DE3306944C2

DE3306944C2 -

Info

Publication number: DE3306944C2
Application number: DE3306944A
Authority: DE
Inventors: Hisashi Mihara; Hiroyuki Miyazaki Jp Sumi
Original assignee: Individual
Current assignee: MIHARA, HISASHI, MIYAZAKI, JP
Priority date: 1982-02-27
Filing date: 1983-02-28
Publication date: 1989-04-13
Also published as: JPS645576B2; IT1197586B; FR2522266A1; GB2116565B; DE3306944A1; GB2116565A; IT8347795A0; CA1198672A; FR2522266B1; JPS58148824A; GB8305359D0

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Extrakts, der aus Regenwürmern extrahiert wird, als fibrinolytisches Mittel.

In den letzten Jahren richtet sich das medizinische und pharmazeutische Interesse aus geriatrischer Sicht auf verschiedene auf der Blutkoagulation beruhende Erkrankungen, die bei vielen Erwachsenen im Blütealter und älteren Personen auftreten. Einige dieser gut bekannten Krankheiten sind z. B. der Myocardinfarkt, die Cerebralthrombose und das Syndrom der multiplen intravasculären Koagulation; zur Behandlung dieser Krankheiten werden bisher Urokinase menschlichen Ursprungs und Streptokinase verwendet.

Diese Medikamente sind jedoch in verschiedener Hinsicht nicht ganz zufriedenstellend. So wird z. B. Urokinase menschlichen Ursprungs aus Humanurin als Ausgangsmaterial hergestellt, so daß die Versorgung damit durch die Verfügbarkeit dieses Ausgangsmaterials begrenzt ist. Streptokinase ist wegen der Antigenwirkung ungünstig. Außerdem müssen beide Medikamente durch Instillation verabreicht werden, was für den unter Behandlung stehenden Patienten unweigerlich sehr schmerzhaft ist.

Es ist daher seit langem erwünscht, ein Arzneimittel bereitzustellen, das zur Behandlung der erwähnten Erkrankungen ohne die Probleme der herkömmlichen Medikamente verwendet werden kann, das hinsichtlich der Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials keinen Einschränkungen unterliegt und dem Patienten nicht durch Instillation verabreicht werden muß, sondern auf andere Art, vorzugsweise oral, und ohne dem Patienten Schmerzen zu verursachen, verabreicht werden kann.

Regenwürmer der Familie Lumbricidae werden bekanntermaßen seit Menschengedenken in östlichen Ländern als eine Art volkstümlicher Medizin für zahlreiche Indikationen verwendet. In der vorveröffentlichten japanischen Publikation "Unsere chinesischen Arzneimittel", Serie 8, Kapitel "Regenwürmer", Bericht über chinesische Drogen von Kakeslu Tamono, ist die Extraktion von Regenwurmgewebe mit Wasser bzw. Alkohol sowie die Verwendung der Extrakte als Antipyretika, Dinretika, Antirheumatika, Anti-Jussiva sowie Antihypertensiva beschrieben. Jedoch findet sich in der Literatur nirgends ein Hinweis auf die Möglichkeit, daß die Gewebe von Regenwürmern auch einen fibrinolytischen Wirkstoff enthalten könnten, der in der Lage ist, die fibrinolytische Aktivität von menschlichem Blut zu erhöhen, insbesondere bei oraler Verabreichung. Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß das mit einem wäßrigen Extraktionsmittel aus Regenwürmern extrahierte Material eine derartige fibrinolytische Wirksamkeit aufweist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Wirkstoff anzugeben, der sich zur Verwendung als fibrinolytisch aktives Mittel zur Behandlung von Krankheiten, die auf der Blutkoagulation beruhen, eignet, keinen Einschränkungen durch die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials unterliegt und nicht durch Instillation verabreicht werden muß.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Die Erfindung beruht auf der Verwendung eines durch Extraktion von Geweben von Regenwürmern der Familie Lumbricidae mit Wasser oder einem Gemisch von Wasser mit einem polaren organischen Lösungsmittel als Extraktionsmittel erhaltenen und ggfs. nach üblichen Fraktionierungsverfahren gereinigten konzentrierten oder entwässerten Extrakts als fibrinolytisches Mittel.

Der Erfindung liegen ausgedehnte Untersuchungen an zahlreichen natürlichen Quellen für den gewünschten Wirkstoff zugrunde, bei denen festgestellt wurde, daß Gewebe von Regenwürmern eine solche Substanz in günstiger Menge enthalten.

Der erfindungsgemäße als Fibrinolytikum verwendete Wirkstoff ist durch übliche Extraktion von Geweben von Regenwürmern der Familie Lumbricidae mit einem wäßrigen Extraktionsmittel zu einer die Wirkstoffe enthaltenden Extraktlösung und Konzentrieren oder Entwässern dieser Extraktlösung und gegebenenfalls Reinigung durch Fraktionierung erhältlich.

Das Verfahren zur Herstellung dieses fibrinolytisch wirksamen Mittels beruht darauf, daß man

a) die Gewebe von Regenwürmern der Familie Lumbricidae mit einem wäßrigen Extraktionsmittel zu einer wäßrigen, die Wirkstoffe enthaltenen Extraktlösung extrahiert und
b) die wäßrige Extraktlösung konzentriert oder entwässert

Dabei werden die fein gemahlenen Gewebe von Regenwürmern im Extraktionsmittel dispergiert; die den Wirkstoff enthaltende Extraktlösung wird dann von unlöslichem Material abgetrennt, und der in der Extraktlösung enthaltene Wirkstoff wird konzentriert oder entwässert.

Das so erhaltene Konzentrat oder entwässerte Material ist, obwohl es noch im Rohzustand ist, bereits als solches wirksam. Vorzugsweise wird jedoch dieses Rohprodukt in geeigneter Weise weiter gereinigt, z. B. durch Adsorption, fraktionierte Fällung mit einem polaren organischen Lösungsmittel, Aussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie und/oder hydrophobe Chromatographie.

Die erfindungsgemäße Verwendung des Extraktes aus Regenwürmern wird im folgenden anhand der Zeichnung erläutert; es zeigt

Fig. 1: Die Bedingungen für die Abtrennung des fibrinolytisch aktiven Wirkstoffs durch isoelektrische Fokussierung,

Fig. 2: den zeitlichen Verlauf der fibrinolytischen Aktivität des peripheren Bluts von drei Patienten mit Hochdruck,

Fig. 3: die fibrinolytische Aktivität und die optische Dichte von Fraktionen, die durch säulenchromatographische Fraktionierung des Regenwurm-Extraktes in Beispiel 14 erhalten wurden, und

Fig. 4a und 4b: die Lösezeit des Euglobulins und den zeitlichen Verlauf (siehe Beispiel 16) der fibrinolytischen Aktivität von peripherem Blut von Patienten, denen oral die in Beispiel 14 erhaltenen fibrinolytisch aktiven Mittel verabreicht wurden.

Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung des fibrinolytisch wirksamen Mittels aus Regenwürmern eingehender beschrieben.

Das Ausgangsmaterial wird aus den Geweben von Regenwürmern gewonnen. Frische lebende Regenwürmer und Regenwürmer, denen die Eingeweide entfernt wurden, sowie die Eingeweide selbst sind ebenfalls als Ausgangsmaterial geeignet. Die zoologische Art der Regenwürmer unterliegt innerhalb der Familie der Lumbricidae keinen einschränkenden Bedingungen; Regenwürmer jeder Art sind im wesentlichen gleich gut geeignet, z. B. Lumbricus rubellus, Lumbricus terrestris oder Eisenia foetida. Die Regenwürmerkörper werden fein vermahlen und als Homogenisat verwendet. Zweckmäßigerweise werden die Gewebe von Regenwürmern zuvor durch Erhitzen, unter vermindertem Druck oder durch Gefriertrocknen getrocknet und zu einem feinen Pulver pulverisiert, das dann als solches oder nach dem Entfetten verwendet werden kann. Als Ausgangsmaterial am meisten bevorzugt sind gefriergetrocknete Pulver oder frische Regenwürmer-Gewebe mit oder ohne Entfetten.

Das wäßrige Extraktionsmittel, mit dem die fein gemahlenen Gewebe von Regenwürmern extrahiert werden, sollte einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 10 und vorzugsweise von 6 bis 8 haben. Das für diesen Zweck geeignete wäßrige Extraktionsmittel ist nicht auf reines Wasser begrenzt, auch physiologische Natriumchloridlösung, Pufferlösungen und die wie weiter unten beschriebenen Salzlösungen, die außerdem eine geringe Menge eines mit Wasser mischbaren polaren organischen Lösungsmittels, wie Methylalkohol, Ethylalkohol, Propylalkohol, Aceton, Diethylether und/oder Dioxan, enthalten, sind geeig net. Geeignete wäßrige Extraktionsmittel sind physiologische Salzlösungen und Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 5 bis 10 und insbesonders von 6 bis 8. Phosphat-, Acetat-, Borat-, Citrat- und Tris-Salzsäure-Pufferlösungen sind ebenfalls geeignet. Die oben erwähnte Salzlösung ist eine verdünnte wäßrige Lösung, die durch Vermischen einer wasserlöslichen organischen oder anorganischen Säure, wie Salzsäure, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Milch-, Citronen- oder Bernsteinsäure, und einer alkalischen Verbindung, wie einem Hydroxid oder Carbonat eines Alkalimetalls oder Ammoniak, auf einen pH-Wert von 5 bis 10 und insbesonders 6 bis 8, hergestellt wird. Das geeignete Massenverhältnis von wäßrigem Extraktionsmittel zu Ausgangsmaterial liegt im Bereich von 1 : 1 bis 100 : 1 und insbesondere von 5 : 1 bis 30 : 1, bezogen auf die Trockenmasse des Ausgangsmaterials. Die Extraktion wird bei einer Temperatur nicht über 60°C und insbesonders im Bereich von 5 bis 40°C während einer genügend langen Zeit von bis zu 500 Tagen und vorzugsweise von 30 min bis etwa 30 Tagen durchgeführt.

Die Extraktion der fein gemahlenen Regenwurm-Gewebe mit dem wäßrigen Extraktionsmittel wird durch Bewegen oder Schütteln des aufgeschlämmten Gemisches oder durch Durchleiten des wäßrigen Extraktionsmittels durch ein Bett des gepulverten Ausgangsmaterials durchgeführt. Insbesondere werden die Regenwurm-Gewebe mit einem Homogenisator, Mischer, Ultraschall-Desintegrator, Druckhomogenisator oder einer Mahlvorrichtung zu einem Homogenisat homogenisiert, z. B. einer wäßrigen Suspension der Zellbestandteile, um die Zellen der Regenwurm-Gewebe zu zerstören, bevor das schlammartige wäßrige Gemisch zur Extraktion inkubiert wird.

Nach beendeter Extraktion der Wirkstoffe aus den Regenwurm- Geweben wird das aufgeschlämmte wäßrige Gemisch filtriert; das klare Filtrat, das heißt die Extraktlösung, wird ggfs. mit den Waschwässern des Rückstandes der Filtration vereinigt und eine gewisse Zeit bei einer geeigneten Temperatur stehengelassen und dann in an sich bekannter Weise, z. B. durch Verdampfen unter Erhitzen oder unter vermindertem Druck und/oder Ultrafiltration oder Entwässern durch Verdampfung des wäßrigen Lösungsmittels unter vermindertem Druck oder Gefriertrocknen, zu einem festen Material aufkonzentriert. Insbesondere wird dem wäßrigen aufgeschlämmten Gemisch der Regenwurm-Gewebe bei der Inkubation oder der wäßrigen Extraktlösung beim Konzentrieren oder Entwässern eine geringe Menge eines antiseptischen oder konservierenden Mittels zugesetzt.

Die Zugabe des oben erwähnten polaren organischen Lösungsmittels zum wäßrigen Extraktionsmittel verstärkt und beschleunigt nicht nur die Extraktion der Wirkstoffe, sondern verhindert auch die Denaturierung. Die Konzentration des organischen Lösungsmittels im wäßrigen Extraktionsmittel sollte je nach Art des Lösungsmittels und anderen Parametern festgelegt werden, obwohl die Konzentration des organischen Lösungsmittels im wäßrigen Extraktionsmittel 50 Vol-% nicht übersteigen sollte.

Nach der Konzentrierung oder Entwässerung enthält die erhaltene Extraktlösung die gewünschten fibrinolytisch aktiven Bestandteile im Rohzustand, so daß insbesonders eine Reinigung folgen sollte. Die Reinigung oder Fraktionierung der Wirkstoffe erfolgt mit der konzentrierten wäßrigen Extraktlösung als solcher oder mit dem entwässerten Material, das in einer geringen Menge Wasser gelöst wird. Geeignet sind allgemein die bekannten Methoden zur Reinigung von hochpolymeren Substanzen, z. B. die im folgenden näher beschriebenen.

Zur Reinigung oder Fraktionierung der Roh-Wirkstoffe aus einer wäßrigen Lösung sind die Verwendung eines Adsorbens oder eines polaren organischen Lösungsmittels, das Aussalzen, die Ultrafiltration, die Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie und/oder hydrophobe Chromatographie geeignet. Jedes dieser Verfahren kann in einigen Fällen ausreichen, im allgemeinen werden jedoch zwei oder mehrere dieser Verfahren in Kombination in zweckmäßiger Reihenfolge verwendet, um die unerwünschten Verunreinigungen zu entfernen.

Als Adsorbentien geeignet sind z. B. Aktivkohle, saurer Ton, aktivierter Ton und Adsorbentien auf Kunstharzbasis, z. B. Ionenaustauscherharze, wie Amberlite XAD. Als polares organisches Lösungsmittel für die fraktionierte Fällung der Wirkstoffe kann man Methylalkohol, Ethylalkohol, Propylalkohol, Aceton, Diethylether und/oder Dioxan verwenden, wobei Ethylalkohol, Aceton und Propylalkohol bevorzugt sind.

Als Salze für das Aussalzen geeignet sind z. B. Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und/oder Natriumcitrat, wobei Ammoniumsulfat bevorzugt ist.

Für die Ionenaustauschchromatographie sind Ionenaustauscher geeignet, die sich von hydrophilen Polysacchariden, wie Cellulose, Dextran oder Agarose, ableiten, wobei Diethylaminoethylcellulose (DEAE-Cellulose), Triethylaminoethylcellulose (TEAE-Cellulose), Aminoethylcellulose (AE-Cellulose), Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), Phosphorcellulose (P-Cellulose), Phosphomethylcellulose (PPM-Cellulose) und Diethylaminoethylcellulofine (DEAE-Cellulofine) bevorzugt sind.

Die Ionenaustauschchromatographie kann auch mit herkömmlichen Ionenaustauscherharzen vorgenommen werden, z. B. mit schwach sauren Kationenaustauscherharzen, wie beispielsweise Amberlite IRC-50, Amberlite IRC-75, Amberlite IRC-84, Dowex CCR-2 u. dgl., sowie schwach basischen Anionenaustauscherharzen, wie Amberlite IR-4B, Amberlite IR-45, Amberlite IRA-400, Dowex 3 u. dgl.

Die Gelfiltration kann unter Verwendung von vernetzten Polysacchariden, wie z. B. Sephadex, Sepharose, Biogel, Toyopearl Ultragel, Cellulofine u. dgl., durchgeführt werden.

Als stationäre Phase zur Affinitätschromatographie eignen sich verschiedene Adsorbentien, wie Sepharose und Toyopearl, als Träger.

Die hydrophobe Chromatographie kann mit einem Adsorptionsmittel, wie z. B. einem hydrophilen Polysaccharid, durchgeführt werden, z. B. mit Agarose und Cellulose als Träger, in den mit einer aliphatischen, alicyclischen oder aromatischen Verbindung mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer Aminogruppe im Molekül hydrophobe Gruppen eingeführt wurden.

Die folgenden Schemata 1 bis 16 erläutern verschiedene Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Extrakts in Form von Fließbildern.

Im folgenden werden eine geeignete Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung eines fibrinolytisch aktiven Mittels aus Regenwürmern sowie die charakteristischen Eigenschaften der so erhaltenen Produkte eingehend erläutert.

I. Herstellung der fibrinolytisch aktiven Mittel

Ein entfettetes Pulver von gefriergetrockneten Regenwürmern wird in der zehnfachen Masse 0,050 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 dispergiert und 200 h bei 37°C inkubiert, wobei die fibrinolytisch aktiven Bestandteile in die wäßrige Phase extrahiert werden. Diese wäßrige Extraktlösung wird durch Ultrafiltration eingeengt; die konzentrierte Extraktlösung wird mit einem genügend großen Volumen an Ethylalkohol vermischt, wobei die Wirkstoffe fraktioniert ausgefällt werden. Die Niederschläge werden in destilliertem Wasser gelöst und an DEAE-Cellulose in drei fibrinolytisch aktive Fraktionen, F-I, F-II bzw. F-III, fraktioniert.

Die Fraktionen F-I und F-II werden mit Ammoniumsulfat ausgesalzt, anschließend mit Sephadex G-75 behandelt und gefriergetrocknet. Die dritte Fraktion F-III wird als solche entsalzt und anschließend zu einem gereinigten Produkt gefriergetrocknet.

II. Charakteristische Eigenschaften der Fraktionen F-I bis F-III und Verfahren zur Bestimmung der Aktivität

(1) Aktivität: Jede der Fraktionen hat fibrinolytische Aktivität.
(2) Substratspezifität: Jede der Fraktionen hat eine starke Aktivität, Fibrin zu zersetzen.
(3) pH-Optimum und stabilisierender pH-Wert: Das pH-Optimum der fibrinolytischen Substanz liegt bei etwa 8 bis 10, während der stabilisierende pH-Wert etwa 5 bis 10 ist.
(4) Aktivitätsbestimmung: Fibrinogen wird in einer 0,17 M Boratpufferlösung, pH 7,8, die 0,01 M Natriumchlorid in solchen Konzentrationen enthält, daß die Konzentration des koagulierbaren Proteins 0,15 Masse-% beträgt, gelöst. 10 ml der Lösung werden in eine sterilisierte Glasschale von 80 mm Durchmesser gegeben, mit 0,5 ml einer 20 Einheiten/ml enthaltenden Thrombinlösung vermischt und 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei die Schale bedeckt wird.

Für den Standard-Fibrinplattentest werden 0,03 ml der oben hergestellten Testlösung auf eine Standard-Fibrinplatte aufgetropft, die mit 10 ml einer 0,15%igen Fibrinogenlösung hergestellt wurde, 10 min mit einem unter den Glasdeckel eingeführten Filterpapier stehengelassen und zum Ablauf der Reaktion 18 h in einen Thermostaten mit 37°C gestellt. Die fibrinolytische Aktivität des Produkts wird angegeben in mm², berechnet aus der Länge der größeren und der kleineren Achse der Fläche auf der Standard-Fibrinplatte, die durch Auflösen gebildet wurde.

(5) Stabilität: Eine wäßrige Lösung der fibrinolytisch aktiven Bestandteile mit einem pH-Wert von 7,5 oder 9,0 hat nach 30 min bei 50°C noch mindestens 92% Rest aktivität.
(6) Inhibitoren: Die Aktivität der fibrinolytischen Substanz wird gehemmt durch Aprotinin (Trasylol), Tranexamsäure (Transamine), Soyabohnen-Trypsininhibitor und Serum.
(7) Fibrinolytische Aktivität: Das fibrinolytisch aktive Mittel hat zusätzlich zur direkten Wirkung unter Auflösung von Fibrin eine Plasminogen aktivierende Wirkung, so daß das Fibrin auch indirekt aufgelöst wird. Außerdem zeigen eine Extraktlösung, die durch 20tätige Inkubation eines Homogenisats von 300 g gefriergetrocknetem Pulver von Regenwurm- Geweben in 3 l physiologischer Salzlösung bei 37°C oder das gefriergetrocknete Material der Extraktlösung eine entsprechende Aktivität.

Bei der isoelektrischen Fokussierung mit einer Extraktlösung, die wie oben beschrieben erhalten und filtriert wurde, erhält man die pH-Gradientenkurve (I) und die Kurve der optischen Dichte bei 750 nm (II) der Fig. 1. Jede Fraktion mit einem Volumen von 2,5 ml wird mit dem Kupfer-Folinreagens umgesetzt. Die Ergebnisse zeigen die Anwesenheit von proteinhaltigen oder quasi-proteinhaltigen Substanzen mit isoelektrischen Punkten bei pH-Werten von 1,5, 3,4 und 5,6.

Fig. 1 enthält auch die Ergebnisse der Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität der Fraktionen der isoelektrischen Fokussierung der oben erhaltenen Extraktlösung nach Filtration oder Dialyse (Kurven III bzw. IV). Diese Ergebnisse zeigen die Anwesenheit einer fibrinolytisch hoch aktiven Substanz in den Fraktionen der Extraktlösung ohne Dialyse, die am oder nahe am isoelektrischen Punkt von 3,4 erhalten wurden, und die Anwesenheit von fibrinolytisch aktiven Substanzen mit einer etwas niedrigeren Aktivität in den Fraktionen, die an oder nahe an den isoelektrischen Punkten von pH 1,5 und 4,0 erhalten wurden. Im Gegensatz dazu haben die Fraktionen, die am oder nahe am isoelektrischen Punkt von pH 5,6 erhalten wurden, keine fibrinolytische Aktivität. Auf der anderen Seite entfernt man durch die Dialyse der Extraktlösung die fibrinolytisch aktive Substanz, die vor der Dialyse in den Fraktionen am oder nahe am isoelektrischen Punkt von pH 1,5 aufgetreten ist, während die Aktivität der Fraktionen am oder nahe dem isoelektrischen Punkt von pH 3,4 auch nach der Dialyse erhalten bleibt. Aus den Ergebnissen der Fig. 1 wird daher geschlossen, daß der Wirkstoff einen isoelektrischen Punkt von etwa 3,4 hat, wogegen die Substanz mit einem isoelektrischen Punkt bei etwa pH 5,6 für die fibrinolytische Aktivität des extrahierten Materials aus Regenwürmern irrelevant ist.

III. In-vivo-Aktivitätstest der fibrinolytischen Substanz

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung des fibrinolytisch aktiven Mittels als fibrinolytisches Arzneimittel in der Humanmedizin unter oraler Verabreichung kann man das rohe oder teilgereinigte Produkt aus jeder Zwischenstufe der Reinigung in den oben angegebenen Reinigungsschemata verwenden. Es ist jedoch selbstverständlich, daß das hochgereinigte Endprodukt am meisten bevorzugt ist, da es bei oraler Verabreichung eine ausgezeichnete Wirksamkeit besitzt.

Das gemäß Beispiel 1 erhaltene gereinigte Produkt wurde oral an drei männliche, 60, 73 bzw. 59 Jahre alte Patienten mit Arteriosklerose verabreicht. Jeder Patient erhielt eine Dosis von 600 mg gefriergetrocknetem Produkt. Das periphere Blut jedes Patienten wurde in 1 h-Abständen entnommen; die fibrinolytische Aktivität in mm² wurde anhand der Euglobulin-Fraktionierung ermittelt. Für die drei Patienten wurden die Kurven I, II und III der Fig. 2 erhalten. Die weißen bzw. schwarzen Kreise auf jeder Kurve entsprechen der vollständigen bzw. nicht vollständigen Auflösung von Fibrin. Aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß die fibrinolytische Aktivität des peripheren Bluts 2 h nach Verabreichung anzusteigen beginnt und 4 bis 6 h nach Verabreichung des fibrinolytisch aktiven Mittels den Maximalwert erreicht.

Beispiel 1

Eine wäßrige Aufschlämmung von 1 kg feingepulvertem, gefriergetrocknetem Gewebe von Regenwürmern der Gattung Lumbricus rubellus wird nach Entfetten mit Aceton in 10 l einer 0,050 m Phosphatpufferlösung, pH 7,0, dispergiert und 100 h bei 37°C bewegt, um die wasserlöslichen Bestandteile zu extrahieren, und dann filtriert. Der Rückstand aus der Filtration wird mit 3 l der gleichen Pufferlösung gewaschen; die Waschwässer werden mit dem Filtrat zu einem Gesamtvolumen von 12,8 l klarer Extraktlösung vereinigt. Die fibrinolytische Aktivität dieser Extraktlösung beträgt nach 10facher Verdünnung mit destilliertem Wasser 490 mm²/ml.

Die so erhaltene Extraktlösung wird durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 1,75 l eingeengt. Diese konzentrierte Extraktlösung hat nach 60facher Verdünnung eine fibrinolytische Aktivität von 550 mm²/ml. Die in dieser konzentrierten Extraktlösung enthaltenen Wirkstoffe werden zuerst durch Zugabe von 1,75 l Ethylalkohol zur Extraktlösung und dann durch Zugabe von 7,0 l Ethylalkohol zum Filtrat der ersten Fällungsstufe fraktioniert ausgefällt. Die Niederschläge der zweistufigen Fällung werden vereinigt und in 1,1 l der gleichen Pufferlösung. Die so erhaltene Lösung hat nach 60facher Verdünnung eine fibrinolytische Aktivität von 694 mm²/ml. Die Lösung wird weiter an DEAE- Sepharose chromatographisch in drei Fraktionen, F-I, F-II und F-III, fraktioniert. Die Fraktionen F-I und F-II werden durch 60%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgesalzt, anschließend mit Sephadex G-75 behandelt und gefriergetrocknet. Man erhält aus den Fraktionen F-I bzw. F-II 625 mg eines entwässerten pulverigen Materials mit einer fibrinolytischen Aktivität von 12 300 mm²/mg und 665 mg eines pulverigen Materials mit einer fibrinolytischen Aktivität von 10 700 mm²/mg. Die dritte Fraktion F-III wird nach dem Entsalzen und Konzentrieren gefriergetrocknet; man erhält 1200 mg eines pulverigen Materials mit einer fibrinolytischen Aktivität von 11 500 mm²/mg.

Beispiel 2

84 g lebende Regenwürmer der Gattung Lumbricus rubellus werden bis auf ein Gesamtvolumen von 300 ml in physiologische Natriumchloridlösung gegeben und zu einer homogenen Suspension zerkleinert, die 100 h bei 37°C inkubiert und dann durch Zentrifugieren in eine Extraktlösung und einen unlöslichen Rückstand getrennt wird. Der Rückstand wird mit 150 ml physiologischer Natriumchloridlösung gewaschen; das Waschwasser wird mit der Extraktlösung zu einem Gesamtvolumen von 400 ml vereinigt. Diese vereinigte Lösung hat nach 10facher Verdünnung eine fibrinolytische Aktivität von 375 mm²/ml. Das durch Gefriertrocknung dieser Lösung erhaltene entwässerte Material hat eine fibrinolytische Aktivität von 142 mm²/mg.

Beispiel 3

84 g lebende Regenwürmer werden zu 500 ml destilliertem Wasser, das 0,3 g Phenol enthält, gegeben und zu einer homogenen Suspension zerkleinert, die bei 30°C 76 h inkubiert und dann filtriert wird, um den unlöslichen Rückstand aus der wäßrigen Extraktlösung zu entfernen. Der Rückstand wird mit 200 ml destilliertem Wasser gewaschen; das Waschwasser wird mit der Extraktlösung zu einem Gesamtvolumen von 650 ml vereinigt. Diese vereinigte Lösung hat nach 10facher Verdünnung eine fibrinolytische Aktivität von 220 mm²/ml.

Beispiel 4

84 g lebende Regenwürmer werden zu einem Gemisch von 400 ml destilliertem Wasser und 30 ml Ethylalkohol gegeben und zu einer homogenen Suspension gemahlen, die bei 25°C 240 h inkubiert und dann zentrifugiert wird. Man erhält eine klare Extraktlösung mit einer fibrinolytischen Aktivität von 350 mm²/ml nach 10facher Verdünnung.

Beispiel 5

Durch Vermischen von 50 g eines Pulvers von vakuumgetrockneten Regenwürmern mit 400 ml einer physiologischen Natriumchloridlösung und 100 ml einer Salzlösung, pH 6,5, die aus 1,8% wäßriger Phosphorsäurelösung und 1,8% wäßrigem Ammoniak hergestellt wurde, wird eine wäßrige Suspension hergestellt, die 100 h bei 38°C inkubiert und dann filtriert wird. Man erhält eine klare Extraktlösung mit einer fibrinolytischen Aktivität von 725 mm²/ml nach 10facher Verdünnung, entsprechend einer Aktivität von 72,5 mm²/mg des trockenen Regenwurmpulvers.

Beispiel 6

Durch Dispergieren von 50 g eines Pulvers von gefriergetrockneten Regenwürmern in einem Gemisch von 250 ml einer verdünnten Salzlösung, pH 6,3, hergestellt aus 2% wäßriger Essigsäurelösung und 2% Natronlauge, 200 ml physiologischer Natriumchloridlösung, 50 ml destilliertem Wasser und 0,5 g Natriumazid, wird eine wäßrige Suspension hergestellt, die 72 h bei 37°C inkubiert und dann filtriert wird. Man erhält eine klare Extraktlösung mit einer fibrinolytischen Aktivität von 460 mm²/ml nach 10facher Verdünnung.

Beispiel 7

Durch Dispergieren von 50 g entfettetem Pulver von gefriergetrockneten Regenwürmern in einem Gemisch von 200 ml einer Acetatpufferlösung, pH 7,0, 200 ml einer Boratpufferlösung, pH 7,0, 100 ml destilliertem Wasser, 10 ml Propylalkohol und 10 ml Dioxan wird eine wäßrige Suspension hergestellt, die 240 h bei 32°C inkubiert und dann filtriert wird. Man erhält eine klare Extraktlösung mit einer fibrinolytischen Aktivität von 772 mm²/ml nach 10facher Verdünnung.

Beispiel 8

Durch Dispergieren von 50 g eines entfetteten Pulvers von gefriergetrockneten Regenwürmerkörpern, aus denen die Eingeweide entfernt worden waren, in einem Gemisch von 250 ml einer verdünnten Salzlösung, pH 6,8, hergestellt aus 1,8% wäßriger Phosphorsäurelösung, 3,5% Salzsäure und 2 n Natronlauge, 225 ml physiologischer Natriumchloridlösung und 25 ml Aceton, wird eine wäßrige Suspension hergestellt, die 96 h bei 25°C inkubiert und anschließend abgenutscht wird. Man erhält eine klare Extraktlösung mit einer fibrinolytischen Aktivität von 600 mm²/ml nach 10facher Verdünnung.

Beispiel 9

Durch Dispergieren von 10 g eines entfetteten Regenwurmpulvers, das durch Hochtemperatur-Flashtrocknen entwässert wurde, in 50 ml einer Phosphatpufferlösung, pH 6,4, und 50 ml einer Citratpufferlösung, pH 6,5, wird eine wäßrige Suspension hergestellt, die 7 h bei 37°C inkubiert und anschließend filtriert wird. Man erhält eine klare Extraktlösung. Der Rückstand wird mit physiologischer Natriumchloridlösung gewaschen; das Waschwasser wird mit der Extraktlösung zu einem Gesamtvolumen von 120 ml vereinigt. Die vereinigte Extraktlösung wird mit 0,1 g Natriumazid vermischt und weitere 10 h bei 37°C inkubiert. Die entstandene Lösung hat nach 10facher Verdünnung eine fibrinolytische Aktivität von 280 mm²/ml.

Beispiel 10

Durch Dispergieren von 10 g eines entfetteten Pulvers von gefriergetrockneten Regenwürmern in 50 ml einer Phosphatpufferlösung, pH 7,4 und 50 ml einer physiologischen Natriumchloridlösung wird eine wäßrige Suspension hergestellt, die 4 h bei 22°C bewegt wird, um die wasserlöslichen Bestandteile in die wäßrige Lösung zu extrahieren, und dann zentrifugiert wird. Man erhält eine klare Extraktlösung, deren fibrinolytische Aktivität nach Vermischen mit 0,07 g Natriumazid und fünfstündiger Inkubation bei 37°C nach 10facher Verdünnung 190 mm²/ml beträgt.

Beispiel 11

10 g lebende Regenwürmer werden zu 70 ml einer Acetatpufferlösung, pH 7,0, und 30 ml destilliertem Wasser gegeben und zu einer homogenen wäßrigen Suspension zerkleinert, die 2 h bei 20°C bewegt wird, um die wasserlöslichen Bestandteile in die wäßrige Lösung zu extrahieren. Nach dem Zentrifugieren erhält man eine klare Extraktlösung. Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen; das Waschwasser wird mit der Extraktlösung zu einem Gesamtvolumen von 180 ml vereinigt. Nach dem Vermischen mit 0,1 g Natriumazid und siebenstündiger Inkubation bei 37°C hat die vereinigte Lösung eine fibrinolytische Aktivität von 40 mm²/ml nach 10facher Verdünnung.

Beispiel 12

Durch Dispergieren von 1 kg gefriergetrocknetem Regenwurmpulver in 10 l einer wäßrigen Lösung, die 0,1 Masse-% Natriumbenzoat und 0,9 Masse-% Natriumchlorid enthält, wird eine wäßrige Suspension hergestellt, die 96 h bei 32°C bewegt wird, um die wasserlöslichen Bestandteile zu extrahieren. Nach dem Filtrieren wird der Rückstand mit 3 l der gleichen wäßrigen Lösung von Natriumbenzoat und Natriumchlorid gewaschen; die Waschwässer werden mit dem Filtrat zu 12,5 l klarer Extraktlösung mit einer fibrinolytischen Aktivität von 490 mm²/ml nach 10facher Verdünnung vereinigt.

Die so erhaltene Extraktlösung wird durch Ultrafiltration auf ein Gesamtvolumen von 0,5 l aufkonzentriert. Die konzentrierte Lösung wird zuerst durch Zugabe von 0,5 l Ethylalkohol und dann durch Zugabe von weiterem Ethylalkohol zum Filtrat der ersten Fällung bis auf eine Endkonzentration an Ethylalkohol von 80% fraktioniert ausgefällt, wobei man eine weitere Niederschlagsmenge erhält. Die in der Zweistufen-Fällung erhaltenen Niederschläge werden vereinigt, mit Ethylalkohol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 40,5 g eines trockenen Pulvers mit einer fibrinolytischen Aktivität von 1285 mm²/mg.

Dieses Pulver wird in 1 l einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (durch Umsetzen von Hexylamin mit durch Epichlorhydrin aktivierter Agarose (Sepharose) hergestellt), pH 8,0, gelöst und zur Adsorption der Wirkstoffe durch eine mit Hexyl-Sepharose gefüllte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit der gleichen Pufferlösung wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung, die jedoch 0,25 m Natriumchlorid enthält, eluiert. Man erhält 1 l Eluatlösung, die nach der Dialyse gefriergetrocknet wird. Man erhält 5,75 g entwässertes Material mit einer fibrinolytischen Aktivität von 7241 mm²/mg.

Beispiel 13

Es wird wie in Beispiel 12 verfahren bis zur fraktionierten Fällung mit Ethylalkohol und anschließendem Trocknen unter vermindertem Druck. 47 g des getrockneten Pulvers mit einer fibrinolytischen Aktivität von 1100 mm²/mg werden 1 l 0,20 M Phosphatpufferlösung, pH 7,0, gelöst und zur Adsorption der Wirkstoffe durch eine Säule geleitet, die mit Albumin-Trypsin inhibitor-Sepharose (ETI-Sepharose) (hergestellt durch Bindung von Albumin-Trypsininhibitor an mit Epichlorhydrin aktivierter Agarose) gefüllt ist. Nach dem Waschen mit zuerst der gleichen Pufferlösung wie oben und dann mit 0,1 M Acetatpufferlösung, pH 5,0, wird die Säule mit der gleichen Acetatpufferlösung wie oben, die jedoch 1 M Natriumchlorid und 0,5 M Arginin enthält, eluiert. Man erhält 0,8 l Eluat, das nach der Dialyse gefriergetrocknet wird.

Man erhält 225 mg eines entwässerten Materials mit einer fibrinolytischen Aktivität von 70 960 mm²/mg.

Beispiel 14

Eine wäßrige Dispersion von 1 kg eines Pulvers von gefriergetrockneten Regenwürmern in 10 l einer wäßrigen Salzlösung, die 0,1% Natriumbenzoat und 0,9% Natriumchlorid enthält, wird 72 h bei 30°C bewegt, um die wasserlöslichen Bestandteile in die wäßrige Lösung zu extrahieren. Durch Filtration erhält man eine klare Lösung. Der Rückstand wird mit 3 l der gleichen Salzlösung wie oben gewaschen; die Waschwasser werden mit der Extraktlösung zu einem Gesamtvolumen von 13 l klarer Lösung mit einer fibrinolytischen Aktivität von 450 mm²/ml nach 10facher Verdünnung vereinigt.

Diese wäßrige Lösung wird durch Ultrafiltration auf ein Flüssigkeitsvolumen von 0,71 l konzentriert und dann mit dem entsprechenden Volumen an Ethylalkohol vermischt, um festes Material auszufüllen, das durch Filtration gesammelt wird. Das Filtrat wird weiter mit Ethylalkohol bis auf eine Endkonzentration an Ethylalkohol von 80% vermischt; die weiteren Niederschläge werden gesammelt, mit Ethylalkohol gewaschen und unter vermindertem Druck zu einem Pulver getrocknet. Die Gesamtausbeute an getrockneten pulverigen Produkten in dieser Zweistufen-Fällung beträgt 42 g, die fibrinolytische Aktivität der Produkte ist 1322 mm²/mg.

Dieses pulverige Produkt wird in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst und unter Verwendung von DEAE-Cellulofine als Adsorptionsmittel säulenchromatographisch fraktioniert. Man erhält drei Fraktionen, F-I, F-II und F-III. Fig. 3 zeigt die fibrinolytische Aktivität in mm² (Kurve I) und die optische Dichte bei 280 nm (Kurve II) der erhaltenen Eluatfraktionen von je 20 ml. Die gestrichelte Linie in Fig. 3 zeigt die Natriumchlorid-Konzentration in den Eluatfraktionen, gemessen über die elektrische Leitfähigkeit in mΩ^-1.

Jede der Fraktionen F-I bis F-III wird durch 60%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgesalzt. Die Niederschläge werden in einem geringen Volumen einer 0,01 M Phosphatpufferlösung, pH 8,0, gelöst und nacheinander der Gelfiltration an Sephacryl S-200, der entsalzenden Aufkonzentrierung durch Ultrafiltration und anschließend der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält 629 mg entwässertes Produkt aus der Fraktion F-I, 879 mg aus der Fraktion F-II und 1070 mg aus der Fraktion F-III mit einer fibrinolytischen Aktivität von 13 780 mm²/mg, 9290 mm²/mg bzw. 17 620 mm²/mg.

Jedes der so erhaltenen entwässerten Produkte wird auf seine Aktivität als Plasminogen-Aktivator untersucht. Das trockene Produkt wird in Wasser zu einer Konzentration von 0,1 mg/ml gelöst; 20 µl dieser Lösung werden mit 10 µl Plasminogen mit einer Aktivität von 5 Einheiten/ml und 30 µl einer 0,17 m Boratpufferlösung, pH 7,8, die 0,01 M Natriumchlorid enthält, vermischt. Nach 10minütigem Stehen bei 37°C werden 0,03 ml der Lösung senkrecht auf eine Fibrinplatte, die frei von Plasminogen ist, getropft. Nach einer Reaktionszeit von 18 h bei 37°C wird die aufgelöste Fläche in mm² bestimmt. Wird die so erhaltene Fläche mit A bezeichnet und eine entsprechende Fläche in mm², die durch Verwendung von 10 µl 0,17 M Boratpufferlösung anstelle von Plasminogen erhalten wird, mit B bezeichnet, so wird die Plasminogen- Aktivator-Aktivität durch A-B ausgedrückt. Die Werte der so bestimmten Plasminogen-Aktivator-Aktivität sind dann 2025 mm²/mg, 1721 mm²/mg bzw. 1283 mm²/mg für die trockenen Produkte aus den Fraktionen F-I, F-II bzw. F-III.

Beispiel 15

Die in Beispiel 14 erhaltenen fibrinolytisch aktiven Produkte werden auf ihre Reaktivität mit Fibrin und Fibrinogen untersucht. Dazu werden 0,18 ml Humanblutplasma, 0,02 ml 0,25 M wäßrige Calciumchloridlösung und 0,02 ml einer wäßrigen Lösung eines der fibrinolytisch aktiven Produkte in verschiedenen Konzentrationen vermischt und das Fibrin-Zersetzungspeptid, das nach 30minütiger Reaktion bei 37°C gebildet wird, im Latex-Koagulationstest unter Verwendung des Thrombo-Wellco-Testkits bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle für fünf verschiedene Konzentrationen von 10⁴ bis 10^-1ng/ml angegeben. Die Zeichen (+), (++) und (+++) in der Tabelle geben die Bildung des Fibrin-Zersetzungspeptids aus Fibrin an, wobei die Anzahl der Kreuzchen der Zunahme der Bildung des Fibrin-Zersetzungspeptids entspricht, wogegen (-) keine Bildung von Fibrin-Zersetzungspeptid aus Fibrin bedeutet.

Diese gleiche Bestimmung wird andererseits in Abwesenheit von Calciumchlorid durchgeführt, d. h. durch Verwendung einer physiologischen Natriumchloridlösung anstelle der wäßrigen Calciumchloridlösung, um festzustellen, daß unabhängig von den Fraktionen an fibrinolytisch aktiven Produkten und deren Konzentration kein Fibrin-Zersetzungspeptid gebildet wird. Die Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle angegeben. Die Tabelle zeigt, daß das erfindungsgemäß verwendete fibrinolytisch aktive Mittel mit Fibrin, jedoch nicht mit Fibrinogen reagiert.

Beispiel 16

Jedes der gefriergetrockneten, gereinigten Produkte der Fraktionen F-I bis F-III des Beispiels 14 wird gesunden Probanden in einer Dosis von 1 µg/kg Körpermasse oral verabreicht. Den Probanden wird für die Euglobulin- Fraktionen periodisch Blut abgenommen, und die Zeit für die vollständige Auflösung des Euglobulins in Stunden sowie die Fibrin-Auflöse- Aktivität in mm² im Standard-Fibrin-Plattentest werden bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4a bzw. 4b dargestellt.

Aus Fig. 4a ist ersichtlich, daß die Zeit für die Auflösung von Euglobulin etwa 2 h nach der oralen Verabreichung der gereinigten fibrinolytisch aktiven Mittel aus den Fraktionen F-I (Kurve I) und F-III (Kurve III) deutlich verringert ist und daß diese Abnahme der Auflösungszeit für Euglobulin weiter besteht. Andererseits nimmt die Auflösezeit für Euglobulin etwa 6 h nach der oralen Verabreichung des fibrinolytisch aktiven Mittels aus der Fraktion F-II (Kurve II) allmählich ab. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß jedes der gereinigten fibrinolytisch aktiven Mittel aus den Fraktionen F-I bis F-III nach oraler Verabreichung die fibrinolytische Aktivität des Blutes erhöht.

Ferner zeigt Fig. 4b, daß, trotz der beträchtlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Personen, die fibrinolytische Aktivität der aus peripherem Blut erhaltenen Euglobulin-Fraktionen 2 bis 7 h nach der oralen Verabreichung der aktiven Mittel aus den Fraktionen F-I bis F-III (Kurven I bis III) am höchsten ist und sogar noch 10 h nach der Verabreichung andauert.

Claims

Verwendung eines durch Extraktion von Geweben von Regenwürmern der Familie Lumbricidae mit Wasser oder einem Gemisch von Wasser mit einem polaren organischen Lösungsmittel als Extraktionsmittel erhaltenen und ggfs. nach üblichen Fraktionierungsverfahren gereinigten konzentrierten oder entwässerten Extrakts als fibrinolytisches Mit tel.