ES2356308T3 - Uso de derivados peptídicos para inducir la diferenciación celular. - Google Patents
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Abstract
Derivado peptídico de fórmula general **(Ver fórmula)** en la que:- n=0-4, m=1-4, k=0-1; - R1 es un radical hidrocarbonado C1-C3 sustituido con un grupo funcional seleccionado de grupos carboxílico, amido C1-C5 o amino, estando el grupo carboxílico opcionalmente esterificado; o - R1 es un radical hidrocarbonado C1-C3 sustituido simultáneamente con (a) un grupo amino que está opcionalmente sustituido con un sustituyente acilo y (b) un grupo carboxílico; o - R1 es un radical hidrocarbonado C1-C3 sustituido con un grupo heterocíclico insaturado de 5-6 miembros, en el que el radical hidrocarbonado puede comprender simultáneamente un grupo amino opcionalmente sustituido con un sustituyente acilo; o - R1 es un grupo heterocíclico saturado; - R2 es átomo de hidrógeno o un grupo funcional seleccionado de carboxilo, que puede estar esterificado; - R3 es un grupo heterocíclico o cíclico saturado o insaturado de 5-6 miembros, o un grupo carboxilo o amino, estando el grupo carboxilo opcionalmente esterificado; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de hemoblastosis o melanoma.
Description
Uso de derivados peptídicos para inducir la
diferenciación celular.
La invención se refiere a la medicina y en
particular, al tratamiento de enfermedades cancerosas y es útil en
el tratamiento de tumores de diferentes génesis tal como se
especifica en las reivindicaciones.
La invención se refiere a la inducción de la
diferenciación celular usando derivados peptídicos como agente que
induce la diferenciación celular y en particular, a su uso en la
terapia no citotóxica antitumoral tal como se especifica en las
reivindicaciones.
Se sabe que la ausencia de la capacidad de
diferenciar la mayoría de las células tumorales da como resultado un
crecimiento tumoral incontrolable.
La búsqueda de agentes para inducción tanto
específica como no específica de la diferenciación celular es por
tanto uno de los enfoques novedosos de la terapia no citotóxica
antitumoral.
Por "inducción de la diferenciación
celular" se entiende la capacidad de las diferentes sustancias
para restaurar (o realizar) las siguientes funciones perdidas o
disminuidas debido a diversos motivos: pasar un ciclo celular normal
por una célula, síntesis de sustancias vitalmente importantes y
biológicamente activas en la misma, etc.
Las sustancias o compuestos cuyo mecanismo de
acción no se asocia con una función celular particular y aquéllos
pueden provocar su diferenciación por varios parámetros, pueden
atribuirse a inductores de diferenciación no específicos.
Se conocen métodos para inducir la
diferenciación de células tumorales administrando retinoides o
\alpha-2-interferón [Cancer Res.,
40, 2245-3350, 1980].
Se usa el inductor de diferenciación celular
ácido politransretinoico (PTRA) como agente para prolongar la
remisión tras la inducción o terapia de posremisión de leucemia
promielocítica aguda. La diferenciación celular tal como se afecta
por derivados de ácido retinoico conduce a la estabilización del
crecimiento de células tumorales [Abelev G.I. Differentiation and
tumor phenotype in cells of leukoses and lymphomas/En: The Clinical
Oncohematology (editado por M.A. Volkova). Moscú, the Meditsina
publishers, 2001, capítulo 11, páginas 116-123].
El uso de preparaciones de
\alpha-interferón como agentes de inmunoterapia en
el tratamiento de melanoma también se asocia con la inducción de la
diferenciación de células tumorales en la que se potencia la
capacidad de adhesión y se cambia el perfil antigénico. La terapia
con interferón da como resultado la progresión reducida del
crecimiento tumoral así como previene el desarrollo y la tasa de
metástasis [Atzpodien J., Kirchner H. Cancer, Cytokines, and
cytotoxic cells: interleukin-2 in the immunotherapy
of human neoplasms. Klin. Wochenschr, 1990, v. 68, pág.
1-7].
Recientemente, se han introducido en la práctica
clínica preparaciones que provocan la diferenciación de células
hematopoyéticas dañadas debido a quimioterapia citotóxica. Estas
preparaciones son diferentes citocinas preparadas a partir de médula
ósea tal como hematohormonas: factor estimulante de colonias
granulocíticas, factor estimulante de colonias de granulocitos y
macrófagos y otros. Su uso en el tratamiento de diferentes tumores
humanos da como resultado la maduración acelerada de las células de
la médula ósea y previene el efecto citotóxico hematológico de las
preparaciones para quimioterapia [Crawford j., Ozer H., Stoller R.
et al. Phase II of clinical investigation of
GM-CSF by the patients of SCLC with the
dose-intensive chemotherapy. The New England Journal
of Medicine. 1991, v. 325, N.º 3, pág. 164-170].
Por tanto, la inducción de la diferenciación de
células tumorales es uno de los mecanismos destacados de la
estabilización del crecimiento de neoplasma, aumento del efecto de
la inmunoterapia y la corrección de la toxicidad hematológica de las
preparaciones para quimioterapia.
El documento
DE-A-3424781 se refiere al uso de
L-carnosina, y sales de la misma, en el tratamiento
de tumores. El documento
JP-A-1042430 se refiere a
L-carnosina en el contexto de aliviar los efectos
secundarios de agentes quimioterápicos.
El documento
GB-A-2143732 da a conocer una
combinación de homocarnosina con OK-432, que se dice
que es un inmunopotenciador.
Los presentes inventores han descubierto que los
derivados peptídicos de fórmula general (I):
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son inductores potentes de la
diferenciación celular y son útiles como agentes para terapia no
citotóxica de enfermedades cancerosas en particular melanoma y
hemoblastomas, así como, como agentes de corrección
hematológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmula (I)
se dan a conocer en la solicitud
internacional PCT/RU98/00215 como que tienen un efecto antioxidante,
antiasmático, antihipóxico, antiinflamatorio, antiviral,
antibacteriano, regulador de lípidos, antimetastásico así como otras
clases de efectos terapéuticos. Los compuestos de estructura
acetil-aspartil-histamina y
aspartil-histamina cíclica se dan a conocer en el
trabajo de Kvamme, E.; Reichelt, K.L.; Edminson, P.D.; et al.
N-substituted peptides in brain. Fed. Eur. Biochem.
Society Meet., [Proc.], 1975, 41,
127-136.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un derivado
peptídico de fórmula general (I)
en la
que:
- n=0-4, m=1-4,
k=0-1;
- R_{1} es un radical hidrocarbonado
C_{1}-C_{3} sustituido con un grupo funcional
seleccionado de grupos carboxílico, amido
C_{1}-C_{5} o amino, estando el grupo
carboxílico opcionalmente esterificado; o
- R_{1} es un radical hidrocarbonado
C_{1}-C_{3} sustituido simultáneamente con (a)
un grupo amino que está opcionalmente sustituido con un sustituyente
acilo y (b) un grupo carboxílico; o
- R_{1} es un radical hidrocarbonado
C_{1}-C_{3} sustituido con un grupo
heterocíclico insaturado de 5-6 miembros, en el que
el radical hidrocarbonado puede comprender simultáneamente un grupo
amino opcionalmente sustituido con un sustituyente acilo; o
- R_{1} es un grupo heterocíclico
saturado;
- R_{2} es átomo de hidrógeno o un grupo
funcional seleccionado de carboxilo, que puede estar
esterificado;
- R_{3} es un grupo heterocíclico o cíclico
saturado o insaturado de 5-6 miembros, o un grupo
carboxilo o amino, estando el grupo carboxilo opcionalmente
esterificado;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para su uso en el tratamiento de hemoblastosis o melanoma.
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En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un derivado peptídico de fórmula general:
en la
que:
- n es 0, k es 0 y R_{1}-CON-
es
- n es 0, k es 1 y R_{1}-CO-
es
- R_{2} es H, COOH o COOCH_{3};
- R_{3} es
- m es 1-4,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para su uso en el tratamiento de hemoblastosis o melanoma.
\vskip1.000000\baselineskip
También se proporciona un derivado peptídico de
fórmula general (I)
en la que R_{1}, n, k, R_{2}, m
y R_{3} son tal como se definieron anteriormente, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la reducción
de neutropenia provocada por terapia
mielosupresora.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos preferidos de fórmula general (I)
usados en la presente invención son compuestos de fórmula general
(I) mostrados a continuación:
También se proporcionan los compuestos 1 a 9, y
11 a 38 anteriores, y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos, para su uso en la reducción de neutropenia provocada por
quimioterapia mielosupresora.
La presente invención también proporciona los
compuestos 1 a 7, 9 y 11 a 38 anteriores, y sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos, para su uso en el tratamiento de
hemoblastosis o melanoma, en combinación con interferón, para
potenciar la eficacia de la inmunoterapia.
El compuesto más preferido usado en la presente
invención es el compuesto de fórmula
En una realización adicional, la presente
invención proporciona un derivado peptídico de fórmula
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para su uso en la reducción de neutropenia y
trombocitopenia provocada por terapia mielosupresora. También se
proporciona dicho derivado peptídico y sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para su uso en inmunoterapia contra tumores
malignos, en combinación con interferón, para mejorar la eficacia de
la
inmunoterapia.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la invención los
derivados peptídicos de fórmula general (I) son para administración
durante un período prolongado de tiempo a una dosis única de
0,5-5,0 mg/kg de peso corporal.
En una realización preferida de la invención los
derivados peptídicos de la invención son para su uso en la inducción
de la diferenciación celular en la que con el fin de estabilizar el
crecimiento de tumores malignos, en particular melanoma o
hemoblastosis, los derivados peptídicos de fórmula general (I) deben
administrarse en la dosis única de 0,5-5,0 mg/kg de
peso corporal durante al menos 15 días cuando se han agotado las
capacidades de la quimioterapia.
La administración de derivados peptídicos de
fórmula general (I) en combinación con el agente de inmunoterapia
interferón da como resultado la potenciación de su eficacia con
respecto a células tumorales malignas en particular melanoma.
En otra realización preferida de la presente
invención, los derivados peptídicos de la presente invención son
para su uso en la inducción de la diferenciación celular en la que
con el fin de potenciar la eficacia de la inmunoterapia contra
melanoma, los derivados peptídicos de fórmula general (I) deben
administrarse en una dosis de 0,5-5,0 mg/kg de peso
corporal durante no menos de 15 días junto con la administración de
interferón.
En una realización preferida adicional de la
presente invención los derivados peptídicos de la invención son para
su uso en la inducción de la diferenciación celular en la que con el
fin de disminuir la toxicidad hematológica, los derivados peptídicos
de fórmula general (I) deben administrarse diariamente en la dosis
única de 0,5-5,0 mg/kg de peso corporal 5 días antes
de que se inicie el ciclo de quimioterapia, durante la quimioterapia
y dentro del período entre los ciclos de quimioterapia hasta el
siguiente ciclo de terapia citotóxica.
A continuación, se presentan los ejemplos que
ilustran las realizaciones preferidas de la presente invención.
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Se llevó a cabo el estudio en ratones Balb/C
hembras (desnudas) sin timo de 10-12 semanas de edad
que pesaban 20-22 gramos (criadas en el Centro de
Investigación del Cáncer Ruso (RCRC) denominado después N.N. Blokhin
de la Academia Rusa de Ciencias Médicas (RAMS)). Se tomó una cepa de
melanoma humano obtenido anteriormente a partir de material clínico
primario del banco de cepas tumorales del RCRC de la RAMS para su
trasplante a ratones "desnudos" sin timo. Se disgregó el tumor
mediante solución de Versen con tinción azul trípano vital y se
inoculó por vía subcutánea a ratones en la cantidad de 1,6 millones
de células por ratón.
Se administró Dicarbamine a ratones por vía
intragástrica usando una sonda de metal diariamente en una dosis de
1,0 mg/kg empezando 4 días antes de la inoculación del tumor y
después durante 10-11 días (ciclo de administración
hasta 15 días). Se sacrificaron los ratones con anestesia con éter
12, 24 y 48 horas tras la última administración.
Se usaron 4 grupos de ratones en el
experimento:
Grupo 1 - el control, no se administra
Dicarbamine. Los ratones se sacrifican en los mismos términos que
los de los grupos que recibieron Dicarbamine.
Grupo 2 - se administra Dicarbamine y los
ratones se sacrifican 12 horas tras la finalización de la
administración.
Grupo 3 - se administra Dicarbamine y los
ratones se sacrifican 24 horas tras la finalización de la
administración.
Grupo 4 - se administra Dicarbamine y los
ratones se sacrifican 48 horas tras la finalización de su
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron cuatro parámetros morfológicos
tales como el número de células con pigmento y el número de células
con signos de apoptosis (capacidad para diferenciar), el número de
mitosis (actividad de proliferación) y zona de necrosis para
monitorizar el grado de diferenciación y proliferación de melanoma
M-6 en los grupos de animales control y los grupos
de Dicarbamine. Estos parámetros se determinaron dinámicamente y se
correlacionaron con la imagen morfológica general de un crecimiento
tumoral como signo integral. Para este fin se retiró el tumor en
ratones, se colocó en formalina y se procesó histológicamente para
microscopía óptica. Los datos obtenidos se muestran en la tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
El estudio llevado a cabo permitió a los
inventores establecer que melanoma humano inoculado a ratones
desnudos en el día 9 forma el tumor que consiste en células
polimorfas que crecen en campos continuos con desarrollo de estroma
no significativo. Se cuentan los sitios de necrosis pequeños en el
tumor, sitios que aumentan ligeramente a las 48 horas (hasta el
3-5% de zona de corte) en comparación con plazos de
sacrificio de 12 y 24 horas (el 1-2% y el
2-3%, respectivamente). Se observó el
3-5% de mitosis en el tumor durante todos los
períodos de crecimiento. La apoptosis se expresa ligeramente. Se
encuentran con poca frecuencia células que contienen pigmento y su
número durante el primer día no supera el 1-2% y
sólo en 48 horas de crecimiento aumenta hasta el
2-3%. Por tanto, la intensidad de génesis de
melanina durante este período no es significativa. La característica
obtenida permite concluir que el melanoma es un tumor de crecimiento
rápido que prácticamente carece de capacidad de diferenciar
basándose tanto en el grado de apoptosis como ante todo, basándose
en la capacidad funcional basal de génesis de melanina.
Se evaluó el efecto de Dicarbamine en la
diferenciación de células de melanoma basándose en la intensidad de
la génesis de melanina contando el número de células con melanina en
los cortes del tumor. Con este objeto, se extirpó el tumor en
ratones, se colocó en glutaraldehído y se procesó histológicamente
para que se realizara microscopía electrónica. Se calculó el índice
de intensidad de génesis de melanina (MGII) que refleja el grado de
diferenciación celular en los cortes preparados según la siguiente
ecuación:
MGII = NCM x
NM,
en la
que:
NCM es el número de células que contienen
melanosomas;
NM es el número promedio de melanosomas por
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la intensidad de génesis de
melanina llevado a cabo mediante este índice se muestra en la tabla
2.
La prueba de microscopía electrónica muestra que
en comparación con el control, aumentan el número de células
tumorales que comprenden melanosomas y el número de melanosomas por
célula debido al efecto de Dicarbamine. El índice MGII aumenta para
los plazos observados como sigue: en 12 horas - 1,9 veces, en 24
horas - 2,4 veces y en 48 horas - 2,3 veces.
Por tanto, tras un ciclo de administración de 15
días de Dicarbamine, el aumento promedio del grado de diferenciación
de células tumorales de melanoma M-6 es 2,2 veces lo
que está respaldado por la intensidad de génesis de melanina (el
índice MGII), el aumento en el número de células que comprenden
melanosomas (1,3 veces) y el aumento en el número de melanosomas
(1,3 veces).
\vskip1.000000\baselineskip
A ratones con melanoma humano inoculado por vía
subcutánea tal como se describe en el ejemplo 1, se les dosificó
diariamente por vía p.o. Dicarbamine a una dosis única superior de
4,5 mg/kg durante 3 semanas desde el momento del trasplante
tumoral.
Se sacrificaron los animales a las 3 semanas del
trasplante tumoral. En el momento del sacrificio el volumen del
tumor era en promedio de 150 mm^{3}. Tras el sacrificio, el tumor
se extirpó en ratones y se disgregó con solución de Versen y se
aisló la fracción celular en la que se calculó el número de células
con pigmento en la cámara de Goryaev durante la microscopía
óptica.
Los estudios llevados a cabo muestran que en el
control el número promedio de células con melanina era de
39,14\pm8,72, y en la prueba era de 108,42\pm11,91, es decir el
número de células que sintetizan melanina aumentó significativamente
3 veces (p<0,01).
Por tanto, en las series de pruebas llevadas a
cabo usando Dicarbamine a las diferentes dosis, se obtuvo un efecto
estadísticamente significativo de inducción pronunciada de
diferenciación de células de melanoma humano tal como se evidencia
basándose en la intensidad de génesis de melanina.
Los datos se presentan en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el estudio en ratones Balb/C
hembras "desnudas" sin timo de 10-12 semanas de
edad que pesaban 20-22 gramos (criados en el RCRC
denominado después N.N. Blokhin de la RAMS). Se tomó una cepa
Mel-6 de melanoma humano obtenida anteriormente de
material clínico primario del banco de cepas tumorales del RCRC de
la RAMS para su trasplante a ratones sin timo.
Se administró Dicarbamine diariamente por vía
p.o. a las dosis únicas de 1,5 mg/kg y 4,5 mg/kg a dos grupos de
ratones durante 3 semanas desde el momento del desarrollo tumoral
(desde el día 15 hasta el día 36 a partir del trasplante del
tumor).
Se realizó la medición del tumor en los días 18,
25, 33, 39, 46 y 53 a partir del trasplante. Se evaluó el efecto de
Dicarbamine basándose en la dinámica de crecimiento tumoral durante
8 semanas en mediciones múltiples de volúmenes tumorales "V"
según la fórmula:
en la que L es la longitud en mm, s
es el ancho en mm; y h es la altura en
mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calculó entonces la razón entre los volúmenes
de los tumores V_{t}/V_{t-1} expresada en
porcentaje y se procesó estadísticamente según el método de Student
para calcular una diferencia estadísticamente significativa. Los
datos obtenidos se muestran en la tabla 4.
Los datos obtenidos mostraron un retraso de 7
días en la ganancia de masa tumoral máxima en comparación con el
control. En comparación con el grupo control, se encontraron
diferencias estadísticamente significativas en la tasa de
crecimiento tumoral en el día 25 desde el trasplante en el grupo de
ratones que recibieron Dicarbamine en las dosis únicas de 4,5 mg/kg
que corresponde a un ciclo de 10 días de dosificación de Dicarbamine
a una dosis de ciclo de 45 mg/kg. En este grupo el volumen del tumor
promedio aumentó en el 166,0\pm93,0%, mientras que en el control
este parámetro era del 329,0\pm88,9% (p<0,015).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el estudio según la técnica
descrita en el ejemplo 3. Se administró Dicarbamine diariamente por
vía p.o. a la dosis única de 4,5 mg/kg durante 3 semanas desde el
momento de la aparición del tumor (desde el día 15 hasta el día 36).
En los grupos de tratamiento combinado también se administró
Dicarbamine diariamente a la dosis única de 4,5 mg/kg durante 3
semanas (días 15-36) en combinación con una
administración única de los agentes citostáticos antitumorales
cisplatino a una dosis de 6 mg/kg por vía i.v. (día 25) y aranoza a
una dosis de 40 mg/kg por vía i.p. (día 27). Se inició la terapia
citostática siendo el volumen del tumor promedio de 200\pm62
mm^{3}. A los días 18, 25, 33, 39, 46 y 53 del trasplante se
midieron los volúmenes de los tumores y se calculó el valor
V_{t}/V_{t-1}, valor que se expresó en
porcentaje. Los datos obtenidos se muestran en la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se deduce de los datos presentados que
Dicarbamine en la vía de dosificación usada retarda el crecimiento
tumoral en etapas iniciales lo que puede mostrarse por la
disminución en la ganancia de masa tumoral en el día 25 del
166,0\pm93,0% en comparación con el control en el que la ganancia
era del 329,0\pm88,9%. Por tanto, se reprodujeron los resultados
del efecto de Dicarbamine sobre el crecimiento del melanoma (véase
el ejemplo 3). La combinación de la quimioterapia con aranoza y
cisplatino en los regímenes indicados parecen ser ineficaces, es
decir la ganancia del tumor en este plazo era superior al valor
control (413,0\pm276,0%). Esto prueba la ausencia de sensibilidad
de la cepa de melanoma humano Mel-6 usada al esquema
de quimioterapia proporcionado. La introducción de Dicarbamine en el
esquema de quimioterapia ineficaz dio como resultado una disminución
estadísticamente significativa (p<0,05) en la ganancia de masa
tumoral en el día 25 del 182,0\pm60,0% lo que prueba su eficacia
en caso de ausencia del efecto de la quimioterapia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió el efecto de Dicarbamine sobre la
capacidad de proliferación de células de melanoma junto con la
administración de \alpha-interferón (Introne®,
IN). Debe observarse que Dicarbamine por sí misma puede ralentizar
la actividad de proliferación de células de melanoma sin cambiar su
supervivencia.
Se llevó a cabo el estudio en dos cultivos
celulares continuos que crecen en forma de una monocapa en un
cultivo tisular sobre células de melanoma B-16
murino y células de melanoma M-5 humano. Se
administró IN a concentraciones de 70-700 UI/ml. Se
transfirió Dicarbamine (D) a la disolución madre (1.000 \muM), se
esterilizó a través de filtros con diámetro de poro de 0,22 \mum y
después se diluyó hasta concentraciones de 0,01 y 1,0 \muM.
Se evaluó el efecto de preparaciones sobre
células basándose en la tasa inicial de proliferación celular
(IRCP). Este índice (IRCP) que habitualmente se denomina tasa de
crecimiento de colonias, se determinó contando el número de células
en microcolonias durante los primeros días tras la afección en
placas de "prueba" (con preparaciones) y "control" (sin
preparaciones), analizando 50 colonias en cada una de ellas. Cada
"punto" incluía no menos de tres placas Petri con colonias
celulares en crecimiento en concentraciones específicas de adición
de preparaciones en estudio. Se calculó la tasa de crecimiento de
colonias (en %) según la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se calcularon los números de células en
microcolonias para cada "punto". Se evaluó la toxicidad de las
preparaciones en el intervalo seleccionado de concentraciones
mediante la supervivencia de células que se determinó por la razón
entre los números de colonias en crecimiento en placas de
"prueba" y "control". Los resultados de las pruebas se
muestran en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Puede observarse en la tabla que en el control
con melanoma M-5 el índice IRCP se conservó al nivel
del 100% durante 96 horas.
En las muestras con células de
M-5 cuando se añadió
\alpha-interferón a la concentración de 7,0 UI/ml
en 48 horas, el índice IRCP aumentó hasta el 111,3% y se ralentizó
hasta el 94,8 y el 73,0% respectivamente sólo en 76 y 96 horas.
Cuando se añadió \alpha-interferón a una
concentración de 70 UI/ml en 48 horas, el índice IRCP se ralentizó
hasta el 53,7%, en 72 horas - hasta el 51,9% y en 96 horas - hasta
el 48,8%. Es decir el efecto de inhibición máximo de
\alpha-interferón a una concentración de 70 UI/ml
logra un IRCP del 50%.
Cuando se añadió Dicarbamine a la concentración
de 0,01 \muM, el índice IRCP en 48 horas se ralentizó hasta el
82,4%, en 72 horas - hasta el 73,6% y en 96 horas - hasta el 70,2% y
cuando se añadió Dicarbamine a la concentración de 1 \muM, el
índice IRCP en 48 horas se ralentizó hasta el 69,0% y en 72 horas -
hasta el 50,0%.
Por tanto, el efecto de inhibición máximo de
Dicarbamine también logra el 50% del índice IRCP y se obtuvo a la
concentración de preparación de 1,0 \muM.
En las pruebas sobre melanoma
B-16 cuando se añadió
\alpha-interferón a la concentración de 70 UI/ml,
el índice IRCP en 72 horas se ralentizó hasta el 50,0%, y cuando se
añadió Dicarbamine en dos concentraciones indicadas, el índice IRCP
en 48 horas se ralentizó hasta el 52,9 y el 44,6% respectivamente y
en 72 horas hasta el 61,0 y el 44,6% respectivamente. La reducción
significativa del índice IRCP hasta el 38,0 y el 29,8% se obtuvo
sólo cuando se añadió \alpha-interferón a una
concentración de 700 UI/ml.
Por tanto, las pruebas llevadas a cabo muestran
que \alpha-interferón y Dicarbamine inhiben el
crecimiento de células de melanoma M-5 y melanoma
B-16 al nivel del 40,0-50,0% que es
característico de inductores de diferenciación. Puede obtenerse un
efecto más pronunciado sobre el índice IRCP sólo en caso de un
aumento de 100 veces en la concentración de
\alpha-interferón.
La adición combinada de
\alpha-interferón a una concentración de 70,0
UI/ml y Dicarbamine a células de M-5 muestra que en
todos los casos el índice IRCP bajó hasta el
30,7-24,0-31,0% respectivamente para
los plazos de registro. El efecto más pronunciado se obtuvo sobre
melanoma B-16 cuando se usaron en combinación
\alpha-interferón a una concentración de 700 UI/ml
y Dicarbamine a ambas concentraciones: el índice IRCP bajó hasta el
24,9 y el 29,8% en 48 horas y hasta el 22,0 y el 16,0% en 72 horas,
respectivamente.
Por tanto, Dicarbamine de manera similar a
\alpha-interferón ralentiza la proliferación de
células de melanoma B-16 murino y melanoma
M-5 humano y no muestra toxicidad (según el índice
de supervivencia). Tal como se mostró mediante los ejemplos
proporcionados, el efecto de Dicarbamine es característico de
inductores de diferenciación y tiene un carácter aditivo en
combinación con el inductor de diferenciación conocido
\alpha-interferón sobre células de melanoma. Este
efecto da como resultado la potenciación de la inhibición del
crecimiento tumoral y es una indicación para elevar la eficacia de
la inmunoterapia de melanomas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el estudio en un cultivo celular
continuo de melanoma B-16 murino que crece en forma
de una monocapa en un cultivo tisular. Se administró
\alpha-interferón seleccionado como una
preparación de comparación, a una concentración de 70 UI/ml.
Se transfirieron los compuestos sometidos a
prueba a una disolución madre (1.000 \muM), se esterilizaron a
través de filtros con un diámetro de poro de 0,22 \mum y después
se diluyeron hasta una concentración de 100 \muM.
Se evaluó el efecto de los compuestos sobre
células basándose en la tasa inicial de proliferación celular
(IRCP). Se determinó este índice contando el número de células en
microcolonias durante los primeros días tras la afección en placas
de "prueba" (con preparaciones) y "control" (sin
preparaciones), analizando 50 colonias en cada una de ellas.
Se calculó la tasa de crecimiento de colonias
(en %) según la fórmula:
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\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron cálculos de números celulares en
microcolonias para cada "punto". Se evaluó la toxicidad
mediante la supervivencia de las células de melanoma
B-16 que se determinó mediante la razón entre los
números de las colonias en crecimiento en placas de "prueba" y
"control". Los resultados de la prueba se muestran en la tabla
7.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los datos presentados en la tabla 7 muestran que
los derivados peptídicos inhiben el crecimiento de colonias
celulares de melanoma B-16 al nivel del
50,0-70,0% que es característico de inductores de
diferenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron pruebas en melanoma
B-16 inoculado. El efecto de Dicarbamine sobre la
distribución de células tumorales se estudió basándose en el
contenido de ADN a diferentes plazos tras la administración de la
preparación. Desde el día 6 tras la inoculación del tumor se
administraron a los ratones durante 10 días diariamente por vía
intragástrica 0,5 mg/kg de Dicarbamine. Se sacrificaron los animales
con investigación posterior de material tumoral en los días 10, 12,
16 y 18 tras la inoculación, es decir los días 5 y 7 respectivamente
tras la administración de Dicarbamine así como en los días 2 y 4
tras la finalización de la dosificación de 10 días de
Dicarbamine.
Los resultados de las pruebas muestran que
Dicarbamine provocó un aumento significativo de la parte de células
tumorales en interfase (IIG^{1}) (\approx25%). En una parte
constante de células proliferativas (\approx30%) se observó un
aumento en la parte de células IIG^{2} (12-14%).
Por consiguiente la parte de células del estroma normales (IG^{1})
en las muestras disminuye de manera compensatoria. Dichos cambios
son más claramente pronunciados tras 5-10
administraciones de Dicarbamine.
La dosificación de ciclo de Dicarbamine provoca
la redisposición cinética de la población de células tumorales. Se
observa la inhibición de células en la fase de ciclo sintético (fase
S) con disminución compensatoria en la parte de células que están
listas para proliferación o células proliferativas (fase G^{2}).
Simultáneamente se produce la acumulación de células tumorales en la
fase estacionaria G^{1}.
Reduciendo el nivel de actividad proliferativa,
Dicarbamine promueve la acumulación de células en fase de ciclo
celular estacionaria (no proliferativa). Puede ralentizar el
crecimiento tumoral y promover la transición de células a un estado
más diferenciado.
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Se estudió el efecto de corrección hematológica
de Dicarbamine sobre la primera generación de híbridos de ratones
macho F_{1} (CBA x C_{57}BI).
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Grupo 1 - Dicarbamine, 0,5 mg/kg diariamente
empezando 5 días antes de la administración de CPH y durante 5 días
tras la administración única de CPH a una dosis de 200 mg/kg;
Grupo 2 - la administración única de 200 mg/kg
de CPH;
Grupo 3 - control intacto;
Grupo 4 - Dicarbamine 0,5 mg/kg diariamente
durante 10 días.
Los datos obtenidos se muestran en la tabla
8.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los datos obtenidos muestran que el uso de
Dicarbamine en combinación con CPH permite reducir el efecto
hematotóxico de esta última y acelerar la recuperación de parámetros
sanguíneos.
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7.2. Cuando se estudia el efecto de Dicarbamine
sobre la acción hematotóxica de combinaciones de CPH con derivados
de platino, se administró Dicarbamine diariamente por vía
intragástrica a ratones durante 20 días diariamente a una dosis
única de 0,5 mg/kg. Se administraron una vez preparaciones
citostáticas por vía intraperitoneal en el día cinco desde el inicio
del ciclo de administración de Dicarbamine. Se muestran dosis de
preparaciones citostáticas en las tablas 10 y 11.
Los resultados de estudiar el efecto de
Dicarbamine sobre el número de leucocitos en sangre periférica de
ratones cuando se combinó la dosificación de CPOH con cisplatino o
carboplatino se muestran en las tablas 9 y 10 respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
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Los datos presentados muestran que ya el día 5
en el grupo de ratones que recibió preparaciones citostáticas a
dosis máximas junto con Dicarbamine, el número de leucocitos alcanzó
el borde inferior de la norma fisiológica y el día 7 prácticamente
se restauró hasta el nivel inicial. Sin Dicarbamine se observó la
restauración sólo el día 21 de la prueba. En ratones que recibieron
preparaciones citostáticas a dosis máximas sin Dicarbamine se
observó la muerte de animales en los días 3, 4 y 7 de la prueba. En
animales a los que se les administraron preparaciones citostáticas a
dosis máximas junto con Dicarbamine, sólo se observó muerte
retardada en los días 8 y 16.
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Los datos presentados muestran (tabla 10) que en
caso de usar Dicarbamine junto con carboplatino y ciclofosfano a las
dosis letales, el número de leucocitos en sangre periférica y los
plazos de muerte de animales son similares a los datos presentados
en la tabla 9.
Por tanto, Dicarbamine inhibe el desarrollo de
leucopenia en todos los ciclos estudiados, acelera la recuperación
del número total de leucocitos y retarda el plazo de muerte de
ratones cuando se usan preparaciones citostáticas a dosis
letales.
\vskip1.000000\baselineskip
7.3. Cuando se estudia el efecto de derivados
peptídicos de fórmula general (I) sobre la acción hematotóxica de
combinaciones de CPH con carboplatino, los compuestos se
administraron por vía intragástrica a ratones diariamente a la dosis
de 0,5 mg/kg durante 10 días. En el día cinco tras iniciar la
administración de los compuestos sometidos a prueba se les inyectó a
los ratones por vía intraperitoneal CPH a una dosis de 200 mg/kg y
carboplatino a una dosis única de 15 mg/kg. Después se continuó con
la administración de los compuestos sometidos a prueba durante 5
días más.
Antes de iniciar la dosificación de los
compuestos sometidos a prueba, se extrajo sangre de la cola de
ratones para calcular el número total de leucocitos. En los días 3,
5 y 7 tras la administración de ciclofosfamida con carboplatino
también se extrajo sangre de la cola de ratones para calcular el
número total de leucocitos. Cada grupo incluía 15 animales.
Como control se usó un grupo de ratones que sólo
recibió preparaciones citostáticas.
Los datos presentados en la tabla 11 muestran
que los derivados peptídicos de fórmula general (I) inhiben el
desarrollo de leucocitopenia y aceleran la recuperación del número
total de leucocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
7.4. El efecto de Dicarbamine sobre la
diferenciación celular está respaldado por el estudio del número
diferencial de sangre periférica en ratones bajo efecto de
ciclofosfamida en combinación con Dicarbamine en comparación con la
dosificación de ciclofosfamida sola.
Se usan dos grupos de ratones. Al grupo uno se
le administra Dicarbamine a una dosis de 0,5 mg/kg 5 días antes de y
5 días tras la administración de CPH a una dosis de 200 mg/kg. Al
grupo dos de ratones se le administra CPH sola a una dosis de 200
mg/kg. Los resultados de los estudios se muestran en las tablas 12 y
13.
Los datos presentados en las tablas 12 y 13
muestran que se produce la recuperación de sangre periférica debido
al estallido de formas maduras lo que confirma el efecto de
diferenciación de Dicarbamine. Esto se observa especialmente en los
días 3 y 5 por el número de sangre periférica y la celularidad de la
médula ósea (tablas 12 y 13). En el grupo con Dicarbamine están
ausentes mielocitos y neutrófilos en banda en sangre periférica y en
el grupo sin Dicarbamine están presentes estas formas de elementos
(tabla 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios se llevaron a cabo en 100 híbridos
de ratones macho BDF_{1} que se dividieron en grupos que contenían
10 ratones cada uno. Se usaron ratones DBA_{2} lineales para el
pase de FEB in vivo.
\newpage
Se obtuvo una cepa de eritroblastosis por virus
de Friend del banco de cepas tumorales del GU RCRC denominado
después N.N. Blokhin de la RAMS, se hizo pasar dos veces por vía
intraperitoneal usando generaciones 3-8 en
inoculación subcutánea. Se realizó la inoculación usando una
suspensión celular a una cantidad de 1 x 10^{6} en 0,3 ml de medio
1999.
Se administraron por vía intragástrica
diariamente disoluciones de los compuestos sometidos a prueba a
ratones usando una sonda desde el día 3 hasta el día 7 tras la
inoculación de tumores.
Se evaluó la eficacia de la terapia basándose en
la inhibición de crecimiento tumoral (TGI, %) y una vida útil
promedio (ALS). Se determino el aumento de vida útil mediante el
criterio comúnmente aceptado T/C (%) que se calculó como razón entre
ALS en los grupos de prueba y control. Se calculó la tasa de
crecimiento tumoral V_{t}/V_{1} basándose en la dinámica de
cambio en volúmenes promedio de tumores.
Los datos de los estudios sobre el efecto de
derivados péptidos sobre el tamaño del tumor y sobre la tasa de
crecimiento tumoral se muestran en las tablas 14 y 15,
respectivamente.
Los resultados obtenidos muestran que los
derivados peptídicos provocan la inhibición del crecimiento de FEB
inoculada por vía subcutánea durante 19 días tras la finalización de
la terapia. Dicho efecto empezó a registrarse inmediatamente tras la
finalización de la administración de compuestos a una dosis única de
1,5 mg/kg y se mantuvo a un nivel significativo (p<0,05) hasta el
día 13. La tasa de crecimiento tumoral se estabilizó durante una
semana tras la retirada de los compuestos.
Se estableció como resultado de los estudios
llevados a cabo que los compuestos de fórmula general (I) tienen un
efecto inhibidor sobre el desarrollo de nodo subcutáneo por FEB. Los
datos obtenidos permiten considerar que los compuestos de prueba son
útiles para terapia de hemoblastosis humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la eritroblastosis por virus de
Friend que se inoculó por vía subcutánea a ratones hembra DBA_{2}
a través de células de bazo.
Se llevaron a cabo 4 grupos de pruebas.
Grupo 1 - animales control sin terapia, se
administró una solución salina fisiológica;
grupo 2 - se administró diariamente por vía s.c.
Reaferon a una dosis de 100 mil UI/kg desde el día 3 hasta el día 7
tras la inoculación;
grupo 3 - se administró por vía p.o. Dicarbamine
a una dosis única de 4,5 mg/kg desde el día 3 hasta el día 7 tras la
inoculación;
grupo 4 - se administraron simultáneamente
Dicarbamine y Reaferon según un esquema similar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomó material para microscopía óptica en
animales sacrificados los días 3, 7 y 14 tras la finalización de
terapia o administración de una solución salina fisiológica, se tomó
material para microscopía electrónica los días 7 y 14.
Para un examen histológico se fijaron fragmentos
de tumor en formalina neutra al 10% y se incrustaron en parafina;
los cortes obtenidos se tiñeron con
hematoxilina-eosina y se examinaron para determinar
el contenido en glicógeno (polisacáridos) usando reacción de Schiff
con ácido peryódico, para determinar el contenido en ARN según
Brachet, para determinar lípidos y hierro. Se observaron los cortes
a través de y se fotografiaron en el microscopio óptico Polivar
(Austria).
Para microscopía electrónica se fijaron
fragmentos de tumor en disolución de glutaraldehído al 2,5% y
tetraóxido de osmio al 1%, se incrustaron en
EPON-812. Se prepararon cortes semigruesos y
ultragruesos en el ultratome LKB-III (Suecia). Los
cortes semigruesos obtenidos se tiñeron con azul de toluidina y se
observaron a través del microscopio óptico. Los cortes ultragruesos
se tiñeron adicionalmente con acetato de uranilo y citrato de plomo;
se observaron los cortes a través de y se fotografiaron en el
microscopio electrónico JEOL 1200 EX-II (Japón).
Se calculó el porcentaje de células con
diferentes tipos de diferenciación (blastocitos, linfocitos y
leucocitos granulares) durante microscopía electrónica para una
evaluación cuantitativa.
Se evaluaron el porcentaje de mitosis y células
con apoptosis así como las zonas de necrosis durante el examen
histológico.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo
I
En el examen histológico se encontró que las
células tumorales son grandes, polimorfas, sus núcleos son claros,
el citoplasma está desarrollado moderadamente. El tamaño celular
algunas veces fluctúa y se encuentran células más pequeñas
individuales pero las células grandes representan la principal masa
de células.
Las células tumorales forman excrecencias
continuas. En tumores individuales se encuentran sitios de necrosis
que rodean campos conservados de células tumorales. La zona de
necrosis no superó el 10-15% de la superficie del
corte.
En la mayoría de las células tumorales la
reacción de Brachet para ARN es muy pronunciada, con menos
frecuencia es débil o está ausente (en células pequeñas
individuales).
La reacción de Schiff con ácido peryódico tenía
carácter difuso, la reacción para dar hierro era positiva sólo en
células individuales.
En el tumor entre células grandes se encontraron
mitosis (hasta el 1-1,5%) y células con signos de
apoptosis (hasta el 0,5%).
Según crecía el tumor, aumentaba la zona de
necrosis hasta el 20-30% de la superficie del corte,
el número de mitosis aumentó (hasta el 1,5-2%), la
actividad de apoptosis no cambió. El número de células polimorfas
grandes prevaleció significativamente en todos los plazos.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo
II
Los tumores tienen una estructura histológica
habitual. Como en el control, entre células polimorfas grandes se
encuentran células más pequeñas con núcleo hipercromático.
En el día 14, la zona de necrosis es el
40-50% de la superficie del corte, la actividad
mitótica es del 0,5-1%, en el día 7 aumentó la
apoptosis hasta el 1-2%, pero en el día 14 disminuyó
hasta el 1-1,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo
III
Se observa el aumento en la cantidad de células
tumorales pequeñas con núcleos hipercromáticos. La cantidad de
células polimorfas grandes prevalece significativamente. La zona de
necrosis no cambió significativamente en comparación con la imagen
del grupo I. La actividad mitótica también permaneció dentro de los
límites de las figuras del control. En los días 3 y 7 la tasa de
apoptosis disminuyó ligeramente (hasta el 0,1-0,5%
en el día 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo
IV
La zona de necrosis y la actividad mitótica no
mostraron cambios significativos en comparación con los cambios en
el grupo II. En el día 3 la apoptosis disminuyó hasta el
0,2-0,5%, en los días 7 y 14 es del 0,5% (como en el
control).
Las células polimorfas grandes de tipo
blastocito prevalecen significativamente en el tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo
I
Las células con baja diferenciación polimorfas
grandes de tipo blastocito se encuentran principalmente en el tumor
durante la microscopía electrónica. Los núcleos en estas células
tienen forma redonda o ligeramente irregular ocasionalmente con
superficie poco uniforme. Habitualmente se observa la distribución
difusa de cromatina en ellas, sólo en algunas de ellas se observa la
formación de heterocromatina ubicada marginalmente. Los núcleos
habitualmente ocupan una parte importante del citoplasma en el que
prevalecen ribosomas, mitocondrias individuales, ocasionalmente las
estructuras del retículo endoplásmico ligeramente rugosas. Los
blastocitos ascienden al 90-95% de toda la población
tumoral.
Además de los blastocitos, se encuentran
linfocitos de diferente grado de madurez, es decir linfoblastos,
linfocitos (grandes, medianos, pequeños). Los núcleos en estas
células son redondeados, ovales, con frecuencia con superficie poco
uniforme, comprenden heterocromatina en forma de acumulaciones
grandes, se encuentran nucléolos. El citoplasma está moderadamente
desarrollado, comprende una gran cantidad de ribosomas; hay pocos
orgánulos de otro tipo, ocasionalmente se encuentran gránulos
densos.
Los leucocitos granulares son gránulos pequeños,
característicos de neutrófilos, con menos frecuencia pueden verse
eosinófilos en el citoplasma. Los núcleos en estas células están
segmentados o tienen concavidades profundas. Ocasionalmente pueden
observarse células que tienen gránulos en el citoplasma, un núcleo
irregular y una membrana plasmática sobresaliente en forma de
protuberancias (monocitos). Se encontraron glóbulos rojos que
estaban libremente en el tumor.
Los blastocitos grandes prevalecen
principalmente en el tumor (hasta el 90-95%). Se
encuentran células linfoides dentro del intervalo del
4-8%, las células granulares ascienden al
1-2%.
No se observaron cambios significativos en la
razón entre tipos celulares diferentes a medida que el tumor crecía
tras el injerto.
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Grupo
II
Se conserva la ultraestructura general de
células tumorales de diferente tipo.
La cantidad de blastocitos grandes no disminuye,
las células linfoides ascienden hasta el 4-8%, los
leucocitos granulares ascienden hasta el 1-2%. Están
presentes glóbulos rojos individuales en el tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo
III
La ultraestructura de células tumorales de
diferente tipo se mantiene como anteriormente. Su razón cuantitativa
cambia y el nivel de diferenciación aumenta un poco. La cantidad de
células de tipo blastos grandes disminuye hasta el
70-80%, la cantidad de linfocitos y granulocitos
aumenta hasta el 18-25% y el 2-5%
respectivamente. Están presentes glóbulos rojos individuales en el
tumor.
Los cambios hallados de manera más constante se
encuentran en el día 7 tras la finalización del tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo
IV
La ultraestructura de células tumorales de
diferente tipo prácticamente corresponde a lo que se describió
anteriormente (véase el grupo I).
La cantidad de células de tipo blastos grandes
fluctúa dentro del intervalo del 70-80%. El número
de linfocitos alcanza el 18-25%, la cantidad de
leucocitos se mantiene al nivel del 2-5%. Se
encuentran glóbulos rojos que están entre las otras células.
Tal como en los grupos anteriores, los cambios
encontrados son lo más pronunciados en el día 7.
Por tanto, se estableció que Dicarbamine
administrada por vía oral a ratones con eritroblastosis por virus de
Friend a una dosis de 4,5 mg/kg diariamente durante 5 días provocaba
la diferenciación de células tumorales inmaduras principalmente en
la dirección de formar granulocitos así como células de linaje
eritroide.
En comparación con tumores de los animales
control, cuando se usó Dicarbamine, la cantidad de células tumorales
inmaduras disminuyó hasta desde el 90-95% hasta el
70-80%, es decir en un 15-20% y la
cantidad de linfocitos aumentó desde el 4-8% hasta
el 18-25%, es decir 4 veces.
La cantidad de células de linaje granulocítico
aumentó menos significativamente (desde el 1-2%
hasta aproximadamente el 2-5%).
Debe observarse que los cambios más frecuentes
se encontraron en el día 7 tras la finalización del tratamiento. En
el día 14 tras la finalización del tratamiento estos cambios se
estabilizaron.
Reaferon en administración subcutánea durante 5
días a una dosis de 100 mil UI/kg provocó un aumento en la zona de
necrosis en el tumor (desde el 15-20% en el grupo
control hasta el 40-50% en la prueba en el día 7
tras la finalización del tratamiento y desde el
20-30% hasta el 40-50% en el día
14). La tasa de mitosis disminuyó un poco (desde el
1,5-2% hasta el 0,5-1%) y la
cantidad de células con signos de apoptosis aumentó (desde el 0,5%
hasta el 1-2% en el día 7 tras la finalización del
tratamiento). La diferenciación de células tumorales prácticamente
no cambió.
En la administración simultánea de Dicarbamine y
Reaferon en las mismas dosis y en los mismos plazos se encontró la
suma del efecto de cada preparación. Se observó la potenciación de
diferenciación de blastocitos inmaduros característica del efecto de
Dicarbamine sola así como se encontraron un crecimiento de la zona
de necrosis y una disminución en el número de mitosis que se
observaban en la administración de Reaferon solo.
Por tanto, se ha establecido que Dicarbamine
puede potenciar la diferenciación de células hematopoyéticas
tumorales inmaduras de eritroblastosis por virus de Friend en
diferentes direcciones en particular con formación de células
tumorales de linaje linfoide y mieloide.
El efecto de Dicarbamine sobre la diferenciación
celular representa su propiedad general como se observó
anteriormente en el ejemplo del estudio de melanoma.
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En los estudios anteriores dedicados a estudiar
el mecanismo de acción de Dicarbamine sobre la médula ósea, se
encontró que la preparación proporcionada protegía la médula ósea en
animales en condiciones de prueba contra el efecto citotóxico
adverso de ciclofosfamida reduciendo la apoptosis en células
hematopoyéticas normales.
Se obtuvieron datos similares en las biopsias
por punción de médula ósea y sangre periférica de 10 pacientes con
cáncer de ovario en estadio III-IV.
Se dividieron los pacientes en dos grupos
iguales: grupo I - pacientes que recibieron la quimioterapia sola y
grupo II - pacientes que recibieron la quimioterapia junto con
administración de Dicarbamine.
Los pacientes en los grupos I y II recibieron
600 mg/m^{2} de ciclofosfano y 400 mg/m^{2} de carboplatino
durante el primer día de terapia; se repitieron los ciclos con
intervalo de 3-4 semanas. El promedio de ciclos de
quimioterapia de un paciente incluía 6 ciclos sin Dicarbamine y 5,7
ciclos con Dicarbamine.
En el grupo II los pacientes recibieron la
quimioterapia junto con Dicarbamine con dosificación a una dosis
única de 100 mg empezando 5 días antes del primer ciclo y después
hasta el inicio del siguiente ciclo a la misma dosis. La duración
del uso de Dicarbamine entre dos ciclos promedió 24,5 días. La dosis
total promedio era de 2,5 gramos.
La biopsia por punción de la médula ósea y
sangre periférica para microscopía electrónica se tomaron en
pacientes antes de la quimioterapia al inicio y al final del ciclo
del tratamiento con Dicarbamine o sin ella.
Las biopsias por punción de médula ósea frescas
se colocaron sobre un portaobjetos y muchas veces se agitaron con
varilla de agitación hasta que se obtuvieron fragmentos densos
pequeños. Estos últimos se fijaron en una disolución de
glutaraldehído al 2,5% fijada adicionalmente en una disolución de
tetraóxido de osmio al 1%; tras el lavado con tampón fosfato a pH
7,4 se deshidrataron en alcoholes de concentración creciente y se
incrustaron en la mezcla de resinas epoxídicas
EPON-812. Se prepararon cortes semigruesos y
ultragruesos en el ultratome LKB-III (Suecia). Los
cortes semigruesos se tiñeron con azul de metileno o toluidina, los
cortes ultragruesos se contrastaron con disolución acuosa de acetato
de uranilo y citrato de plomo.
Se centrifugó sangre periférica que comprendía
heparina durante 1 hora a 3.000 rpm. Después se vertió una
disolución de glutaraldehído al 2,5% sobre la superficie de la
película formada durante 10-15 minutos, se retiró la
película y se continuó con el tratamiento tal como se describió
anteriormente.
Se observaron cortes delgados en el microscopio
óptico Polivar (Austria) y se observaron cortes delgados en el
microscopio electrónico
JEOL-1200-CX-11
(Japón).
\vskip1.000000\baselineskip
Se encuentran células hematopoyéticas de
diferente grado de madurez y dirección de diferenciación en biopsias
por punción de la médula ósea estando una parte de la célula con los
signos de vacuolización y distrofia.
Hay blastocitos no diferenciados de tamaño
grande con borde de citoplasma estrecho que comprende principalmente
ribosomas. En estas células un núcleo de forma oval redondeada con
cromatina difusa y nucléolos individuales ocupa la parte principal
del citoplasma.
Una parte de las células se diferencia en la
dirección de linaje granulocítico de leucocitos de diferente tipo y
grado de diferenciación.
Se observan promielocitos y mielocitos con
núcleos ovales redondeados, cromatina difusa que comprende en el
citoplasma una cantidad diferente de gránulos específicos. Con
frecuencia se sitúan glóbulos rojos y granulocitos más maduros
alrededor de estas células.
Se observan con frecuencia acumulaciones de
granulocitos más diferenciados, es decir neutrófilos en banda y
neutrófilos segmentados. Los gránulos específicos de diferente tipo
característicos de neutrófilos, eosinófilos y basófilos están
presentes en su citoplasma.
Las células linfoides de diferente grado de
diferenciación (pequeño, medio, grande - linfoblástico) se disponen
entre granulocitos.
Se encuentran muchos glóbulos rojos maduros, que
tienen con frecuencia diferente forma así como normoblastos que
comprenden núcleos y plaquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
En las células hematopoyéticas conservadas de
diferente tipo (granulocitos, linfocitos, normocitos, glóbulos
rojos, plaquetas) se encuentran signos de distrofia y bajo grado de
madurez en las biopsias por punción de médula ósea tomadas tras el
ciclo de quimioterapia.
En los blastocitos, el citoplasma contiene
ribosomas y con frecuencia está vacuolado. Los núcleos son grandes
con cromatina difusa o acumulaciones de heterocromatina,
ocasionalmente de forma irregular y con sitios estirados dentro.
La cantidad de gránulos específicos en
promielocitos y mielocitos no es significativa y el citoplasma con
frecuencia tiene cambios distróficos pronunciados.
En los granulocitos conservados de tipo banda y
segmentado, también se observan cambios distróficos y una cantidad
no significativa de gránulos específicos. Con frecuencia los
presentes gránulos también se modifican de manera distrófica y están
vacuolados.
Los normoblastos conservados son con frecuencia
de forma irregular con protuberancias y proyecciones de
citoplasma.
Debe observarse que en biopsias de médula ósea
por punción especialmente entre granulocitos se encontraron células
con signos de apoptosis. En tales células se observaron la
marginación de heterocromatina, los signos de la fragmentación del
núcleo y citoplasma y la formación de cuerpos apoptóticos.
\vskip1.000000\baselineskip
En biopsias de médula ósea por punción de
pacientes que se sometieron a la quimioterapia junto con
administración de Dicarbamine se encontraron células hematopoyéticas
de diferente grado y tipo de diferenciación (granulocitos,
linfocitos, plaquetas, normoblastos).
Las células de tipo blastos son grandes,
contienen núcleos redondeados con cromatina difusa y nucléolos
individuales, su citoplasma es estrecho y en el mismo se observan
ribosomas, mitocondrias individuales y ocasionalmente gránulos
densos primarios simples.
Hay muchos promielocitos y mielocitos que
comprenden núcleos redondeados u ovales con cromatina difusa o
condensada; su citoplasma comprende una cantidad bastante grande de
gránulos específicos tanto primarios (oscuros) como menos maduros
(más maduros).
También se encuentran frecuentemente leucocitos
en banda y segmentados. Tienen un núcleo cóncavo (similar a una
judía) o segmentado, abundancia de gránulos específicos de tipo
predominantemente neutrófilo en su citoplasma, con menos frecuencia
de tipo eosinófilo con estructuras cristaloides.
Los linfocitos de diferente grado de
diferenciación comprenden en el citoplasma mitocondrias, estructuras
de retículo endoplásmico rugoso, ocasionalmente inclusiones simples
en forma de gránulos simples.
Las células de tipo granulocítico, linfocitos
forman con frecuencia acumulaciones compactas.
Junto con glóbulos rojos, se encuentran
normoblastos de diferente grado de diferenciación y de forma
relativamente habitual.
Raramente, se encuentran células con signos de
apoptosis.
Las mismas regularidades de la composición que
se describieron anteriormente para elementos de médula ósea se
encontraron en células hematopoyéticas en estudio de sangre
periférica.
La microscopía electrónica comparativa llevada a
cabo de células hematopoyéticas de médula ósea y sangre periférica
en pacientes con cáncer de ovario antes y después de la
quimioterapia combinada (ciclofosfamida + carboplatino) y durante la
quimioterapia junto con dosificación de Dicarbamine permitió
establecer mecanismos de su efecto protector a partir de la
influencia citotóxica de las preparaciones usadas.
El estudio mostró que las preparaciones de
quimioterapia usadas en el presente trabajo ejercen un efecto
citotóxico pronunciado sobre diferentes tipos de células
hematopoyéticas de linaje granulocítico, linfoide y eritroide.
Este efecto citotóxico se expresa en forma de
cambios distróficos en el citoplasma y la muerte de gránulos
específicos que se desarrollan en células de la médula ósea (y
sangre periférica respectivamente).
Dichos trastornos afectan especialmente a
células granulocíticas y en menor grado a células linfoides en
estadios tempranos de su diferenciación, es decir formación de
blastocitos, promielocitos, mielocitos, linfoblastos, e implican
linaje eritroide así como dan como resultado la acumulación
insuficiente de formas competentes funcionalmente diferenciadas de
células hematopoyéticas.
Además, según se encontró en los elementos de
linaje granulocítico se potencia la muerte celular programada
genéticamente, es decir apoptosis.
Los cambios distróficos y la apoptosis
generalmente dan como resultado el desarrollo de leucopenia,
neutropenia, trombocitopenia y otros trastornos del estado de
hematopoyesis y limitan las capacidades de la quimioterapia.
Basándose en el estudio llevado a cabo, se
estableció que Dicarbamine protegía células hematopoyéticas de la
médula ósea (y sangre periférica respectivamente) frente al efecto
citotóxico de las preparaciones usadas para quimioterapia, promovía
la diferenciación de formas jóvenes para dar elementos celulares
maduros y reducía los eventos de apoptosis.
Como resultado del efecto encontrado de
Dicarbamine, en la médula ósea de pacientes durante la quimioterapia
se produce la acumulación de formas jóvenes (blastos) de células
hematopoyéticas y lo que es especialmente importante, se potencia su
diferenciación para dar formas funcionalmente competentes.
Por tanto, en las condiciones de la
quimioterapia, la estimulación de la diferenciación de células
hematopoyéticas de la médula ósea, especialmente de células de
linaje granulocítico, y la prevención del crecimiento de apoptosis
son los mecanismos subyacentes al efecto protector de
Dicarbamine.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió el efecto de Dicarbamine en 13
pacientes con cáncer de ovario en estadio III-IV que
se sometieron a 77 ciclos de quimioterapia según el esquema: 400
mg/m^{2} de carboplatino por vía i.v. gota a gota, una vez + 600
mg/m^{2} de ciclofosfano por vía i.v. gota a gota, una vez; se
repitieron los ciclos a los 28 días. Se prescribió Dicarbamine
diariamente a una dosis de 100 mg por vía oral tras las comidas
empezando 5 días antes del primer ciclo y después durante tres
semanas. La duración de dosificación fue de 26 días, siendo la dosis
del ciclo 2600 mg. Se proporcionó Dicarbamine de nuevo 5 días antes
del segundo ciclo de quimioterapia y se continuó la dosificación
durante 21 días. La duración total de la toma de Dicarbamine durante
dos ciclos de quimioterapia fue de 52 días.
Se evaluó la toxicidad hematológica (leucopenia,
neutropenia, trombocitopenia) en 13 pacientes que recibieron 77
ciclos de la quimioterapia con Dicarbamine en comparación con el
grupo de 7 pacientes que recibieron 25-27 ciclos de
la quimioterapia sin Dicarbamine (control).
Se evaluaron los parámetros de hematopoyesis
dinámicamente muchas veces antes y después de llevar a cabo la
quimioterapia (control) así como dinámicamente antes y después de la
dosificación de Dicarbamine en el grupo de prueba. A continuación se
presentan parámetros de hematopoyesis en pacientes individuales que
recibieron la quimioterapia según el esquema indicado con
Dicarbamine o sin él.
\vskip1.000000\baselineskip
Mujer de 51 años de edad, diagnóstico: cáncer de
ovario en estadio III; recibió el primer ciclo de la quimioterapia
según el esquema de terapia tal como sigue: 600 mg/m^{2} de
ciclofosfano y 400 mg/m^{2} de carboplatino una vez. Análisis de
sangre completa, ciclo 1 de la quimioterapia
El segundo ciclo de terapia se retrasó en 7 días
debido a neutropenia.
El segundo ciclo de la quimioterapia según el
esquema de terapia era tal como sigue: 600 mg/m^{2} de
ciclofosfano + 400 mg/m^{2} de carboplatino una vez, sin
Dicarbamine.
Análisis de sangre completa, ciclo 2 de la
quimioterapia
El tercer ciclo se retrasó debido a
neutropenia.
Mujer de 63 años de edad, diagnóstico: cáncer de
ovario en estadio IV, afectación metastásica de un ganglio linfático
de la ingle derecha, ascitis; recibió el primer ciclo de la
quimioterapia según el esquema de terapia tal como sigue: 600
mg/m^{2} de ciclofosfano + 400 mg/m^{2} de carboplatino una vez,
sin Dicarbamine.
Análisis de sangre completa, ciclo 1 de la
quimioterapia
El segundo ciclo de terapia se retrasó durante 4
días debido a leuco y neutropenia.
El segundo ciclo de la quimioterapia se llevó a
cabo según el esquema de terapia y era tal como sigue: 600
mg/m^{2} de ciclofosfano + 400 mg/m^{2} de carboplatino una vez,
sin Dicarbamine.
Análisis de sangre completa, ciclo 2 de la
quimioterapia
El tercer ciclo se retrasó debido a
neutropenia.
\vskip1.000000\baselineskip
Mujer de 51 años de edad, diagnóstico: cáncer de
ovario en estadio III; recibió el primer ciclo de la quimioterapia
según el esquema de terapia tal como sigue: 600 mg/m^{2} de
ciclofosfano y 400 mg/m^{2} de carboplatino en el día 1 de
terapia. Se prescribió Dicarbamine diariamente a una dosis de 100 mg
empezando 5 días antes del ciclo 1 de la quimioterapia y después
durante 21 días. El período de terapia con Dicarbamine fue de 26
días antes del ciclo 2.
Análisis de sangre completa, ciclo 1 de la
quimioterapia con Dicarbamine
El ciclo 2 de la quimioterapia se llevó a cabo
en el tiempo según el esquema de terapia tal como sigue: 600
mg/m^{2} de ciclofosfano y 400 mg/m^{2} de carboplatino una vez
en el día 28 tras llevarse a cabo el primer ciclo de la
quimioterapia + Dicarbamine. Se administró Dicarbamine a una dosis
de 100 mg durante 5 días antes del ciclo 2 y después diariamente
durante 21 días. La duración total de la toma de Dicarbamine (2
ciclos de la quimioterapia) fue de 52 días.
Análisis de sangre completa, ciclo 2 de la
quimioterapia
\newpage
El tercer ciclo de QT se proporcionó a
tiempo.
Mujer de 75 años de edad, diagnóstico: cáncer de
ovario en estadio III, ascitis; recibió la quimioterapia con
Dicarbamine según el esquema de terapia tal como sigue: 600
mg/m^{2} de ciclofosfano y 400 mg/m^{2} de carboplatino en el
día 1 de terapia. Se prescribió Dicarbamine a una dosis de 100 mg
diariamente empezando 5 días antes del ciclo 1 de QT y después
durante 21 días. El período de terapia con Dicarbamine fue de 26
días antes del ciclo 2.
Análisis de sangre completa, ciclo 1 de la
quimioterapia con Dicarbamine
\vskip1.000000\baselineskip
El ciclo 2 de la quimioterapia se llevó a cabo a
tiempo según el esquema de terapia tal como sigue: 600 mg/m^{2} de
ciclofosfano y 400 mg/m^{2} de carboplatino una vez en el día 28
tras llevarse a cabo el primer ciclo de la quimioterapia +
Dicarbamine. Se administró Dicarbamine a una dosis de 100 mg durante
5 días antes del ciclo 2 y después diariamente durante 21 días. La
duración total de la toma de Dicarbamine (2 ciclos de la
quimioterapia) fue de 52 días.
Análisis de sangre completa, ciclo 2 de la
quimioterapia
\vskip1.000000\baselineskip
El tercer ciclo de QT se proporcionó en el
plazo.
Mujer de 65 años de edad, diagnóstico: cáncer de
ovario en estadio IV, ascitis, afectación metastásica de la región
umbilical; recibió la quimioterapia con Dicarbamine según el esquema
de terapia tal como sigue: 600 mg/m^{2} de ciclofosfano y 400
mg/m^{2} de carboplatino en el día 1 de terapia. Se prescribió
Dicarbamine a una dosis de 100 mg diariamente empezando 5 días antes
del ciclo 1 de QT y después durante 21 días. El período de terapia
con Dicarbamine fue de 26 días antes del ciclo 2.
\newpage
Análisis de sangre completa, ciclo 1 de la
quimioterapia con Dicarbamine
El ciclo 2 de la quimioterapia se llevó a cabo a
tiempo según el esquema de terapia tal como sigue: 600 mg/m^{2} de
ciclofosfano y 400 mg/m^{2} de carboplatino una vez en el día 28
tras llevarse a cabo el primer ciclo de la quimioterapia +
Dicarbamine. Se administró Dicarbamine a una dosis de 100 mg durante
5 días antes del ciclo 2 y después diariamente durante 21 días. La
duración total de la toma de Dicarbamine (2 ciclos de la
quimioterapia) fue de 52 días.
Análisis de sangre completa, ciclo 2 de la
quimioterapia
El tercer ciclo de QT se proporcionó en el
plazo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos obtenidos muestran que la toxicidad
hematológica limitativa del estadio III-IV sin uso
de Dicarbamine (tabla 16) realcanza para la leucopenia más del
23,0%, para la neutropenia el 42,3% y para la trombocitopenia el
20,0%.
En el grupo de pacientes que recibieron
Dicarbamine la tasa de incidencia de leuco, neutro y trombocitopenia
era significativamente inferior (tabla 17). La toxicidad
hematológica para la leucopenia disminuyó hasta el 12,9%, es decir
1,8 veces, para la neutropenia 2,6 veces y para la trombocitopenia
2,2 veces. Por tanto, el uso de Dicarbamine dio como resultado la
reducción de todas las clases listadas de toxicidad
hematológica.
A continuación se presentan los datos que
respaldan el hecho de que la administración de Dicarbamine no
disminuye la eficacia de la terapia con agentes citostáticos sino
que por el contrario potencia en cierta medida el efecto
logrado.
Se evaluó la eficacia de la terapia en grupos de
pacientes tras dos ciclos de la quimioterapia con o sin Dicarbamine
según el esquema descrito anteriormente. Se evaluó la eficacia según
los parámetros generalmente aceptados: RC - remisión completa, RP -
remisión parcial, SB - estabilización; y Progr. - progresión.
Los datos obtenidos se presentan en la tabla
18.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados muestran que en el grupo
de pacientes que recibieron la quimioterapia sin Dicarbamine, el
control de crecimiento tumoral (RC+RP) asciende al 49,9%. En el
grupo de pacientes que recibieron la quimioterapia con Dicarbamine
la eficacia de terapia es del 73,2%.
Por tanto, el uso de Dicarbamine en el
tratamiento de pacientes que reciben la quimioterapia da como
resultado la reducción de las clases principales de toxicidad
hematológica sin disminuir la eficacia de la terapia.
\newpage
Los datos clínicos y de prueba presentados
anteriormente demuestran claramente la eficacia de los derivados
peptídicos de fórmula general (I) como inductores no específicos de
diferenciación que, cuando se usan derivados peptídicos junto con la
quimioterapia mielosupresora, se muestra en la reducción del grado y
número de neutropenias y cuando se usa solo da como resultado la
estabilización del crecimiento de hemoblastosis murina, de
diferenciación de melanoma murino y humano incluyendo el caso de
ausencia de eficacia de la quimioterapia.
Se mostró que el efecto de derivados peptídicos
de fórmula general (I) sobre el crecimiento tumoral estaba asociado
con el retardo de la actividad de proliferación de células tumorales
y un grado elevado de diferenciación en particular la capacidad de
sintetizar melanina de células de melanoma y la inducción de
diferenciación de células precursoras de eritroblastosis por virus
de Friend.
Las investigaciones clínicas revelaron las
propiedades de derivados peptídicos de fórmula general (I) para
disminuir significativamente la toxicidad hematológica en el
tratamiento de pacientes con cáncer usando diferentes esquemas de la
quimioterapia combinada. Por tanto, cuando se tratan pacientes que
padecen cáncer de ovario con preparaciones de platino (ciclofosfano)
junto con derivados peptídicos, el grado de trombocitopenia y
neutropenia limitativa bajó en 2-3 veces. Al mismo
tiempo la eficacia de la terapia no bajó.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (9)
1. Derivado peptídico de fórmula general
en la
que:
- n=0-4, m=1-4,
k=0-1;
- R_{1} es un radical hidrocarbonado
C_{1}-C_{3} sustituido con un grupo funcional
seleccionado de grupos carboxílico, amido
C_{1}-C_{5} o amino, estando el grupo
carboxílico opcionalmente esterificado; o
- R_{1} es un radical hidrocarbonado
C_{1}-C_{3} sustituido simultáneamente con (a)
un grupo amino que está opcionalmente sustituido con un sustituyente
acilo y (b) un grupo carboxílico; o
- R_{1} es un radical hidrocarbonado
C_{1}-C_{3} sustituido con un grupo
heterocíclico insaturado de 5-6 miembros, en el que
el radical hidrocarbonado puede comprender simultáneamente un grupo
amino opcionalmente sustituido con un sustituyente acilo; o
- R_{1} es un grupo heterocíclico
saturado;
- R_{2} es átomo de hidrógeno o un grupo
funcional seleccionado de carboxilo, que puede estar
esterificado;
- R_{3} es un grupo heterocíclico o cíclico
saturado o insaturado de 5-6 miembros, o un grupo
carboxilo o amino, estando el grupo carboxilo opcionalmente
esterificado;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para su uso en el tratamiento de hemoblastosis o melanoma.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Derivado peptídico de fórmula general
en la
que:
- n es 0, k es 0 y R_{1}-CON-
es
- n es 0, k es 1 y R_{1}-CO-
es
- R_{2} es H, COOH o COOCH_{3};
- R_{3} es
NH_{2}, -COOH o -COOCH_{3}; y
- m es 1-4,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
para su uso en el tratamiento de hemoblastosis o melanoma.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Derivado peptídico de fórmula general (I)
en la que R_{1}, n, k, R_{2}, m
y R_{3} son tal como se definen en la reivindicación 1 ó 2, o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la
reducción de neutropenia provocada por terapia
mielosupresora.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Compuesto para su uso según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que
n = 0-4,
k = 0-1,
R_{1} = NH_{2}CH_{2}-,
HOOC-CH_{2}-,
CH_{3}CONH-CH_{2}-,
CH_{3}OCO-CH_{2}-,
o, cuando n es 0 y k es
0,
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
o, cuando n es 0 y k es
1,
R_{2}=H, COOH, COOCH_{3};
y m=1-4.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Compuesto para su uso según una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que el derivado peptídico es
un compuesto de fórmula
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Derivado peptídico según la reivindicación 3,
que tiene la fórmula
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para su uso en la reducción de neutropenia y
trombocitopenia provocada por
quimioterapia.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Derivado peptídico de fórmula general
(I),
en la que R_{1}, n, k, R_{2}, m
y R_{3} son tal como se definen a continuación, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la reducción
de neutropenia provocada por quimioterapia
mielosupresora,
\vskip1.000000\baselineskip
8. Derivado peptídico para su uso según la
reivindicación 1 ó 2, que tiene la fórmula general (I),
en la que R_{1}, n, k, R_{2}, m
y R_{3} son tal como se definen a continuación, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento
de hemoblastosis o melanoma, en combinación con interferón, para
potenciar la eficacia de la
inmunoterapia,
\vskip1.000000\baselineskip
9. Derivado peptídico de fórmula
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para su uso en la inmunoterapia contra tumores
malignos, en combinación con interferón, para mejorar la eficacia de
la
inmunoterapia.
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