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Beschreibung
im Bereich der Erfindung
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Die Erfindung liegt im Bereich der
Pharmakologie, d. h. pharmazeutische Mittel, die Peptide enthalten und
ihre Zusammensetzungen, die eine prophylaktische und/oder therapeutische
Anwendung in der Medizin als Stimulatoren der Geweberegeneration
bei eitrig-entzündlichen
Krankheiten und nachoperativen Komplikationen, Ernährungskrankheiten,
Erkrankungen und Verletzungen der Haut und Mukosa Membran, Schädigungen
durch Strahlung, thermische und chemische Faktoren, begleitet von
Störungen
des Reparaturprozesses.
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Die Erfindung betrifft die Anwendung
des Dipeptids L-lysyl-L-glutaminsäure (L-Lys-L-Glu) als Arznei, das
die Reparaturprozesse bei Personen, die dieses benötigen, stimuliert.
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Hintergrund
der Erfindung
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Als Arzneimittel die in ihrer Anwendung
zu dem Erfindungsgemäßen am stärksten analog
sind, gibt es eine Gruppe von Präparaten,
die Stoffwechselprozesse stimulieren: Derivate von Pyrimidin (Methyliracil,
Pentoxyl) und biogene Präparaten
(Actovegin, Solcoseryl) (1).
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Die Nachteile des Methyluracils bestehen
in kutanen, allergischen Reaktionen (urticaria eruption), manchmal
treten Kopfschmerzen und Schwindel auf. Die Oralverabreichung von
Pentoxyl kann Dyspepsie aufgrund der irritierenden Wirkung des Arzneimittels
hervorrufen. Der Nachteil von Actovegin und Solcoseryl besteht in
der kleine Mengen an wirksamen Substanzen in den Arzneimitteln,
einer verlängerten
Behandlung und einer begrenzten Anwendung in Bezug auf das Stadium
der Wunde, genauso wie eine niedrige Wirksamkeit bei der Behandlung
von eitrigen Wunden. Diese Arzneimittel produzieren einen deutlich
stimulierenden Effekt auf die Leukopoese.
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Das Dipeptid L-Lys-L-Glu ist als
Komponente bei der Peptidsynthese bekannt (2).
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Es ist allgemein bekannt, dass L-Lys-L-Glu
Dipeptid eine immunmodulierende Wirkung aufzeigt, (3) und WO 9503067.
Diese Aktivität
des Dipeptids charakterisiert allerdings nur seine immunbiologische
Wirkung, dies ist aber keine offensichtliche und miteinander verbundene
Manifestierung der Eigenschaften des Dipeptids, Reparaturprozesses
zu stimulieren und spezifiziert keine Indikation der klinischen
Anwendung. Die unten dargestellten Beispiele für das Dipeptid L-Lys-L-Glu
in seiner stimulierenden Wirkung auf die Reparaturprozesse bestätigen objektiv
die Abwesenheit einer Korrelation zwischen den bekannten und den
beanspruchten Eigenschaften.
EP
0 165 492 offenbart die Verwendung von Lys-Pro Dipeptid
für eine
verbesserte Heilung bei Verletzungen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die beanspruchte Erfindung richtet
sich auf die Lösung
des Problems des Erhalts einer von einem Peptid stammenden Substanz,
die in der Lage ist, Reparaturprozesse zu stimulieren.
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Erfindungsgemäß wird die Verwendung von L-Lys-L-Glutaminsäure Dipeptid
(L-Lys-L-Glu) zur
Herstellung eines Peptidpräparates
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die eine Stimulation der
Geweberegeneration benötigen,
vorgeschlagen, wobei die Erkrankung zu der folgenden Gruppe gehört: eitrig-entzündliche
Krankheiten und nachoperative Komplikationen, Ernährungskrankheiten,
Haut- und Schleimhautkrankheiten und -verletzungen; Bestrahlungsnachwirkungen,
chemische und thermische Faktoren.
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Das Dipeptid wird durch ein klassisches
Verfahren zur Peptidsynthese in Lösung erhalten (4). Bisher unbekannte
Eigenschaften des L-Lys-L-Glu Dipeptids in der Stimulation von Reparaturprozessen
wurden experimentiell gefunden.
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Erfindungsgemäß besteht das pharmazeutische
Peptidpräparat
aus einem pharmazeutischen annehmbaren Träger und einer wirksamen Menge
von L-Lys-L-Glu oder einem seiner Salze.
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Erfindungsgemäß kann das pharmazeutische
Peptidpräparat
Salze der Aminogruppe (Acetat, Hydrochlorid, Oxalat) oder der Carboxylgruppen
(Salze der Metalle Natrium, Kalzium, Lithium, Zink, Magnesium oder andere
organische und anorganische Kationen, z. B. Ammonium, Triethylammonium)
enthalten.
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Der Ausdruck „pharmazeutisches Peptidpräparat", wie er hier verwendet
wird, bedeutet die Verwendung des Dipeptids in irgendeiner Arzneiform,
die eine therapeutische Wirkung bei der Behandlung von Erkrankungen,
die eine Stimulation der Geweberegeneration benötigen, aufzeigt.
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Der Ausdruck „wirksame Menge", wie er hier verwendet
wird, bedeutet die Anwendung einer Menge an wirksamer Grundsubstanz,
die in Übereinstimmung
mit den quantitativen Indizes der Aktivität und Toxizität, sowie
dem zur Verfügung
stehenden Wissen, in seiner Arzneiform wirksam ist. Um pharmazeutische
Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, zu
erhalten, wird das vorgeschlagene Dipeptid oder dessen pharmazeutisch
annehmbaren Derivate als aktiver Inhaltsstoff und ein pharmazeutischer
Träger
gemäß anerkannten
pharmakologischen Verfahren zur Formulierung vermischt.
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Der Träger kann verschiedene Formen
aufzeigen, diese hängen
von der Arzneiform des Präparats
ab, wie es für
die Verabreichung vorgesehen ist, z. B. paranteral, oral, intranasal
oder lokal (z. B. als Verabreichungen oder Salben).
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Alle bekannten pharmazeutischen Komponenten
können
zur Herstellung der Zusammensetzungen in bevorzugten Dosen zu oralen
oder lokalen Anwendung verwendet werden.
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Zur parenteralen (intranasalen) Verabreichung
umfasst der Träger üblicherweise
steriles Wasser, obwohl auch andere Inhaltsstoffe, die zur Stabilität oder zur
Aufrechterhaltung der Sterilität
beitragen, verwendet werden können.
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Erfindungsgemäß ist das Dipeptid bei Verabreichung
von Dosen von 0,01 bis 100 μg/kg
Körpergewicht wirksam,
obwohl auch geringere (höhere)
Dosen unter Berücksichtigung
der Schwere und dem Auftreten der Erkrankung verwendet werden können.
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Das pharmazeutische Peptidpräparat wird
zur parenteralen, intranasalen, oralen und lokalen Verabreichung
vorgeschlagen. Die Erfindung ist geeignet zur Verwendung bei Menschen
und Tieren, die eine solche Stimulation benötigen.
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Die Stimulation der Regenerationsprozesse
durch Verabreichung des Arzneimittels, das als aktive Substanz das
Dipeptid L-lysil-L-Glutaminsäure
(L-Lys-L-Glu) oder dessen chemische Modifikation in Form eines Salzes
oder andere Derivate enthält,
wird aufgezeigt durch Aktivierung des Zellstoffwechsels und des
regulierenden Effekts auf die Prozesse der Proliferation und Differenzierung
der Zellen in verschiedenen Geweben. Das Verfahren ist zur prophylaktischen
und therapeutischen Anwendung geeignet, wobei das Objekt, das dieses
braucht, Dosen von 0,01 bis 100 μg/kg
mindestens einmal am Tag über
einen Zeitraum, der notwendig ist, um eine therapeutische Wirkung
zu erzielen, wie 10 bis 40 Tage unter Berücksichtigung der Ausbildung und
Schwere der Erkrankung, erhält.
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Die Verwendung des Dipeptids schließt die Herstellung
der Präparate
zur Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen, bei der eine Stimulation
der Geweberegeneration notwendig ist, ein; eitrig-entzündliche Prozesse
und postoperative Komplikationen, Ernährungsstörungen, Haut und Schleimhauterkrankungen
und Verletzungen, Bestrahlungsnachwirkungen, thermische und chemische
Faktoren, begleitet von Verschiebungen der Reparaturprozesse.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Die Erfindung wird mit Hilfe von
Beispielen zur Synthese des Dipeptids der Formel L-lysil-L-Glutaminsäure (L-Lys-L-Glu)
(Beispiel 1), Tests zur Toxizität
und biologischen Aktivität
des Dipeptids (Beispiele 2, 3, 4 und 5) und Beispiele der Ergebnisse
der klinischen Anwendung des Dipeptids, das deren pharmazeutische
Eigenschaften aufzeigt und die Möglichkeit
des Erzielens einer therapeutischen Wirkung bestätigt, dargestellt (Beispiele
6, 7, 8). Bezug wird auch auf die Abbildungen genommen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
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1A zeigt
PCNA positive Kerne proliferierender Zellen im Wachstumsbereich
des Duodenums. Avidin-Biotin-Peroxidase Verfahren, × 100. Bestrahltes
Tier.
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1B zeigt
PCNA positive Kerne proliferierender Zellen im Wachstumsbereich
des Duodenums. Avidin-Biotin-Peroxidase Verfahren, × 100. Bestrahlte
Tiere + L-Lys-Glu Dipeptid.
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2A zeigt
Serotonin immunpositive Zellen in der mukosalen Membran des Duodenums.
Streptavidin-Biotin-Peroxidase Verfahren × 100. Bestrahlte Tiere.
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2B zeigt
Serotonin immunpositive Zellen in der mukosalen Membran des Duodenums.
Streptavidin-Biotin-Peroxidase Verfahren × 100. Bestrahlte Tiere + L-Lys-L-Glu Dipeptid.
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3A zeigt
Metallotionein immunpositive Zellen in der mukosalen Membran des
Duodenums (histotopografische Lokalisierung der MLT-positiven Zellen.
Streptavidin-Biotin-Peroxidase
Verfahren, × 100.
Bestrahlte Tiere.
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3B zeigt
Metallotionein immunpositive Zellen in der mukosalen Membran des
Duodenums (histotopografische Lokalisierung der MLT-positiven Zellen.
Streptavidin-Biotin-Peroxidase
Verfahren, × 100.
Bestrahlte Tiere + L-Lys-L-Glu Dipeptide.
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4A zeigt
Mastzellen in der mukosalen Membran des Duodenums. Selektive Färbung mit
Toluidin blau, pH 0,5-×100.
Bestrahlte Tiere.
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4 B
zeigt Mastzellen in der mukosalen Membran des Duodenums. Selektive
Färbung
mit Toluidin blau, pH 0,5-×100.
Bestrahlte Tiere +L-Lys-L-Glu Dipeptide.
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Beispiel 1. Synthese von
L-Lys-L-Glu Dipeptid
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1. Nα,Nε-Dibenzyloxycarbonyl-L-lysyl-γ-benzyl-Glutaminsäure (I)
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0,154 g (0,65 mmol) γ-Benzyl-Glutaminsäure wurden
in 3 ml Dimethylformamid suspendiert und 0,091 ml (0,65 mmol) Triethylamine
wurden unter Rühren
hinzugefügt,
anschließend
wurden 0,300 g (0,59 mmol) N-Oxysuccinimidether des Nα,Nε Dibenzyloxycarbonyl-L-lysyls
hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde innerhalb von 12 Stunden
bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschließend wurde das Lösungsmittel
im Vakuum unter 40°C
abgezogen und 10 ml H2SO4 zu
dem Rest gegeben. Das Produkt wurde zweimal mit Ethylacetat (30 × 2) extrahiert.
Die organische Schicht wurde mit H2SO4 und Wasser bis zur Neutralreaktion gewaschen und über Na2SO4 getrocknet.
Lösungsmittel-Destillation
wurde unter Vakuum bei 40°C
durchgeführt
und der Rest wurde in 1–2
ml Ethylazetat gelöst.
Das Produkt wurde mit Hexan ausgefällt und im System Ethylazetat/Hexan
rekristallisiert. Das Produkt wurde filtriert und unter Vakuum über P2O5 getrocknet. Die
Ausbeute war 0,0330 g (88%). Der Koeffizient Rf war 0,81 (Benzol
: Azeton 1 : 1, Silufol).
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2. L-lysyl-L-Glutaminsäure
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Geschütztes Dipeptid (1) (0,330 g)
wurde in 10 mg Methanol gelöst,
es wurden 3 ml Wasser hinzugegeben und über Kohlenstoff / Palladium
hydriert. Eine Kontrolle wurde mit Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Nach
Beendigung der Hydratisierung wurde der Katalysator abfiltriert,
und der Rest wurde in einer minimalen Menge Wasser gelöst und mit
Methanol präzipitiert.
Das Produkt wurde filtriert, mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum über P2O5 getrocknet. Die
Ausbeute war 0,110 g (85 %). Die Schmelztemperatur war 194 bis 196°C. (α) γ20 =
+20,0° (c
= 3,0; H2O). Rf = 0,54 (Azeton: Wasser 1
: 3, „Merk"). Elektrophorese:
EGly = 1,96; Ehis =
0,98 (1400 Volt, 45 min., 2% Essigsäure, „Watmann 3MM".
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Um die entsprechenden Salze der Carboxylgruppen
zu erhalten, wurden dem freien Dipeptid entsprechende Mengen einer
wässrigen
Lösung
des Hydroxids des entsprechenden Metalls hinzugefügt (NaOH, KOH,
ZnOH2, LiOH, CaOH2,
NH4OH). Um das Triethylammonium Salz zu
erhalten, wurde das gleiche Verfahren mit Triethylamin als Base
durchgeführt.
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Beispiel 2. Untersuchung
zur Toxizität
von L-Lys-L-Glu Dipeptid
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Die Untersuchung zur allgemeinen
toxischen Wirkung des Dipeptids L-Lys-L-Glu wurde gemäß den „Regeln
zur präklinischen
Bestimmung der Sicherheit von pharmakologischen Substanzen (GLP)" durchgeführt.
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Der Zweck der Studie besteht in der
Identifikation von tolerierbaren toxischen Dosen des Arzneimittels, Bestimmung
des Stadiums und des Charakters der pathologischen Veränderungen
in verschiedenen Organen und Systemen des Organismus und Bestimmung
der Korrelation zwischen toxischer Wirkung in bezug auf die Dosis
und die Dauer der Arzneiverabreichung.
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Die Bestimmung der akuten Toxizität des Dipeptids
L-Lys-L-Glu wurde gemäß Kerber
durchgeführt. Die
Studie wurde bei 66 weißen
männlichen
Inzuchtmäusen
mit einem Körpergewicht
von 20–23
g durchgeführt,
diese wurden unter Standardbehandlung gehalten und mit einer Standardernährung in
Käfigen
aufbewahrt. Die Tiere wurden zufällig
in sechs gleiche Gruppen a' 11
Mäuse unterteilt.
Die Tiere wurden einer einzelnen intramuskulären Verabreichung des Arzneimittels,
0,25 ml in Dosen von 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg,
ausgesetzt, dies war mehrere Tausendfach über der empfohlenen therapeutischen
Dosis bei einem klinischen Versuch. Die Kontrolltiere wurden mit
einer Natriumchloridlösung
gleicher Menge behandelt.
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Nach 72 Stunden und nach 14 Tagen
verstarb keines der Tiere irgendeiner Gruppe. Keine Veränderung
im allgemeinen Zustand, Verhalten, Bewegungsaktivität, Haar- oder Hautintegument
oder physiologischen Ausscheidungen.
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Somit zeigt das L-Lys-L-Glu Dipeptid
in Dosen, die die für
klinische Tests empfohlene Dosis mehrere Tausendfach überschreitet,
keine toxischen Wirkungen auf, dies deutet auf eine breite therapeutische
Anwendbarkeit des Arzneimittels.
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Die Untersuchung der subakuten Toxizität des L-Lys-L-Glu
Dipeptids wurde an 60 weißen
Inzuchtratten mit einem Körpergewicht
von 150 bis 250 g durchgeführt.
Die Tiere der Experimentalgruppen wurden täglich einer einzelnen intramuskulären Verabreichung
des Arzneimittels für
90 Tage in Dosen von 1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 3 mg/kg in 0,5 ml Natriumchloridlösung ausgesetzt.
Den Tieren der Kontrollgruppen wurde Natriumchloridlösung in
gleicher Menge verabreicht.
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Während
des gesamten Untersuchungszeitraums wurden die Tiere täglich kontrolliert.
Das Verhalten der Tiere wurde aufgezeichnet, genauso wie das Freß- und Trinkverhalten,
der Zustand der Haare und mukosalen Oberflächen. Die Tiere wurden wöchentlich
gewogen. Die morphologische Zusammensetzung und die Eigenschaften
des peripheren Bluts wurden vor und am 30sten, 60sten und 90sten
Tag der Arzneiverabreichung untersucht. Biochemische und Koagulationsindizes
des Bluts wurden nach Beendigung des Experiments bestimmt.
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Die chronische Toxizität des erfindungsgemäßen L-Lys-L-Glu
Dipeptids wurde bei Langzeitverabreichung an Ratten mit einem Körpergewicht
von 150 bis 250 g untersucht. Die Tiere der Experimentalgruppen wurden
täglich
einer intramuskulären
Gabe oder Substanz in Dosen von 1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 3 mg/kg in 0,5
ml Natriumchloridlösung über 6 Monate
ausgesetzt. Das Verhalten der Tiere, genauso wie das Ess- und Trinkverhalten,
der Zustand der Haare und der mukosalen Oberflächen wurde beobachtet. Die
Tiere wurden in den ersten drei Monaten des Experiments täglich gewogen
und anschließend
einmal im Monat. Drei Monate nach Beginn der Gabe und nach Beendigung
des Experiments wurden hematologische und biochemische Untersuchungen
durchgeführt.
Die Funktionen des cardiovasculären
Systems, Leber, Pancreas, Niere und Nebenniere wurden untersucht.
Nach Beendigung der Arzneimittelverabreichung wurden einige Tiere
pathomorphologischen Untersuchungen unterworfen, mit dem Ziel verschiedene
Bereiche des Gehirns und des Rückenmarks, Herz,
Aorta, Lunge, Leber, Endokrin- und Immunsystem zu untersuchen.
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Die Bestimmung des allgemeinen Zustandes
des Tieres, der morphologischen und biochemischen Indizes des peripheren
Bluts, des morphologischen Zustands der intrinsi schen Organe, des
cardiovaskulären und
Atmungssystems, der Leber und Nierenfunktion zeigte keine pathologischen
Veränderungen
des Organismus.
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Die Untersuchung der subakuten und
chronischen Toxizität
des L-Lys-L-Glu Dipeptids zeigte die Abwesenheit von Nebeneffekten
der Langzeitgabe des Arzneimittels in Dosen, die die therapeutische
100 bis 1000fach überschritt.
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Beispiel 3. Einfluss des
L-Lys-L-Glu Dipeptids auf die Heilung von eitrigen gequetschten
Schnittwunden des Weichgewebes
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Die Wirksamkeit des L-Lys-L-Glu Dipeptids
wurde an einem Modell von eitrigen gequetschten Schnittwunden in
Weichgeweben an Oberschenkeln bei „Chinchilla" Kaninchen beiderlei
Geschlechts mit ein Körpergewicht
von 2 bis 3 kg untersucht. Die Kaninchen wurden in dem Bereich des
Weichgewebes der Oberschenkel rasiert mit einem anschließenden Schnitt
von 5 cm Länge
und 2 cm Tiefe. Das Weichgewebe (Muskel, subkutanes Fett) wurde
mit Kocher's Pinzetten
gequetscht und mit der pathogenen Mischung: Staphylococcus aureus,
Stamm 186, infiziert. Anschließend
wurde die Wunde vernäht.
Nach 72 Stunden wurde die Naht geöffnet, und die Wunde wurde
mit 3% Wasserstoffperoxidlösung
behandelt.
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Den Tieren der Experimentalgruppe
wurde intramuskulär
jeden Tag für
fünf Tage
mit dem Dipeptid L-Lys-L-Glu in einer einzelnen Dosis von 1 μg pro Injektion
injiziert. Den Kontrollkaninchen wurde Natriumchloridlösung gemäß dem gleichen
Schema injiziert. Beim Behandlungsverfahren wurden die Wunden mit
einem antiseptischen Arzneimittel zur externen Anwendung behandelt.
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Die Bestimmung der Wirksamkeit des
L-Lys-L-Glu Dipeptids in dem Fortschreiten der Regression des Entzündungsprozesses
bezog sich auf die Abstoßung
der Kruste und der Entfernung von pyonekrotischer Masse aus der
Wunde, dem Auftreten von granulärem
Gewebe in der Wunde und dem Beginn der Epithelbildung an den Ecken.
Mit dem Ziel, objektive Kriterien für das Fortschreiten des Heilungsprozesses
zu identifizieren, wurden Indizes analysiert, die halbquantitative
Eigenschaften verschiedener zellulärer Elemente und Strukturen
des granulären
Gewebes an den Tagen 6, 14, 21, 28 und 40 wiedergeben. Weiterhin
wurde die Aktivität
der Gewebeenzyme bestimmt (5, 6, 7).
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Als Ergebnis der Untersuchung wurde
festgestellt, dass die Tiere aller Gruppen in der ersten Phase der
Entzündung
am 6. Tag eine ausgeweitete Nekrose in dem umgebenen Gewebe mit
einem dünnen
Rand an granulärem
Gewebe mit diffusen frischen Fibroblasten und einzelnen Histiozyten
aufzeigten. In der Phase der Proliferation waren schmale Foci einer
Nekrose umringt von einer breiten Schicht granulären Gewebes mit Auftreten von
Gefäßen und
Lymphozyten. Die Menge an Histiozyten nahm zu, und die Makrophagen
bildeten Kluster in den nekrotischen Bereichen. Die Fibroblasten
waren gestreckt und hatten dünne
Nuclei. Besonders verstärkt
waren Prozesse der zellulären
Aktivierung bei den Tieren der Experimentalgruppe (Tabelle 1). In
der Phase der Narbenbildung zeigten diese Tiere Foci von Nekrose
umgeben mit einer Schicht granulären
Gewebes mit reifen Fibroblasten. Zwischen den Fibroblasten wurde
eine Schicht von kollagenen Fasern gefunden. Interstitielle Substanzen,
die sich innerhalb der nekrotischen Bereiche befanden, enthielten
Prekollagen Fasern, Fibroblasten, Histiozyten, dies legt einen Resorptionsprozess
und einen Austausch des nekrotischen Gewebes mit frischem granulären Gewebe
nahe.
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Ein hervortretendes Merkmal der Antwort
des Gewebes auf die Verabreichung von L-Lys-L-Glu Dipeptid bestand in der hohen
Aktivität
der sauren Phosphatase in Histiozyten zum Zeitpunkt der Proliferation
(14–28 Tage).
In neuen Foci von Leukozyten Infiltrationen, genauso wie im vaskulären Endothel
wurde eine starke Aktivität
der alkalischen Phosphatase beobachtet. In der Narbenbildungsphase
wurde ein hoher Gehalt an saurer Phosphatase in Histiozyten und
von alkalischer Phosphatase in Leukozyten und Gefäßen festgestellt
(Tabelle 2).
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Die beobachteten Veränderungen
beweisen eine Intensivierung des Zellstoffwechsels in Geweben, das
Fördern
eines schnellen Säuberns
der Wundenoberfläche
von nekrotischem Gewebe mit anschließender Epithelbildung in der
Wunde (Tabelle 3).
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Beispiel 4. Einfluss des
L-Lys-L-Glu Dipeptids auf die kompensatorische Regenerierung der
Leber nach teilweiser Hepatektomie
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Die Untersuchung wurde bei 26 weißen männlichen
Inzuchtratten mit einem Gewicht von 150 bis 200 g durchgeführt. Die
Tiere wurden in die folgenden drei Gruppen unterteilt:
- 1. Gruppe: gesunde Tiere
- 2. Gruppe: Kontrolle (Ratten, die einer teilweisen Hepatektomie
unterzogen wurden, wobei 2/3 der Leber entfernt wurde)
- 3. Gruppe: Ratten, die der Operation unterzogen wurden und anschließend (2
und 24 Stunden nach der Operation) wurden zwei subkutane Injektionen
des L-Lys-L-Glu Dipeptids (0,1 μg
pro Ratte) durchgeführt.
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Gleichzeitig wurden die Tiere der
ersten und zweiten Gruppe mit dem gleichen Volumen Natriumhydrochlorid
injiziert. Die entfernte Leber wurde in Formalin fixiert. Die operierten
Ratten wurden mit Hilfe von Ether 32 bzw. 96 Stunden nach der Operation
getötet.
Die Ratten der Kontrollgruppe wurden zur gleichen Zeit getötet. Deren
Leber wurde in Formalin fixiert. Durch Nachfärben der Präparate mit Hematoxilin-Eosin
wurde der mitotische Index in den Leberzellen definiert, genauso
wie die Menge an polyploiden Zellen in der S-Phase des Zellzyklus
(die Menge an sich teilenden Zellen).
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Die Untersuchung der Mitose-Aktivität der sich
regenerierenden Leberzellen 32 Stunden nach teilweise Hepatektomie
zeigte, dass die Zahl der Mitosen und der Zellen in der S-Phase
des Zellzyklus zweifach größer war
als in der Leber der gesunden Tiere. Dieser Unterschied ist im Falle
der Injektion von Natriumhydrochlorid nicht deutlich, während die
Zunahme der Mitosen, der DNA synthetisierenden Zellen und der Gesamtmenge
an sich teilenden Zellen nach Gabe des L-Lys-L-Glu Dipeptids deutlich
war.
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Die Untersuchung der Leberpräparationen
96 Stunden nach Hepatektomie bewies, dass sowohl Ratten, denen Natriumhydrochlorid
als auch solche denen L-Lys-L-Glu Dipeptid injiziert wurde, eine
deutliche Intensivierung der Mitose-Aktivität der Hepatozyten aufzeigt.
Ein Vergleich der Daten der dritten und der zweiten Gruppe zeigte, dass
die Ratten, denen L-Lys-L-Glu Dipeptid injiziert wurde, eine doppelt
so große
Zahl an Mitosen aufwies als die Ratten, denen Natriumhydrochlorid
injiziert wurde. Die Zahl der Zellen in der S-Phase jedes Zellzyklus
bei der dritten Gruppe von Ratten unterschied sich nicht signifikant
von der Zahl der Hepatozyten in der S-Phase der zweiten Gruppe,
obwohl insgesamt die Zahl der sich teilenden Zellen 96 Stunden nach
Hepatektomie in der regenerierten Leber der mit L-Lys-L-Glu Dipeptide
injizierten Ratten 75% größer war als
bei den Ratten, denen Natriumhydrochlorid injiziert wurde (Tabelle
4).
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Somit konnte gezeigt werden, dass
Ratten, denen L-Lys-L-Glu Dipeptide injiziert wurde, 96 Stunden nach
teilweiser Hepatektomie eine Intensivierung der Mitose-Aktivität der Hepatozyten
aufzeigte, dies zeigt die Beschleunigung der reparativen Prozesse
der Leber.
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Beispiel 5. Einfluss des
L-Lys-L-Glu Dipeptids auf die Regeneration von intestinaler mukoser
Membran nach Verletzung durch Bestrahlung
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Die Untersuchung wurde an 24 Monate
alten weißen
männlichen
Ratten der Wistar Linie durchgeführt, Gewicht
90 bis 100 g. Die folgenden drei Gruppen von Tieren wurden untersucht:
- 1. Gruppe: gesunde Tiere
- 2. Gruppe: Kontrolle (bestrahlte Tiere)
- 3. Gruppe: bestrahlte Tiere, denen L-Lys-L-Glu Dipeptid injiziert
wurde.
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Eine einzelne γ Bestrahlung von sechs Gy, die
das „Syndrom
des intestinalen Tod" induziert,
wurde mit einem Kobaltapparat „GUB
20000" mit einer
Dosiskapazität
von 200 rad/min, durchgeführt.
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L-Lys-L-Glu Dipeptid wurde 24 Stunden
nach Bestrahlung intraperitoneal über 5 Tage mit 0,5 μg in 0,5 ml
Natriumhydrochlorid injiziert. Die Tiere der ersten und zweiten
Gruppen erhielten Natriumhydrochlorid gemäß dem gleichen Schema.
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Die Untersuchung der Wirkung des
L-Lys-L-Glu Dipeptids wurde im proximalen Bereich des Duodenums
der bestrahlten Tiere durchgeführt.
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Die Tiere wurden unter Nembutal-Narkose
(50 mg/kg) am achten Tag nach Bestrahlung getötet (Beginn der Regeneration
des Reparaturzeitraums). Teile des Duodenums wurden gemäß Karnovsky
für 24
Stunden fixiert für
die Elektronenmikroskopie.
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Die ultrastrukturelle Untersuchung
wurde mit dem JEM-100S Mikroskop (JEOL, Japan) mit ultradünnen mikroskopischen
Schnitten, hergestellt mit dem LKB-7A Ultra-Mikrotom (LKB, Schweden), durchgeführt, diese
wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt.
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Mastzellen wurden selektiv mit 1%
Lösung
Toluidin blau (Fluka) in 0,5 M HCl mit einem pH von 0,5 gefärbt (8,9).
Um die Proliferationsaktivität
der Zellen zu untersuchen, wurden Maus monoklonale Antikörper gegen
das nukleäre
Zell-Proliferations Antigen (PCNA), 1 : 50 verdünnt (Klon PC 10, Calbiochem,
USA) und Avidin-Biotin Peroxidase zum Aufzeigen der Mausimmunoglobuline
(Vectastain, USA) verwendet. Serotonin positive Zellen wurden dargestellt
mit Hilfe des polyklonalen Kaninchenantikörpers gegen Serotonin (unverdünnt) und
Streptavidin-Biotin-Peroxidase Kit (Bio-Genex, USA). Um MTL positive Zellen
aufzuzeigen, wurden Kaninchen Antikörper gegen Metallthioneine
verwendet (1 : 2000).
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Die immunhistochemische Identifizierung
der Antigene auf histologischen Schnitten wurde gemäß den Bedingungen
für Immunperoxidaseverfahren
gemacht (10,11).
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Die quantitative Untersuchung wurde
mit Hilfe des Systems zur Computeranalyse von mikroskopischen Bildern
IMSTAR (Imstar, Frankreich) und der lizenzierten Anwendungsverfahren
Morphostar-2 und Colquat-2 durchgeführt gemäß den allgemeinen Prinzipien
der Stereologie in der Morphometrie (12, 13). Für jedes Tier wurde die Berechnung
der entsprechenden Strukturen in 10 verschiedenen Untersuchungsbereichen
bei drei Schnitten des untersuchten Organs durchgeführt. Der
Mitose-Index (Imit) und der Index der proliferierenden Fähigkeit
(Ipcna) der Duodenumzellen wurde in 10 bis 15
Standardabschnitten mit Gesamtmengen von nicht weniger als 1000
Nuclei von Enterozyten definiert. Der Testbereich zum Auffinden
von Serotonin-positiven- und Mastzellen deckte nicht weniger als
3 mm2 ab. MTL positive Zellen wurden in
100 Duodenum Krypten gezählt.
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Nach Ionenbestrahlung war am Tag
8 eine teilweise, in manchen Fällen
sogar totale, Wiederherstellung der Ultrastruktur der Enterozyten
zu beobachten, es traten allerdings nach wie vor hyperplastische
(„geschwollene") Mitochondrien, Ödeme des
endoplasmatischen Retikulums und fokale Vakuolisierung des Zytoplasmas
auf, die endokrinen Zellen schauten zu diesem Zeitpunkt im Prinzip
unverändert
aus.
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Quantitative Veränderungen im Duodenum am B.
Tag nach Total γ-Bestrahlung
mit 6 Gy des Darms zeigten die folgenden spezifischen Merkmale:
IPCNA in den intestinalen Krypten stieg
auf 46,5%, während
der Mitose-Index bis auf 4,2% stieg (Tabelle 5). Diese Daten bestätigen, dass
die Wiederherstellung des Mukosaepithels in den überlebenden Tieren sehr schnell
vor sich ging, während
der Pool an Gefäßzellen
im intestinalen Epithel zu diesem Zeitraum in einem Stadium der
Hyperregenerierung war (1a).
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Histologische Untersuchung der Präparate,
die mit Hematoxilin und Eosin gefärbt wurden, bestätigen ebenfalls
den Beginn der Normalisierungsprozesse des Epithelaufbaus. Die Ergebnisse
der Computeranalyse zeigten allerdings, dass die zahlenmäßige Dichte
der Enterochromaffinn Zellen (2a)
und MTL-positiven Zellen (3a)
noch nicht die Niveaus der Indizes gesunder Tiere aufzeigte (MTL-positiv
= Metallothionein-positiv).
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Die Menge an Mastzellen der mukosalen
Grundplatte der bestrahlten Tiere war um das 10fache verringert
(4a), dies bestätigt die
starke Bestrahlungssensitivität
der Mastzellen vom mukosalen Typ gegenüber ionisierender Strahlung,
genauso wie die sehr langsame Wiederherstellung ihrer Zahl, selbst
wenn sie subletalen Dosen ausgesetzt sind.
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Es ist bemerkenswert, dass die Injektion
des L-Lys-L-Glu Dipeptids die Strukturen des zytoplasmatischen Retikulums
und die des Plattenkomplexes der endokrinen Zellen des Duodenums
aktiver macht, dies zeigt die stimulierende Wirkung auf die Syntheseprozesse
und die Hormonsekretion.
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Gemäß den Ergebnissen der morphometrischen
Analyse tritt in den Krypten der Gedärme der bestrahlten Tiere nach
Injektion von L-Lys-L-Glu Dipeptid eine bemerkenswerte Beschleunigung
des Wiederherstellungsverfahrens auf (1b).
Der PCNA-Index geht
auf 49,8%, während
der Mitose-Index sich auf 4,7% erhöht (Tabelle 5). Die quantitative
Dichte der Enterochromaffinn Zellen stellte sich praktisch auf die
der gesunden Tiere ein. Es bestand eine Tendenz der Erhöhung der
Zahl und Intensität
von immungefärbten
MTL positiven Zellen an der Kryptenbasis (3b).
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Die Verwendung von L-Lys-L-Glu Dipeptid
intensiviert das Proliferationspotential von Gefäßzellen des Darms und stärkt die
morphofunktionelle Regeneration der intestinellen Mukosa nach allgemeiner γ-Bestrahlung
mit einer Dosis von 6 Gy.
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Somit zeigt die Experimentalstudie,
dass L-Lys-L-Glu Dipeptid nicht toxisch ist, dass es Stoffwechselprozesse
und die Proliferationsaktivität
von Zellen in irgendeinem Gewebe aktiviert, um so deren Wiederherstellung
zu verbessern.
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Die Eigenschaften des L-Lys-L-Glu
Dipeptids, die sich während
der experimentellen pre-klinischen Untersuchung darstellten, erlauben
eine prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung als Stimulans
zur Gewebewiederherstellung bei eitrigen entzündlichen Erkrankungen, postoperativen
Komplikationen, Ernährungskrankheiten,
Haut und Mukosa Verletzungen und Erkrankungen, Bestrahlung, thermischen
und chemischen Nachwirkungen, begleitet von Reparaturprozesszuständen.
-
Die Beispiele der klinischen Studien
des beanspruchten Dipeptids, wie sie unten gezeigt sind, zeigen dessen
pharmakologische Eigenschaften und bestätigt dessen Patentfähigkeit.
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Beispiel 6. Wirksamkeit
der Verwendung des L-Lys-L-Glu Dipetids zur Behandlung bei der Entzündung der Speicheldrüsen und
Sialolithiasis
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45 Patienten wurden untersucht. Von
diesen hatten 27 Personen eine Entzündung der Speicheldrüse, 4 davon
hatten Parotitis. 18 Personen litten an Sialolithiasis der Unterkieferdrüsen. Das
Durchschnittsalter der Patienten war 35–40. Alle Patienten mit der
Sialolithiasis hatten entfernte Steine. 30 Patienten (15 von diesen hatten
eine Entzündung
der Speicheldrüse,
die anderen 15 hatten Sialolithiasis) wurden einer täglichen
intramuskulären
Injektion von L-Lys-L-Glu Dipeptid von 1 μg über 5 Tagen unterworfen.
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Die Patienten der Kontrollgruppe
wurden einer Standardbehandlung unterworfen: antibakterielle, Desensibilisierungstherapie,
Joddimexidverbände,
physische Therapie (Ultraschall, 5–10% Kaliumjodidelektrotherapie
des Drüsenbereichs),
lokale Behandlung (Waschen der Drüsen mit einer antiseptischen
Lösung
und Antibiotika).
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Die Patienten, die eine Sialolithiasis
aufzeigten und mit L-Lys-L-Gludipeptid behandelt wurden, zeigten keinen
Auswurf von Eiter aus den Drüsengängen, im
postoperativen Zeitraum heilte die Wunde in der Mundhöhle beim
ersten Verheilen ohne irgendwelche Nachwirkungen. Ein Schwellen
und eine Infiltration des Weichgewebes und der mukosalen Membran
der Mundhöhle
war am 3.–4.
Tag nach der Operation abgeklungen. Die Größe der Drüse nahm deutlich ab, und die
Schmerzen verschwanden.
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Die Patienten, die eine Entzündung der
Speicheldrüsen
hatten und die mit L-Lys-L-Glu Dipeptid behandelt wurden, hatten
am 4.–5.
Tag nach Behandlung keine Schmerzen in der Drüse mehr und der Auswurf an
Eiter aus den Drüsengängen stoppte,
die Speichelbildung nahm zu, die Schwellung und die Infiltration
des Weichgewebes verschwand; beim Abtasten war die Größe der Drüse deutlich
verringert, und sie wurde schmerzfrei. Der Allgemeinzustand der
Patienten verbesserte sich. Die Laborwerte normalisierten sich ebenfalls.
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Somit half die Verwendung von L-Lys-L-Glu
Dipeptid bei der Reduktion der Zahl der Entzündungen, beschleunigte die
Regeneration bei Wunden und verkürzte
den Behandlungszeitraum.
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Beispiel 7. Wirksamkeit
von L-Lys-L-Glu Dipeptid bei der Behandlung von eitrigen Entzündungserkrankungen verschiedener
Lokalisation
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L-Lys-L-Glu Dipeptid wurde bei der
komplexen Behandlung von 15 Patienten, die Fleischwunden mit verzögerter Granulierung
in oberen und unteren Extremitäten
hatten und 19 Patienten, die Phlegmone im Kiefer und Gesichtsknochenbereich
hatten, verwendet. 1 μg
der Präparation
wurde jeden Tag für
10 Tage intramuskulär
injiziert. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde in ihrer Dynamik
gemäß den Veränderungen
der Aktivität
der Wundenzyme und dem Zeitraum der Heilung untersucht.
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Es wurde gefunden, dass L-Lys-L-Glu
Dipeptid sich als am wirksamsten bei Patienten mit geringer Aktivität der eiweißspaltenden
Wundenzyme im ersten und zweiten Stadium des Wundheilungsprozesses
herausstellte, mit nekrotischem Zytogramm und langsamer Heilung.
L-Lys-L-Glu Dipeptid erhöht
die Aktivität
der Wundfermente in der ersten Phase des Heilungsprozesses, verursachte
eine Adaption der Restrukturierung in der Wunde und fördert die
Synthese der sauren Phosphatasen in Histozyten, der alkalischen
Phosphatasen in Leukozyten und Zytochrom C in Makrophagen und verstärkt die
Reparaturprozesse. Das Injizieren des Dipeptids hilft einer beschleunigten
Reinigung der Wunde von nekrotischen Geweben und Heilen der Wunde
aufgrund der Makrophagen, Fibroblasten und Leukozytenaktivierung
im Entzündungsfokus.
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L-Lys-L-Glu Dipeptid-Behandlung führte zu
einer schnelleren Abwicklung des lokalen Entzündungsprozesses, Verbesserung
des allgemeinen Zustandes des Patienten und der Kürzung des
Behandlungszeitraums.
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Beispiel 8. Wirksamkeit der Verwendung
des L-Lys-L-Glu Dipeptids bei Krebspatienten mit postoperativen
Komplikationen
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L-Lys-L-Glu Dipeptid wurde bei der
komplexen Behandlung von 9 Patienten mit verzögert granulierenden Wunden
nach operativer Behandlung bei Lungenkrebs des zweiten bis dritten
Stadiums und Magenkrebs im zweiten bis dritten Stadium verwendet.
Im pre-operativen Zeitraum wurden die Patienten einer Gesamtbestrahlungstherapie
unterworfen, unter Verwendung von großen Bereichen der Komplexkonfiguration
eines linearen Elektronenbeschleunigers (dessen Leistung ist 4,3
Mev) und einer Gamma-Therapievorrichtung „Rokus-M" im Bremsmodus. In
bestimmten Fällen
war eine Komponente der kombinierten Therapie eine Chemotherapie.
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Beginnend mit dem 3. Tag nach der
Operation wurde 1 μg
L-Lys-L-Glu Dipeptid über
10 Tage intramuskulär
injiziert.
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Es stellte sich heraus, dass die
Verwendung dieses Präparats
die Ödeme
und Schmerzen im Wundbereich reduzierten und sowohl die Entfernung
von nekrotischem Gewebe aus der Wunde als auch die Bildung postoperativer
Narben beschleunigte. Während
des Injektionszeitraums wurden die folgenden Faktoren beobachtet:
Normalisierung der Temperatur, Verbesserung des Appetits und schnellere
Gewichtszunahme.
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Die Verwendung des L-Lys-L-Glu Dipeptids
als Teil der komplexen Therapie bei Krebspatienten stimuliert somit
die Reparaturprozesse in den Geweben, fördert die Verbesserung des
Allgemeinzustandes des Patienten und reduziert die Behandlungszeit.
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Die klinische Anwendung von L-Lysyl-L-Glutaminsäure (L-Lys-L-Glu)
wird durch die durch experimentelle Untersuchungen erhaltenen Daten
bestätigt,
dies zeigt, dass das Präparat
ein wirksames Arzneimittel gegenüber
Störungen
des Reparaturprozesses ist.
-
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DATENBLATT
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Patentinhaber: Obschestvo s Ogranichennoi
Otvetstvennostiju "Klinika
Instituta Bioregulyatsii i Gerontologii, pr. Dinoamo, 3, St. Petersburg
197110/RU
Vertreter: GRAMM, LINS & PARTNER GbR Freundallee 13, D-30173
Hannover
Aktenzeichen: 99928267.6-2107
Veröffentlichungsnummer:
1 089 753
Bezeichnung der Erfindung: USE OF A DIPEPTIDE FOR
STIMULATING REPAIR PROCESS
Aktenzeichen des DPMA für das Europäische Patent:
699 09 794.0-08