CH671516A5

CH671516A5 -

Info

Publication number: CH671516A5
Application number: CH3724/86A
Authority: CH
Inventors: Rolf Schaefer; Hans Hitz
Original assignee: Amcis Ag
Priority date: 1986-09-16
Filing date: 1986-09-16
Publication date: 1989-09-15
Also published as: US4908206A

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus Organen embryonaler Säugetiere, wobei dieser Extrakt frei von hochmolekularen Bestandteilen und unpolaren Bestandteilen ist.

Der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Extrakt wird in pharmazeutischen Präparaten zur Bekämpfung von peripheren Durchblutungsstörungen, cerebralen Durchblutungsstörungen, wie von Acne vulgaris, eingesetzt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein entsprechendes pharmazeutisches Präparat, welches den nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Extrakt der embryonalen Säugetierorgane enthält. Diese pharmazeutischen Präparate können in Form eines cerebrovas-kulären Regenerators vorliegen.

Es ist bekannt, dass aus Rohprodukten, die aus dem Organismus von Säugetieren stammen, Wirkstoffgemische gewonnen werden können, die zur Behandlung oder Verhinderung bestimmter krankhafter Zustände eingesetzt werden können.

Beispielsweise werden in den USA Patentschriften Nr. 3 953 290 und 4 054 557 Verfahren beschrieben, bei denen, ausgehend von Säugetierblutplasma oder Blutserum, durch Behandlung mit einer Säure, insbesondere Salzsäure, Polypeptide gewonnen werden können, die das Zellwachstum fördern und deren Molekulargewicht im Bereich von 4000 bis 7000 liegt.

In der USA Patentschrift Nr. 4 139 611 wird ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit insulinartiger Aktivität aus Blut oder Blutkomponenten von warmblütigen

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Tieren beschrieben, bei dem man das Blut in einem hydrophilen Verdünnungsmittel entweder in einem sauren pH-Bereich von 2 — 4 oder in einem alkalischen pH-Bereich von 8 — 10 behandelt und anschliessend neutralisiert und aus diesem Hydrolysat durch Dialyse die entsprechende Polypep-tidfraktion gewinnt, deren Molekulargewicht im Bereich von etwa 350 bis 6000 liegt.

In der USA Patentschrift Nr. 2 912 359 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem hämolysiertes Blut im pH-Bereich von 6 — 9 mit einem proteolytischem Enzym, beispielsweise Papain, behandelt wird, um ein proteinfreies Material herzustellen, das wundheilende Wirkung besitzt.

In der USA Patentschrift Nr. 3 973 001 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem aus dem Blut von jungen Säugetieren, beispielsweise einem Monat alten Kälbern, ein Blutextrakt mit einer die Zellatmung anregenden Aktivität gewonnen wird, indem man das Blut zunächst defibriniert, hämoly-siert und von Feststoffen befreit und aus dieser Lösung dann durch Dialyse die Komponenten, deren Molekulargewicht über 4500 liegt, entfernt.

In der französischen Patentveröffentlichung Nr. 2 157 994 wird ferner ein Heilmittel zur Behandlung von Störungen und Erkrankungen des peripheren Blutgefässsy-stems beschrieben, wobei der entsprechende Wirkstoff aus Fetten des Knochenmarks von Säugetieren gewonnen wird.

Es ist ferner auch bereits bekannt, aus einzelnen Organen von Säugetieren Wirkstoffe zu gewinnen.

Beispielsweise wird in dem am 1. September 1963 veröffentlichten französischen Medikamentenpatent (Brevet Spécial de Médicament) Nr. 1 951 M ein Pankreasextrakt beschrieben, der zur Behandlung von chronischen und akuten Gefässerkrankungen eingesetzt werden kann. Zu diesem Zweck wird das entnommene Organ tiefgefroren und unter Aufrechterhaltung des physiologischen Zellgleichgewichtes mechanisch zerkleinert und schliesslich das Material in tiefgefrorenem Zustand lyophilisiert. Auf Seite 2, linke Spalte, dritter Abschnitt dieser Patentschrift, wird daraufhingewiesen, dass bei den vor diesem Zeitpunkt angewandten Gewinnungsverfahren für Organextrakte, eine Entfernung der Proteine stattgefunden hatte, indem man das Material in saurem Milieu in Anwesenheit von alkoholischen Lösungsmitteln erhitzte um die unerwünschten Proteine auszufallen.

In der französischen Patentveröffentlichung Nr. 2 320 760 wird ein eine Mischung aus Gangliosiden enthaltendes Medikament beschrieben, das unter anderem zur Behandlung von Gefässkrankheiten und von altersbedingten Gehirnstörungen verwendet werden kann. Dieses Produkt wird gewonnen, indem man tierisches Nervengewebe in einem Phosphatpuffer in Anwesenheit von Tetrahydrofuran behandelt, die Feststoffe abzentrifugiert, die nicht-polaren Bestandteile mit Diäthyläther entfernt und schliesslich das Produkt über eine Ionenaustauschersäule reinigt. Später durchgeführte Arbeiten zeigten jedoch, dass für Organextrakte eine Fraktionierung über Ionenaustauschermaterialien aufgrund der komplizierten Zusammensetzung dieser Extrakte ungünstig ist.

In der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 1 910 715 wird eine aus Säugetiergehirnen und Milzen gewonnene Fraktion mit antimikrobieller Aktivität beschrieben, die ein Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 2000 aufweist. Die entsprechende Fraktion kann gewonnen werden, indem man aus einem Alkoholextrakt des Ausgangsmaterials den Alkohol entfernt und anschliessend eine Gelfiltration durchführt.

Es ist schliesslich bekannt, dass pharmazeutische Präparate, die lyophilisierte Zellen von Säugetierembryonen enthalten, eine regenerierende und stimulierende Wirkung auf den menschlichen Organismus ausüben und derartige Präparate werden insbesondere zur Behandlung von Alterserscheinungen bei menschlichen Patienten eingesetzt. Zellen, die aus entsprechenden Organen von erwachsenen Säugetieren stammen, üben diese Wirkung der Embryonalzellen nicht aus.

Ziel der vorliegenden Erfindung war es, aus embryonalen Säugetierorganen eine Fraktion von pharmazeutisch wirksamen Bestandteilen zu isolieren, wobei diese Fraktion frei von hochmolekularen Materialien sein sollte. Ferner war man bestrebt, die entsprechenden von hochmolekularen Bestandteilen freien Extrakte herzustellen, ohne dass in dem verwendeten Ausgangsmaterial ein enzymatischer Abbau oder ein im sauren pH-Bereich oder alkalischen pH-Bereich durchgeführter hydrolytischer Abbau von Proteinen hohen Molekulargewichts durchgeführt wird, sondern die in den embryonalen Säugetierorganen in geringen Mengen vorhandenen Wirkstoffe niedrigen Molekulargewichtes sollten ohne Abbau von Bestandteilen hohen Molekulargewichtes als Wirk-stoff-Fraktion isoliert werden. Des weiteren sollte diese Isolierung so durchgeführt werden, dass die Nachteile von Fraktionierungen über Ionenaustauschersäulen und auch die zeitraubenden Arbeitsschritte, die mit einer Gelfiltration verbunden sind, vermieden werden.

Überraschenderweise zeigte es sich, dass die angestrebten Ziele dadurch erreicht werden können, dass man die fein zerkleinerten embryonalen Säugetierorgane mit einem Gemisch aus Wasser und wassermischbarem organischen Lösungsmittel, das dieses zu mindestens 70 Vol.-% enthält und einen etwa neutralen pH-Bereich aufweist, behandelt, und nach der Entfernung der festen Bestandteile aus dem flüssigen Material durch Erhitzen in dem etwa neutralen pH-Bereich, die hochmolekularen Proteine ausfallt und entfernt und schliesslich weitere hochmolekulare Materialien, deren Molekulargewicht über 5000 liegt, durch Filtration durch ein Ultramembranfilter entfernt. Durch diese Arbeitsweise können aus etwa 1000 Gewichtsteilen der eingesetzten frischen Embryonalorganen 4—11 Gew.-Teile eines trockenen Wirkstoffextraktes gewonnen werden, der zur Bekämpfung von peripheren Durchblutungsstörungen, cerebralen Durchblutungsstörungen, sowie zur Bekämpfung von Acne vulgaris geeignet ist. Dieses Verfahren zur Herstellung eines Wirk-stoffextraktes aus embryonalen Säugetierorganen ist wesentlich einfacher und arbeitssparender durchzuführen, als bisher bekannte Verfahren, bei denen Fraktionierungen über Jonenaustauschersäulen oder Gelfiltrationen durchgeführt werden mussten.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines von hochmolekularen Bestandteilen und unpolaren Bestandteilen freien Extraktes aus fein zerkleinerten Säugetierorganen unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und wasserlöslichem organischen Lösungsmittel als Extraktionsmittel, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die eingesetzten Säugetierorgane oder Gemische aus unterschiedlichen Säugetierorganen von embryonalen Säugetieren stammen und dass das fein zerkleinerte Organmaterial aufgeschlämmt in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und wassermischbarem Lösungsmittel, das einen pH-Wert von 6 bis 8 und einen Gehalt an wassermischbarem organischen Lösungsmittel von mindestens 70 Vol.-% aufweist unter kräftigem Rühren bei atmosphärischem Druck mindestens zwei Stunden unter Rückfluss gekocht wird, die Aufschlämmung danach auf eine Temperatur von maximal + 8 rC gekühlt und die Flüssigkeit von den festen Bestandteilen bei dieser Temperatur abgetrennt wird, anschliessend die wässrig organische Lösung unter Vakuum zur Trockene eingedampft wird, der Rückstand in Wasser aufgenommen und eine halbe Stunde bis zwei Stunden bei einer Temperatur von 75 — 85 ;C gerührt wird, anschliessend die Lösung auf eine Temperatur

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von maximal +8 C gekühlt und von Feststoffen befreit wird, worauf dann aus dem Filtrat die hochmolekularen Materialien mit einem Molekulargewicht von über 5000 durch Filtration durch einen Ultramembranfilter entfernt werden.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des Extraktionsverfahrens wird dieses mit einem Gemisch aus 75 Vol.-% bis 85 Vol.-% an wassermischbarem organischen Lösungsmittel und Wasser durchgeführt, wobei das wassermischbare organische Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Propanol . oder Aceton ist. Ein speziell geeignetes Lösungsmittelgemisch ist eine Mischung aus 80 Vol.-% Äthanol plus 20 Vol.-% Wasser.

Die Aufschlämmung des zerkleinerten Organmateriales in dem Lösungsmittelgemisch weist vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 7,5 und speziell bevorzugt im Bereich von 6,8 bis 7,1 auf.

Zur Durchführung des Extraktionsschrittes werden pro Gewichtsteil des frischen, fein zerkleinerten Embryonalorga-nes oder der Mischung auf fein zerkleinerten unterschiedlichen Embryonalorganen 5 bis 15 Gewichtsteile des Lösungs-mittelgemisches eingesetzt. Speziell bevorzugt werden pro Gewichtsteil der zerkleinerten Embryonalorgane oder der Mischung an unterschiedlichen Embryonalorganen 9 — 10 Gewichtsteile des Lösungsmittelgemisches eingesetzt.

Die verwendeten embryonalen Säugetierorgane stammen vorzugsweiser von Embryonen, die nach Ablauf von etwa der Hälfte der üblichen Tragzeit der jeweiligen Säugetierart bis zu etwa5/ó der üblichen Tragzeit der jeweiligen Säugetierart gewonnen wurden. Bevorzugte Säugetiere, von denen die entsprechenden Organe stammen, sind Wiederkäuer, insbesondere Rinder, Schafe oder Ziegen. Die embryonalen Säugetierorgane können jedoch auch von anderen Säugetierarten stammen, wie zum Beispiel Pferden, Schweinen, Affen oder Nagetieren, beispielsweise Kaninchen oder Meerschweinchen.

Bevorzugte Organe der Embryonen, die zur Herstellung der Wirkstoffextrakte herangezogen werden, sind Lungen, Nieren, Lebern, Herzen oder Mischungen aus unterschiedlichen Organen der Säugetiere, die jedoch mindestens eines der oben genannten Organe enthalten. Zur Herstellung der erfindungsgemässen Wirkstoffextrakte sind das Blut der Embryonen, das Knochenmark der Embryonen und Hormone und Enzyme abscheidende Drüsen der Embryonen, wie zum Beispiel Pankreas, nicht geeignet und es zeigte sich auch, dass aus dem Gehirn der Säugetierembryonen gewonnene entsprechende Organextrakte nicht die erwünschte pharmakologische Aktivität bei der Bekämpfung von peripheren Durchblutungsstörungen, cerebralen Durchblutungsstörungen, sowie Acne vulgaris aufweisen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden von den entnommenen Embryonalorganen zunächst einmal anhaftende, nicht zum Organ gehörende Gewebsreste und Fettpartikel entfernt, und dann erst wird die mechanische Zerkleinerung der Organe in dem Lösungsmittelgemisch vorgenommen.

Es zeigte sich, dass es vorteilhaft ist, unterschiedliche Organe der entsprechenden Säugetierembryonen gemeinsam in dem Lösungsmittelgemisch zu zerkleinern und das aus diesen unterschiedlichen Organen stammende zerkleinerte Material den übrigen Arbeitsschritten des erfindungsgemässen Verfahrens zu unterwerfen.

Die Aufschlämmung des fein zerkleinerten Organmateriales in dem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und wassermischbarem Lösungsmittel, insbesondere einem Lösungsmittelgemisch aus etwa 20 Vol.-% Wasser plus 80 Vol.-% Äthanol wird vorteilhafterweise 2,5 bis 3,5 Stunden unter Rückfluss gekocht, beispielsweise 3 Stunden, um die Ausfällung der hochmolekularen Proteinbestandteile zu erreichen. Wesentlich ist bei diesem Verfahrensschritt, dass der pH-Wert der Aufschlämmung während des Erhitzens etwa im neutralen pH-Bereich liegt, d.h. vorzugsweise bei etwa 6,5 — 7,5 und insbesondere im Bereich von 6,8 — 7,1, um zu erreichen, dass ein hydrolytischer Abbau der vorhandenen hochmolekularen Proteine zu niedrig molekularen Peptiden oder einzelnen Aminosäuren verhindert wird.

Nach diesem Erhitzungsvorgang wird die Suspension auf eine Temperatur von maximal +8 °C, beispielsweise +2 CC bis + 6 °C, gekühlt und die festen Bestandteile der Suspension werden bei dieser Temperatur abgetrennt, beispielsweise durch Filtrieren oder durch Zentrifugieren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein pharmazeutisches Präparat zur Bekämpfung von peripheren Durchblutungsstörungen, cerebralen Durchblutungsstörungen, sowie von Acne vulgaris, wobei dieses Präparat dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Wirkstoff den nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Extrakt der embryonalen Säugetierorgane enthält.

Die entsprechenden pharmazeutischen Präparate enthalten ferner vorzugsweise ein pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial oder Verdünnungsmittel.

Entsprechende erfmdungsgemässe pharmazeutische Präparate können so formuliert werden, dass sie zur oralen Verabreichung, zur Verabreichung mittels Injektion oder Infusion oder zur topischen Verabreichung geeignet sind.

Es zeigte sich, dass Patienten, die an Diabetes leiden, und die einer Behandlung mit den erfindungsgemässen Präparaten unterworfen wurden, eine Besserung der diabetischen Krankheitszustände feststellten. Derzeit werden weitere Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, in wie weit die erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate auch zur Bekämpfung von Diabetes geeignet sind.

Zur Testung der Wirksamkeit der erfindungsgemässen Präparate zur Bekämpfung von Acne vulgaris wurden hauptsächlich Patienten der Altersgruppe 16-jährig bis 21-jährig herangezogen, die alle an Acne vulgaris litten und es wurde sowohl eine topische Behandlung als auch eine orale Behandlung mit entsprechenden Wirkstoffpräparaten vorgenommen.

Die peripheren Durchblutungsstörungen wurden hauptsächlich an weiblichen und männlichen Personen der Altersgruppe 40- bis 60-jährig getestet, die alle an Symptomen der peripheren Durchblutungsstörungen litten. Bei diesen Personen erfolgte je nach Testgruppe die Verabreichung des Wirkstoffes oral oder durch Injektion oder auch topisch.

Zur Testung der Wirksamkeit der erfindungsgemässen Präparate bei der Behandlung von cerebralen Durchblutungsstörungen wurden männliche und weibliche Personen herangezogen, die hauptsächlich 60 bis 75 Jahre alt waren. Die entsprechenden Wirkstoffpräparate wurden oral oder durch Injektion verabreicht.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird nach der Abtrennung der festen Bestandteile aus der Suspension bei einer Temperatur von maximal +8 CC eine wässrige organische Lösung erhalten, die dann unter Vakuum zur Trockene eingedampft wird. Dieser Trockenrückstand ist ein gelb-braunes Produkt und im allgemeinen ergeben 1000 Gewichtsteile der fein zerkleinerten Embryonalorgane 5 — 12 Gew.-Teile, beispielsweise 7—10 Gew.-Teile, dieses Trockenrückstandes.

Der so erhaltene Trockenrückstand wird dann, wie bereits erwähnt wurde, in Wasser aufgenommen und eine halbe Stunde bis zwei Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 75 — 85 "C gerührt. Zweckmässigerweise wird ein Gewichtsteil des Trockenrückstandes in 100 —150 Gewichtsteilen Wasser, vorzugsweise 120—130 Gewichtsteilen Wasser

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aufgenommen. Diese wässrige Mischung wird dann unter Rühren eine halbe bis zwei Stunden, vorzugsweise etwa eine Stunde, bei einer Temperatur von 75 — 85 °C behandelt, beispielsweise bei einer Temperatur von 77—83 °C. Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens auch bei dieser zweiten Wärmebehandlung ein pH-Wert im Bereich von 6,5—7,5, vorzugsweise 6,8 — 7,1 eingehalten, damit ein hydrolytischer Abbau von hochmolekularen Proteinen unter Bildung niedermolekularer Proteine auch bei diesem Arbeitsschritt verhindert wird.

Nach dieser Wärmebehandlung erfolgt die Abkühlung der Lösung auf eine Temperatur von maximal + 8 °C, beispielsweise auf eine Temperator von 2° — 6 °C. Danach ist in der gelblichen Lösung die Ausbildung einer Trübung festzustellen.

Die Feststoffe werden aus der trüben Lösung entfernt, beispielsweise durch eine Filtration unter Verwendung einer Glasfritte.

Anschliessend erfolgt dann die Filtration der klaren Lösung durch ein Ultramembranfilter mit einer Ausschlussgrenze eines Molekulargewichts von 5000 (5000 Dalton). Durch diese relativ rasch durchzuführende Ultramembranfiltration werden aus dem Produkt hochmolekulare Materialien, deren Molekulargewicht über 5000 liegt, entfernt.

Zweckmässigerweise wird diese Filtration durch das Ultramembranfilter durchgeführt, indem man durch dieses Filter zunächst 5/ö des Gesamtvolumens der Flüssigkeit filtriert, den verbleibenden Rückstand mit Wasser wieder auf das Ausgangsvolumen verdünnt und wieder 5/ô des verdünnten Materiales durch das Ultramembranfilter filtriert. Gegebenenfalls wird dieser Vorgang noch mehrmals wiederholt.

Bei dieser bevorzugten Ausführungsart der Filtration durch das Ultramembranfilter erhöht sich also das Volumen, gegenüber derjenigen Wassermenge in der der Trok-kenrückstand aufgenommen worden war, auf das Doppelte bis Dreifache, sodass man also pro Gew.-Teil des Trockenrückstandes, der in den 100—150 Gew.-Teilen Wasser aufgenommen worden war, schliesslich 200—450 Gew.-Teile wässrige Lösung erhält.

Diese nach der Filtration durch das Ultramembranfilter erhaltene wässrige Lösung wird zunächst unter Vakuum auf etwa '/io ihres Volumens eingeengt und diese eingeengte Lösung wird schliesslich lyophilisiert, wobei als Rückstand ein gelbes Pulver zurückbleibt.

Pro 1000 Gew.-Teile der eingesetzten frischen Embryonalorgane werden im allgemeinen 3 — 10 Gew.-Teile, beispielsweise 5 — 8 Gew.-Teile, dieses gelben Trockenrückstandes erhalten.

Beim Auflösen in Wasser ergibt dieser Trockenrückstand eine klare wässrige Lösung. In dieser konnten durch Gelelektrophorese keine Proteine eines Molekulargewichts von über 5000 nachgewiesen werden.

Durchgeführte Antigentests zeigten ferner, dass das erhaltene Produkt frei von Substanzen ist, die Allergien hervorrufen könnten.

Anhand der folgenden Beispiele werden bevorzugte Ausführungsarten des Verfahrens zur Herstellung des Wirkstoffextraktes aus embryonalen Säugetierorganen erläutert und es werden auch die Ergebnisse von Tests der pharmakologischen Wirksamkeit der erhaltenen Produkte veranschaulicht.

Beispiel 1

Herstellung eines Wirkstoffextraktes aus Organen embryonaler Rinder

10 kg eines Gemisches von Lungen, Nieren, Lebern und Herzen embryonaler Kälber wurden gemeinsam fein zerkleinert, beispielsweise unter Verwendung eines Fleischwolfes püriert. Der erhaltene Brei wurde mit 1001 einer Mischung aus 20 Vol.-% Wasser plus 80 Vol.-% Äthanol vermischt. Diese Aufschlämmung wurde unter kräftigem Rühren unter dem Druck der umgebenden Atmosphäre während drei Stunden unter Rückfluss gekocht.

Anschliessend wurde die Aufschlämmung rasch auf 4 °C abgekühlt und die festen Teile der Aufschlämmung wurden unter Verwendung einer Zentrifuge abgetrennt. Das erhaltene Sediment wurde verworfen und die abgetrennte wässrige Flüssigkeit unter Wasserstrahlvakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers zur Trockene eingeengt. Es blieben 83 g eines gelb-braunen Rückstandes zurück.

Dieser Rückstand wurde mit 101 Wasser vermischt und eine Stunde lang bei einer Temperatur von 80 °C gerührt. Anschliessend wurde auf 4 °C abgekühlt und die trübe gelbe Lösung filtriert, beispielsweise unter Verwendung einer 30 mcm-Glasfritte, wobei man ein klares Filtrat erhielt.

Aus diesem klaren Filtrat wurden die hochmolekularen Bestandteile, deren Molekulargewicht über 5000 liegt, unter Verwendung eines Ultramembranfilters mit einer Ausschlussgrenze eines Molekulargewichts von 5000 filtriert. Bei der Durchführung dieser Filtration mit dem Ultramembranfilter wurde das Filtrationsretentat während des Filtriervorganges dreimal bis zu einem Volumen von 21 eingeengt und dazwischen jeweils mit Wasser auf ein Volumen von 101 zurückverdünnt. Es wurden so schliesslich 241 eines von hochmolekularen Bestandteilen, beispielsweise Proteinen, befreiten Ultrafiltrates erhalten.

Dieses Filtrat wurde zunächst unter Vakuum auf ein Volumen von 21 eingeengt und diese eingeengte Lösung wurde anschliessend lyophilisiert. Man erhielt dabei 79 g eines gelben Pulvers und mit diesem Wirkstoffextrakt wurden die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen klinischen Tests durchgeführt.

Eine Untersuchung einer wässrigen Lösung von 40 mg/ml dieses Wirkstoffextraktes mit der Gelelektrophorese zeigte, dass dieses Produkt frei von Proteinen eines Molekulargewichts von 5000 und höher ist.

Eine Lösung des Wirkstoffextraktes von 40 mg/ml wurde einem Antigentest unterworfen. An Kaninchen, die mit Kälberserum sensibilisiert worden waren, konnte keine antigenetische Aktivität nachgewiesen werden und auch im Antigentest nach Ouchterlony war keine antigenetische Aktivität feststellbar.

Beispiel 2

Herstellung von pharmazeutischen Präparaten unter Verwendung des nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellten Wirkstoffextraktes

Es wurden Lösungen hergestellt, die zur Verabreichung mittels Injektion, beispielsweise intramuskuläre Injektion, oder durch Infusion geeignet sind.

Diese Lösungen enthielten 40 mg/ml des nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellten trockenen Wirkstoffextraktes in bidestilliertem Wasser und sie waren pyrogenfrei und steril.

Für die Versuche zu Vergleichszwecken wurden ferner entsprechende Placebolösungen hergestellt, die statt des Wirkstoffes 0,9 Gew.-% an Natriumchlorid in bidestilliertem Wasser enthielten und diese Placebolösungen waren ebenfalls pyrogenfrei und steril.

Zur oralen Anwendung wurden Dragées hergestellt, die pro Dragée 200 mg des nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellten trockenen Wirkstoffextraktes enthielten.

Zur Testung der Gruppe zu Vergleichszwecken wurden entsprechende oral zu verabreichende Placebodragées herge5

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stellt, und diese waren wirkstofffrei und enthielten statt dessen 200 mg Milchzucker pro Dragée.

Zur topischen Anwendung wurde eine Wirkstoffcrème hergestellt, die pro g der Crème 20 mg des nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 hergestellten trockenen Wirkstoffextraktes enthielt. Dieser Wirkstoff war in einer unparfümier-ten neutralen Crèmegrundlage enthalten.

Zur Testung der Gruppe der Personen zu Vergleichszwecken wurde eine Placebocrème verwendet, die aus der entsprechenden wirkstofffreien neutralen unparfümierten Crèmegrundlage bestand.

Beispiel 3

Testung der Wirksamkeit der Milderung peripherer Durchblutungsstörungen

Der Test wurde mit Hilfe der Lagerungsproben nach Ratschow durchgeführt. Hiezu wurden beide Beine der Versuchsperson mit Hilfe eines Kippbrettes senkrecht erhoben. In dieser Stellung rollte die Testperson die Füsse.

Bei gesunden Testpersonen war eine beschwerdefreie Haltung in dieser Lage während 10 Min. oder länger festzustellen. Bei Personen mit peripheren Durchblutungsstörungen trat innerhalb von kürzerer Zeit eine Aufhellung der Hautfarbe und ein Schmerzempfinden ein. Der Zeitpunkt des Schmerzeintrittes (Schmerzpunkt) wurde gemessen und für die nachfolgenden Tests wurden nur solche Testpersonen ausgewählt, bei denen der Schmerzpunkt nach 5 Min. oder kürzerer Zeit erreicht war.

Nach dieser Probe wurden die Beine der Testpersonen senkrecht gestellt, wobei bei den gesunden Testpersonen innerhalb von 1—2 Sek. eine Rötung eintrat und die Venen nach ca. 5 Sek. wieder gefüllt waren. Bei den getesteten Personen mit peripheren Durchblutungsstörungen waren das Auftreten der Rötung und die Wiederauffüllung der Venen verzögert.

Sowohl die Testgruppe als auch die Gruppe zu Vergleichszwecken bestand aus 25 Personen der Altersklasse 50—71 Jahren, wobei in jeder der beiden Gruppen die Anzahl der männlichen und weiblichen Patienten etwa gleich war.

An die Testgruppe wurde während sechs Tagen einmal täglich 1 ml der Wirkstofflösung durch intramuskuläre Injektion verabreicht und anschliessend einmal täglich ein Wirkstoffdragée während der nachfolgenden 7 — 36 Tage. An die Gruppe zu Vergleichszwecken wurde während 6 Tagen einmal täglich 1 ml der Placebolösung durch intramuskuläre Injektion verabreicht und anschliessend während der Tage 7—36 einmal täglich 1 Placebodragée oral verabreicht.

Die beschriebenen Lagerungstests wurden bei den Personen am Tag 0 (vor der ersten Behandlung), am Tag 7 (nach der letzten intramuskulären Injektion) und am Tag 36 (nach der letzten oralen Verabreichung) vorgenommen.

Am Tage 0 trat bei den 25 Personen der Testgruppe und den 25 Personen der Vergleichsgruppe der Schmerzpunkt nach 40 — 250 Sek. auf.

In der Testgruppe war am sechsten Tag nach der Behandlung eine deutliche Verzögerung des Auftretens des Schmerzpunktes festzustellen, und zwar hatte sich der Durchschnittswert um 90 Sek. verlängert. Im Gegensatz dazu hatte sich bei der Gruppe zu Vergleichszwecken der Durchschnittswert um 7 Sek. verlängert.

Am 36. Tage hatte sich bei der Versuchsgruppe der Schmerzpunkt, verglichen mit dem Tage 0 durchschnittlich um 210 Sek. verlängert, während sich bei der Gruppe zu Vergleichszwecken der Schmerzpunkt im Vergleich zum Tage 0 nur um 10 Sek. verlängert hatte.

In der Versuchsgruppe konnten die getesteten Personen vor der Behandlung etwa 2 Min. lang die Beine schmerzfrei hoch lagern, während diese schmerzfreie Hochlagerungszeit nach der 36 Tage dauernden Behandlung durchschnittlich 6 Min. betrug. Bei der Gruppe zu Vergleichszwecken war vor dem Einsetzen der Behandlung die durchschnittliche schmerzfreie Hochlagerungszeit ebenfalls 2 Min. und nach der Behandlung wiederum ebenfalls 2 Min.

Beispiel 4

Testung der cerebralen Durchblutungsstörungen

Dieser Test wurde mit Hilfe eines Erinnerungstests durchgeführt.

Hiezu wurden auf einem Schachbrett mit dem Zufallszahlengenerator 10 der 64 Quadrate bestimmt. Ebenfalls mit Hilfe des Zufallszahlengenerators wurden in der Reihenfolge Al — H8 den ausgewählten Quadraten Zahlen zwischen 0 und 9 zugeordnet. Diese Zahlen wurden auf quadratisches Papier von der Fläche der Schachquadrate notiert und offen auf das zugeordnete Quadrat gelegt.

Jede der getesteten Personen wurden 15 Sek. Zeit zum Studium der Anordnung gegeben und dann wurden die Zahlen durch Wenden der Papiere verdeckt. Nach weiteren 15 Sekunden notierte jede der Testpersonen die von ihr in Erinnerung behaltene Zahl auf der Rückseite des jeweiligen Papiers. Zur Auswertung wurden diese Zahlen mit der vorgegebenen Anordnung verglichen. Nur richtige Zahlen an der richtigen Position wurden als Punkt gewertet. Von jeder getesteten Person wurde der Test im Abstand von 3 Minuten insgesamt 10 mal durchgeführt, wobei vor jedem Test ein Positionswechsel und Zahlenwechsel vorgenommen wurde.

40 Personen, etwa gleich viel männliche und weibliche, die sämtliche im Alter von 60—75 Jahren waren und über Gedächtnisschwäche oder Konzentrationsschwäche klagten, wurden den Vortests unterworfen, von diesen wurden jedoch dann alle ausgeschieden, die mehr als 50 Punkte, also mehr als 50% des möglichen Maximums, erreicht hatten. Es verblieben dabei 21 Testpersonen, die willkürlich in eine 11 Personen umfassende Versuchsgruppe und eine 10 Personen umfassende Gruppe zu Vergleichszwecken aufgeteilt wurden. An die Versuchsgruppe wurden jeweils während 6 Tagen täglich 1 mal 1 ml der in Beispiel 2 genannten injizierbaren Wirkstofflösung durch intramuskuläre Injektion verabreicht und nachher während der Tage 7 — 36 jeweils 1 Wirkstoffdragée täglich pro Person.

In der Gruppe zu Vergleichszwecken fand während der Tage 1 — 6 täglich die Verabreichung von 1 ml Placebolösung durch intramuskuläre Injektion statt und anschliessend die Verabreichung von täglich einem Placebodragée während der Tage 7—36.

Die beschriebenen Erinnerungstests wurden jeweils am Tage 0 (vor der ersten Behandlung), am Tage 7 (nach der letzten Injektionsbehandlung) und am Tage 36 (nach der letzten oralen Gabe) vorgenommen.

Von sämtlichen 21 eingesetzten Testpersonen erreichte keine am Tage 0, also vor der Behandlung, mehr als 47 Punkte, und die erreichten Punktzahlen lagen im Bereich von 14—47 Punkten. In der Testgruppe war am 7. Tage eine durchschnittliche Verbesserung um 12,7 Punkte festzustellen und am 36. Tage eine durchschnittliche Verbesserung um 18 Punkte.

Im Gegensatz dazu war in der Gruppe zu Vergleichszwecken am 7. Tage nach der Behandlung eine durchschnittliche Verbesserung um 3,4 Punkte festzustellen, während am 36. Tage der Behandlung im Vergleich zum Tage 0 eine durchschnittliche Verschlechterung um 2 Punkte festzustellen war.

Aus den Ergebnissen sieht man, dass durch die intramuskuläre Verabreichung bereits eine deutliche Verbesserung des Gedächtnisses und der Erinnerungsfähigkeit hervorgeru6

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fen werden konnte und dass eine nachfolgende orale Verabreichung noch eine deutliche weitere Verbesserung bewirkte.

Beispiel 5 Testung von Acne vulgaris 20 Patienten der Altersklasse 16—21 Jahre, und zwar 10 weibliche und 10 männliche Patienten, die alle unter starker Gesichtsakne litten, wurden für den Test ausgewählt.

Sämtliche 20 Patienten wurden 30 Tage lang mit der in Beispiel 2 beschriebenen Placebocrème behandelt. Vor dem Beginn der Behandlung und nach dieser Behandlung mit der Placebocrème wurde von einem Dermatologen qualitativ festgestellt, ob die Akne gleichbleibend, verschlechtert, verbessert oder abgeheilt war.

Nach einer Behandlungspause von 60 Tagen wurden die gleichen Patienten wiederum einer 30-tägigen Behandlung unterworfen, jedoch diesmal mit der in Beispiel 2 beschriebenen Wirkstoffcrème.

Bei 12 der getesteten Personen konnte nach der Behandlung mit der Placebocrème kein Rückgang der Akne festgestellt werden, nach der Behandlung mit der Wirkstoffcrème jedoch ein deutlicher Rückgang der Akne bemerkt werden, und bei zwei dieser Personen war nach der Behandlung mit der Wirkstoffcrème die Akne sogar völlig verschwunden.

Drei der getesteten Personen zeigten einen Rückgang der Akne, sowohl nach der Behandlung mit der Placebocrème als auch nach der Behandlung mit der Wirkstoffcrème, wobei bei diesen Patienten in der Behandlungspause ein deutliches Stärkerwerden der Akne festzustellen war.

Bei zwei der behandelten Patienten zeigte sich eine Besserung der Akne nach der Behandlung mit der Placebocrème, eine Verschlechterung der Akne während der Behandlungspause und keine Besserung bei der nachfolgenden Behandlung mit der Wirkstoffcrème.

Zwei der behandelten Patienten sprachen weder auf die Behandlung mit der Placebocrème noch auf die Behandlung mit der Wirkstoffcrème an.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines von hochmolekularen Bestandteilen und unpolaren Bestandteilen freien Extraktes aus fein zerkleinerten Säugetierorganen unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und wasserlöslichem organischen Lösungsmittel als Extraktionsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Säugetierorgane oder Gemische aus unterschiedlichen Säugetierorganen von embryonalen Säugetieren stammen und dass das fein zerkleinerte Organmaterial aufgeschlämmt in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und wassermischbarem Lösungsmittel, das einen pH-Wert von 6 bis 8 und einen Gehalt an wassermischbarem organischen Lösungsmittel von mindestens 70 Vol.-% aufweist unter kräftigem Rühren bei atmosphärischem Druck mindestens zwei Stunden unter Rückfluss gekocht wird, die Aufschlämmung danach auf eine Temperatur von maximal +8 °C gekühlt und die Flüssigkeit von den festen Bestandteilen bei dieser Temperatur abgetrennt wird, anschliessend die wässrig organische Lösung unter Vakuum zur Trockene eingedampft wird, der Rückstand in Wasser aufgenommen und eine halbe Stunde bis zwei Stunden bei einer Temperatur von 75—85 °C gerührt wird, anschliessend die Lösung auf einem Temperatur von maximal + 8 °C gekühlt und von Feststoffen befreit wird, worauf dann aus dem Filtrat die hochmolekularen Materialien mit einem Molekulargewicht von über 5000 durch Filtration durch ein Ultramembranfil-ter entfernt werden.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Extraktion ein Gemisch aus

75 Vol.-% bis 85 Vol.-% an wassermischbarem organischen Lösungsmittel und Wasser verwendet, wobei das wassermischbare organische Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Propanol oder Aceton ist, vorzugsweise eine Mischung aus 80 Vol.-% Äthanol plus 20 Vol.-% Wasser, und dass die Aufschlämmung des zerkleinerten Organmaterials in diesem Lösungsmittelgemisch einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,8 bis 7,1 aufweist.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aufschlämmung des fein zerkleinerten Organmateriales in dem Lösungsmittelgemisch 2,5 bis 3,5 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden unter Rückfluss kocht, anschliessend auf eine Temperatur von +3 bis + 5 °C kühlt und die festen Bestandteile bei dieser Temperatur durch Zen-trifugieren abtrennt.

4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man pro Gewichtsteil des frischen, fein zerkleinerten Embryonalorganmateriales 5 bis 15 Gewichtsteile, vorzugsweise 9 bis 10 Gewichtsteile des Lösungsmittelgemisches einsetzt.

5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die embryonalen Säugetierorgane von Embryonen stammen, die nach Ablauf der Hälfte der üblichen Tragzeit bis % der üblichen Tragzeit der jeweiligen Säugetierart gewonnen wurden, wobei die Säugetiere Wiederkäuer, vorzugsweise Rinder, Schafe oder Ziegen, Nagetiere, vorzugsweise Kaninchen, Pferde oder Schweine sind und dass die verwendeten Embryonalorgane Lungen, Nieren, Lebern und Herzen sind, wobei man vorzugsweise zwei oder mehr unterschiedliche der genannten Organe zur Herstellung des fein zerkleinerten Organmateriales einsetzt.

6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass beim Trocknen der wässrigen organischen Lösung unter Vakuum ein gelbbrauner Trockenrückstand verbleibt, wobei pro 1000 Gewichtsteile des eingesetzten frischen Embryonalorganes 5 bis 12 Gewichtsteile des Trockenrückstandes gewonnen werden, und dass ein Gewichtsteil dieses Trockenrückstandes in 100 —150 Gewichtsteilen Wasser aufgenommen wird, etwa eine Stunde bei einer

Temperatur von 77 bis 83 CC und einem pH-Wert von 6,5 — 7,5 gerührt wird, anschliessend die Lösung auf eine Temperatur von 2 °C bis 6 CC gekühlt wird, durch Filtration von den Feststoffen befreit wird und dann durch ein Ultramembranfilter mit einer Ausschlussgrenze eines Molekulargewichts von 5000 (5000 Dalton) filtriert wird.

7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Filtration mit dem Ultramembranfilter zunächst 2/3 bis 5/ö des Gesamtvolumens filtriert, den verbleibenden Rückstand mit Wasser wieder auf das Ausgangsvolumen verdünnt und wieder % bis 5/6 des verdünnten Materiales durch das Ultramembranfilter filtriert und gegebenenfalls diesen Vorgang noch mehrmals wiederholt.

8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die nach der Filtration durch das Ultramembranfilter gewonnene wässrige Lösung unter Vakuum einengt, vorzugsweise bis zur Erreichung eines Trockenrückstandes lyophilisiert.

9. Pharmazeutisches Präparat zur Bekämpfung von peripheren Durchblutungsstörungen, cerebralen Durchblutungsstörungen, sowie von Acne Vulgaris, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff den nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestellten Extrakt der embryonalen Säugetierorgane enthält.

10. Pharmazeutisches Präparat nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff den nach dem Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 2 bis 8 hergestellten Extrakt enthält und vorzugsweise ausserdem ein pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial oder Verdünnungsmittel.

11. Pharmazeutisches Präparat nach Patentanspruch 9 in Form eines cerebro-vascularen Regenerators.