DE1949195A1 - Verfahren zur Herstellung deproteinisierter Bluextrakte mit Heilwirkung - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung deproteinisierter
Blutextrakte mit Heilwirkung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung deproteinisierter Blutextrakte. Insbesondere wird gemäß dem Verfahren nach der Erfindung mit haemolisiertem und defibriniertem gemischten Blut von Ochsen und Pferden eine enzymatische Hydrolyse durchgeführt, der sich eine Deproteinisierungs-Wärmebehandlung anschließt·

Durch ein solches Verfahren erhält man Blutextrakte, die Polypeptidketten enthalten, die durch Unterstützung der Entwicklung der Proteinsynthese in dem Gewebe das Heilen derselben begünstigen.

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Aus der Literatur sind zahlreiche Abhandlungen über in diesem Bereich durchgeführte Versuche und über die erhaltenen Produkte bekannt, wobei deren therapeutische Anwendungen beschrieben worden sind, ohne daß irgendwelche Hinweise hinsichtlich des Schemas gegeben werden, das das Verfahren gemäß der Erfindung kennzeichnet.

Die ersten experimentellen Arbeiten zum Erhalten von Blutextrakten von Tieren, die Produkte enthalten, die von dem Spalten der Proteine abstammen, aus denen sie bestehen, stammen aus dem Jahre 1919· Insbesondere erfolgt die erste Erwähnung der Wirkung entweder haemolisierter oder autolysierter Blutextrakte in Physiol. Abstr. 4,464 bzw. H. Roger de med.exp. 27,325-1919. 1922 (US Patentschrift 1,403,892) wurden Versuche mit der Hydrolyse von Blut und Haemoglobinproteinen mittels organischer Säuren und Pepsin durchgeführt.

Die Herstellung von Extrakten durch ein Verfahren, das auf der Wirkung von Kohlendioxyd mit Fragmentierung und Extrahierung verschiedener biologischer Substrate, beispielsweise Blut, Mark und Milzen (frisches Blut) und der Pulverung solcher Extrakte im physiologischen Bereich basierte, sind in der britischen Patentschrift 333,159 beschrieben, während noch 1929 (H.Bierry Compt« Rend. Soc. Biol. 101,20, 1929) Berichte über das Zerlegen der Plasmaproteine mit HCl oder KOH unter Wärmeeinwirkung und über das Extrahieren von Plasmazucker veröffentlicht wurden.

In anderen Untersuchungen aus 1935 und 1937 erfolgt eine ausführliche Erwähnung der Eigenschaft,»die Blutextrakte besitzen, in Hinsicht auf die Reproduktionsgeschwindigkeit bestimmter vegetaler Gewebe (Proo,Ind.Academy of Scieno©B, IB, 381, 1935) und in Hinsicht auf die Fähigkeit solcher Extrakte zur Herstellung antigonadotropischer Substanzen (Chinese Journal of Physiology 11,329* 1937)*

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Neueren Datums sind einige Untersuchungen über die Verwendung von Hydrolisaten mit HCl als Tonikum (i.Marinescu - Lucrarele Institut Cercatari Alem. 1, 11-28, 1957)» über den Effekt von Hydrolisaten von Platelet auf den Atmungsstoffwechsel (Kazuo Okada - Osaka Daigaku Igaku Jasshi 10, 1511$ 1958) und über die Verwendung solcher "Blutextrakte als Beschleuniger des Lipoidstoffwechsels (H.P. Kaufmann, Feite, Seifen, Anstrichmittel 65, 331 - 4 I96I). Das gleiche Problem ist in der japanischen Patentschrift 279» 556 "breiter entwickelt und ■beschrieben worden. Dabei wird die Herstellung des Blutextrakts durch eine Dialyse durchgeführt. Andere haben das Problem einer solchen· Extraktion durch die Verwendung von Ionenaustauschharzen untersucht (Bellettino Chimico Farmaceutico Vol. 101 - I962).

Die Hauptüberlegungen, die auf der Basis der technologischen Literatur durchgeführt werden können, können unter den folgenden Punkten zusammengefaßt werden:

a.) Blut tierischen Ursprungs als Ausgangsmaterial, von dem einfachere Produkte ("Extrakte") erhalten wurden, die vom Spalten seiner Protein-Komponenten abgeleitet wurden, ist . im therapeutischen Bereich sowohl als solches, d.h. als ganzes Blut, als auch in seinen verschiedenen Bestandteilen verwendet worden. Von frischem Blut, haemolisiertem Blut, Blutplasma, Blutserum, roten Blutkörperchen, Haemoglobin, Platelet erhaltene Autolysate sind bekannt. Kurz gesagt, wird in der Herstellung dieser Autolysate jedes Teil des flüssigen Gewebes (Blut) einer Hydrolyse unterzogen·, wobei sich Produkte bilden, die verschiedene Charakteristiken und Zwecke haben.

b.) Die chemischen Verfahren der Blutbehandlung, die sich bis her daran anschlossen, sind im wesentlichen auf verschiedene Hydrolyse-Verfahren begründet, die einzeln durchgeführt wurden mit:

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- C02 (Kohlendioxyd)

- anorganischen Säuren (HCl)

- anorganischen Basen (natrium oder Kaliumhydroxyd)

- Pepsin (reines Enzym)

- Pepsin und Trypsin, die einzeln als reine Enzyme oder im Gemisch verwendet werden.

In den zuvor erwähnten verschiedenen Verfahren sind chemisch physikalische Voraussetzungen (Zeit, Temperatur usw.) eines Angriffs, die sich zum Erhalten" von Blutextrakten mit bestimmten Eigenschaften eignen, von Zeit zu Zeit festgelegt worden; immer jedoch mit dem gemeinsamen Kriterium, in jedem Fall ein Endprodukt zu erreichen, bei dem das Blut-soweit wie möglich die Grundzusammensetzung und die relativen therapeutischen Eigenschaften bewahrt hat.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß diese Eigenschaften aus der Kombination einer Mehrzahl therapeutischer Wirkungen herrühren, die jeweils den verschiedenen Substanzen zuzuschreiben sind, welche im gesamten Blut vorhanden sind.

Auf der Basis einer solchen Überlegung waren die bisherigen Untersuchungen und Versuche darauf gerichtet, diese verschiedenen Substanzen aus dem Blut zu gewinnen oder Extrakte herzustellen, die reicher an diesen Bestandteilen als an anderen waren. Im Effekt sind Vasodilator, Hypotensor, Hypertensorsubstanzen, Stoffe, die die Wirkung von Antibiotika steigern oder das Wachsen von Fermenten oder Bakterien begünstigen, oder Hormonsubstanzen aus Blut gewonnen und in die Therapie eingeführt worden. Insbesondere sind viele Arbeiten und Untersuchungen zu einem Abschluß gebracht worden, um aus Blut Substanzen zu erhalten, die die Atirangeaktivität der Zellen in Geweben steigern können, die durch !Teerose befallen sind. In diesem Zusammenhang wird Erwähnung davon gemacht, was in der genann-

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ten japanischen Patentschrift 279»556 beschrieben worden ist. Bs ist jedoch an dieser Stelle wichtig, darauf hinzuweisen, daß solche Untersuchungen als Zweck hatten, nicht nur einzelne Substanzen zu erhalten, die aus Blut gewonnen werden, sondern einen besonderen Extrakt aus vollem Blut von Ochsen, die zum Schlachten anstehen, wobei eine Behandlung vor dem Schlachten mittels besonderer chemischer oder physikalischer Verfahren erfolgt.

Das Ergebnis ist, wie das in der genannten japanischen Patentschrift beschrieben worden ist, die Entdeckung von Substanzen, die in dem Blut enthalten sind, und die die Atmung stimulieren und den Stoffwechsel reaktivieren, deren Vorhandensein im vollen Blut oder Plasma schwer nachzuweisen war.

!Tatsächlich waren diese Stoffe, obgleich sie schon im Blut enthalten waren, in einer kombinierten oder inaktiven Form vorhan-.den, mit der es deshalb nicht möglich war, die therapeutische Aktivität zu beweisen, wobei aber die Gewinnung und Konzentrierung in einer injizierbaren Form wichtig war. Gemäß der Offenbarung in der genannten japanischen Patentschrift ist zu diesem Zweck ein Verfahren zum Erhalten eines Blutextraktes aufgestellt worden, das aus den erforderlichen Schritten besteht, um das allmähliche Freisetzen aus den kombinierten oder inaktivierten Formen der thermolabilen Substanzen zu ermöglichen, die im ursprünglichen vollen Blut enthalten sind, wobei solche Stoffe als die Faktoren angesehen werden, denen die therapeutische Wirkung der Atmungsstimulation zuzuschreiben war. Auf dieser Grundlage führte das in der genannten japanischen Patentschrift folgende Verfahren zur Herstellung eines Blutextraktes» bei dem vollständig und frei jene Substanzen enthalten sind, die schon in vollen Blut odes in !Teilen davon vorhanden wasen.

Andere als zuvor bekannt, ist gemäß des Erfindung festgestellt

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worden, daß man einen Blutextrakt mit einer verbesserten Heilaktivität bei Wunden, Schmerzen und Geschwüren erhalten kann, wenn in dem Blut nach dessen Abziehen aus den Tieren die Herstellung der erforderlichen aktiven Grundstoffe bewirkt wird.

Das Grundprinzip, auf dem diese Erfindung beruht, besteht im wesentlichen in der Feststellung, daß solche Komponenten nicht von vornherein im Blut vorhanden sind, und zwar weder in der kombinierten Form noch in der aktiven Form, sondern daß sie sich im Gegenteil als Folge des besonderen Verfahrens bilden, das im nachfolgenden noch zu beschreiben sein wird und das •deren Bildung in wärmestabiler und analytisch kontrollierbarer Form gestattet.

Me Erfindung bezweckt deshalb die Schaffung eines Yerfahrens, das nicht darin besteht, thermolabile Substanzen aus Blut freizusetzen und zu gewinnen, die in ihm enthalten sind, sondern in dem Blut von Tieren, insbesondere Pferden, die Bildung thermostabiler Substanzen und thermostabiler Grundstoffe in die Wege zu leiten, die eine gut definierte therapeutische Aktivität haben, nämlich das schnelle Heilen durch Geschwüre befallener Gewebe. Diese thermostabilen Grundstoffe sind die Grundstoffe in den Bestandteilen der Protein-Moleküle, die das neue Gewebe an- stelle des durch !Teerose befallenen Gewebes neu bilden müssen.

Aus dem Vorangegangenen geht der Wirkungsmechanismus des Produkts gemäß der Erfindung hervor: Der Körper konsumiert normalerweise Aminosäuren für die Proteinsynthesen, die in ihm stattfinden, und da in besonderen Fällen (Geschwüre, Schmerzstellen, Wunden) diese Enzyme die Bildung der ersten paar Hingketten steuern (die ersten Polypeptide, aus denen sich das Protein-Molekül bildet), sind die Proteinwerte des durch Necrose befallenen Gewe- ' beβ nicht mehr synthetisierbar.

Es ist nun gemäß der Erfindung festgestellt worden, daß man da-

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.durch, daß man dem von Necrose befallenen Gewebe die Möglichkeit eines Beginns der Protein-Synthese nicht mehr mit Hilfe einfacher Aminosäuren gibt, sondern mit Hilfe einer Yielzahl gebundener Aminosäuren (Polypeptide), die schon zur weiteren Bildung de:? endgültigen Kette vorgeordnet sind, wahrscheinlich durch Bindung mit anderen Polypeptid-Fragmenten, eine gute Reaktivierung in der !Fähigkeit der Protein-Synthese des befallenen Gewebes bewirkt. Es ist insbesondere nach einer sorgfältigen Untersuchung zahlreicher enzymatischer Lysen, die besonders nutzbar sind, festgestellt worden, daß das Durchführen einer enzymatisehen Lyse mit Papain unter technologisch geeigneten Voraussetzungen in dem Blutextrakt gemäß' der Erfindung die Herstellung der Polypeptid-Ketten bewirkt.

Es ist deshalb ein besonderer Zweck der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung deproteinisierter Blutextrakte mit einer Heilwirkung zu schaffen, das aus der Folge von Schritten besteht, Blut von gerade geschlachteten Tieren zu sammeln, insbesondere das gemischte Blut von Ochsen und Pferden, das Blut zu haemolisieren, defibrinieren und filtrieren, das erhaltene Filtrat einer enzymatisehen Hydrolyse zu unterwerfen, das Hydrolysat durch Erwärmung auf 80⁰C zu deproteinisieren, dem sich eine sofortige Abkühlung und !nitrierung anschließen, die entstandene Substanz unter Vakuum zu konzentrieren oder zu lyophilisieren, das Produkt mit Äthanol weiter kalt zu deproteinisieren, die Alkohol-Lösung zu filtrieren und zu konzentrieren, bis das Ithanol entfernt ist, das Filtrat zu verdünnen, die Lipide mit Chloroform zu entfernen, das Produkt zu dehistaminisieren, zu reinigen und unter Vakuum zu trocknen.

Insbesondere wird das Blut, vorzugsweise gemischtes Blut (Ochsen und Pferde), das unmittelbar nach Schlachten der Tiere abgezogen wird, vorzugsweise kontrolliert in sterilen Behältern aus nicht rostendem Stahl gesammelt.

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Nach dem Abziehen wird das haemolisierte Blut zur Behandluhgsanlage gebracht und defibriniert, wobei darauf hinzuweisen ist, daß die Haemolyse im Verfahren gemäß der Erfindung naoh bekannten Methoden durchgeführt wird, .indem dem Blut apyrogenetisch.es destilliertes Wasser zugesetzt wird und ein Umrühren erfolgt, bis die Haemolyse auftritt. Das Verhältnis von Wasser zu Blut kann lsi betragen. Das auf diese Weise gewonnene Blut wird durch Seitz-Klär- und Sterilisierfilter geleitet, um eine klare Flüssigkeit zu erhalten, die für die nachfolgenden Behandlungen vorbereitet ist, wovon die erste die enzymatische Hydrolyse ist.

Eine solche Hydrolyse wird in Behältern aus nichtrostendem Stahl bei optimaler Temperatur durchgeführt, wobei als Enzym Papain verwendet wird. Bei einer solchen Temperatur handelt es sich um die Temperatur, bei der das Enzym seine höchste Aktivität bei Vorhandensein einer bestimmten Konzentration des Substrats hat, und in dem infrage stehenden Fall'liegt sie im Bereich von 55 - 42 ⁰C, wobei der pH-Wert auf den Bereich von 5 - 5»5 eingestellt worden ist. Die pH-Einstellung auf diese Werte ist besonders für die Enzym-Aktivität und die Eigenschaften des Endproduktes wichtig.

Der Trockenrest hat ein Aschegehalt von etwa 4 $t während im Gegensatz dazu ein Extrakt, der durch enzymatische Lysen auf der Grundlage anderer Enzyme (Pepsin, Trypsin) erhalten wird, die allein oder in Kombination verwendet werden, einen Aschegehalt von 10 - 20 $ hat. Andererseits hat offensichtlich das durch den Papain-Angriff entstandene Produkt eine ihm eigentümliche Zusammensetzung, sowohl hinsichtlich der Art als auch hinsichtlich der Anteile von Peptiden und Aminosäuren, und zwar aufgrund der absoluten Besonderheit der Polypeptid-Bindungen, die durch das Papain geipalten werden. Es ist im übrigen bekannt, daß jedes proteolytisehe Enzym sfEifisch dadurch wirkt, daß es nur bestimmte Punkte des Protein-Moleküls angreift und spaltet, was zu einem anderen Endgehalt spezifischer Peptide führt.

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Fach Verstreichen einer bestimmten Zeit wird die hydrolysiert© und auf einen geeigneten pH-Wert eingestellte Flüssigkeit zur ersten Deproteinisierung schnell auf 80⁰O erwärmt.

Im übrigen ist gemäß der Erfindung* festgestellt worden, daß die hydrolysiert e Flüssigkeit einer schnellen Erwärmung unterzogen werden kann, wobei ausgeschlossen ist, daß die Aktivität des Heilpräparats, was ebenfalls der Erfindung zugrunde liegt, den-thermolabilen Produkten zugeschrieben werden kann, die während der enzymatischen Hydrolyse gebildet werden.

Es ist insbesondere festgestellt worden, daß nur die thermostabilen Produkte, die von der enzymatischen Lyse mit Papain abstammen, für die therapeutischen Zwecke des Extraktes gemäß der Erfindung von Bedeutung sind und daß die durch Erwärmung entstehende Destruktion aller thermolabilen Substanzen für die therapeutische Verwendung des Produktes erforderlich ist.

Deshalb erfolgt anders als bei bekannten Verfahren gemäß der Erfindung eine Erwärmung der Masse bis zu 80°, dem sich eine unmittelbare Abkühlung mit einer mechanischen Kühleinrichtung anschließt, gefolgt von einem Filtiieren in Seitz-Filtern.

Die auf diese Weise entstandene Flüssigkeit wird unter Vakuum bei tiefer Temperatur konzentriert, bis deren Volumen auf l/2Ö des ursprünglichen Volumens reduziert worden ist·

An dieser Stelle kann man auch eine Lyophilisation anstelle einer Konzentration unter Vakuum anwenden, wobei die Wahl des einen oder des anderen Verfahrens jedoch für die Zwecke der Erfindung nicht entscheidend ist· Mit dem auf diese Weise entstandenen konzentrierten Produkt wird eine weitere Kaltdeproteinisierung durchgeführt} und zwar durch anschließende Behandlung mit Ithanol bei Normalstärken von 40, 60, 70$ diese Behandlungen werden im übrigen üblicherweise zum Fällen von Proteinen in Lösung verwendet·

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Die Alkohol-Losung wird nach dem Filtrieren erneut unter Vakuum konzentriert, bis das Xthanol ausgeschieden worden ist, und anschließend erfolgt eine Verdünnung mit apyrogenetischem destilliertem Wasser und eine Filtrierung in einer Seitz-Filterpresse.

Anschließend wird eine Abscheidung von Lipiden durch eine Schüttelbehandlung in Trenntrichtern (aus nichtrostendem Stahl) mit fol·-' genden Beilen von Chloroform durchgeführt, und die Entfernung der Chloroform-Lagen wird bewirkt.

Diese Behandlung mit Chloroform hat eine besondere Bedeutung im Verfahren gemäß der Erfindung.

Dadurch ist es nämlich möglich, die Reinheits-Charakteristiken des Produktes zum Zwecke seiner therapeutischen Verwendung zu beeinflussen.

Die Volumen:" von Chloroform, mit denen der Extrakt behandelt wird, müssen ausreichend sein, um ihn gründlich zu benetzen und um sogar einen kleinen Anteil an Flüssigkeitsüberschuss vorliegen zu lassen. Beispielsweise werden 500 Gramm des Extraktes in einer IPolge mit 1,5 Itr. Chloroform behandelt.

Der letzte Schritt des Verfahrens ist derjenige, der das Endprodukt hinsichtlich seiner Zusammensetzung und hinsichtlich des Fehlens von Substanzen toxischer Hatur darin konditioniert, die dessen Verwendung durch einen injizierbaren (intravenösen) Weg begrenzen wurden. Dieser Schritt besteht in der Durchleitung des Produktesdurch ein Ionenaustauschharz. Zu diesem Zweck wird das Produkt in Wasser aufgelöst, um eine Wasserlösung zu erhalten, die eine geeignete Konzentration hat. Diese Lösung wird dazu gebracht, langsam durch sine Glaskolonne zu fließen, die Harzgranulat, beispielsweise Amberlite I*R. - 120, oder eine andere Art eines ähnliohen Harzes enthält.

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Das Harz Ainberlite I.E.. -120 ist ein stark kationisches Harz: es absorbiert alle freien Aminosäuren, und wenn es gründlich gesättigt ist, gibt es allmählich die Säuren höherer Azidizität ab, dann die Säuren geringerer Azidizität," dann die neutralen Säuren, bis schließlich nur die zweibasischen Aminosäuren zurückbleiben. Auf diese Weise -wird die Endzusammensetzung des Extrakts nach Durchgang durch das Harz wesentlich modifiziert, es enthält jedoch nicht, selbst in extrem kleinen Anteilen, toxisches Histamin, selbst nicht die histaminähnlichen Aminosäuren.

Die nach dem Durchgang durch das Harz erhaltene Flüssigkeit wird dann durch sterilisierende und apyrogenetische Filter gefiltert.

Diesem Schritt schließt sich ein Trocknen unter Vakuum--bei "tiefer Temperatur an.

Der dadurch erhaltene Extrakt ist zur geeigneten Verdünnung bereit, bis eine Endlösung entsteht, die nach Filtrierung in Ampullen abgefüllt und in einem Autoklaven bei 120° 30 Minuten lang mühelos sterilisiert wird, und zwar aufgrund der Thermoetabilität des infrage stehenden Produktes» Schließlich wird eine Analyse des Produktes durchgeführt.

Die Analyse dient neben der Endkontrolle des Produktes außerdem dazu, nachzuweisen, daß das für die Herstellung dieses Blutextraktes aus einer Papain-Lyse verwendete Verfahren eine Polypeptid-Eonzentration erbringt, die eine Eigentümlichkeit des Produktes darstellt. Dabei wird 0,1 ml einer Vasserlösung des Extraktes mit einer Konzentration im Bereich von 0,5 - 5 ί» a*x den Anfangspunkt einer chromatographischen Platte aufgetragen, wobei die Herstellung wie folgt vorzusehen ist:

Ein Gelatin Sephadex G25 (SG25) wird in einer Pufferlösung suspendiert, beispielsweise einer 0,02-M-PhosphatlÖsung mit einem pH-Wert

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von 6,8* Etwa 50 ml Pufferlösung pro Gramm Sephadex werden verwendet. Das Gel wird durch Absetzen mehrere Male gewaschen, wobei das SG 25 mindestens 48 Stunden lang in Kontakt mit der.Pufferlösunggelassen wird,

An diesem Punkt werden die Platten durch Absetzen und dann durch Entfernen des Überschuss-Lösungsmittels mit Filterpapier hergestellt, und die Papier-Chromatographie wird nach bekannten Methoden durchgeführt. . '

Die Ergebnisse der chromatographischen Proben.sind in Fig. 1 der Zeichnung angegeben, in der eine Kurve dargestellt ist, auf deren Abszisse die Wanderungegeschwindigkeit Rf (Wanderung der verschiedenen chromatographischen Zonen relativ zum Ausfluß) angegeben sind, die proportional zu den Molekulargewichten der verschiedenen Polypeptid-Fraktiorien des Extraktes sind, und auf der Ordinate sind die Werte der optischen Dichte der Polypeptid-Fraktionen angegeben. " "' -

Diese Kurven müssen durch Vergleich mit einer besonders hergestellten Eichkurve gelesen werden.

^Dazu sieht man einige reine Substanzen vor, die ein bekanntes Molekulargewicht haben, jedoch innerhalb des Bereichs von 200 4·000, die mit Gel Sephadex 25 chromatographiseh ausgewertet werden, '"..·■ -

Die Entwicklung wird mit Hilfe des Paulys-Heagenzmittels durchgeführt,^ ·

Beispielsweise sieht man Tyrosin mit einem Molekulargewicht von 180, Tyrosyl-leucyl-glycyl-glutamylphenylalamin mit einem Molekulargewicht von 800, Plastein mit einem Molekulargewicht von I500 und Serin mit einem Molekulargewicht von 4OOO vor.

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Wenn man die Wajiderungsgeschwindigkeit Rf dieser Substanzen jeweils kennt, kann man eine Eichkurve bilden.

Dann wird die Lösung des Extraktes in der oben beschriebenen Weise chromatographisch ausgewertet, und man erhält Kurven, wie sie in dem Schaubild (Fig«. 1} dargestellt sind.

Die in dem Schaubild dargestellten vier Kurven "beziehen sich Jeweils auf eine Messung, die mit einem Blutextrakt gemäß der Erfindung durchgeführt worden ist. Dabei ist darauf hinzuweisen, daß die Unterschiede zwischen den einzelnen Kurven von den kleinen Schwankungen in der Zusammensetzung abhängen, die zwischen verschiedenen Proben eines gleichen biologischen Produktes allgegenwärtig sind. In den Kurven sind gezeigt:

a.) eine Zusammensetzung mit einer normalen Prozentzahl (auf PoIypeptid-Basis) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 500 - 3500 (Ef = 0,9) und einem Maximum innerhalb des Bereichs von 500 (Hf =0,5) - 1000 (Ef = 0,6), charakteristisch für das Papain-Hydrolisat;

b.) das Fehlen von Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 3500 (Ef = 0,9)» und das bedeutet, daß der Extrakt nicht zu Eeaktionen einer anaphylactisehen Schockart führen, kann.

Falls eine genauere Auswertung der quantitativen Zusammensetzung des Extraktes erreicht werden soll, bei der die Yerteilungsrate der Molekulargewichte der verschiedenen Polypeptide definiert werden soll, kann eine Filtrierung mit Gel (Dextran, das mit Epichlorohydrin mischpolymerisiert wird) und anschließende Abscheidung der wasserlöslichen Moleküle, die ein anderes Molekulargewicht haben, durch selektive Adsorption in den Gel-Poren durchgeführt werden.

Die angewandte Methode ist di© bekannte Methode der Säulen-Chromatographie, mit deren Ergebnis eine Bestimmung des Molekulargewichts anschließend durchgeführt wird.

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Analyse ■

Die Analyse eines Blutextrakts, den man dadurch erhält, daß man das gemischte Blut von zwei Tierarten (Ochsen und Pferden) einer Haemolyse und einer Hydrolyse unterzieht. Die zu analysierende Lösung (in einer größten Menge von 3 nil) muß in der folgenden Weise oben in die Kolonne eingeführt werden: zunächst wird die gesamte Flüssigkeit, die über der Kolonne liegt, mittels einer Pipette entfernfc, so daß eine Lage von 1 - 2 ml über bleibt. Diese Flüssigkeit läßt man dann durch die Kolonne fließen, und wenn sich die obere Schicht des Gels zu bedecken beginnt, wird fe der Flüssigkeitsstrom unterbrochen, indem man die untere Zapfstelle der Kolonne schließt, und die Probelösung wird zugesetzt.

Dann läßt man die Flüssigkeit wieder fließen, so daß die Lösung durch die obere Lage des Gels absorbiert wird. Zu diesem Zeitpunkt «dirdvdie Kolonne mit dem Ausflußbehälter verbunden, und die Analyse beginnt. ■

Unter Verwendung von 0,2-M-Essigsäure als Verdickungsmittel wird die optische Dichte der Lösung kontinuierlich mit Hilfe eines Beckmann-DU-Spectrophotometers abgelesen, das mit einer 1 ml Durchflußzelle bestückt ist, und zwar bei einer Wellenlänge von 280 mu. Bei einem Bett aus Sephadex G 25 mit einer Länge von etwa 200 cm " treten die ausgeschlossenen Substanzen (die, welche ein Molekulargewicht* von mehr als 5000 haben) schon nach 30 ml aus, während die stärker absorbierten Substanzen, das sind HH/j. + Ionen und Glycerol, nach etwa 100 ml Verdickungsmittel austreten. Deshalb treten alle Peptide mit einem zwischenliegenden Molekulargewicht, die für die Analyse von Interesse sind» zwischen 30 und 1000 aus und werden gesammelt.

Alle Fraktionen werden duroh eine automatische Fraktions-Sammelapparatur gesammelt, die auf 5 ml eingestellt ist, und zwar in

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Reagenzgläsern, deren Gewicht zuvor bestimmt worden ist.

!lach Abschluß der Analyse (optische Dichte gleich der des Lösungsmittels im Beckmann-Du-Apparat) werden alle Reagenzgläser in einen Lyophilisationsapparat gesetzt, und deren Inhalt wird sorgfältig getrocknet.

Wichtig ist eine vollständige Entfernung des Lösungsmittels? deshalb wird die Trocknung mit P2O5 in einem Vakuum-Trockenapparat sieben Tage lang fortgesetzt«, Durch ein zusätzliches Wiegen wird das Gewicht des Trockenrestes im jeweiligen Reagenzglas abgeleitet, und das jeweilige Molekulaxgewieht wird nach Auflösung in 0,5 ml destilliertem Wasser in einem automatischen Meßgerät für osmotisehen Druck bestimmt. Die Werte des Molekulargewichts (Molekulargewicht χ 10~²) werden in zunehmender Größe auf die Abszisse eines Schaubilds aufgetragen, deren Ordinate das Gewicht (trockenes Prozentgewicht) der jeweiligen Fraktion angibt, der das jeweils gegebene Molekulargewicht entspricht. Auf diese Weise erhält man den gewünschten Umriß der Prozentzusammensetzung des Extraktes als Funktion des Molekulargewichts der verschiedenen Fraktionen. Solche Ergebnisse sind in Fig. 2 der Zeichnung dargestellt.

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Claims (12)

Pat e η t an e-p r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung deproteinisierter Blutextrakte mit einer Heilwirkung, da durch gekennzeichnet, daß Blut von gerade geschlachteten Tieren einer enzymatisehen Hydrolyse unterzogen wird, das erhaltene Hydrolysat durch Erwärmen, dem sich ein unmittelbares Abkühlen anschließt, deproteinisiert wird und das. Produkt nach einer Konzentration oder Lyophilisation weiter mit Alkohol deproteinisiert wird, die Lipide daraus in einem organischen Lösungsmittel entfernt werden, eine Reinigung vorgenommen wird, Histamin daraus entfernt wird und der erhaltene Extrakt unter Vakuum getrocknet wird. ...- ..-;'. --..;

2. Verfahren nach Anspruch 1, d a durch ge k en η ze i c hn e.t, daß die enzymatische Hydrolyse mit Papain in Behältern aus nicht rostendem Stahl durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, d ad u r c h g e k en η ze ic hn e t, daß die enzymatische Hydrolyse mit Papain bei einer Temperatur im Bereich von 35 - 42⁰O bei einem pH-Wert im Bereich von 5 - 5»5 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, d a d u r c h g e kenn ζ e i c h net» daß das "Erwärmen des Hydrolisats schnell bis zu einer Temperatur von 80⁰C durchgeführt wird, dem sich in einem mechanischen Kühler einer unmittelbare Abkühlung und eine Filtrierung in Seitz-Piltern anschließen.

5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -4» d a d ur c h g e k e η η ζ e i ohne t, daß die nach der Deproteinisierungswärmebehandlung erhaltene Konzentration der Plüssigkeit eine Verminderung ihres Volumens bis zu 1/20 des ursprünglichen Volumens hervorruft«

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5» dadurch gekennzeichnet, daß die Deproteinisierung mit Alkohol mit Äthanol durchgeführt wird ₉ wobei anschließende Behandlungen mit Alkohol jeweils mit Bormalstärken von 40_?60,70 ° durchgeführt werden. - -

7» Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Entfernen der Lipide in einem organischen Lösungsmittel die Alkohol-Lösung nach Filtrierung unter Vakuum mit Entfernung des Äthanols konzentriert, mit apyrogenetischem, destilliertem Wasser verdünnt und in einem Seitz-Filter gefiltert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet;, daß als organisches Lösungsmittel von Chloroform Gebrauch gemacht wird, wobei die Lipid-Entfernung mit Hilfe von Schüttel-Trenntriehtern aus nicht rostendem Stahl vorgenommen wird. ■

9. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h gekennzeichnet, daß Chloroform in einer Menge von 1,5 1 pro 500 Gramm Extrakt verwendet wird,

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9» d. a d u r c h gekennzeichnet, daß die Histamin-Entfernung sowie die Endreinigung des Produktes in einer wässrigen Lösung in Filtern aus synthetischem Material vorgenommen werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Filter aus synthetisohem Material durch Harz Amberlite I.E.-120 (starkes katioaisohes Harz) in G-ranulatform gebildet werden.

12. Verfahren nach einen dtr Ansprüche 1 - 11, dadurch ge kennzeichnet, daß als behandeltes Blut gemischtes

Blut von Pferden twd Ochsen verwendet wird, das unmittelbar nach Schlachten der Tiere gesammelt wird.

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Le e rs e i te