DE1802386C2

DE1802386C2 - Verfahren zur Gewinnung von cytobiotischen Globulinen

Info

Publication number: DE1802386C2
Application number: DE1802386A
Authority: DE
Inventors: Robert Clamart Ardry; Michel Paris Robilliart
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 1967-10-10
Filing date: 1968-10-10
Publication date: 1984-02-02
Also published as: BE721924A; DE1818054C2; GB1247886A; DE1802386A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von cytobiotlschen Globulinen aus der Haut bzw. dem Fell gewisser Tiere oder dem Gewebe eines Tieres im Zustand foetalen Lebens.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, welches es ermöglicht, aus Organen gesunder Tiere, wie sie im Schlachthof erhalten werden können, .!. h. aus Organen, welche von Tieren stammen, die keinerlei vorhergehender Behandlung unterworfen worden sind, proteinhaltige Substanzen und insbesondere die an diesen Organen haftenden Globuline abzutrennen, die eine cytobiotische Aktivität besitzen, welche derjenigen vcn gewebezerslörenden Antikörperchen analog ist, die aus Tierblut erhalten werden, das zuvor einer langen Überimmunisierung mittels eines zweckentsprechenden Gewebe-Antigens unterworfen worden ist.

Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung der cytoblotlschen Globuline als biologisches Stimulans für die menschliche Haut. .

In der DE-PS 9 40 728 sind bereits regenerative organspezifische Seren beschrieben, die durch Immunisieren eines Tieres einer anderen Art mit antigenen Extrakten aus tierischen Organen hergestellt werden.

Es war allgemein bekannt, daß die eigentlichen immunologischen Wirkstoffe in Seren die Globuline darstellen. Ein Verfahren zur Gewinnung derartiger stabiler hochgereinigter y-Globulinpräparate ist z. B. in der DE-PS 9 17 209 beschrieben. Bei diesem Verfahren scheidet man aus der von Albuminen befreiten rohen Globulinfraktion des menschlichen oder tierischen Serums oder Plasmas bei einer bestimmten Ionenstärke und einem bestimmten pH-Wert sowie bei einer Eiweißkonzentration von 3 bk, 4% die Hauptmenge der /I-Globuline und anschließend In einer /weiten Stufe die Hauptmenge der jr-GlobuIlne durch Ausfällung ab und trennt anschließend unter Zusatz einer bestimmten Menge von Aluminiumhydroxydgel noch vorhandene geringe Restmengen von 2- und //-Globulin als unlösliche Aluminiumverbindungen ab.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Gewinnung von cylobioiischen Globulinen von hoher Reinheit und hoher Aktivität, das ohne den Weg über die Immunisierung direkt eingesetzt werden kann.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt gemäß der Erfindung durch die Schaffung eines Verfahrens zur Gewinnung von cytoblotischen Globulinen aus der Haut bzw. dem Fell gewisser Tiere oder dem Gewebe eines Tieres im Zustand foetalen Lebens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) die rasch zerkleinerten Gewebe mehrmals mit einer 0,9%lgen Natriumchloridlösung wäscht,

(b) anschließend In einem Mischer zerkleinert und In einer dem Zehnfachen seines Gewichtes entsprechenden Menge der gleichen Salzlösung etwa 1 h unter Rühren suspendiert,

(c) den unlöslichen Teil dann abtrennt und bei unter -20° C einfriert,

(d) wieder auftaut und abermals in einer dem Zehnfachen seines Gewichtes entsprechenden Menge der Salzlösung suspendiert,

(e) den unlöslichen Anteil abtrennt und mit der Salzlösung wäscht, bis nichts Lösliches mehr mitgeführt wird,

(0 zu dem erhaltenen unlöslichen Geweberest die 2- bis 3fache Menge seines Gewichts einer Natriumcitratlösung mit einem pH-Wert von 3,1 ±0,01 (lonenstärke 0,15 M) zusetzt, den pH-Wert der Mischung erforderlichenfalls durch Zugabe von Salzsäure auf 3,1 ±0,01 nachstellt, die Mischung 1 h bei Raumtemperatur stehenläßt und zentrifugiert,

(g) die überstehende Flüssigkeit durch Zusatz von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von nahe 6 bringt und den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren und Filtrieren entfernt,

(h) das Filtrat auf den pH-Wert von 7 einstellt und mit einer genügenden Menge einer 45%lgen Ammoni-

umsulfailösung versetzt, um eine endgültige Konzentration von 1,85 M zu erhalten, und einige Stunden stehenläßt, worauf

(i) der Niederschlag gesammelt, in reinem Wasser gelöst, die Lösung gegenüber reinem Wasser dialysiert, dann zentrifugiert, filtriert und lyophilisiert wird.

Die cylobiotischen Globuline weisen die folgenden Eigenschaften auf:

(a) sie haben keine aggressive oder toxische Aktivität gegenübtr dom menschlichen Organismus;

(b) sie haben einen spezifischen Tropismus für die homologen Gewebe von tierischen Geweben, aus denen sie abgetrennt bzw. isoliert worden sind;

(c) sie vermögen atf beschädigte Gewebe eine regenerative Wirkung auszuüben, die zu einer Wiederherstellung des normalen biologischen Kreislaufes führt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im nachstehenden näher erläutert.

1. Vorbereitung der Organe

Das für die Gewinnung spezifischer cytobiotischer Globuline ausgewählte Organ, welches beispielsweise die Niere für Globuline mit Nierenwirkung oder das Herz für Globuline mit Herzwirkung sein kann, wird sofort nach Erhalt vom Schlachthof oder, falls dies nicht möglich ist, n> nach einem Einfrleren verwendet, das unmittelbar nach der Abnahme des Organs von dem Tier vorgenommen wird. Die rasch zerkleinerten Organe oder Gewebe werden dann entsprechend den vorstehend angegebenen Stufen (a) bis (e) behandelt. In der Stufe (c) wird der unlösli- J> ehe Teil bei einer Temperatur von unterhalb 20° C eingefroren, um ein Reißen der Zellen hervorzurufen.

2. Eluieren der cytobiotischen Globuline

Es können mehrere Mittel verwendet werden, um die ■"> Bindungen zwischen den Proteinen aufzubrechen und damit aus dem Gewebe die cylobiotischen Globuline zu eluieren.

Beispielswelse kann der unlösliche Zellenanteil, der In einer Elulerlösung dispergiert Ist, einer Erwärmung auf ··> 6O⁰C während 15 Minuten unterworfen werden. Die Elulerlösung kann eine wäßrige 109blge Natrlumsallcylatlösung oder eine wäßrige Harnstofflösung, deren Konzentration je nach dem gewählten Organ zwischen 15 und 309b schwanken kann, oder eine der mit Puffer versetzten >" Lösung von variierender lonenstärke sein, die in dem alkalischen Bereich (Phosphatpuffer) pH-Werte von 9,5 bis 11 und In dem sauren Bereich (Cltratpuffer) pH-Wert von 2,8 bis 3,2 liefern können.

Jedoch weist das unter Verwendung einer der vorgenannten Elulerlösungen erhaltene Endprodukt einen variablen Heterogenitätsgrad auf und erfordert eine nachträgliche Reinigung.

Es wird daher gemäß der Erfindung ein besseres Ergebnis erhalten, wenn eine Elulerlösung mit einem to pH-Wert von 3,1 ±0,01 verwendet wird und wenn dem Eluieren eine erste Entfernung des nicht cytobiotischen Anteils durch Übergang auf einen pH-Wert von 6 nachfolgen gelassen wird (vgl. Stufen (Γ) und (g)].

Diese Relnigungsbehandlung In den Stufen (f) und (g) Ist für die spätere ausschließliche Gewinnung der cytobiotischen Globuline wesentlich.

Nach Ausführung der Stufe lh) wird nach Stehenlassen während einiger Stunden der gebildete Niederschlag gesammelt und in der gerade erforderlichen Menge gereinigten Wassers aufgelöst. Die Lösung wird gegenüber gereinigtem bzw. destilliertem Wasser dialysiert, bis jede Spur des Ammoniumsalzes verschwunden ist. Es bildet sich allgemein ein neuer Niederschlag, der durch Zentrifugieren der dialysierten Lösung entfernt wird.

3. Konzentration der cytobiotischen Globuline

Die nach dem Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit kann gemäß zwei verschiedenen Arbeitsweisen behandelt werden, je nachdem, ob sogenannte »rohe« cytobiotische Globuline, d. h. solche, die mit Proteinen mit verringerter cytobiotischer Aktivität oder mit einer cytobiotischen Aktivität Null gemischt sind, oder cytobiotische Globuline von hohem Reinheitsgrad erhalten werden sollen.

In dem ersten Fall wird die dialysierte und zentrifugierte Lösung filtriert und lyophilisiert. Das trockene Endprodukt besteht aus den »rohen« cytobiotischen GIobulinen, die für die Verwendung in ein geeignetes Auflösungsmittel eingeschlossen werden.

In dem zweiten Fall wird der dialysierten und zentrifugierten Lösung Nalriummonophosphat zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,0175 M (pH-Wert 6,3) zu erhalten. Diese Lösung wird danach durch eine Säule von Diäthylaminomethylcellulose hindurchgeführt, die in einer Puffet lösung von Mononatriumphosphat von 0,2 M (pH-Wert 6,3) dispergiert war, und dann mit dem Mononatriumphosphatpuffer von 0,0175 M (pH-Wert 6,3) gewaschen. Die endgültigen A.nteile werden durch den gleichen Puffer elulert. Das Eluat enthält die »gereinigten« cytobiotischen Globuline, die im wesentlichen IgG-Globullne darstellen.

Nach erneutem Dialysleren und Filtrieren wird die Lösung lyophilisiert. Der trockene Rückstand besteht aus cytobiotischen Globulinen von hohem Reinheitsgrad. Diese Globuline werden zum Zeltpunkt ihres Gebrauchs in dem geeigneten Auflösungsmlttel gelöst. Die so erhaltenen cytobiotischen Globuline besitzen eine Anzahl von Eigenschaften, die sie für ihre Verwendung in der Kosmetik geeignet machen. So haben die aus der Haut bzw. dem Fell gewisser Tiere oder aus dem Gewebe eines Tieres im Zustand foetalen Lebens Isolierte Substanzen auf die menschliche Oberhaut und selbst auf die Lederhaut eine stimulierende Wirkung, die sich in einer neuen Kräftigung und einem besonders frischen Aussehen der Haut äußert.

Die cytobiotischen Globuline können auf die Haut In Form einer Creme, einer Pomade usw. oder in Form einer Lösung, einer Lotion, einer Milch usw. aufgebracht werden.

Unabhängig von der verwendeten Form kann eine Regenerierung der Teile des Körpers, auf die sie aufgebracht wird, erhalten werden, und es ergibt sich daraus ein frisches Aussehen der Haut und eine sehr bemerkenswerte Straffung der Gewebe.

Nachstehend werden zwei Beispiele von In der Kosmetik verwendbaren Zusammensetzungen angegeben, die cytobiotische Globuline enthalten.

Beispiel 1
(Revitallslerungscreme) (Regenerierungscreme)

5%ige wäßrige Lösung von 4 g

cytobiotischen Globulinen

polyoxyäthylenlerte Olelnglyceride 5,2 g

Glykolstearat 22 g

Glycerin 1 gleiche Teile

gereinigtes bzw. destilliertes Wasser J auf 100 g

Beispiel 2 (Hautmilch?

5%ige wäßrige Lösung von 4 g

cytobiotischen Globulinen

polyoxyäthylenierte Oleinglyceride 10 g

Polyäthylenglykolstearat 10 g

p-Natriummethyloxybenzoat 0,10 g

gereinigtes bzw. destilliertes Wasser auf 100 ml

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der cytobiotischen Globuline in einem Arzneimittel in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die insbesondere als biologisches Stimulans und Aktivator des Zellenmetabolismus verwendbar ist.

Die gemäß dem eingangs beschriebenen Verfahren erhaltenen cytobiolischen Globuline liegen in Form eines sehr leichten Pulvers vor, das eine etwas ins Graue gehende weiße Farbe hat und in Wasser und in physiologischem Serum löslich ist.

Diese cytobiotischen Globuline wurden einer pharmakologischen Prüfung unterzogen, die ihre biologische Aktivität erkennbar gemacht hat, welche zu einer metabolischen Stimulierung der Gewebe führt.

1. Wirkung auf embryonale Organe in einer Kultur der

Organe

Das embryonale Organ in Organkultur ist ein gewähltes Material, um die biologische Aktivität und den Grad der Cytotoxlzität eines Produktes erkennbar zu machen. Die Empfindlichkeit des Kulturgewebes ist außerordentlich hoch und ermöglicht sehr feine Bestimmungen. Dem Kulturmedium wurden acht Tropfen einer l%igen Lösung des untersuchten Globulins je ml des Mediums zugesetzt.

Im Falle des embryonalen Schienbeins (tibia) wurde das tägliche Wachsen photographisch ausgezeichnet, und der Vergleich mit einer Kontrollkultur zeigte ein beschleunigtes und intensiveres Wachsen in Gegenwart des Globulins sowie eine beträchtliche Verminderung von Mißbildungen. Diese Mißbildungen betrugen bei den Kontrollproben 70% und im Fall der mit dem spezifischen Globulin behandelten Schienbeinproben nur 20%.

Eine an den Körpern dieser Schienbeinproben durchgeführte Autoradiographle zeigte einen viel intensiveren Einschluß von radioaktivem Schwefel Si< (der aus dem dem Nährmedium zugesetzten markierten Methionin stammt) als bei den Kontrollproben.

2. Die auf die Gewebe ausgeübte Erneuerungswirkung

Die spezifischen Globuline riefen die Heilung von experimentellen Wunden In einer merklich kürzeren Zeit als bei den Kontrollproben hervor.

Dieses Phänomen ist an Knochenbeschädigungen bei einer Ratte sichtbar gemacht worden. Die Geschwindigkeit der Verheilung war Im Mittel doppelt so hoch wie bei den Kontrollproben.

(a) Wirkung auf die Niere

Die Erzeugung von Nierenschäden der Amyloseart durch Injektion von Nalriumcaseinat wurde durch die gleichzeitige Verabreichung des spezifischen Globulins verlangsamt oder verhindert. Der Schutz der Niere war derart, daß die behandelten Tiere überlebten, während die Kontrolltiere starben.

(b) Wirkung auf dip Leber

Die Gewebeerneuerung ging nach einer operativen Entfernung eines großen Teiles der Leber erheblich lascher nach der Verabreichung von Leberglobulinen vor sich.

(c) Wirkung auf die Haut

Auch in diesem Fall wurde die Gewebeerneuerung ίο beschleunigt, wenn die experimentelle Wunde mit einer Lösung des spezifischen Hautglobulins behandelt wurde; gegenüber den Kontrollproben war die Geschwindigkeit der Wundenheilung verdoppelt.

Anhand von verschiedenen durchgeführten Testen konnte außerdem festgestellt werden, daß die cytobiotischen Globuline beim Tier die folgenden Eigenschaften ergaben:

Schutz der Maus gegen akute Vergiftung durch Ammoniumchlorid;

Beschleunigung des Metabolismus bei der Ratte, die einer aus dem Gleichgewicht gebrachten und mangelhaften Ernährung ausgesetzt war;

Doping-Effekt bei unterernährten Tieren, die mit Beginn der Wiederaufnahme der normalen Nahrung einem Test hinsichtlich der physischen Aktivität unterworfen wurden;

Protido-anabolische Wirkung, bei der jede androgene Wirkung fehlte;

Verzögerung des Auftretens der Muskelermüdung; Zurückhaltende Wirkung auf den Arteriendruck des Kaninchens;

Beschleunigung der Heilung von experimentellen Wunden zufolge von Verbrennung beim Kaninchen.

Die toxikologische Untersuchung der cytobiotischen Globuline hat erwiesen:

daß sie keine akute Vergiftung bei der Maus und dem Meerschweinchen verursachen;

daß sie keine chronische Vergiftung bei dem Kaninchen und dem Meerschweinchen verursachen; •fo daß sie keine Antikörper enthalten, die mittels der Diffusionsmethode in Gelose gegen verschiedene menschliche, amniotische und vom Schwein stammende Zellen auffindbar sind;

daß sie keine Antikörper enthalten, die mittels Fixierung des Komplementes gegen zerriebene menschliche, amniotische Zellen und zerriebene Schweinenieren auffindbar sind;

daß sie keine teratogene Aktivität bei der Maus, der Ratte und dem Kaninchen verursachen, so Zur Anwendung In der menschlichen Therapie können die nachstehend als Beispiele genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen benutzt werden:

Lösung zur parenteralen Injektion

Lyophilisat von spezifischen 10 mg

Globulinen (Niere, Leber, Haut)

physiologisches Serum 2 ml

je Ampulle

Lösung für lokale Anwendungen

Lyophilisat von spezifischen 0,60 g

Mehrfachgewebe-Globulinen
Lösungsmittel (destilliertes Wasser 100 ml

oder physiologisches Serum) q.s.p.

Es können auch andere Formen, wie z. B. Zäpfchen, benutzt werden.
Die cytobiotischen Globuline sind In der menschlichen

Therapie bezüglich Störungen In der Ernährung, Aslhenie- und Abmagerungserscheinungen untersucht worden..

Das Medikament wurde In Form einer Injizierbaren Lösung verabreicht. Die intramuskuläre Verabreichung erwies sich ebenfalls als frei von Nachtellen.

Der angenommene Verabreichungsrhythmus bestand aus zwei bis drei Injektionen je Woche. Die Dauer der Behandlung betrug drei Wochen.

Die erzielten Ergebnisse waren allgemein gut.

In der Geriatrie waren die Ergebnisse noch ausgeprägter. Die Besserungsquole lag in der Größenordnung von 80% der Rille.

Die Wiederholung der Injektionen hatte keinerlei Sensibilitatsslörung nach sich gezogen.

Claims

Patentansprüche: ίο

1. Verfahren zur Gewinnung von cylobioiischen Globulinen aus der H₁UIt bzw. dem Fell gewisser Tiere oder dem Gewebe eines Tieres im Zustand foeialen Lebens, dadurch gekennzeichnet, daß man

(c) den unlöslichen Teil dann abtrennt und bei -20° C einfriert,

(d) wieder auftaut und abermals in einer dem Zehnfachen seines Gewichts entsprechenden Menge der Salzlösung suspendiert.

(e) den unlöslichen Anteil abtrennt und mit der Salzlösung wäscht, bis nichts Lösliches mehr mitge- ^ führt wird,

(D zu dem erhaltenen unlöslichen Geweberest die 2-bis 3fache Menge seines Gewichts einer Natriumcltratlösung mit einem pH-Wert von 3,1 ±0,01 (Ionenstärke 0,15M) zusetzt, den pH-Wert der Mischung erforderlichenfalls durch Zugabe von " Salzsäure auf 3,1 ±0,0! nachstellt, die Mischung 1 h bei Raumtemperatur stehenläßt und zentrifugiert,

(h) das Filtrat auf den pH-Wert von 7 einstellt und mit einer genügenden Menge einer 45%igen _J5 Ammoniumsulfatlösung versetzt, um eine endgültige Konzentration von 1,85 M zu erhalten, und einige Stunden stehenläßt, worauf

U) der Niederschlag gesammelt, in reinpm Wasser gelöst, die Lösung gegenüber reinem Wasser dialyslert, dann zentrifugiert, filtriert und lyophilisiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der dlalyslerten und zentrifugierten Lösung von (I) Natriummonophosphat bis zu einer ⁴^ Konzentration von 0.0175 M zusetzt (pH 6,3), die Lösung durch eine Säule von Diäthylaminomelhyrcellulose, die in einer Pufferlösung von Mononatrlumphosphat von 0,2 M (pH 6,3) dlsperglert war, hindurchführt und dann mit Mononatriumphosphatpuf- ⁵ⁿ ferlösung (0,0175 M, pH 6,3) elulert, das Eluat dialysiert und filtriert und das Filtrat lyophilislert.

3. Verwendung der nach Anspruch 1 oder 2 erhaltenen cytoblotlschen Globuline als biologisches Stimulans für die menschliche Haut.