBC, hasta 100, con un microscopio óptico, después de
depositar una gota de aceite de cedro sobre el portaobjetos.
La cantidad de WBC/ml, evaluada usando el
hemocitómetro, se multiplica por el valor del porcentaje de los
granulocitos neutrófilos correspondientes de la fórmula
leucocitaria. Este parámetro, dividido entre 100, expresa el valor
de neutrófilos/mm^{3} de sangre.
La comparación entre los valores de granulocitos
neutrófilos obtenidos para los diferente grupos se hace usando el
análisis ANOVA. Los tamaños de los tumores se comparan usando la
prueba no paramétrica de Mann Whitney para los datos
desparejados.
El tratamiento con taxol (30 mg/kg por vía i.p.
cada 2 días durante un total de 4 veces) causó una significativa
reducción en los polimorfonucleatos (-93% vs vehículo, p <
0,0001) en el ratón inoculado con cáncer de mama de roedor
L-MM3. La administración por vía oral de acetil
L-carnitina (100 mg/kg una vez al día durante 10
días) combinada con el tratamiento con taxol probó ser capaz de
contrarrestar significativamente la reducción de los granulocitos
neutrófilos inducida por el taxol (335/mm^{3} vs 65/mm^{3}, ººp
<,01) (Tabla 7).
Se encontró que el taxol, inyectado de acuerdo
con el mismo programa usado para la evaluación de los granulocitos
neutrófilos (30 mg/kg por vía i.p. cada dos días durante un total de
4 veces), inhibe significativamente el crecimiento tumoral
L-MM3, que se controló hasta que el tamaño del tumor
alcanzó aproximadamente 2 cm en el grupo de control (0,56 cm vs 1,8
cm, p < 0,0001). El tratamiento combinado con la ALC administrada
por vía oral durante 14 días (100 mg/kg una vez al día) más taxol
(30 mg/kg por vía i.p. cada 2 días durante un total de 4 veces) no
afectó a la actividad anticancerígena del taxol.
En conclusión, en este modelo de tumor, asimismo,
el taxol causó neutropenia severa y la ALC, administrada de forma
continua durante el periodo en el que tiene lugar este tipo de
toxicidad para la médula ósea, fue capaz de prevenir la reducción
de polimorfonucleares inducida por el taxol. Al mismo tiempo, la
acción de la ALC no afectó a la actividad anticancerígena del
taxol.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El taxol ha demostrado ser eficaz en el
tratamiento del cáncer de ovarios, de mama y de pulmón y en otros
tipos de cáncer (Rowinsky, E. K. y R. C. Donehower, (1991);
Pharmacol. Ther. 52:35.). La acción anticancerígena de este
compuesto está relacionada principalmente con su capacidad para
inhibir la depolimerización de los microtúbulos en los monómeros de
tubulina (Schiff, P. B., J. Fant y S. B. Horwitz. 1979. Nature);
este efecto bloquea las células que proliferan en la fase G_{2}/M
del ciclo celular, es decir, entre la última etapa de la interfase
en la que se completa la síntesis del ADN y el periodo posterior de
división celular o mitosis y esto conduce, en la célula, al inicio
de una cascada de eventos típica del proceso apoptótico. Por otra
parte, el taxol, al igual que otros agentes quimicoterapéuticos, se
asocia con efectos secundarios tales como neuropatías y
mielosupresión.
Comparando los datos estadísticos obtenidos en
los grupos de animales tratados sólo con vehículo y los de aquellos
tratados con taxol en combinación con acetil
L-carnitina administrado por vía oral, se ha
encontrado una reducción estadísticamente significativa en la masa
tumoral en el último caso en todos los tiempos de observación. En
contraste, la comparación del grupo tratado sólo con el vehículo,
con el grupo tratado con el vehículo en combinación con la
administración de acetil L-carnitina, no reveló
diferencias estadísticamente significativas en el crecimiento de
masa tumoral en ninguno de los tiempos de observación. El análisis
de los datos relacionados con la comparación entre el grupo tratado
con taxol y el grupo tratado con taxol en combinación con acetil
L-carnitina no mostró diferencias significativas en
el peso tumoral. En lo que respecta al análisis del número de
metástasis, los datos obtenidos muestran una reducción
estadísticamente significativa en ese número en los grupos tratados
con taxol, con taxol en combinación con acetil
L-carnitina y con vehículo en combinación con acetil
L-carnitina, en comparación con el grupo tratado
sólo con vehículo. En particular, los ratones tratados taxol o con
taxol en combinación con acetil L-carnitina también
mostraron una reducción en el diámetro de las metástasis comparado
con los grupos tratados sólo con vehículo o con vehículo en
combinación con acetil L-carnitina. Por lo tanto,
sobre la base del análisis de los datos siguientes, podemos afirmar
que la acetil L-carnitina no interfiere con la
acción anticancerígena del taxol en términos de inhibición de la
masa tumoral. Además, la acetil L-carnitina mostró
un efecto inhibitorio significativo sobre la formación de metástasis
pulmonar.
El siguiente ejemplo ilustra este aspecto
adicional de la presente invención.
En un estudio conducido de acuerdo con la Buena
Práctica de Laboratorio (BPL), para evaluar la acción de la acetil
L-carnitina (ALC) en combinación con taxol sobre
crecimiento tumoral, se inocularon ratones Balb/c con cáncer de
pulmón (M109) de roedor y se trataron los animales tanto con ALC más
taxol, como sólo con taxol o sólo con ALC. Además, en este modelo
tumoral, se midió la cantidad de neutrófilos que circulaban.
Se usó la sal interna de acetil
L-carnitina (ampolla estéril, 0,5 g), disuelta en
agua para preparados inyectables.
Cada ampolla de ALC se disuelve en 4 ml del
disolvente proporcionado (disolución O). Para ser precisos, se
llevaron 1,6 ml de disolución O hasta 40 ml con disolución de tampón
estéril (PBS, Sigma P-4417) y a continuación se
administraron por vía oral (100 mg/kg/20 ml).
Se pesa taxol (paclitaxel (INDENA), cod.
3926570), se disuelve en el vehículo específico (Cremophor® EL
(BASF), diluido 1:1 con etanol) y se almacena a +4ºC, resguardado de
la luz. En el momento de su uso, la disolución de 12 mg/ml se diluye
a 1:4 con solución salina en tampón de fosfato (PBS) (SIGMA) y se
inyecta por vía i.p. (30 mg/kg/10 ml).
Animales: 60 ratones Balb/c hembra que pesan 18 g
(Harlan).
Condiciones de alojamiento de los animales: 5
ratones por jaula; temperatura 22 \pm 2ºC; humedad relativa 55
\pm 15%; 15-20 cambios de aire/h; ciclo de
luz/oscuridad de 12 h (luz de 7,00 a.m. - 7,00 p.m.); jaulas de
makrolon (26,7 x 20,7 x 14 cm) con tapas de rejilla de acero
inoxidable; camas de virutas de mazorca de maíz, desempolvadas,
estériles.
Dieta: pienso 4RF21 (compañía: Mucedola), comida
y agua disponibles "ad libitum".
Aleatorización: casual en bloques de
animales.
Peso de los animales: los ratones se pesan antes
del inicio del tratamiento y a continuación una vez a la semana
hasta la finalización del experimento.
Las células tumorales M109 se aíslan del tumor
sólido.
Se adopta el procedimiento descrito por Kedar E.,
B. Ikejiri, G. D. Bannard y R. B. Herberman (Eur. J. Cancer Clin.
Oncol. 18; 991: 1982) con modificaciones. Se sacrificó un ratón
Balb/c (donante) mediante dislocación cervical y después de lavar su
espalda con alcohol desnaturalizado, la piel dorsal se cortó
longitudinalmente en dos colgajos que se separaron para eliminar la
masa tumoral. Esta última se puso sobre una gasa estéril, en donde
estaba libre de adherencias de tejido conjuntivo y de partes
necróticas y hemorrágicas. El tejido de estudio se puso sobre una
placa que contenía PBS con Ca^{++} y Mg^{++} (Gibco) a pH 7,2 y
en frío, se rompió en trozos que medían 2-3 mm y se
volvieron a poner en suspensión en una disolución (15 ml de
disolución/g de tumor) de PBS con Ca^{++} y Mg^{++}, pH 7,2 que
contenía 2 mg/ml de tripsina (tipo III, 10000 U/mg de proteína,
Sigma-Aldrich), 2 mg/ml de colagenasa (tipo
I-S 180 U/mg de sólido, Sigma), 0,2 mg/ml de ADNse
(tipo I 1548 U/mg de proteína, Sigma) y 25 \mug/ml de gentamicina
(Sigma) y se incubó a 37ºC durante 15 minutos bajo agitación
constante. A continuación la suspensión celular se homogeneizó
durante 2 minutos con la ayuda de un homogeneizador de tipo potter
(B. Braun), se incubó a 37ºC durante 10 minutos y se aspiró
suavemente varias veces con una jeringuilla con una aguja estéril
del Nº 21. Después de la adición de 30 ml de
RPMI-1640 (Eurobio) que contenía SFB al 10%
(Eurobio) y mantenida a 4ºC, la suspensión celular se filtró sobre
una gasa estéril y a continuación se centrifugó a 700 g durante 10
minutos. El sedimento celular se puso de nuevo en suspensión en
RPMI-1640 que contenía SFB al 10% y 0,2 mg/ml de
ADNse (Sigma) y a continuación se centrifugó a 700 g durante 10
minutos. El sedimento se sometió de forma consecutiva a dos lavados
con RPMI-1640; al final del segundo lavado, el
sedimento se puso de nuevo en suspensión suavemente con
RPMI-1640 para llevar a cabo el conteo para
establecer la concentración celular.
Conteo celular bajo el microscopio: El conteo
celular se lleva a cabo por medio de la prueba de exclusión de
colorante vital de azul de tripano; las células tumorales se diluyen
de forma apropiada con azul de tripano (Sigma) al 0,4%, un colorante
vital, que hace posible distinguir entre las células viables y las
muertas. La dilución que contiene las células que se van a contar se
agitó suavemente, se eliminaron 10 \mul y se usaron para preparar
una cámara de Burker. Se usó una rejilla cuadrada delimitada por las
tres líneas triples, que comprendía 16 cuadros pequeños (4 x 4)
delimitados unos de otros mediante líneas dobles. Ambas, las células
viables (que tienen una apariencia translúcida) y las células
muertas (que tienen una apariencia de color azul, habiendo
incorporado el colorante), se tienen que encontrar posicionadas
dentro del cuadrado formado por la línea central y por las líneas
triples, o en la propia línea. Esta operación se repitió para otros
tres cuadrados, después de lo cual se calculó la suma de las células
contadas en cada uno de los cuadrados y se determinó la media
aritmética para las lecturas tomadas en los cuatro cuadrados. La
media aritmética de las células viables se multiplicó por el factor
de dilución usado y por el factor de poder específico para el tipo
de cámara usada para el conteo (10^{4}), obteniendo así el número
de células viables contenido en un mililitro. La proporción de la
media aritmética de las células viables a la media aritmética de las
células totales, multiplicado por cien, expresa el porcentaje de
viabilidad celular.
Condiciones de inoculación: 60 ratones Balb/c sin
anestesiar que pesaban aproximadamente 18 g (Harlan) recibieron
inyecciones por vía i.m. de 3 x 10^{5} células de cáncer de pulmón
M109 en 0,1 ml de RPMI-1640 (Sigma) en la pata
trasera derecha.
Programa de tratamiento: para los propósitos de
evaluar el tamaño del tumor en los grupos de estudio experimentales,
cada uno de ellos constituido por 15 ratones Balb/c, se inocularon 3
x 10^{5} células de cáncer de pulmón M109 y se administraron las
moléculas de estudio en los tiempos programados. Se administró ALC
en la dosis de 100 mg/kg (por vía os) entre el día 4 y el día 17. El
vehículo diluido 1:4 con PBS de la disolución madre se administró
por vía i.p. en los días 8, 10, 12 y 14. El taxol se administró en
la dosis de 30 mg/kg (por vía i.p.) en los días 8, 10, 12 y 14, tal
como se describe en el siguiente programa:
Los animales se mantuvieron bajo observación
hasta el día 22 después de la inoculación de las células de cáncer
de pulmón de roedor M109 y a continuación se sacrificaron y se
extrajeron los pulmones para determinar el número de metástasis.
Los grupos experimentales, constituido cada uno
por 15 ratones, son:
| Grupo | Jaula Nº | |
| Tumor + Vehículo + ALC | 1, 2, 3 | |
| Tumor + Taxol + ALC | 4, 5, 6 | |
| Tumor + Taxol | 7, 8, 9 | |
| Tumor + Vehículo | 10, 11, 12 |
Tabla de
tratamiento
\newpage
Medida tumoral: el tumor se midió con un compás
tres veces a la semana tan pronto como llegó a ser palpable. La masa
tumoral se calcula sobre la base de las medidas de las dos
dimensiones (longitud y anchura), expresadas en mm, de acuerdo con
la fórmula siguiente:
(longitud x
anchura^{2})/2 = volumen tumoral
(mm^{3})
Si consideramos de forma convencional una
densidad tumoral igual a 1, el resultado es que el volumen tumoral
expresado en mm^{3} es igual al peso del tumor expresado en
mg.
Determinación del número de metástasis de pulmón:
en el día 22 después de la inoculación de cáncer de pulmón de roedor
M109, los animales de estudio se sacrificaron mediante dislocación
cervical. A continuación se extrajeron sus pulmones y se mantuvieron
durante aproximadamente 5-7 días en 5 ml de solución
de Bouin con la siguiente composición: 71% como disolución saturada
de ácido pícrico (Merck) y 24% como formaldehído al 10% (Fluka).
Cuando las metástasis de pulmón fueron evidentes, se contó su
número.
El análisis estadístico de los datos de tamaño
tumoral y del número de metástasis de pulmón se llevó a cabo usando
la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para datos
desparejados.
El análisis de los datos obtenidos en los
distintos grupos de animales de estudio muestra la inhibición del
crecimiento de masa tumoral en el grupo de ratones tratados con 30
mg/kg de taxol administrado por vía i.p., en comparación con los
ratones del grupo tratado sólo con vehículo (Tabla 8). Este fenómeno
ya es marcado después de sólo la primera administración del agente y
la diferencia en el peso de los tumores entre el grupo tratado con
taxol y el grupo tratado sólo con vehículo probó ser
estadísticamente significativa con p < 0,01. Después de la
segunda administración, la reducción observada en la masa tumoral se
mantiene, con una diferencia estadísticamente significativa (p <
0,0001) en comparación con el grupo tratado sólo con vehículo y esta
inhibición de la masa tumoral se mantiene después de las siguientes
administraciones. El grupo de animales tratados con taxol
administrado por vía i.p. en la dosis de 30 mg/kg en combinación con
acetil L-carnitina administrada por vía oral en la
dosis de 100 mg/kg ya muestra una reducción en el crecimiento de la
masa tumoral en comparación con la administración sólo del vehículo
después del primer tratamiento, con una significación de p <
0,05. Esta tendencia también se mantiene después de las
administraciones posteriores. En todos los días se llevó a cabo el
análisis, el grupo tratado con vehículo en combinación con acetil
L-carnitina no mostró diferencias altamente
significativas en el crecimiento de masa tumoral en comparación con
el grupo tratado sólo con vehículo. Además, la comparación entre el
grupo tratado sólo con taxol y el grupo que recibe tratamiento
combinado con taxol más acetil L-carnitina, no
reveló diferencias estadísticamente significativas en el tamaño de
masa tumoral en ninguno de los días analizados. Por lo tanto, sobre
la base del análisis de los datos siguientes, podemos afirmar que la
acetil L-carnitina no interfiere con la acción
anticancerígena del taxol en términos de inhibición de la masa
tumoral.
En lo que respecta al análisis del número de
metástasis al final del experimento, los datos obtenidos muestran
una reducción estadísticamente significativa en su número en los
grupos tratados con taxol, con taxol combinado con acetil
L-carnitina y con vehículo combinado con acetil
L-carnitina, en comparación con el grupo tratado
sólo con vehículo. En particular, los ratones tratados taxol o con
taxol combinado con acetil L-carnitina también
mostraron una reducción en el diámetro de las metástasis en
comparación con los grupos tratados sólo con vehículo o con vehículo
más acetil L-carnitina (véase la Tabla 10). Sobre la
base del análisis de los datos obtenidos, se puede sugerir que la
acetil L-carnitina tiene un moderado efecto
inhibitorio sobre la formación de metástasis de pulmón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La ALC no interfiere con el efecto terapéutico
del taxol y este aspecto también se ha evaluado en un modelo tumoral
humano, tal como se ilustra en el siguiente ejemplo.
Se usaron cultivos celulares de cáncer de colon
humano LOVO, transplantados en ratones sin pelo.
El tumor se inoculó en fragmentos sólidos en
ambos costados de los ratones (día 0).
Los tumores inoculados se midieron con un compás
y cuando se alcanzó un peso medio de tumor de 100 mg (día 7), los
animales se dividieron en 4 grupos de 5 animales cada uno de acuerdo
con el siguiente programa:
| Grupo 1 | Controles |
| Grupo 2 | taxol |
| Grupo 3 | ALC |
| Grupo 4 | taxol + ALC |
En el mismo día, se inició el tratamiento con ALC
y se continuó durante 18 días consecutivos (qdx18) (grupos 3 y 4).
La ALC se administró en la dosis de 100 mg/kg con un volumen de
administración de 25 ml/kg.
El taxol (54 mg/kg/ 15 ml/kg)se administró
por vía i.v. de acuerdo con un programa que consta de un total de 4
administraciones a intervalos de 4 días (q4dx4; días 10, 14, 18, 22)
(grupos 2 y 4).
En el curso del tratamiento y en las tres semanas
siguientes a intervalos de cada quince días, se midieron los tumores
y se calculó la inhibición de volumen tumoral (% de IVT, calculada
como 100 - (peso medio de los tumores tratados/peso medio de los
tumores de control x 100)) tal como se obtuvo con los distintos
tratamientos.
El tratamiento con taxol causó una inhibición del
crecimiento tumoral (IVT = 88%). El tratamiento con ALC no tuvo
efecto sobre el crecimiento tumoral, que fue similar al de los
tumores de los grupos de control. El tratamiento combinado con taxol
más ALC mostró una eficacia anticancerígena (IVT = 90%) casi
idéntica a la alcanzada sólo con taxol, confirmando que la ALC no
interfiere con la actividad citotóxica del taxol.
Hámsteres que pesaban 120 g se trataron con
bleomicina (1 unidad) por vía intratraqueal (IT) o con un volumen
equivalente de salino. Además, los animales se pretrataron con ALC
(200 mg/kg) o con salino por vía intraperitoneal justo antes de la
instilación de bleomicina, seguido por inyecciones diarias durante 1
semana. Se permitió que los animales se recuperasen durante 3
semanas antes de tomar las muestras de tejido. En el momento en el
que se tomaron las muestras de tejido (día 22), se preparó un pulmón
de cada animal para investigación histológica y el otro pulmón para
la determinación cuantitativa de hidroxiprolina.
Los grupos experimentales se organizaron del modo
siguiente:
1. Pretratamiento con solución salina/solución
salina por vía IT
2. Pretratamiento con solución salina/bleomicina
por vía IT
3. Pretratamiento con ALC/solución salina por vía
IT
4. Pretratamiento con ALC/bleomicina por vía
IT
Se llevaron a cabo tres experimentos en un total
de 41 animales.
Los pulmones se fijaron mediante insuflación a 20
cm de H_{2}O ex vivo con formaldehído al 10% en PBS (pH 7),
se embebieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con
hematoxilina/eosina. Se examinaron secciones con orientación similar
de la porción superior, media e inferior del lóbulo pulmonar,
respectivamente, para verificar la presencia y el grado de
infiltrado inflamatorio, edema y fibrosis intersticial e
intra-alveolar.
Los pulmones que recibían solución salina o
pretratamiento con ALC/ solución salina por vía IT, presentaban una
arquitectura alveolar normal. Los animales tratados con bleomicina
por vía IT o con pretratamiento sólo con solución salina presentaban
fibrosis densa, atelectasia alveolar y edema. En los animales
pretratados con ALC, hubo varias áreas fibróticas que, sin embargo,
parecían más delgadas con áreas de colapso menos densas.
El contenido de hidroxiprolina (uno de los
componentes principales del colágeno) se midió usando el conocido
método de Woessner. Las muestras de pulmón se homogeneizaron, se
hidrolizaron con NaOH y a continuación se dejaron oxidar antes de
añadir el reactivo de aldehído de Erlich. Se ensayaron alícuotas por
duplicado de cada muestra mediante espectrofotometría y se
compararon con una curva de calibración estándar obtenida con
hidroxiprolina purificada. El contenido de hidroxiprolina (HYP) se
expresa como mg/pulmón.
Los hámsteres sin tratar o aquellos tratados sólo
con ALC presentaron niveles de HYP compatibles con los valores
normales aceptados. Los animales tratados con bleomicina presentaban
un aumento en el nivel de HYP consecuente con la deposición
incrementada de colágeno durante la reacción fibrótica. Sin embargo,
los animales tratados con ALC mostraban una reducción en los niveles
de HYP, comparados con aquellos tratados con bleomicina, consecuente
la mejora en la respuesta fibrótica.
| Grupo | HYP |
| Solución salina/solución salina | 0,741 |
| Solución salina/bleomicina | 1,831 |
| ALC/solución salina | 0,801 |
| ALC/bleomicina | 1,380 |
| La ALC causa una reducción de la respuesta fibrótica en los animales tratados con bleomicina. |
Se usaron cultivos celulares de células de cáncer
de mama de roedor L-MM3, cultivadas a 37ºC en
matraces de plástico en una atmósfera humidificada con el 5% de
CO_{2}. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con SFB al
10% y en presencia de L-glutamina 2 mM y de 80
\mug/ml de gentamicina. Las células subconfluentes se recogieron
durante la fase de crecimiento exponencial usando
tripsina-EDTA y se pusieron de nuevo en suspensión
en DMEM. A continuación, éstas se inyectaron por vía subcutánea en
ratones Balb/c hembra que pesaban 20 g a una densidad de 4 x
10^{5}.
El tumor se midió con un compás tres veces a la
semana tan pronto como llegó a ser palpable. La masa tumoral se
calcula sobre la base de las medidas de las dos dimensiones
(longitud y anchura), expresadas en mm, de acuerdo con la fórmula
siguiente:
(longitud x
anchura^{2})/2 = volumen tumoral
(mm^{3}).
Si consideramos de forma convencional una
densidad tumoral igual a 1, el resultado es que el volumen tumoral
es igual al peso del tumor (mm^{3} = mg).
Agente usado: taxol (paclitaxel INDENA). El
agente se pesa, se disuelve en el vehículo específico (12 mg/ml) y
se almacena a +4ºC, resguardado de la luz. En el momento de su uso,
se diluye 1:4 con solución salina en tampón de fosfato (PBS, SIGMA)
y se inyecta.
Vehículo del agente: Cremophor EL (BASF).
El cremophor se diluye 1:1 con etanol y se
almacena resguardado de la luz. El día del tratamiento se diluye 1:4
con PBS.
Los animales se seleccionaron y se trataron tal
como se describió en los ejemplos anteriores.
Programa A). Los ratones se trataron por vía i.p.
con 30 mg/kg de taxol y por vía s.c. con 100 mg/kg de PLC de acuerdo
con el siguiente programa.
\vskip1.000000\baselineskip
En ambos programas de tratamiento, los grupos de
control, de taxol y de PLC se inocularon con el mismo número de
células.
Además, el tratamiento con taxol se administró de
acuerdo con los mismos procedimientos y en los mismos tiempos tanto
en el grupo tratado sólo con taxol, como en el grupo tratado con
taxol y PLC.
El tratamiento con PLC, ya sea sólo o en
combinación con taxol, en el programa de tratamiento A) comienza en
el día 12 (después de la inoculación del tumor) y finaliza en el día
24; en el programa de tratamiento B), el tratamiento comienza en el
día 5 después de la inoculación del tumor y finaliza al final del
experimento, es decir, en el día 59.
Experimento
A)
Animales con tumores/número
total de
animales
Tamaño
tumoral
Aplicando la prueba no paramétrica de
Mann-Whitney para datos desparejados, se
encontraron diferencias significativas en todos los tiempos de
observación en el grupo de taxol + PLC frente al grupo de control,
con p < 0,003 y sólo en el último tiempo de observación (día 46)
el nivel de significación cayó hasta p < 0,034. Se debería
observar que los valores para el grupo del taxol en el día 46 no
eran significativamente diferentes de los valores del grupo de
control.
Experimento
B)
Animales con tumores/animales
totales
\newpage
Tamaño
tumoral
En este experimento se aplicó la prueba
estadística de Wilcoxon, que reveló que sólo el grupo de control era
significativamente diferente del grupo de Taxol + PLC, con p <
0,05.
Claims (18)
1. Uso de propionil L-carnitina o
de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer,
conteniendo además dicho medicamento taxol, caracterizado
porque dicha propionil L-carnitina produce un efecto
sinérgico con la actividad del taxol.
2. Uso de acetil L-carnitina o de
una sal farmacéuticamente aceptable para la preparación de un
medicamento eficaz en la reducción de la metástasis, conteniendo
además dicho medicamento taxol.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el
tumor tratado es un tumor de pulmón.
4. Uso de acetil L-carnitina o de
una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación
de un medicamento para el tratamiento del cáncer, conteniendo además
dicho medicamento taxol, caracterizado porque dicho
medicamento está sustancialmente desprovisto de los efectos
secundarios típicos del taxol.
5. Uso de acetil L-carnitina o de
una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación
de un medicamento para el tratamiento del cáncer, conteniendo además
dicho medicamento bleomicina, caracterizado porque dicho
medicamento está sustancialmente desprovisto de la toxicidad
pulmonar típica de dicha bleomicina.
6. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho
efecto secundario es neutropenia.
7. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho
efecto secundario es neuropatía periférica.
8. Uso según la reivindicación 5, en el que dicho
efecto secundario es lesión pulmonar.
9. Combinación para el tratamiento del cáncer que
comprende taxol y acetil L-carnitina o una de sus
sales farmacéuticamente aceptables.
10. Uso de la combinación según la reivindicación
9 para la preparación de un medicamento con actividad
anticancerígena, caracterizado porque dicho medicamento
ejerce una acción sinérgica y está sustancialmente desprovisto de
efectos secundarios o presenta sólo efectos secundarios
limitados.
11. Composición farmacéutica que comprende la
combinación según la reivindicación 9 en una mezcla con vehículos
y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
12. Combinación para el tratamiento del cáncer
que comprende bleomicina y acetil L-carnitina.
13. Uso de la combinación según la reivindicación
12, para la preparación de un medicamento con actividad
anticancerígena, caracterizado porque dicho medicamento está
sustancialmente desprovisto de efectos secundarios, o presenta sólo
efectos secundarios limitados.
14. Composición farmacéutica que comprende la
combinación según la reivindicación 12, en una mezcla con vehículos
y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
15. Composición farmacéutica según la
reivindicación 14, que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de bleomicina junto con una cantidad protectora de acetil
L-carnitina, en una mezcla con vehículos y
excipientes farmacéuticamente aceptables.
16. Kit para el tratamiento del cáncer que
comprende:
a) una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de taxol;
b) una composición farmacéutica que comprende
propionil L-carnitina o sales farmacéuticamente
aceptables de la misma en una cantidad adecuada para producir un
efecto sinérgico con dicho taxol.
17. Kit para el tratamiento del cáncer que
comprende
a) una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de taxol;
b) una composición farmacéutica que comprende
acetil L-carnitina o sales farmacéuticamente
aceptables de la misma en una cantidad adecuada para producir una
acción sustancialmente protectora frente a los efectos secundarios
del taxol.
18. Kit para el tratamiento del cáncer que
comprende
a) una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de bleomicina;
b) una composición farmacéutica que comprende
acetil L-carnitina o sales farmacéuticamente
aceptables de la misma en una cantidad adecuada para producir una
acción sustancialmente protectora frente a la toxicidad pulmonar de
la bleomicina.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT98RM000511 IT1302121B1 (it) | 1998-07-30 | 1998-07-30 | Associazione ad attivita' antineoplastica sostanzialmente priva deglieffetti tossici o collaterali causati dai farmaci antineoplastici |
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| IT1999RM000206 IT1306124B1 (it) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | Uso di alcanoil l-carnitine nella preparazione di medicamenti adattivita' antitumorale. |
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