DE2456589C2 - Verfahren zur Herstellung eines Plasminogen-Aktivators und denselben enthaltendes Mittel - Google Patents

Description

a) Suspendierung des angegebenen Pulvers in einer wäßrigen Salzlösung schwacher lonenstärke bei neutralem pH-Wert.

b) Aufnahme des in Verfahrensstufe (a) erhaltenen Niederschlags in einer wäßrigen Salzlösung mit einer lonenstärke zwischen 0,6 und 1 bei einem pH-Wert zwischen 3 und 5.

c) Ausfällung der nach Abdekantieren der in Vcrfahrerisätüfe (b) erhaltenen Lösung durdi Zugabe eines Salzes oder eines organischen Lösungs-nittels bei einem pH-Wert zwischen 3 und5.

d) Aufnahme des in Verfahrensstufe (c) erhaltenen Niederschlags in Wasser oder einer Salzlösung und Ausfällung durch Zugabe eines Salzes bei .einem pH-Wert nahe oder leicht über 7 und

e) Aufnahme des in Verfahrensstufe (d) erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse der erhaltenen Lösung bis zu einem spezifischen Widerstand in der Größenordnung von 1000 Ohm · cm bei 10⁰C.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (a) als Salz Kaliumacetat oder Kaliumchlorid in Konzentration ^J zwischen 1 und 10 g/l einsetzt.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (b) Kaliumchlorid, -acetal oder -sulfat in Konzentrationen zwischen 20 und 80 g/l einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (c) als Salz Ammoniumsulfat oder Kaliumchlorid in Konzentrationen zwischen 100 -.'id 200 g/l verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (d) ais Saiz Natriumchlorid, Ämmoniumsuifat oder Kaliumsulfat verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufen (a) und (b) bei 4° C durchführt.

. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6. dadurch gekennzeichnet, daß man als tierisches Organ Mutterschweineierstöcke einsetzt.

8. Pharmazeutisches Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Produkt, das nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche I bis 7 hergestellt ist.

Die Erfindung betrifft das Verfahren des Patentanspruchs I und das Mittel des Patentanspruchs 8. Die Patentansprüche 2 bis 7 betreffen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Nach dem erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren wird der in den im Anspruch 1 genannten Organen vorliegende Aktivator für Plasminogen extrahiert. Dieser Aktivator wirkt auf die Arginin-Valin-Peptidbin-•«0 düngen des Plasminogen durch Öffnung dieser Bindungen ohne Aufspaltung der Disulfidbrücken, wobei Plasminogen in Plasmin überführt wird gemäß folgenden Globalschema:

H₂NLyS-

Arg — VaI — S—S — (S — S),

Plasminogen

+ Aktivator

H₂NLyS-

II

In obigem Schema bedeuten:

Lys = Lysin

Arg = Arginin und

VaI = Valin.

ArgCOOH

C _

N₂NVaI-Plasmin

-(S-S)₁

Das auf diese Weise gebildete Plasmin oder Fibrinolysin erweist sich, da es die Geschwindigkeit der Lysis von Fibringerinnseln erhöht, als besonders wertvolles Medikament, insbesondere zur Behandlung von artcrillen und venösen Thrombosen.

Ein Aktivator des erfindungsgemäßen Typs ist bereits bekannt, nämlich die Urokinase, die aus dem Urin von Säugetieren extrahiert wird (verwiesen sei z. B. auf die USA-Patentschriften 29 61 382, 29 83 647 und 29 89 440). Nachteilig ist jedoch, daß Urokinase sehr empfindlich gegenüber induzierten Inhibitoren ist und daß seine Wirkung sehr rasch abnimmt.

Es besteht daher das Bedürfnis nach einem Aktivator, dessen Aktivität zumindest gleich derjenigen von Urokinase ist, der jedoch eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren aufweist, wie dies beim erfindungsgemäß hergestellten Plasminogen-Aktivator der Fall ist.

Gegenstand der Erfindung ist also das im Anspruch 1 angegebene Verfahren.

Selbstverständlich kann man die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Lösung — falls erforderlich — noch reinigen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein pharmazeutisches Mittel, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an einem Produkt, das nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt ist.

Bei dem in Verfahrensstufe (a) verwendeten Salz handelt es sich vorzugsweise um Kaliumacetat oder Kaliumchlorid, die in Konzentrationen zwischen 1 und 10 g/l eingesetzt werden.

Bei dem in Verfahrensstufe (b) verwendeten Salz handelt es sich insbesondere um ein Kaliumsalz, vorzugsweise um Kaliumchlorid. Kaliumacetat oder Kaliumsulfat, die in Konzentrationen zwischen etwa 20 und 80 g/l eingesetzt werden, wobei der pH-Wert zweckmäßig mit Hilfe emer Säure, z. B. Essigsäure oder Schwefelsäure, in solcher Weise auf 3 ^?-s 5 eingestellt wird, daß die lonenstärke der Lösung zwischen 0.6 und 1 liegt.

Bei dem in Verfahrensstufe (c) verwendbaren Salz handelt es sich vorzugsweise um Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, die in Konzentrationen zwischen 100 und 200 g/l eingesetzt werden.

Obwohl in Verfahrensstufe (c) die Ausfällung der Lösung auch mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, z. B. Aceton erfolgen kann, wird vorzugsweise die Ausfällung mit Hilfe eines Salzes bewirkt, das die Ausbeute der Verfahrensoperation erhöht.

Bei dem in Verfahrensstufe (d) verwendbaren Salz handelt es sich vorzugsweise um Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder Kaliumsulfat, wobei der pH-Wert mit Hilfe einer Base. z. B. Natronlauge, auf nahe oder leicht über 4 eingestellt wird.

Die Verfahrensstufen (a) und (b) werden vorzugsweise bei etwa 4°C durchgeführt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Organe werden gleich nach dem Tode der Tiere entnommen und danach mechanisch entfettet und zerkleinert.

Die auf diese Weise grob zerkleinerten Organe werden eingefroren und können bei Bedarf in gefrorenem Zustand erneut zerkleinert und danach aufgebaut werden in Suspension in einer Pufferlösung von schwachei lonenstärke und einem pH-Wert zwischen 5 und 7, um sie zu homogenisieren.

Gemäß einer /weckmäßigen Ausführungsform der E* indung wird das Acctonpulver der tierischen Organe tv: gestellt durch Dispergieren der zerkleinerten und h'Ttogcnisierten Organe in einem Acctonbad bei n; drigcr Temperatur. /. B. bei - IOC. Das Acetonpulw." wird aus dieser Suspension durch Filtration und T; ocknung erhalten.

Die Reinigungsschritte umfassen am besten eine Ausfällung beim isoelektrischen pH-Wert, und zur Durchführung derselben wird die in Verfahrensstufe (a) erhaltene, einen spezifischen Widerstand von 1000 Ohm · cm aufweisende Lösung auf einen pH-Wert von 6,8 gebracht, worauf die Ionenstärke der Lösung auf 10-² gebracht wird mit Hilfe eines Salzes, z. B. mit Calciumchlorid, vorzugsweise jedoch mit einem Zinksalz, z. B. Zinkacetat oder Zinkchlorid, worauf schlieflich die Lösung bei 0°C zur Vervollständigung der Ausfällung stehen gelassen wird. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag kann nach Dialyse durch Lyophilisation konserviert werden.

Wird eine weitere Reinigung gewünscht, so kann hierzu selbstverständlich eine Abscheidungschromatographie verwendet werden auf einem Gel aus einem Gemisch aus Dextran-Agarose und Polyacrylamid, z. B. einem sog. »Sepharose 6 Bw-GeI zur Abtrennung bestimmter molekularer Verunreinigungen, und/oder eine lonenaustausch-Chromatographie zur Abtrennung der ionogenen Verunreinigungen. Typische geeignete Harze sind z. B. schwach saure ionenaustauscher oder Gemische, z. B. die sog. »Bio-rex 70«-Harze zur Elution bei konstanter lonenstärke und steigendem pH. die sog. »AG 1! As-Bio-rad«-Harze zur Elution bei konstantem pH und steigender lonenstärke, oder die sog. »Biogel H.T.P.«-Harze. bei denen die lonenstärke verändert wird.

Die lonenstärken der Lösungen werden aus den nach üblichen bekannten Methoden gemessenen Widerstandswerten der Lösungen berechnet.

Im folgenden wird ein allgemeines Schema zur Herstellung des erfindungsgemäßen Aktivators nach einer vorteilhaften Ausführungsform angegeben.

I. Herstellung des Acetonpulvers

Die angegebenen Organe werden nach dem Tod der Tiere entnommen und danach mechanisch entfettet und zerkleinert.

Nach der Zerkleinerung werden die Organe rasch eingefroren. Sie werden schließlich in gefrorenem Zustand einer Zerkleinerungsoperation unterworfen irnd danach homogenisiert, nachdem sie in einer Phosphat-Pufferlösung von schwacher lonenstärke und einem pH-Wert zwischen 5 und 7 aufgetaut worden war.

Die auf diese Weise erhaltenen Organe werden in einem Acetonbad. dessen Temperatur nicht über — 10°C liegen darf, dispergiert.

Nach Herstellung eines genügend langen innigen Kontakts wird die Suspension unter schwachem Vakuum filtriert.

Der Filterkuchen wird sorgfältig getrocknet durch Zirkulat'on von Stickstoff bei niedriger Temperatur.

Das auf diese Weise erhaltene Acetonpulver ist von rosa Farbe und kann nach beendeter Trocknung einer feinen Homogenisierung unterworfen werden.

II. Herstellung eines angereicherten Extrakts
a) Vorwaschen des Acetonpulvers

Diese Operation dient dazu, zuvor eine Reihe von Pigmenten und schwach gebundenen Proteinen abzutrennen, die bei der weiteren Verarbeitung die Extraktion stören können.

Das Acelonpiilver wird suspendiert in einer wäßrigen Lösung eines Salzes, deren lonenstärke schwach ist. wobei der pH-Wert der Lösung zwischen 5 und 8. vorzugsweise nahe dem Ncutralptinkt liegt. Die

Suspension wird bei 4° C 1 Stunde lang unter Rühren belassen. Vom Rückstand des Acetonpulvers wird abdekantiert, die Lösung wird geklärt, z.B. in einer Dekantier-Schleudervorrichtung, und der auf diese Weise erhaltene Bodensatz wird zu dem angegebenen Rückstand gegeben.

b) Extraktion

Der in Verfahrensstufe (a) erhaltene Rückstand wird in einer Lösung mit erhöhter Ionenstärke und einem to pH-Wert zwischen 3 und 5 aufgenommen, wobei die Ionenstärke der Lösung auf 0,6 bis 1 eingestellt wird durch Zugabe eines Kaliumsatzes.

Die erhaltene Extraktionslösung wird mindestens 2 Stunden lang gerührt unter Aufrechterhaltung der Temperatur bei 4° C.

Das Gewichtsverhältnis von Acetonpulver und Lösungsmittel darf 5% nicht übersteigen.

Der nicht extrahierte Rest an Acetonpulver wird durch Abschleudern abgetrennt, und die anfallende Lösung wird unter Stickstoffdnick auf einem sogenannten EKS-Fiiter filtriert.

c) Ausfällung in saurem Milieu

Diese erste Ausfällung der wie angegeben erhaltenen Lösung wird in saurem Milieu bewirkt bei einem pH-Wert von 4,5 mit Hilfe eines zu einer Ausdehnung führenden Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, bei Halbsättigung bei 10⁰C. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in einem Wasservoluiiien oder einer Salzlösung aufgenommen, deren spezifischer Widerstand unter 800 0hm · cm bei 10⁰C liegt, wobei das Volumen dieser Lösung vorzugsweise ein Viertel des Volumens der extrahierten Lösung nicht übersteigt.

d) Ausfällung in schwach basischem Milieu

Der pH-Wert der wie angegeben erhaltenen Lösung wird auf einen leicht über 7 liegenden Wert erhöht mit Hilfe von Natronlauge (pH-Wert zwischen 7 und 8). Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird ausgefällt durch -to Zugabe eines Salzes in großer Menge, z. B. durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Menge von 200 g/l, von Kaliumsulfat in einer Menge von 200 g/i oder von Natriumchlorid in einer Menge von 185 g/l.

Der gebildete Niederschlag wird in Wasser aufge- -»5 nommen, wobei das Volumen des zur Aufnahme verwendeten Wassers V10 des Volumens des in Verfahrensstufe (b) behandelten Extrakts beträgt.

e) Dialyse

Die erhaltene Lösung wird dialysiert bis zu einem spezifischen Widerstand in der Größenordnung von 100 Ohm · cm bei 10"C, wobei das erhaltene Produkt anschließend den abschließenden Reinigungsverfahrer? unterworfen oder durch Lyophilisation konserviert werden kann.

III. Reinigung des angereicherten Extrakts

1. Reinigung durch Ausfällung nahe dem isoelektrischen pH-Wert

Das in Verfahrensstufe (e) erhaltene Dialysat wird auf den isoelektrischen pH des Enzyms, d. h. auf pH 6,8 gebracht, worauf vorsichtig eine Salzlösung, vorzugsweise Zinkacetat, zugegeben wird, um die lonenstärke auf \0~- zu bringen. Dann wird die Niederschlagsbildung über Nacht bei 0⁰C ohne Rühren vor sich gehsn gelassen.

Der gebildete Niederschlag wird isoliert und aufgenommen in V20 des Volumens des Ausgangsextrakts.

2. Ausschluß-Chromatographie

Das in vorstehender Verfahrensstufe oder in Verfahrensstufe (e) erhaltene Produkt wird durch eine Säule von »Sepharose 6 B« geleitet, die ins Gleichgewicht gesetzt ist mit Hilfe einer Phosphatpufferiösujig, deren lonenstärke durch Zugabe von Natrium- oder Kaliumchlorid auf 0,6 eingestellt ist.

Das Verhältnis der Höhe des Gels zum Durchmesser der Säule darf nicht unter 10 betragen. Der Chromatographie-Durchfluß wird zwischen 0,8 und 1 I/Std. für eine Säule von 101 Volumen festgesetzt, wobei das Volumen der aufgebrachten Probe zwischen 500 und 800 ml für eine Säule des angegebenen Typs liegt (was etwa 10 kg Rohorganen entspricht).

Die Chromatographie wird bei 4°C durchgeführt, und es werden eluierte Fraktionen zwischen 15 und 25 I bei Verwendung einer Säule von 10 I Volumen aufgefangen.

Das erhaltene Produkt ka..-ο durch Ausfällung mit Alkohol oder Aceton (dreifaches Volumen) in der Kälte konzentriert oder auch nach Dialyse lyophilisiert werden.

3. Reinigung mit Ionenaustauschern

Unter Verwendung eines schwach sauren
Kationenaustauscherharzes

Verwendet wird ein sogenanntes »Bio rex 7G«-Harz, das im Gleichgewicht steht mit einer Acetatpufferlösung von pH 4,5. Die Elution wird mit Hilfe von Lösungen konstanter Ionenstärke, jedoch steigenden pH-Werts bewirkt. Isoliert wird das Produkt in der eluierten Fraktion zwischen pH 5,2 und 5,7.

Unter Verwendung eines Harzgemisches

Verwendet wird ein sogenanntes »AG 11 Ag«-Harzgemisch, das eingestellt ist auf einen spezifischen Widerstand von über 8000 Ohm · cm. Es wird eine Lösung des angereicherten Extrakts in leicht saurem Milieu behandelt.

Die Elution wird bei steigender lonenstärke bewirkt, und das Produkt in der eluierten Fraktion eines spezifischen Widerstands von etwa 5000 Ohm · cm wird isoliert.

Unter Verwendung von »Biogel H.T.P.«

Das Biogel wird ins Gleichgewicht gesetzt mit einer M/100-PhosphatpufferIösung von pH 6,8. Die Suspension des »Biogel H.T.P.« wird 30 Minuten lang in der Pufferlösung gerührt unter Verwendung von 10 ml Rohextrakt pro G;amm trockenes Absorptionsmittel. i lach Abtrennung der Lösung durch Filtration oder Zentrifugation wird der Bodensatz oder Feststoffrückstand isoliert, und der spezifische Widerstand des Überstands wird auf einen Wert unter 80 Ohm ■ cm gebracht. Nach erneuter Zentrifugation wird der Überstand ciialysiert und lyophilisiert.

4. Reinigung durch Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie wird auf einem Träger des Typs »AH-Sepharose 4 B« bewirkt, auf den zuvor ein spezifischer Inhibitor für den Plasminogenaktivator mit Hilfe eines Carbodiimids aufgekuppelt wurde.

Typische geeignete Inhibitoren sind z. B. ε-Aminocapronsäure, Aminoäthyl-cyclohexansäure, trans-4-Aminoäthvl-cvclohexan-carbonsäure und D-Aminomethvl-

50

b0

benzoesäure.

Die Affinitätschromatographie ist auch auf einer mit CNBr aktivierten Sepharose durchführbar, auf der Lysin oder eine andere der angegebenen Verbindungen fixiert werden kann. '

Alle anderen Trägermaterialien. auf denen ein derartiges Aufpfropfen realisierbar ist. können ebenfalls mit Erfolg verwendet werden, z. B. Materialien aus der Reihe der Biogele.

Dir Plasminogen-Aktivaior wird in einer 0.1 M-Phosphatpufferlösung von pH 7 bis 7,2 gelöst und dann durch eine Säule geleitet, die eines der angegebenen Trägermaterialien enthält. Die aktiven Substanzen werden an das Trägermaterial gebunden, während die inaktiven Proteine eluicrt werden. Die aktiven Substan- '' zen werden sodann eluiert mit Hilfe eines lonenstärke-Gradienten. und die aktive Fraktion kann nach einer der beiden folgenden Verfahrensweisen behandelt werden:

1. Ausfällung mit Hilfe eines Salzes, z. B. Ammonium- ²ⁿ sulfat, danach Dialyse und schließlich Lyophilisation, oder

2. Ausfällung in Form eines bei saurem pH-Wert unlöslichen Komplexes mit Hilfe eines Polysaccharids, danach Aufnahme des Komplexes in einer ²' Lösung bei neutralem pH-Wert und schließlich Lyophilisation.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. ^Jo

Das in den Beispielen verwendete Acetonpulver wurde nach der oben beschriebenen mit I. bezeichneten Verfahrensweise erhalten unter Verwendung von Mutterschweineierstöcken als Ausgangsmaterial.

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Beispiel 1

a) 1 kg des wie angegeben erhaltenen Acetonpuivers wurde in 501 einer wäßrigen Lösung von 10 kg Kaliumacetat/I suspendiert. Es wurde 1 Stunde lang gerührt, worauf Dekantieren gelassen wurde. Der klare Überstand wurde verworfen.

b) Zu dem erhaltenen Niederschlag wurden sodann 50 I kaltes Wasser, danach 1,5 kg Kaliumacetat und schließlich 1 I Eisessig zugesetzt, worauf mindestens 3 Stunden lang kräftig gerührt wurde. Der ^4:) unlösliche Anteil wurde durch Abschleudern entfernt, worauf die erhaltene Lösung filtriert wurde.

c) Die erhaltene Lösung wurde mit 7,5 kg Ammoniumsulfat versetzt, worauf bis zur vollständigen ^⁰ Lösung gerührt und schließlich mindestens 3 Stunden lang stehen gelassen wurde. Die überstehende Lösung wurde verworfen, und der Niederschlag wurde erneut in 101 Kaliumacetat einer Konzentration von 10 g/l gelöst. "

d) Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde mit Natronlauge auf 10 eingestellt, worauf 2 kg Ammoniumsulfat zugefügt wurden. Die Ausfällung wurde 2 Stunden lang vor sich gehen gelassen, und der gesammelte Niederschlag wurde in 5 1 Wasser gelöst.

e) Die erhaltene Lösung wurde eine Nacht lang gegen fließendes Leitungswasser dialysiert.

f) Der im Verlaufe der Dialyse gebildete unlösliche Anteil wurde verworfen, worauf die Lösung mit 500 mg Calciumchlorid behandelt, der pH-Wert auf 6,5 eingestellt und die Lösung erneut einer Dialyse unterworfen wurde gegen 30 1 Calciumchlorid in einer Menge von 100 mg/1. Nach 4 Stunden lai ger Dialyse wurde der gebildete Niederschlag gelöst in I I Wasser unter Zusatz von 5 ml Essigsäure. Die erhaltene Lösung wurde lyophilisiert.

Beispiel 2

a) I kg des wie angegeben erhaltenen Acetonpuivers wurde in 50 I kaltem Wasser suspendiert. Zu dieser Lösung wurden 50 g Kaliumchlorid zugefügt, es wurde gerührt, absetzen gelassen, und die Lösung wurde mit Hilfe eines Schwimmfilters abgetrennt.

b) Die feste Phase wurde in 50 I Wasser suspendiert, das mit 1,750 kg Kaliumchlorid und anschließend mit etwa 500 ml Eisessig versetzt wurde. Es wurde homoge itsicrt und 6 Stunden lang gerührt, worauf die Lösung filtriert wurde.

c) Die erhaltene Lösung wurde sodann mit 5 kg Natriumchlorid behandelt, und der erhaltene Niederschlag würde erneut in 10 1 Natriumchlorid einer Konzentration von 20 g/l gelöst.

d) Nach Neutralisation der Lösung mit Hilfe von Natronlauge wurden 1.750 kg Natriumchlorid zugesetzt. Der dabei erhaltene unlösliche Anteil wurde in 5 I Wasser aufgenommen und eine Nacht lang gegen fließendes Wasser dialysiert.

e) Der bei der Dialyse gebildete unlösliche Anteil wurde abgetrennt, und die zurückbleibende Lösung wurde mit dem dreifachen Volumen Aceton bei — 20⁰C ausgefällt. Der in einer minimalen Menge Wasser wieder aufgelöste Niederschlag wurde aulgebracht auf das Kopfende einer Säule von »Sepharose 6 B« (10x200) das ins Gleichgewicht gesetzt war mit einer Phosphatpufferlösung von pH 7,2. Das Verfahrensprodukt wurde aufgefangen in der eluierten Fraktion zwischen dem 2fachen und 2'/2fachen des Volumens der Säule. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde d;alysicrt und lyophilisiert.

Versuche zur Bestimmung der pharmakologischen
Eigenschaften

Bei dem untersuchten Produkt handelte es sich um das Produkt, das nach Ausfällung der Lösung beim isoelektrischen Punkt erhalten wurde.

1. Molekültyp

Es handelt sich um ein Molekül von Glycoprotein-Natur, dessen Molekulargewicht etwa 40 000 beträgt unter Bildung von Monomeren und Polymeren, die für alle enzymatischen Substanzen gleich sind.

Sein isoelektrischer Punkt (oder isoelektrischer pH-Wert) liegt bei 6,8.

Das Molekül ist in einer Phosphatpufferlösung mit einer Ionenstärke von 2000 Ohm · cm löslich.

2. Pharmakologische Eigenschaften

Das erhaltene Produkt hat 300 bis 500 CTA-Einheiten pro mg. Das aktive Zentrum befindet sich auf den Arginin-Valin-Peptidbindungen des Plasminogens, die geöffnet werden ohne Aufspaltung der Disulfidbrücken unter Überführung des Plasminogens in Plasmin.

Das Molekül erhält damit eine große Beweglichkeit durch Rotation um die Disulfidbrücken, was es ihm ermöglicht, seine enzymatische Aktivität zu entfalten und sich auf den Rezeptoren zu fixieren.

Die auf Fibrinplatten nach der Astrup-Methode in vitro durchgeführten Tests zeigten, daß das durch Lysis mit einer Lösung von 40 μg/ml bewirkte Durchmesser-

9 10

produkt über 400 mm-¹ betrügt. Injektion einer isotonischen Lösung von 25 mg/kg des

Auf JO Minuten lang bei 80"C" crhii/ien Platten (zur angegebenen Produktes führten zu einer 50%igen

Zerstörung des Plasminogens) war keine l.ysiszonc Verminderung der l.ysiszcit des lüiglobulingerinnsels.

feststellbar. was eine wesentliche Aktivierung des zirkulierenden

F.s war keine F.steraseaktivitiit festzustellen gegen- ■-, fibrinolytischen Systems bedeutet.

über Fstern der folgenden Aminosäuren: I.-Lysin. Das nach dem Verfahren der F.rfindung gewonnene ■

!.-Phenylalanin. L-Tryptophan. Lediglich die Methyl- Produkt erweist sich als besonders gut brauchbar als

ester von p-Tosylarginin und p-Nitrophcnyl-N-carbo- Medikament zur Behandlung von artiellen und venösen

bt.iZoxy-L-tyrosin werden gespalten. Thrombosen und von Fibrindepots. Das Produkt wird

Die in vivo nach der von lO'ila-Technik durchgeführ- |₀ zweckmäßig durch langsame intravenöse Injektion oder

ten Versuche durch Messung der Lysiszeii plasmati- durch Perfusion oder Infusion verabfolgt,
scher Fuglobulinc bei der Kalte durch intravenöse

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Hersteilung eines Plasminogen-Aktivators aus einem Acetonpulver aus tierischen Organen, welches aus den Lungen und Nieren von Schweinen, Kälbern, Rindern. Pferden. Lämmern oder Schafen oder aus Schweine-, Rinder- oder Schafeierstöcken besteht, dadurch gekennzeichnet, daß man das Acetonpulver behandelt Ό durch