DE2234832C2 - Proteinfreies Hormonkonzentrat von Säugetier-Nebenschilddrüsen, dessen Herstellung und dieses Hormonkonzentrat enthaltende pharmazeutische Präparate - Google Patents

Proteinfreies Hormonkonzentrat von Säugetier-Nebenschilddrüsen, dessen Herstellung und dieses Hormonkonzentrat enthaltende pharmazeutische Präparate

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DE2234832C2 DE2234832A DE2234832A DE2234832C2 DE 2234832 C2 DE2234832 C2 DE 2234832C2 DE 2234832 A DE2234832 A DE 2234832A DE 2234832 A DE2234832 A DE 2234832A DE 2234832 C2 DE2234832 C2 DE 2234832C2
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Description

2. Verfahren zum Herstellen des wasserlöslichen, proteinfreien Hormonkonzentrats nach Anspruch 1, erhaltlich durch die folgenden Verfahrensschritte:
a) Entfetten getrockneter und vermahlener Säugetier-Nebenschilddrüsen oder deren Gewebe- und Zellkulturen mittels Aceton und Chloroform,
b) Extrahieren des nach a) erhaltene.» entfetteten und getrockneten Nebenschilddrüsenpulvers mit destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur und Zentrifugieren des erhaltenen Extrakts,
3n c) Ausfällen der Proteine In dem nach b) erhaltenen Extrakt mittels Trichloresslgsäure oder Sulfosallcylsäure, Abzentrifugleren des Niederschlags und Entfernen der ProteinfSllungsmlttel aus dem Extrakt, der dabei auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5 eingestellt wird,
d) Lyophlllsieren des nach c) erhaltenen Extrakts,
e) Isolieren des Hormonkonzentrats aus dem nach c) erhaltenen Extrakt oder dem nach d) erhaltenen LyopMIisats durch Gelfiltration nach der absteigenden Methode an Sephadex Gl5 und Wasser als Eluent und
0 Lyophllisierung der bei der Gelfiltration nach e) gegebenenfalls getrennt aufgefangenen Fraktionen, die zuvor noch einer weiteren Reinigung durch Dialyse, Extraktion, Ionenaustauscher und/oder Chromatographie unterworfen werden können.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial für Verfahrensstufe a) Rindernebenschilddrüsen In Pulverform verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Protelnfäilung gemäß Verfahrensstufe c) mit überschüssiger Trichloresslgsäure durchführt und den Trlchloresslgsäureüberschuß durch Extrak- tion mit Äther entfernt oder durch Erhitzen zerstört.
5. Pharmazeutisches Präparat, das als Wirkstoff das nach den Ansprüchen 1 bis 4 erhältliche Produkt enthält.
Die Erfindung betrifft ein wasserlösliches, proteinfreies Hormonkonzentrat von Säugetier-Nebenschilddrüsen, dessen Herstellung aus Säugetier-Nebenschilddrüsen und pharmazeutische Präparate, die diese Hormonkonzentratlon enthalten.
Es ist bekannt, daß die Nebenschilddrüse von Säugetieren die Hormone Parathormon und Calcltonln bildet bzw. enthält. Beide Hormone stellen Polypeptide dar, von denen das Parathormon den Calclum-Clutsplegel erhöht und Calcltonln - der Gegenspieler des Parathormons - den Calclumsplegel senkt.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Nebenschilddrüse von Säugetieren noch ein weiteres Hormon bildet bzw. enthält, das Im Gegensatz zum Parathormon und zum Calcium den Calcltonln-Blutsplegel nicht beeinflußt aber den Slllclum-Blutsplegel und den Vitamin A-Blutspiegel erhöht und außerdem den Blutzuckergehalt des Blutes senkt. Dieses neue Hormon wurde Lltoralon genannt.
Es wurde weiterhin gefunden, daß das neue Hormon Lltoralon In den organischen Lösungsmitteln Aceton, Benzol, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich Ist, In Wasser löslich ist, eine positive Nlnhydrlnreaktion gibt, durch das Polypeptld-Fällungsmlttel Trichloresslgsäure In wäßriger Lösung nicht fällbar Ist, die Elemente C, H, N, O und S enthält und ein MG zwischen 200 und 1000 aufweist.
Die Erfindung betrifft ein wasserlösliches, proteinfreies Hormonkonzentrat von Säugetier-Nebenschilddrüsen, das ein Molekulargewicht zwischen 200 und 1000 hat, In Benzol, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff unlös-
Hch ist, durch Trichloresslgsäure nicht gefällt wird, eine negative Biuretreaktion und eine positive Nlnhydrinreaktion aufweist und durch die folgenden Verfahrensschritte erhältlich 1st:
a) Entfetten getrockneter und vermahlener Säugetier-Nebenschilddrüsen oder deren Gewebe- und Zellkulturen mittels Aceton und Chloroform,
b) Extrahieren des nach a) erhaltenen entfetteten und getrockneten Nebenschilddrüsenpulvers mit destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur und Zentrifugleren des erhaltenen Extraktes,
c) Ausfällen der Proteine in dem nach b) erhaltenen Extrakt mittels Trichloressigsäure oder Sulfosalicylsäure, Abzentrifugieren des Niederschlags und Entfernen der Proteinfällungsmittel aus dem Extrakt, der dabei auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5 eingestellt wird, ;i|
d) Lyophilisieren des nach c) erhaltenen Extraktes,
e) Isolieren des Hormonkonzentrats aus dem nach c) erhaltenen Extrakt oder dem nach d) erhaltenen Lyophilisat durch Gelfiltration nach der absteigenden Methode an Sephadex Gl 5 und Wasser als Eluent und
0 Lyophllisierung der bei der Gelfiltration nach e) gegebenenfalls getrennt aufgefangenen Fraktionen, die zuvor noch einer weiteren Reinigung durch Dialyse, Extraktion, Ionenaustauscher und/oder Chromatographie unterworfen werden können.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung der wasserlöslichen proteinfreien Honr.onkonzentration aus Säugetier-Nebenschilddrüsen mittels Verfahrensstufen a) bis f).
Als Ausgangsmaterial für Verfahrensstufe a) können die Säugetier-Nebenschilddrüsen sowie deren Gewebe- oder Zeükulturen verwendet werden. Der Vorzug wird lyophlllslertem Rindernebenschilddrüsenpulver gegeben, das im Handel erhältlich ist.
Das lyophillslerte Nebenschilddrüsenpulver wird zur Befreiung von Fetten zweckmäßig nach der Methode von Auerbach mehrfach mit Aceton und Chloroform behandelt, wobei der Fettloser Chloroform auch durch den Fettloser Benzol ersetzt werden kann.
Aus dem so erhaltenen fettfreien Nebenschilddrüsenpulver wird das Lltoralon in Verfahrensstufe b) durch Wasserextraktion von den wasserunlöslichen Begleitstoffen abgetrennt und in die wäßrige Phase übergeführt. Die wäßrige Phase gibt eine positive Nlnhydrln-, Biuret- und Trichlores&igsäurereaktion.
In Verfahrensstufe c) wird der nach Stufe b) erhaltene wäßrige, Lltoralon enthaltende Extrakt zur Entfernung der Proteine bzw. der Polypeptide, zu denen das Parathormon und das Calcltonln gehört, zweckmäßig mit überschüssiger Trichloresslgsäure behandelt und von dem dabei gebildeten Niederschlag befreit. Das neue Hormon Litoralon, das durch Trichloressigsäure nicht fällbar ist, verbleibt in der wäßrigen Lösung, die nun eine negative Biuret- und eine negative Trichloressigsäurereaktlon, aber eine positive Ninhydrinreaktion gibt.
Zur Entfernung der überschüssigen Trichloresslgsäure wird die erhaltene, von Proteinen befreite Lösung zweckmäßig einer Reihe von Ätherextraktionen unterworfen, bis die wäßrige Lösung einen pH-Wert von 4,5 bis >5 5 hat. Hierzu sind etwa 17 bis 18 Extraktionen nötig, In der Praxis sind es gewöhnlich 20 bis 25 Extraktionen. Es Ist auch möglich, die Überschüssice Trichloressigsäure durch Erhitzen unter Bildung von Chloroform und Kohlendioxid zu zerstören.
Der nach Stufe c) erhaltene, von Proteinen und Trichloresslgsäure befreite wäßrige Extrakt wird vor oder nach einer Lyophllisierung gemäß Stufe d) der Gelfiltration nach der absteigenden Methode an Sephadex G 15 mit Wasser als Eluent [Stufe e)] unterworfen, wobei aus dem Litoralonkonzentrat die anorganischen Begleitstoffe vollständig, die Nucleotide teilweise entfernt werden.
Die bei der Gelfiltration nach Stufe e) gegebenenfalls getrennt aufgefangenen Fraktionen werden zweckmäßig einer weiteren Reinigung durch Dialyse, Extraktion, Ionenaustauscher und/oder Chromatographie vor der Lyophllisierung unterworfen, um die Polypeptide mit niedrigem MG zu entfernen.
Das In Verfahrensstufe 0 nach dem Lyophilisieren erhaltene Litoralonkonzentrat enthält noch Aminosäuren und Nucleotide, die jedoch die Hormonwirkung nicht stören.
Die nach Verfahrensstufe 0 erhältlichen Lltoralonkonzentrate weisen gleichzeitig folgende Wirkungen auf: sie senken den Blutzuckerspiegel, sie erhöhen den Slliclumsplegel des Blutserums, wodurch die Elastizität bzw. der Turgor der elastischen Gewebe aufrechterhalten und eine Degenerierung der Bindegewebe durch gestörte CaIcI- so flzlerung mit nachfolgender Verkalkung vermieden wird, und sie erhöhen den Vitamin-A-Splegel Im Blutserum, was sich auf die Wundheilung Im Bereich der Haut und Schleimhaut und auf den Gehalt an Spurenelementen günstig auswirkt.
Die kombinierte Wirkung des Litoralonkonzentrats auf den Blutzucker, den Vltamln-A- und den Slliciumgehalt des Blutserums sind ein Anzeichen für ein breites Wirkungsspektrum des Lltoralons.
Klinische Versuche zeigten, daß durch die Behandlung mit dem Litoralonkonzentrat bei den bisher als therapiereslstent geltenden Krankheitsbildern Ocaena und Sjögren Syndrom Hellungen erzielt, bei Vltlllgo eine Replgmentlerung der weißen Hautflecken In einem bisher nicht erreichten Ausmaß beobachtet und bei den bekanntlich unbehandelbaren rezldlvlerenden Herpesfällen Erfolge erzielt worden sind. Klinische Versuche zeigten ferner, daß das Litoralonkonzentrat bezüglich der Strahlenschutzwlrkung und der Immunstimulierenden sowie. der Immunregulierenden Wirkung den bislang auf diesen Gebieten verwendeten Verbindungen überlegen Ist, was auch darauf zurückzuführen Ist, daß Lltoralon praktisch nicht toxisch ist und deshalb über einen längeren
|| Zeltraum verabreicht werden kann.
Il Die Erfindung betrifft auch Präparate, die als Wirkstoff das Litoralonkonzentrat enthalten. Das Hormonkonzentrat wird in an sich bekannter Welse unter Verwendung der üblichen Hilfsmittel In die üblichen Präparate- f>5 formen für die Innerliche und äußerliche Anwendung übergeführt.
Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.
Beispiel 1
a) 10 g lyophllislerte und gemahlene Rindernebenschilddrüsen in Pulverform werden zur Entfernung von Fett nach der Methode von Auerbach bei Raumtemperatur zunächst mit 25 ml abs. Aceton gründlich vermischt
und durch Filtration über einen Glasfilter (G4, Schott) von der Flüssigkeit befreit. Sodann wird das gut
abgesaugte Nebenschilddrüsenpulver bei Raumtemperatur mit 25 ml Chloroform gründlich vermischt und durch Filtration über einen Glasfilter (G4, Schott) von der Flüssigkeit befreit. Diese Operation wird noch einmal wiederholt. Anschließend wird d's abgesaugte Substanz noch einmal bei Raumtemperatur In 25 ml abs. Aceton suspendiert und nach dem Absaugen auf einen Glasfilter (G4, Schott) bei Raumtemperatur im
ίο Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 7-9 g trockenes, fettfreies Drüsenpulver. (Das genaue Gewicht hängt
vom Fettgehalt des Ausgangsmaterials ab.)
b) 10 g gemäß a) erhaltenes, entfettetes, wasserfreies Nebenschilddrüsenpulver extrahiert man bei Raumtemperatur 3mal je 1 Stunde mit je 100 ml destilliertem Wasser, wobei nach jeder Extraktion die wäßrige Extraktflüssigkeit in einer Laborzentrifuge hoher Drehzahl vom DrCsenpulver abgetrennt und bis zur weiteis ren Verwendung unter Stickstoff Im Temperaturbereich von 3-5° C aufbewahrt wird. Die erhaltenen wäßrigen Extrakte geben eine positive Ninhydrin-, Biuret- und Trichloresslgsäurereaktlon.
c) Die gemäß b) erhaltenen wäßrigen Extrakte werden vereinigt, tropfenweise unter ständigem Schütteln so lange mit 50 vol.-%iger wäßriger Trichloresslgsäurelösung versetzt, bis die Trichloresslgsäure-Konzentratlon 15« betragt, und 1 Stunde bei 3-5° C stehen gelassen. Danach zentrifugiert man den gebildeten Protelnnle-
derschlag ab. Dabei wird als überstehende Schicht eine klare, fahlgelbe wäßrige Lösung erhalten, die eine
positive Nlnhydrlnreaktlon aber eine negative Biuret- und eine negative Trichloresslgsäurereaktlon gibt. Aus der erhaltenen Losung wird die überschüssige Trichloresslgsäure bei Raumtemperatur durch serienmäßige Extraktion mit wäßriger Ätherlösung (1-1,2 Vol.-Teile Äther, 1 Vol.-Tell Wasser) entfernt, bis die wäßrige Phase einen pH-Wert zwischen 4,5 und 5 aufweist. Hierzu sind mindestens 17-18 Extraktionen
notwendig, In der Praxis werden 20-25 Extraktionen durchgeführt.
Aus der erhaltenen wäßrigen Lösung wird der Äther mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe bei einer 30° C nicht übersteigenden Temperatur entfernt, was etwa 6 Stunden In Anspruch nimmt und mit einer Volumenverminderung einhergeht, da mit dem Äther auch Wasser verdampft. Die Wasserstrahlbehandlung Ist beendet, wenn die Lösung keinen Äthergiruch mehr aufweist.
d) Die so erhaltene Lösung wird der Lyophlltslerung unterworfen, wobei man eine hygroskopische Substanz erhält, die In einem dicht verschlossenen Gefäß aufbewahrt wird. Die Ausbeute betragt - auf das nicht entfettete Nebenschilddrüsenpulver bezogen - 50-15%, was vom Fettgehalt des Ausgangsmaterials abhängt, e) 5 g des nach d) erhaltenen Lyophlllsats werden in einer Sephadex G-15 enthaltenden Kolonne der Gelfiltration nach der absteigenden Methode unterworfen. Als Eluent wird Wasser verwendet.
Durchmesser der Kolonne: 4,3 cm Höhe der Kolonne: 144 cm Durcnflußgeschwlndigkelt: 60 ml/h Fraktionsgröße: 15 ml. Menge der während der Fraktionierung aufgefangenen lyophllislerten Proben:
Menge (mg)
Röhrchen-Nr. 913
46- 83 1126
84- 98 900
99-118 1416
119-136 24
137-154 3
155-170 19
185-198 2
221-230 15
238-265 1
279-285
Gesamtmenge: 4518 mg (90%)
Die Hauptfraktion Ist in den Röhrchen Nr. 46-83 enthalten; das Gesamtgewicht beträgt 913 mg und die Ausbeute - auf das trockene - nicht entfettete Nebenschilddrüsenpulver bezogen - etwa 2-2,5%. Die Lltoralkonzentratlon Ist bereits so hoch, daß diese Fraktion eine ausgeprägte physiologische bzw. therapeutische Wirkung bei einer Dosierung von 5-10 μg/kg Körpergewicht aufweist.
Die aktive Substanz Ist In den Fraktionen der ersten beiden Peaks der Gelfiltration enthalten. Für die Prüfung der einzelnen Fraktionen werden zweckmäßig folgende Methoden angewandt:
a) spektrophotometrische Absorptionsmessung bei 280, 234 und/oder 360 um,
b) Messung der elektrischen Leitfähigkeit,
c) qualitative Chlorionenbestimmung mit Silbernitratlösung,
d) pH-Messung der zu den einzelnen Peaks gehörenden kombinierten Fraktionen,
e) Nlnhydrln-Test,
f Beurteilung der Opaleszenz und Farbe (gelblich) mit unbewaffnetem Auge.
Beispiel 2
5 g eines nach der Trichloressigsäurefallung gemäß Beispiel 1 c) erhaltenen Protein-freien wäßrigen Extraktes werden der Gelfiltration gemäß Beispiel 1 e) unterworfen, jedoch mit dem Unterschied, daß die Fraktionen mit den beiden ersten Peaks getrennt aufgefangen werden. Auf cMese Welse erhält man
302 mg einer Hauptfraktion I und
555 mg einer Hauptfraktion II.
456 mg der Hauptfraktion II werden einer weiteren Gelfiltration unterworfen, wobei man als Eluent
Wasser verwendet. m
Durchmesser der Kolonne: 4,3 cm
Höhe der Kolonne: !44 cm
Durchflußgeschwindigkeit: 50 ml/Std.
Fraktionsgröße: 10 ml i;
Kolonnenfüllung: Sephadex G-15
Auf diese Weise wird die Hauptfraktion II In drei weitere Peaks aufgeteilt. Die zu dem mittleren Peak gehörenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wobei man 237,5 mg Festsubstanz erhält. Die Ausbeute auf nicht entfettetes Nebenschilddrüsenpulver bezogen - beträgt 0,6-0,8*.
Diese Fraktion weist die physiologische bzw. therapeutische Wirkung des Lltoralons In einer Dosis von 1 μg/kg Körpergewicht auf.
Wird das erhaltene Produkt einer weiteren chromatographischen Reinigung mittels einer Cellulose- oder Ionenaustauscher-Kolonne unterworfen, um weitere begleitende Verunreinigungen, wie Aminosäuren (Lysin, Glutaminsäure) zu entfernen, erhält man in einer Ausbeute von 0,3-0,4% - auf das grockene, nicht entfettete :> Nebenschilddrüsenpulver bezogen - ein Präparat, das in einer Dosis von weniger als 1 μg/kg Körpergewicht die Aktivität des Litoralons zeigt.
Beispiel 3
700 mg eines nach der Trichioressigsäureiaiiung gemäß Beispiel 1 c) erhaltenen Protein-freien Lyophlllsats werden in 33 ml destilliertem Wasser gelöst und bei 5° C in einer Dialysiermembrane (Kalle 44) zunächst 2mal gegen 100 ml Wasser und dann 13mal gegen 150 ml Wasser dialyslert, wobei die äußere wäßrige Phase alle 3,5 Stunden ausgetauscht wird. In den 3 Nächten wird die wäßrige Phase nach 16 Stunden ausgetauscht.
Nach Beendigung der Dialyse sind in der Membrane 41 ml Lösung (nicht dialysierender Teil) enthalten, die nach dem Lyophilisieren 35 mg gereinigtes Hormonkonzentrat geben.
Aus der außerhalb der Membrane befindlichen Phase werden nach Einengen i.v. bei 30° C und Lyophilisieren 662 mg Trockensubstanz erhalten.
B e i s ρ! e! 4 (nachgereicht) 4u
5,1 g eines nach Beispiel 1 d) erhaltenen Lyophllisats werden in einer Sephadex G-15 (Teilchengröße 90 χ 120 μ) enthaltenden Kolonne der Gelfiltration der absteigenden Methode unterworfen.
Das Elutionsdiagramm wird durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt, wobei 7 Peaks (A-G) erhalten werden.
Charakteristische Parameter der Gelfiltration:
Durchmesser der Kolonne: 4,85 cm
Höhe der Kolonne: 149 cm
Durchflußgeschwindigkeit: 0,78 ml/Min.
Dauer: 10 Min.
Fraktionsgröße: 7,8 ml/Röhrchen.
Peaks Röhrchen-Nr.
A 71-103
B 104-128
C 129-134
D 135-162
E 163-189
F 190-217
G 218-227.
Der Wirkstoff ist in der Fraktion mit Peak B enthalten.
Bis zum Röhrchen Nr. 104 beträgt das Volumen des Eluats 814 ml. Das Gesamtvolumen der Fraktion B beträgt 188 ml.
Aus Fraktion B erhält man nach dem Lyophilisieren 0,43-0,53 g Festsubstanz.
Bei Durchführung der Gelfiltration unter den oben angegebenen Bedingungen erscheint der Wirkstoff Litora-
lon bei dem Volumen (0,67 ± 0,02) · V0, wobei V0 das Eluatvolumen ist, bei dem die anorganischen Ionen Im Eluat erscheinen (und mit Silbernitrat eine positive Chlorldreaktlon geben).
301 mg der nach der Lyophillsierung der Fraktion B erhaltenen Festsubstanz werden In eine 30%lge wäßrige Lösung übergeführt, die mit einem Ameisensäure-Essigsäure-Gemisch auf pH 1,8 eingestellt worden ist. (86 ml Eisessig und 25 ml 88 vol.-%lge Ameisensäure mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.) Diese Lösung wird auf einer mit Dowex 50 χ 2 gefüllten Kolonne Chromatographien.
Kolonnengröße: 132 χ 1 cm
Durchflußgeschwindigkeit: 13 ml/Std.
Fraktionsgröße: 4 ml.
Die Elnzelfraktlonen von je 4 ml werden auf Grund der bei 280 nm gemessenen Extlnktlonspeaks zu den Fraktionen A-I vereinigt.
Bezeichnung der Röhrchen-Nr. Menge des Lyophllisats
Fraktionen (mg)
8,4 18,4 64,4 5,2 2,2 0,5 3,1 7,3
6J
116,3 (38,6%)
Die aktive Substanz, das Litoralln, Ist In den Fraktionen D, E und F enthalten, die vereinigt werden und nach dem Lyophilisieren 7,9 mg Festsubstanz ergeben, was 2,696 der bei der Gelfiltration erhaltenen Ausgangsfraktion B entspricht.
Die bei der Ionenaustauscherchromatographie aus den Fraktionen D, E und F erhaltene Festsubstanz wird anschließend auf einem Whatman MM-Papier von 22 cm Breite bei pH 1,8 und einer Spannung von 1500V 90 Minuten der Elektrophorese unterworfen. Materialbelastung 0,5 mg/2 cm. Zusammensetzung des Puffers: 40 ml 98%lge Ameisensäure und 160 ml Eisessig mit destilliertem Wasser auf 21 aufgefüllt.
Die aktive Substanz, das Lltoralon, gibt eine positive Nlnhydrlnreaktion und wandert gleichmäßig von der Startlinie in Richtung des positiven Pols (5 cm/90 Min. bei 1500 V).
Das durch die Elektrophorese isolierte Produkt wird mit Wasser eluiert. Die Ausbeute - auf das trockene, nicht entfettete Nebenschilddrüsenpulver bezogen - beträgt 0,01-0,02%.
Das auf diese Weise erhaltene Litoralon kann als chemisch rein angesehen werden. Seine biologische Aktivität wurde durch folgende biologischen Versuche nachgewiesen.
Bei einer Dosierung von 3 μg/120 g s.c. nahm das Gewicht der Harder-Drüsen von Ratten in starkem Maß zu, bei gleicher Dosierung wurde der Blutzuckergehalt bedeutend herabgesetzt.
Bei einer Dosierung von 3mal täglich 7 üg wurden bei Menschen die Symptome von Rhinolaringo-pharingitls sicca geheilt, und die mit dem Harn ausgeschiedene AMP-Menge nahm stark zu.
A 9-12 Gesamtsumme:
B 13-17
C 18-23
D 24-29
E 30-36
F 37-42
G 43-50
H 51-57
I 58-80

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Wasserlösliches, proteinfreies Honnonkonzentrat von Saugetier-Nebenschilddrüsen, das ein Molekulargewicht zwischen 2OC und 1000 hat, in Benzol, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist, durch Trichloresslgsäure nicht gefallt wird, eine negative Biuretreaktion und eine positive Ninhydrlnreaktion aufweist und durch die folgenden Verfahrensschritte erhältlich ist:
a) Entfetten getrockneter und vermahlener Säugetier-Nebenschilddrüsen oder deren Gewebe- und Zellkulturen mittels Aceton und Chloroform,
Ii b) Extrahieren des nach a) erhaltenen entfetteten und getrockneten Nebenschllddrüsenpulvers mit destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur und Zentrifugieren des erhaltenen Extraktes,
c) Ausfällen der Proteine in dem nach b) erhaltenen Extrakt mittels Trichloresslgsäure oder Sulfosalicylsäure, Abzentrifugleren des Niederschlags und Entfernen der Proteinfällungsmittel aus dem Extrakt, der dabei auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5 eingestellt wird,
is d) Lyophllisleren des nach c) erhaltenen Extraktes,
e) Isolieren des Hormonkonzentrats aus dem nach c) erhaltenen Extrakt oder dem nach d) erhaltenen Lyophlllsat durch Gelfiltration nach der absteigenden Methode an Sephadex G15 und Wasser als Eluent und
0 Lyophillslerung der bei der Gelfiltration nach e) gegebenenfalls getrennt aufgefangenen Fraktionen, die M zuvor nach einer weiteren Reinigung durch Dialyse, Extraktion, Ionenaustauscher und/oder Chromatographie unterworfen werden können.
DE2234832A 1971-08-04 1972-07-15 Proteinfreies Hormonkonzentrat von Säugetier-Nebenschilddrüsen, dessen Herstellung und dieses Hormonkonzentrat enthaltende pharmazeutische Präparate Expired DE2234832C2 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2517028A1 (de) * 1971-08-04 1975-11-20 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Verfahren zur isolierung von gamma- l-glutamyltaurin
JPS5076516A (de) * 1973-11-12 1975-06-23
JPS543205B2 (de) * 1973-12-28 1979-02-20
IL47149A (en) * 1974-04-29 1979-05-31 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Amino acid derivatives,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
JPS5144219A (en) * 1974-10-14 1976-04-15 Japan Servo Musatsushidendokino kaitenseigyosochi
JPS5750437B2 (de) * 1974-12-28 1982-10-27
JPS5238315U (de) * 1975-09-11 1977-03-18

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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