DE2835292C2

DE2835292C2 - Verfahren zur Herstellung von entfibrinisierten und gefriergetrockneten Placentazellen

Info

Publication number: DE2835292C2
Application number: DE2835292A
Authority: DE
Inventors: Gérard Clarens Fontaine
Original assignee: Laboratoires Cellorgan Sa Chatel St Denis Ch
Current assignee: Laboratoires Cellorgan Sa Chatel St Denis Ch
Priority date: 1977-08-16
Filing date: 1978-08-11
Publication date: 1986-08-07
Also published as: LU80105A1; US4193992A; AT364079B; CH635748A5; IT1097944B; DE2835292A1; FR2400521A1; ATA590578A; IT7826676A0; NL7808492A; FR2400521B1; BE869016A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von entfibrinisierten und gefriergetrockneten Placentazeilen aus der fetomaternen Placenta von Mutterschaften, die nach dem Verfahren erhaltenen Zellen, deren Verwendung zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten sowie pharmazeutische Präparate, welche die genannten Placentazellen enthalten. Solche Zellen bzw. Extrakte werden in medizinischen und/oder kosmetischen Präparaten verwendet

Die Gewinnung von Placentazellenextrakten ist bekannt So beschreibt DE-PS 9 73 249 ein Verfahren, nach dem injizierbare Lösungen aus verkleinerten Frischplacentazellen erhalten werden. FR-PS 21 95 425 ein solches, nach dem mit proteolytischen Enzymen behandelte Tierorgane filtriert und zentrifugiert werden, um einen gereinigten flüssigen Zellextrakt zu erhalten. In einem in BR-PS 31 88 324 beschriebenen Verfahren werden Placentazellen in feinst zerriebenem Zustand dialysiert. Nach den in DE-AS 10 33 374 und DE-OS 16 17 864 beschriebenen Verfahren sollen tiefgefrorene Anteile von Placentazellen zermahlen werden, um die makromolekularen Bestandteile der Zellen zu erhalten. Bei allen diesen Verfahren müssen die Placentazellen und der Zellverband vollständig zerstört werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, in einem verbesserten Verfahren aus noch lebendem, unmittelbar nach dem Schlachten entnommenen Gewebe vollständige entfibrinisierte und gefriergetrocknete Placentazellen zu erhalten.
Die Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Ansprüchen.

Die fetomaterne Placenta eines am Ende des vierten Monats der Trächtigkeit getöteten Mutterschafes wird zerkleinert, daß die Teilchen, um Blutspuren wegzuwaschen, sofort in Ringer-Lösung getaucht werden, daß die Teilchen fein zerteilt werden und in eine 1- bis lOprozentige wäßrige trypsinhaltige Lösung überführt werden, daß in dieser Lösung unter Rühren die Trypsinverdauung durchgeführt wird, daß die Placentazellen abfiltriert werden, daß die Zellen in gekühlter Hank-Lösung, vorzugsweise bei einer Temperatur von 10 bis 40⁰C gewasehen werden, daß die Zellen bei niedriger Temperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur von 10 bis 40⁰C, zentrifugiert werden, daß der erhaltene Rückstand in einer kleinen Menge der überstehenden Flüssigkeit suspendiert wird und daß die erhaltene Suspension bis zum Gewichtskonstanz gefriergetrocknet wird. Die wäßrige trypsinhaltige Lösung kann vorzugsweise etwa 5gew.-°/oig sein.

Die erfindungsgemäßen hergestellten defibrinisierten und gefriergetrockneten Placentazellen haben die folgenden allgemeinen Eigenschaften.

Physikalische Eigenschaften
Organoleptische Merkmale

Farbloses Pulver mit schwach salzigem Geschmack und einer mehr oder weniger stark ausgeprägten Kastanienfarbe.

Löslichkeiten

bei 20⁰C:

löslich in Wasser; 0,14 g erfordern mindestens 5 ml Wasser. Die Auflösung erfolgt langsam und erfordert etwa 1,5 bis 2 Std. langes Rühren. Die erhaltene Lösung ist braun, opaleszent und hat eher das Aussehen einer sehr feinen Suspension. Unlöslich in Methanol, Aceton, Tetrachlorkohlenstoff, Äther und Benzol.
W) Bei 37"C:

Die Löslichkeit in Wasser ist beträchtlich verbessert (30 Minuten unter Rühren): unlöslich in Methanol, Aceton. Tetrachlorkohlenstoff und Äther. Sehr leicht löslich in Benzol.

pH-Wert: Bestimmung des pH-Wertes einer 1 %igen (Gew^Vol.) Lösung von Protein.

Charge

12 3 4 5 6 7

Wert 7,40 7.52 7.60 /.32 7.66 7.60 7.43

Sämtliche pH-Werte liegen unter 7,7.

Optische Aktivität ι υ

Die optische Aktivität konnte in Anbetracht der Opaleszenz der Lösungen nicht gemessen werden, selbst nach Verdünnung and Reinigung mittels Trichloressigsäure.

Elektrischerwiderstand

Bestimmung an 2% igen Lösungen in Wasser.

Charge

1 2 3 4 5 6 ,₀

Ohmcm 253 212 215 277 182 240

Mittelwert: 230 ±35 Ohm-cm (229,8 ±33,7). Die erhaltenen Werte streuen beträchtlich.

Spektroskopische Untersuchung

UV- und sichtbarer Bereich: die mit den verschiedenen Proben ausgeführten Tests zeigten eine starke Absorption im fernen Ultraviolett (200 bis 225 nm) und eine beträchtliche Absorption zwischen 225 und 280 nm. Dies ist eine Folge des hohen Proteingehalts des Mediums: Alle Aminosäuren haben eine starke Absorption bei /2=220 nm; Cystin absorbiert bei 240 nm; Tyrosin absorbiert bei 280 nm und Purin und Pyrimidinbasen von Nukleoprotein absorbieren bei 260 nm.

Infrarotspektrum

Obwohl das Produkt eine komplexe Zusammensetzung aufweist, wurde ein Infrarotspektrum in Kaliumbromid aufgenommen.

Obwohl wegen der komplexen Zusammensetzung des Produktes eine genaue Interpretation der erhaltenen Spektren unmöglich war, zeigten die Spektren der verschiedenen Proben eine signifikante Homogenität.

Chemische Eigenschaften

Der Wassergehalt der Präparate wurde durch Wiegen bis zur Gewichtskonstanz nach dem Trocknen bei

104°C bestimmt (Angaben in Gew.-%):

₄₅

Charge

1 2 3 4 5 6_

Wassergehalt in Gew.-°/o 3,23 4,20 3,85 4,70 3,70 4,02

Mittelwert: 4,0±0,5 (3,95 ±0,49 Gew.-%). Die Ergebnisse sind homogen. Der Gesamtaschegehalt wurde nach der Methode der französischen Pharmakopöe, 9. Ausgabe, Seiten 2—300,

mit Proben von 0,5 g bestimmt (Angaben in Gew.-%):

Charge

1 2 3 4 5 6 ^J5

Aschegehalt in Gew.-% 9,85 9,00 8,69 9,90 9,50 9,25

Mittelwert: 9,4 ±0,5 (9,37 ±0,48). Die Ergebnisse sind homogen. _M)

Stickstoffgehalt

Der Gesamtstickstoffgehalt wurde m.ch der Kjeldahl-Methode bestimmt (Angaben in Gew.-%). Aus dem Gesamtstickstoffgehalt wurde der in der zweiten Reihe angegebene Eiweißgehalt berechnet.

Charge 1	2	3	4	5	6
9,5	10,0	10,3	10,6	10,3	10,3
59.3	62,5	64,3	66,2	62,5	62,5

Stickstoffgehalt (Gew.-%)

Proteingehalt (N χ 6,25)

Mittelwerte: N = 10.2 ±0.4 (10.17 ±0,38)
P = 63 ±2,5 (62,68 ±23)

Die analysierten Proben wiesen einen hohen Eiweißgehalt auf. Die erhaltenen Werte wurden in Gruppen angeordnet und zeigen eine gewisse Homogenität der untersuchten Präparate.

Stickstoffgehalt der Nichteiweißverbindungen:

Die Bestimmung des Stickstoffgehalts der Nichteiweißverbindung erfolgte nach der Kjeldahl-Methode nach Enteiweißung mittels 20%iger Trichloressigsäure (Gew.-%).

Charge

12 3 4 5 6

Gew.-% 3,85 3,52 4,02 3,50 3,78 4,02

Mittelwert: 3,8 + 0,3(3,75 + 0,28)

Diese Stickstofffraktion umfaßt die Peptide, Aminosäuren und andere stickstoffhaltige Verbindungen (Harnstoff. Creatinin usw.). Die erhaltenen Werte liegen verhältnismäßig dicht beieinander und zeigen, daß die untersuchten Proben verhältnismäßig reich an dieser Art von Verbindungen sind.

Elektrophorese:

Die Elektrophorese wurde auf einem Beckman-Apparat ausgeführt. Die Tests führten zufolge des hohen Proteingehalts des Mediums zu stark unterschiedlichen Ergebnissen, die nicht einheitlich interpretiert werden konnten.

Glykogengehalt:

Der Glykogengehalt wurde nach der Methode von Good, Kramer und Somogyi ausgeführt; vgl. »Techniques de laboratoire« von J. Loiseleur, Band 1, Teil 2, M asson 1963, Seite 1363.

Charge

12 3 4 5 6

Glykogengehalt (Gew.-%) 0,02 Spuren Spuren 0,3 Spuren 0,1

Aufgrund des bei der Gefriertrocknung angewandten Verfahrens sind die analysierten Proben praktisch frei vonGlykogen.

Biologische Eigenschaften

Sterilität:

Die Prüfungen wurden nach der französischen Pharmakopöe, 9. Ausgabe, Seiten 2—238—243, ausgeführt. Die sechs Proben waren vom Sterilitätsstandpunkt her normal.

Pyrogene Substanzen:

Die Untersuchungen wurden nach der französischen Pharmakopöe, 9. Ausgabe, Seiten 2 — 235—238 ausgeführt. Die Verabreichung von 0.5 ml einer Lösung von 140 mg/5 ml pro kg Körpergewicht mit einem ml apyrogener, isotonischer Lösung von Natriumchlorid in die Ohrvene von Kaninchen führte innerhalb weniger Minuten zum Tod des Versuchstieres. Die hohe Toxizität des Medikaments bei intravenöser Verabreichung beruhte auf dem Eiweißgehalt des Präparats, der zum Schock führte, der für den Tod verantwortlich war.

b5 Histamingehalt:

Die biologische Bestimmung erfolgte nach der französischen Pharmakopöe, 9. Ausgabe, Seiten 2-244-246.

Keine der sechs Proben zeigte eine kontrahierende Wirkung, selbst bei hoher Konzentration (höchstens 10-^J). Manchmal erfolgte eine verzögerte (1 bis 2 Min.) progressive Erhöhung des Tonus des Präparats. Diese konnte nicht dem Histamin zugeordnet werden, da sie im gleichen Test für dieselbe Probe nicht konstant war und da sie langsam auftrat, d.h. sich von einem Histaminspasmus unterschied, der unmittelbar nach der Injektion des Präparats in das Gefäß auftritt. 5

Die Tonusmodifikation kann dem unterschiedlichen Gehalt an hoch eiweißreichen Verbindungen des Präparats als Folge der unterschiedlichen Zusammensetzung der überstehenden Flüssigkeit bei der Zentrifugierung zugeschrieben werden. Die Vermischung mittels Luftblasen ist von der Bildung von großen Mengen Schaum im oberen Teil des Gefäßes begleitet.

Anomale Toxizitätstests:

gemäß französischer Pharmakopöe, 9. Ausgabe, Seiten 2 — 246.

Versuchsdaten:

2°/oige isotonische Kochsalzlösung; injiziertes Volumen 0,5 ml intiaperitoneal; Versuchstiere: 5 weibliche 15 und 5 männliche Mäuse; sämtliche Tiere mußten überleben und durften 6 Tage nach der Injektion keine Krankheitssymptome zeigen.

Charge Vergleich

2 3 4 5 6 (0.5 ml NaCI) ₂₀

Ergebnis normal normal normal normal normal normal normal

Die 6 Proben sind normal.

Verschiedene Bestimmungen:

Mineralien, Bestimmung der Hauptelemente; sämtliche Angaben sind — soweit nicht anders angegeben — in Promille, d. h. m/g:

Natrium: Flammenspektrophotometrische Bestimmung 30

Charge

12 3 4 5 6

mg/g 36,8 32,2 33,3 40,2 22,8 28,1 35

Mittelwert: 32 ± 6 (32,23 ±6,19) Promille

Kalium: Flammenspektrophotometrische Bestimmung

Charge
1 2

mg/g 3,4 2,8 3,6 4,1 3.2 2,8

45 Mittelwert: 3,3 ± 0,5 Promille

Calcium: Spektrophotometrische Bestimmung (Absorption)

50

Charge

12 3 4 5 6

mg/g 19,1 10,2 7,6 8,4 8,4 10.2

Mittelwert: 11 ±4(10,65±4,27) Promille

Magnesium: Spektrophotometrische Bestimmung (Absorption)

Charge

12 3 4 5 6

mg/g 1,0 1,2 0,9 0.8 0,9 1.2

Mittelwert: 1 ±0,17 Promille

Zink: Spektrophotometrische Bestimmung (Absorption)

Charge
12 3 4 5 6

mg/g 0,12 0,12 0,12 0,10 0,11 0,12
Mittelwert: 0,12 + 0.01 Promille

Chlor: Bestimmung mit dem Technicon-Autoänalyzer
(Mercurimetrie)

Charge
I 2

mg/g 26,7 33,2 28,0 28,7 33,2 25,0
Mittelwert: 31 ±3,5 (30,80±3,41) Promille

Phosphor: Bestimmung mit dem Autoanalyzer Technicon

Charge
1 2

mg/g 4,2 4,6 3,9 4,2 3,9 3,5
Mittelwert: 4,1 +0,4(4,05 + 0,37) Promille

Die Ergebnisse zeigen eine verhältnismäßig gute Homogenität der Proben mit einem durchschnittlich hohen Calciumgehrlt im Vergleich zu anderen Elementen und einem konstanten Zinkgehalt.

Schwermetalle:
Die Bestimmung erfolgte gemäß französischer Pharmakopöe, 8. Ausgabe, Seiten 1569— 1571.

Die 0,2-g-Proben wurden nach Methode 4 untersucht (Ergebnisse in ppm).

Charge

,

ppm 12 8 14 10 7 14

Mittelwert: 11 ±3 (10,8 ±2,9) ppm J

Die erhaltenen Werte liegen für sämtliche Proben unter 15 ppm.

Aminosäuren ^

w

Die Analysen wurden auf einem Technicon-Apparat ausgeführt: Die Trennung der Aminosäuren erfolgte Ji?

durch Chromatographie an Ionenaustauschharzsäulen; die Bestimmung nach der Elution erfolgte kolorimetrisch p

mit Ninhydrin. Die Ergebnisse sind in Mikromol pro Gramm Pulver angegeben. &

Probe (Charge) -

3 4 5 6,

Asparaginsäure 45.3 8,1 38,4 6,5

_bU Threonin 61.2 14,7 53,5 12,7 ·υ,ο ->i,j „

Serin 119.1 26,8 102,3 21,3 18,3 71,8 j.

Glutaminsäure 111.0 24,4 93,7 36,4

Prolin 0 0 44,1 0

Glykokoll 75.0 17,7 65,7 19,0

_h5 Alanin 124,5 43.8 114,7 38,0

Valin 99.1 25,2 88,8 19,8

Cystin 12.1 Spuren 0 1,2

Methionin 30.0 10.0 26.6 8,4

9,2	28,7
10.8	51,3
18,3	71,8
24,3	59,4
0	14,0
11.7	51,0
25.2	112,5
16,5	107,7
Spuren	3,8
3,1	24,3

Ίί (Fortsetzung)

Probe (Charge)
1

Isoleucin 81,1 19.6 69,3 12,0 12,0 59,4

Leucin 148,5 54.7 125,4 38,4 27,3 90.0

Tyrosin 58,5 28,5 53,2 24,7 14,5 39.3

Phenylalanin 74,2 28,0 66,2 21,9 13,7 52,0

Lysin 127,5 39,7 115,2 29,6 18,0 36,3 ίο

Histidin 31,7 8,1 29,0 5,8 4,9 30.5

Tryptophan 20,7 9,1 18,0 8,0 5,1 16.6

Arginin 92,7 35,0 nicht 16,8 26,5 58.0

gezeigt

Citrullin 0 0 0 0 0 0 15

Carnosin 0 0 0 0 0 0

1-Methylhistidin 0 0 0 0 0 0

Summe 1312,2 392.2 1104,1 320,5 241,1 906,6

Sämtliche Aminosäuren kommen in sämtlichen Proben vor, außer Prolin, das in den Proben 3 und 6 nicht vorkommt und Cystin, das in Probe 3 nicht vorkommt und das in Spuren in den Proben 2 und 5 gefunden wurde. Obwohl der Gehalt an den verschiedenen Aminosäuren nicht vernachlässigbar ist (im Mittel 10%), variieren sie in den verschiedenen Proben beträchtlich. Dies liegt sicherlich am Herstellungsverfahren (mehr oder weniger starker Abbau durch Trypsin und nachfolgendes Auswaschen. 25

Vitamine

Thiamin:

Die Bestimmung erfolgte nach der »Official methods of analysis of the Association of Official Agricultural 30 Chemists«, Seite 657. Die Ergebnisse sind in Mikrogramm pro Gramm Substanz angegeben.

Charge

12 3 4 5 6

J5 μg/g 0 Spuren Spuren 0 Spuren 0

Riboflavin:

Die Bestimmung erfolgte gemäß »Official methods of analysis of the Association of Official Agricultural Chemists«, Seite 659. 40

Charge

12 3 4 5 6

Ergebnis 0 Spuren 0 0 0 Spu- 45

ren

Vitamin C:

Die Bestimmung erfolgte gemäß »Official methods of analysis of the Association of Official Agricultural Chemists«, Seite 661. 50

Charge

12 3 4 5 6

Ergebnis 0 Spuren 0 0 Spuren 0 55

Trotz ihres Vorkommens in der frischen Placenta fehlen die Vitamine Bi, B2 und C in den analysierten Proben, was wahrscheinlich auf die Gewinnungsmethode des Medikaments zurückzuführen ist (Trypsinabbau, Waschen etc.), wodurch fast alle nicht eiweißartigen wasserlöslichen Bestandteile eliminiert werden.

Enzyme:

Die Bestimmung der Enzymaktivitäten von Transaminasen, saurer und alkalischer Phosphatase, Aldolase, Creatin und Phosphokinase erfolgte nach »Techniques modernes la laboratoire et exploration fonctionelle«, Band I, Luden Hartmann, und »Biochemical Test Combination — Boehringer«. Es wurde eine 0,35%ige Lösung verwendet. Diese Verdünnung war wegen der Färbung erforderlich. (,5

Transaminasen:

TGO- und TGP-Bestimmung im Ultravioletten: Hartmann, Seiten 458—461.
Aldolase (FDP): Ultraviolettbestimmung: Hartmann, Seiten 465—466.
Kreatinphosphokinase oder CPK: Hartmann, Seiten 462—464.
Saure Phosphatase: Biochemical Test Combination — Boehringer.
Alkalische Phosphatase: Biochemical Test Combination — Boehringer.

	TGO	1	2	3	4	5	6	Mittelwert
IO	TGP
Aldolase	14	12	22	16	22	15	16,8 ±4,2
CPK.	1	1	1	2	2	1	1,3 ±0,5
i5 saure Phosphatase	0,1	0	0	0,2	0,1	0	0,07 ±0,08
0,2	0,1	0,3	0	0,2	0,1	0,15±0,l
7	4	2	2	8	3	4,3 ±2,5

alkalische Phosphatase 25 20 20 25 23 25 23 ±2,4

Die Ergebnisse sind in mU/ml Lösung angegeben.

Die Ergebnisse zeigen auf keinen Fall vernachlässigbare Enzymaktivität, berücksichtigt man die Produktkonzentration in der Lösung. Das Auftreten dieser Aktivität zeigt, daß einige der das Medikament bildenden Proteine ihre normalen biologischen Eigenschaften beibehalten haben.

Hormone

Estradiol:

Die Versuche und Bestimmungsmethoden wurden mittels Dünnschichtchromatographie ausgeführt, wobei als Grundlage das Verfahren von Wiriot und Henry »Techniques modernes des laboratoire et explorations fonctionelle«, Hartmann, Seite 596. diente; es wurden 25 ml 2%ige Lösung verwendet.

Die Dünnschichtchromatographie wurde an Silikagel G im System Benzol-Ethanol ausgeführt. Die Entwicklung erfolgte durch Besprühen mit Schwefelsäure/Ethanol, gefolgt von 10 Minuten Trocknen bei 105° C. Der Rf-Wert für Estradiol ist 0,30±0,03 (Kurt Randeratte, Chromatographie sur couches minces, 2. französische Auflage, Seite 142). In allen Fällen sollte eine Vergleichsprobe (handelsübliches Estradiol) verwendet werden.
In allen Proben konnte das Vorhandensein von Estradiol nachgewiesen werden. Aufgrund der Vergleichsproben wurde festgestellt, daß die Estradiolmenge etwa 50 μg beträgt.

Phenolsteroide und gonadotrope Hormone:

Biologische Bestimmung. Die uterotropische Wirkung dieser Hormongruppe ist bekannt. Sie wurde durch direkte subkutane Verabreichung der Produktlösung untersucht, und zwar nach dem Verfahren von Henry und Wiriot »Techniques modernes de laboratoire et explorations fonctionnelles«, Hartmann, Seite 627. Jede Probe wurde an 10 Mäusen von 10 g Gewicht, die noch nicht pubertiert hatten, getestet. Die Mäuse erhielten 0.5 ml einer ι %igen Lösung 3 Tage lang subkutan injiziert. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Charge Vergleich

12 3 4 5 6

Zahl der positiven 7 8 6 7 9 8 10

Ergebnisse

Gewicht des Uterus 58,54 43,63 38,68 42,50 39,10 50,15 15,77

14,32 20.83 IC, 17 15,65 16,2 16,40 2,15

Der Test war für jede Probe positiv (Verdopplung des Uterusgewichts) und zeigte folglich die gewünschte uterotrope Aktivität.

Mikroskopische Untersuchung der Proben

Verfahren:

Dicke Suspension in physiologischer Lösung; Schmierpräparat auf dünner Platte; nach dem Trocknen Mayk-Grunwald-Färbung.

Ergebnisse

Charge 1:

Sehr wenige Zellelemente zurückbehalten. Anhistische Masse mit zahlreichen granulären oder filamentösen Elementen von einigen μΐη Länge von ergastoplasmischem oder mikrosomischemTyp.

Charge 2:

Auf anhistischer Basis vor eiweißartiger Natur zahllose kornartige Elemente (etwa 0,5 μίτι) und kurze Fäden (2 bis 3 .um), die durch Zerkleinerung des Chromatins des Nukleus entstanden sind. Eine verhältnismäßig große Zah' eiförmiger oder kugelförmiger Nuklei sind von der Schmierpräparatbasis ausgelöst, ihre Chromatinstruktur ist in mehr oder weniger starkem Ausmaß zerstört, jedoch häufig in Form eines dichten Netzwerkes vorhanden. Ein- oder mehrkernige Blutzellen erscheinen an manchen Stellen in gut erhaltenem Zustand, sie stellen etwa 1 % der oben beschriebenen Kernelemente dar.

Charge 3:

Identisch mit Charge 1.

Charge 4:

Die anhistische Basis ist von sehr langen cytoplasmischen Fäden (40 bis 50 μπι) durchzogen, die gut erhalten sind und ein schwaches Netzwerk bilden, in dem der Lysis unterliegende Nuklei vorkommen und unveränderte Blutzellen (15% der Kernelemente).

Charge 5:

Die anhistische Basis hat wenige körnige oder faserartige Bildungen, was eine geringe Kernzerstörung anzeigt, während zahlreiche Nuklei vorhanden sind, von denen 50% vollständig erhalten sind und von einem Cytoplasma umgeben sind, das klar definierte Grenzen zeigt.

Charge 6:

Identisch mit Charge 5.

Zusammengefaßt kann gesagt werden, daß das Medium vom mikroskopischen Standpunkt her verhältnismä-Big inhomogen ist und daß sehr wenige Zellen vollständig erhalten sind. Es hat eine mehr oder weniger ausgeprägte Zellzerstörung stattgefunden (stark bei den Chargen 1,2 und 3 und schwächer in den Chargen 5 und 6). was zweifellos auf den Defibrinierungsprozeß zurückzuführen ist. Eine größere Standardisierung wäre sicherlich wünschenswert. Demzufolge bestehen die analysierten Produkte hauptsächlich aus einem Homogenat von Placentazellen, die besonders reich an Eiweißstoffen sind.

Bericht über die Toxikologie der defibrinierten, gefriergetrockneten Placentazellen

Ratten:

Vergleichsgruppe T bestand aus 20 Tieren.

Versuchsgruppe A (20 Tiere): 3 Wochen lang wurde jeden zweiten Tag Lyophilisat (gefriergetrocknetes Präparat) subkutan in einer Menge von 20 mg/kg verabreicht, d. h. 10 H.T.D.D. (H.T.D.D. == humantherapeutische tägliche Dosis: 2 mg/kg, d. h. 140 mg für einen 70 kg schweren Erwachsenen.

Versuchsgruppe B (20 Tiere): 3 Wochen lang wurde jeden zweiten Tag Lyophilisat subkutan in einer Menge von 100 mg/kg, d. h.50 H.T.D.D. verabreicht.

Insgesamt wurden 60 Tiere für die Versuche eingesetzt.

Kaninchen:

Vergleichsgruppe T 10 Tiere 4;

Versuchsgruppe A 10 Tiere

Versuchsgruppe B 10 Tiere

Die verabreichte Dosis und die Verabreichungsart und Häufigkeit war die gleiche, die für die Ratten angewen- 5c det wurde.

Bemerkungen

Die Verabreichungsart und die HTDD sind die von Laboratoire Cellorgan vorgeschlagenen. Bei der Verabrei- 5; chungshäufigkeit ist zu berücksichtigen, daß für Menschen eine einzige intramuskuläre Verabreichung von mg des trockenen Präparats, gelöst in 5 ml physiologischer Kochsalzlösung, empfohlen wird. Diese Injektion braucht möglicherweise erst nach einigen Wochen oder sogar Monaten wiederhoh zu werden. Die angewandten Mengen entsprechen den von toxikologischem Standpunkt empfohlenen Mittelwerten:

1 mittlere Dosis: Gruppe A: 10 H.T.D.D.

1 starke Dosis: Gruppe B: 50 H.T.D.D.

Beherbergung

Die Kaninchen befinden sich in Einzelkäfigen, während je 5 Ratten in einem Käfig gehalten werden, getrennt nach Gruppen und Geschlechtern. Sie werden regelmäßig in Stoffwechselkäfige übergeführt um den Urin und die Fäkalien zu untersuchen. Schließlich werden sie für jeden Versuch 8 Tage lang akklimatisiert und mit U.A.R. Volinahrung ernährt

Ausgeführte Untersuchungen

ίο Reaktion der Tiere:

Gewichtskontrolle durch Wägen der Tiere zweimal pro Woche; klinische Untersuchungen: Untersuchung des Allgemeinzustandes, der Aktivität und der möglichen Sterblichkeit, Kontrolle des Urins und der Fäkalien; nach Beendigung der Versuche wurden die Tiere getötet, die Kadaver wurden autopsiert

Gewicht der Organe:

Die folgenden Organe wurden entfernt: Nebennierenrinde, Leber, Milz, Niere, Herz, Hoden bzw. Eierstöcke.

Histologische Untersuchungen wurden bei 50% der Tiere ausgeführt Die untersuchten Organe waren: Magen, Krummdarm, Leber, Niere, Milz, Herz, Nebennieren, Schilddrüse, Hoden bzw. Eierstöcke. Das Testverfahren bestand in der Fixierung des Organs in 10%igem Formol, Einschluß und Schneiden in Paraffin und Färbung nach Lillie und Pasternak bei einem pH-Wert von 4.

Blutuntersuchung:

Bei allen Tieren erfolgte eine Zählung der Formbestandteile des Bluts; Blutproben wurden bei den Ratten aus dem Schwanz und bei den Kaninchen aus dem Ohr mittels einer Potain-Pipette entnommen, wobei M arcano-Verdünnungsflüssigkeit verwendet wurde. Auszählung der Formbestandteile des Bluts erfolgte in der Zählkammer nach N. Fiessinger; die Färbung des Ausstrichs erfolgte nach der May-Grunwald-Giemsa-Methode; bei Kaninchen erfolgte Hematocrit(Blutzentrifugierung).

Biochemische Prüfungen wurden bei einem Mittel von 50% der Ratten und fast sämtlichen Kaninchen durchgeführt.

Allgemeine biochemische Bilanz
a) Verschiedene Blutbestandteile

Gesamtcholesterin: Liebermann-Reaktion, Technicon-Autoanalyzer

Harnstoff: Diacetylrnonoxim-Färbereaktion.Technicon-Autoanalyzer.

Blutzucker: Kaliumferricyanidreduktion, Technicon-Autoanalyzer.
Gesamtproteine: Biuret-Färbereaktion, Technicon-Autoanalyzer.

Albumine: Färbereaktion durch quantitative Fixierung des H.A.B.A.,Technicon-Autoanalyzer.

Creatinin: Färbereaktion mit Picrinsäure in einem Sodamedium, Technicon-Autoanalyzer.

Harnsäure: Färberaktion durch Reduktion eines Phosphorwolframkomplexes, Technicon-Autoanalyzer.

Gesamtbilirubtn: Azobilirubinbildung, Technicon-Autoanalyzer.
Plasmachlor (Kaninchen): Mercurimetrische Bestimmung, Technicon-Autoanalyzer.

Natrium und Kalium (Kaninchen): Flammenspektrophotometrische Bestimmung.

b) Leberbilanz

Serumtransaminasen: S.G.O.T., S.G.P.T.; »Techniques modernes de laboratoire et explorations fonctionelles«, Seite 492. Die Ergebnisse sind in kolorimetrischen Einheiten angegeben.

Alkalische Phosphatase: p-Nitrophenylphosphatmethode: »Biochemical Test Combination«, Ergebnisse angegeben in mU/ml.

Leberglykogen: Verfahren von Good, Kramer und Somogyi, »Techniques de laboratoire« von J. Loiseleur, Band 1, Teil 1, Masson 1963, Seite 1363.

c) Harnbilanz

Ständige Untersuchung der Tiere während der Versuche; Prüfung der Hauptabweichungen bei Albumin, w Glucose, Blut- und Ketonkörpern.

Die biochemischen Blutuntersuchungen und die Glykogenbestimmungen wurden am Ende des Versuchs nach Toning der Tiere ausgeführt. Das Blut wurde durch Herzpunktion entnommen.

b5 Schlußfolgerungen

Die analysierten lyophilisierten defibrinierten Placentazellen stellen ein verhältnismäßig homogenes System dar, das hauptsächlich aus einem Homogenat von eiweißreichen (60%), gefriergetrockneten Placentazellen

besteht Die Bestimmung der Hormonfaktoren (Phenolsteroide und gonadotrope Hormone) kann als ein wesentliches Merkmal der Placentanatur des Medikaments betrachtet werden. Schließlich sind die Proben vom bakteriologischen Standpunkt sowie hinsichtlich der Histaminsubstanzen und hinsichtlich der außerordentlichen Toxizitätstests einwandfrei-

Akute toxikologische Untersuchungen mit den gefriergetrockneten, defibrinierten Placentazellen

Es ist allgemein bekannt, daß die akute Toxizität eines Produkts an zwei verschiedenen Tierarten bestimmt werden muß. Im vorliegenden Falle erfolgte die Prüfung an Mäusen und Kaninchen.

Die angegebene Humandosis beträgt 100 bis 120 mg bei einer einzelnen Injektion, d. h. etwa 2 mg/kg Körpergewicht Daher beträgt die H.T.D.D. 2 mg/kg.

Mäuse

Wegen des begrenzten Gewichtes der Maus war es möglich, die akute Toxizität des Produkts durch intramuskuläre Injektion von 2,5 g/kg Körpergewicht zu bestimmen, d. h. 1250 H.T.D.D.

Acht Ampullen, die je 250 mg Zjllorgan Placenta D enthielten, wurden in einen sterilen Behälter entleert, der Inhalt wurde mit physiologischer Lösung bis zu einem Gesamtvolumen von 40 ml aufgefüllt, so daß 1 ml der Lösung 50 mg Placenta D enthält

25 Mäuse wurden auf 5 Gruppen verteilt, wobei jede Gruppe gleiches Geschlecht und gleiches Alter hatte. Durchschnittsgewicht pro Gruppe wurde vor der Injektion ermittelt und am 10. und 20. Tag nach der Injektion kontrolliert 10 Vergleichstiere erhielten keine Injektion und wurden in 2 Gruppen zu je 5 Mäusen aufgeteilt und zum gleichen Zeitpunkt gewägt wie die Versuchstiere. Die Versuchstiere wurden individuell gewägt, sie erhielten eine einzige intramuskuläre Injektion von 2,5 g Placenta D pro kg Körpergewicht. Beispielsweise erhielt eine Maus, die 32 g wog, 1,6 ml (0,8 ml in jeden Schenkel), d. h. 80 mg Placenta D, was 2,5 g/kg entspricht.

Während der Versuchsdauer erfolgt kein Todesfall weder bei den behandelten Mäusen noch bei den Vergleichstieren. Zwei der behandelten Mäuse starben zufällig nach dem für das Ende des Versuchs festgelegten Termin, d. h. mehr als 20 Tage nach Injektionen.

Ergebnisse: Durchschnittsgewicht der Mäuse

Das Durchschnittsgewicht der Versuchstiere erhöhte sich innerhalb von 10 Tagen nach der Injektion um 4,2% und fiel bis zum 20. Tag auf das ursprüngliche Gewicht. Im Gegensatz dazu blieb das Durchschnittsgewicht der Vergleichstiere praktisch konstant.

Kaninchen

Wegen des größeren Gewichtes der Kaninchen war es nicht möglich, solche hohen Dosen wie bei den Mäusen anzuwenden. Die Dosis wurde auf 60 H.T.D.D. reduziert, d. h. auf 120 mg/kg Körpergewicht. Ein Gesamtgewicht von 4 g Placenta D wurde in einen sterilen Behälter gegeben und mit physiologischer Lösung (Ringer-Lösung) zu einer Gesamtmenge von 40 ml aufgefüllt; 1 ml enthält demgemäß 100 mg Placenta D.

Es wurden 12 erwachsene Kaninchen verwendet. 3 Kontrolltiere erhielten keine Injektion. Die 9 Versuchskaninchen erhielten in jedem Fall 120 mg/kg Placenta D intramuskulär injiziert. Sämtliche Kaninchen wurden nüchtern vor der Injektion gewägt und dann wurden am 7., 14. und 21. Tag nach der Injektion Kontrollwägungen durchgeführt.

	Vor der	10. Tag	20. Tag	32
	Injektion	nach der Injektion	28,4
Charge 1	32	33,4	29,4
Charge 2	30	30,6	32
Charge 3	28,5	29,8	33
Charge 4	30	32,8	30,2
Charge 5	32	33,8	31,5
Mittelwert	30,5	32,1	32
Vergleichsgruppe	29	30
Vergleichsgruppe	29,5	30,5

	28	35 292	14. Tag	2700	21.Tag
Ergebnisse			nach der Injektion	2300
Kaninchen	Vorder Injektion	7. Tag	2450	2450	2900
			2200	2300	2550
1	2400		2200	2600	2900
2	2200	2350	2600	2550
3	2000	2450	2100	2750
4	2200	2550	3Ί00	2800
5	2400	2000	3350	2300
6	2400	3200	2611	2950
7	1800	3300	2600	3570
8	3000	2522	2600	2808
9	3000	2450	2560	2700
Mittelwert	2377	2450	2570	2700
Vgl. Nr. 1	2400	2420		2650
Vgl. Nr. 2	2300	2423		2670
Vgl. Nr. 3	2300
Mittelwert	2333

Die Kaninchen zeigten an der Injektionsstelle keine anomale Reaktion. Das Durchschnittsgewicht der Kaninchen erhöhte sich regelmäßig sowohl bei den Versuchskaninchen als auch bei den Vergleichskaninchen. Ein Kaninchen, Nr. 8, zeigte einen geringen Gewichtsverlust als Folge eines Coccidiosis-Anfalls.

Ergebnisse:

Die Versuchsergebnisse an Mäusen und Ratten ergaben keine Toxizität des Produktes unter Versuchsbedingungen.

Untersuchungen auf teratogene Wirkungen

Weiße Mäuse, auf vier Gruppen aufgeteilt, wurden für die Versuche verwendet. Sie stammten aus gleichzeitig erfolgten Würfen, so daß sie ungefähr das gleiche Gewicht hatten.

Erste Gruppe: Vergleich

Zweite Gruppe: Injektion von 1 g/kg Körpergewicht 8 Tage nach der Trächtigkeit

Dritte Gruppe: Injektion von 1 g/kg 11 Tage nach der Trächtigkeit

Vierte Gruppe: Injektion von 1 g/kg 14 Tage nach der Trächtigkeit

Bei den Mäusen trat an der Injektionsstelle keine Entzündung auf, was im allgemeinen einen vorübergehenden Streß verursacht, der jedoch das Leben der Tiere nicht gefährdet.

Die Trächtigkeitszeit war für alle Tiere, sowohl injizierte Tiere als auch Vergleichstiere, gleich lang, d. h. etwa 20' Λ Tage. Die Vergleichsmäuse warfen insgesamt 84 Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 1,67 g.

Die injizierten Mäuse warfen:
45

Zweite Gruppe (8 Tage): 25 Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 1,57 g
Dritte Gruppe (11 Tage): 35 Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 1,60 g
Vierte Gruppe (14 Tage): 34 Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 1,54 g

Bei den behandelten Mäusen erfolgte keine Fehlgeburt. Eine statistische Studie ergab, daß die Gewichtsunterschiede bei der Geburt nicht signifikant sind. Gewichtszunahme war regulär. Die behandelten Mäuse zeigten keine Unregelmäßigkeiten, und ihre Nachkommenschaft wurde 6 Wochen lang beobachtet. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Erste Gruppe (Vergleich): Durchschnittsgewicht 27,56 g

Zweite Gruppe (8 Tage): Durchschnittsgewicht 27,81 g

Dritte Gruppe (11 Tage): Durchschnittsgewicht 28,32 g

Vierte Gruppe (14 Tage): Durchschnittsgewicht 33,32 g

Die Gewichtsunterschiede sind nicht signifikant.

Wirkung der Placentazellen bei lokaler Anwendung auf stumpfe Hautverletzungen

Die Placentazellen sind in einem Medikament in Gelform ^für äußerliche Anwendung enthalten. Die Anwen-

tö dung erfolgte durch tägliches Aufbringen unter einem Verband, nachdem die Wunde mit physiologischem Serum gewaschen war. Die meisten der Patienten waren in fortgeschrittenem Alter. Es erwies sich in manchen

Fällen als erforderlich, zusätzlich zur lokalen Behandlung mit dem Gel eine Allgemeinbehandlung durchzuführen entweder mit antiinfektiösen Mitteln oder speziell zur Behandlung eines allgemeinen Mangelzustands. Diese Hilfsmittel sind bei jeder Untersuchung angegeben.

Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in den folgenden beiden Tabellen angegeben.

Zusammenfassender Bericht

24 der 26 Untersuchungen konnten verwendet werden. In 2 Fällen mußte die Behandlung nach 3 Tagen abgebrochen werden, da die Patienten über »schmerzhaftes Prickeln« klagten, was aber auf eine subjektive Empfindung zurückzuführen ist, da mindestens in einem Fall auch bei einem anderen Mittel über die gleiche Erscheinung beklagt wurde. In allen anderen Fällen war die Verträglichkeit ausgezeichnet. Die Ergebnisse sind — aufgeteilt nach dem Alter der Patienten — in der folgenden Tabelle angegeben.

Alter der Patienten in Jahren

über 80 70-80 60-70 50-60 unter 50

2	1	2	1
1	5	1	1
2
1

Spontane variköse Geschwüre 1

nach Trauma nach Excision eines malignen Tumors

Druckgeschwür (ulcus ex decubitu) 4 1

Verbrennungen 1 1

Ergebnisse

Die örtliche und allgemeine Verträglichkeit war bei 24 von 26 Patienten perfekt. Die Wirksamkeit des Gels war in 17 Fällen ausgezeichnet und in 7 Fällen durchschnittlich. Es war bei keinem Patienten, der eine bestimmte Zeit behandelt worden war, völlig wirkungslos. Bei längerem Gebrauch in Spitälern und im Vergleich mit früheren Untersuchungen wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Gel ausgezeichnete Ergebnisse bei der örtlichen Behandlung von erschlafften Wunden erzielt.

Spontane, variköse Geschwüre: Bei 5 von 7 Patienten ausgezeichnete Ergebnisse, bei zweien mittlere Ergeb- 3c nisse. Traumatische variköse Geschwüre: Bei 6 von 8 Patienten ausgezeichnete Ergebnisse, bei zweien mittlere Ergebnisse. Geschwüre nach Excision von malignen Tumoren: Bei einem von 2 Patienten ein ausgezeichnetes Ergebnis, ein durchschnittliches Ergebnis. Druckgeschwüre: Bei vier von fünf Untersuchungen ausgezeichnete Ergebnisse, bei einem mittleres Ergebnis. Verbrennungen: Bei einem von zwei Untersuchungen ausgezeichnetes Ergebnis, ein mittleres Ergebnis.

Im folgenden wird an Hand eines Beispiels eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung näher erläutert.

Beispiel
Herstellung von defibrinierten, gefriergetrockneten Placentazellen 4C

Die Zellen wurden aus der fetomaternen Placenta von Mutterschafen hergestellt. Die Herde von Mutterschafen wurde vor 15 Jahren für diesen speziellen Zweck zusammengestellt. Die Tiere stammen aus der braunschwarzen Jura-Zucht und wurden ohne Neuzugänge von außen weitergezüchtet. Die Herde wird auf einer Farm bei Treyvaux (Fribourg, Schweiz) gehalten und steht unter ständiger veterinärärztlicher Kontrolle. Zweimal jährlich, im Frühling und im Herbst, wird die Herde innerlich und äußerlich gegen Parasiten behandelt.

Die Mutterschafe zur Gewinnung der Präparate wurden gegen das Ende des vierten Monats der Trächtigkeit abgesondert. Kurz vor dem Schlachten wurde eine Blutprobe für die Laboratoriumsuntersuchung entnommen. Die Untersuchungen wurden vom Veterinaria, Zürich, ausgeführt. Außerdem erfolgten nach dem Schlachten Cotyledon-Ausstriche, um das Fehlen von Myagawanella sicherzustellen. se

Unmittelbar nach dem Schlachten wurde der Uterus mit allen erforderlichen aseptischen Vorsichtsmaßnahmen in einem verschlossenen, sterilen Behälter ins Laboratorium überführt. Dort wurde der Uterus geöffnet, der Fötus wurde entfernt und die fetomaterne Placenta (400 g) wurde zerkleinert und unmittelbar danach in Ringer-Lösung untergetaucht. Nach mehrmaligem Waschen zur Entfernung von Blutspuren wurden die Stücke mit einer Schere fein zerteilt und in eine 5°/oige wäßrige trypsinhaltige Lösung überführt. Der Trypsinabbau erfolgte 2 Stunden lang bei 38° C unter ständigem Rühren.

Die abgetrennten Placentazellen wurden abfiltriert und dreimal mit gekühlter Hanks-Lösung (1) gewaschen. Das Zentrifugieren erfolgte mit 1000 U/Min, in einer Kühlzentrifuge bei 38°C. Der Zellrückstand wurde gewägt, in einer möglichst kleinen Menge überstehender Flüssigkeit (2) suspendiert, um leichtere Gefriertrocknung zu ermöglichen. Die Gefriertrocknung erfolgte bis zur Gewichtskonstanz (3 g Zellen). Das so erhaltene Pulver oc stellte das Grundprodukt für das Gel dar, das in Ampullen abgefüllt wurde, die unter Stickstoff oder im Vakuum zugeschmolzen wurden und bei -t-4°C so lange gelagert wurden, wie es für die bakteriologischen Sterilitätskontrollen und die biochemischen Kontrollen erforderlich war.

(1) Hanks Medium t>5

1) Mutterlösung.

Folgende Lösungen wurden getrennt hergestellt:

Lösung A:

Natriumchlorid 320 g

Kaliumchlorid 16 g

Magnesiumsulfat (· 7 HiO) 8 g

Calciumchlorid (CaCb) 5,6 g

Die Salze werden nacheinander in bidestilliertem Wasser gelöst, dann wird die Lösung mit bidestilliertem Wasser auf 2 Liter aufgefüllt. Filtration durch ein L.3-Filter.

Lösung B:

Dinatriumhydrogenphosphat	6g
(12H₂O)	2,4 g (2 H₂O :2,4 g)
Kaliumdihydrogenphosphat	40 g
Glucose

Nach dem Lösen in einer kleinen Menge bidestilliertem Wasser wurde die Lösung mit bidestilliertem Wasser auf 600 ml aufgefüllt. Es wurden 400 ml einer O,l°/oigen Phenolrotlösung zugegeben, die Lösung :o wurde über ein L.3-Filter filtriert.

Getrennt voneinander wurden je 100 ml von beiden Lösungen in 250 ml Rundkolben mit Gummistopfen in den Kühlschrank gestellt.

(2) Überlebensmedium

In einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben werden folgende Substanzen eingewägt:

Ascorbinsäure	100 mg
Cystein	20 mg
Glutamin	300 mg
Caseinhydrolysat	ig

Stufenweise gelöst in etwa 1000 ml bidestilliertem Wasser in einem kalibrierten 2000-ml-Kolben.
Es werden 100 ml Hank-Lösung A (weiß) zugegeben, 100 ml Hanks Lösung B (rot), 20 ml Biotin, 20 ml J5 Vitamin-B-Lösung. 2 ml Folsäure. Es wird mit bidestilliertem Wasser auf 2000 ml aufgefüllt.

Hanks Medium (1) wird durch Kombination von Lösung A mit Lösung B hergestellt. Demzufolge hat diese ausgeglichene Salzlösung die folgende Zusammensetzung (Gramm pro Liter):

NaCl	H₂O	8,00
KCI	12H₂O	0.40
CaCl₂		0,14
MgSO₄ · 7		0,20
NaHPO₄ ·		0,12
KH₂PO₄	0,16
NaHCO₃	0,35
Glucose	1,00

Ringer-Lösung hat die folgende Zusammensetzung:

so Natriumchlorid 8,6 g

Kaliumchlorid 0,3 g

Calciumchlorid 0,33 g

Wasser quantum satis ad 1000 ml Lösung.

ft

3 14 £

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von entfibrinisierten und gefriergetrockneten Placentazellen, dadurch gekennzeichnet, daß die fetomaterne Placenta eines am Ende des vierten Monats der Trächtigkeit getöteten Mutterschafes zerkleinert wird, daß die Teilchen, um Blutspuren wegzuwaschen, sofort in Ringer-Lösung getaucht werden, daß die Teilchen fein zerkleinert werden und in eine 1- bis lOprozentige wäßrige trypsinhaltige Lösung überführt werden, daß in dieser Lösung unter Rühren die Trypsin verdauung durchgeführt wird, daß die Placentazellen abfiltriert werden, daß die Zellen in gekühlter Hank-Lösung gewaschen werden, daß die Zellen bei niedriger Temperatur zentrifugiert werden, daß der erhaltene Rückstand in einer kleinen Menge der überstehenden Flüssigkeit suspendiert wird und daß die erhaltene Suspension bis zur Gewichtskonstanz gefriergetrocknet wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige trypsinhaltige Lösung etwa 5gew.-°/oig ist.