DE2815758C3

DE2815758C3 - Peptidkomplexe aus DNS-haltigen Organismen

Info

Publication number: DE2815758C3
Application number: DE19782815758
Authority: DE
Inventors: Guenther Prof. Dr. 6072 Dreieich Wilhelm
Original assignee: R & Z Vermoegensverwaltungsgesellschaft Mbh 4150 Krefeld De; R & Z Vermoegensverwaltungsgesellschaft Mbh 4150 Krefeld
Current assignee: Wilhelm Guenther Prof Drmed 6072 Dreieich D
Priority date: 1978-04-12
Filing date: 1978-04-12
Publication date: 1982-02-18
Also published as: DE2815758B2; DE2815758A1

Description

2. Peptidkomplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Organismen der Species Mycobacterium tuberculosis oder leprae, oder aus Bordetella pertussis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus pyogenus oder Candida albicans gewonnen wird.

3. Peptidkomplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Blastenzellen akut lymphatisch erkrankter menschlicher Patienten, aus Synovia des entzündeten Gelenkes oder aus Lymphozyten gewonnen wird.

4. Arzneimittel, enthaltend einen Peptidkomplex nach Anspruch 1 bis 3, in einem üblichen pharmazeutischen Träger, gegebenenfalls in Verbindung mit üblichen pharmazeutischen Additiven.

Es ist bekannt, daß Peptide verschiedenster Zusammensetzung allein oder in Verbindung mit Polysacchariden oder Lipiden, spezifische Antigendeterminanten aufweisen können. Sie sind zum Teil nur als Haptene, zum Teil als Immunogene wirksam. Es wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um aus den verschiedensten Organismen Antigene zu isolieren, die zu diagnostischen, therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken in der Human- oder Tiermedizin einsetzbar sind. Die heute in der Tier- und Humanmedizin zur Verfügung stehenden Antigene sind meist Gemische aus zum Teil wirksamen, zum Teil unwirksamen Proteinen, Polysacchariden, Lipiden und Nucleinsäuren. Als Beispiel für die diagnostische Anwendung solcher Zubereitungen sei hier das gereinigte Tubcrkulin für die Tuberkulosediagnostik angeführt. Bei der prophylaktischen Anwendung zur Erzielung eines Impfschutzes gegen bakterielle oder pilzliche Infektionen genügen solche Zubereitungen, wie z. B. das gereinigte Tuberkulin nicht. Man ist gezwungen, ganze, lebende oder aufgelöste Mikroorganismen zu verabreichen, wie dies z. B. bei der Tuberkulose-, Pertussis- oder Salmonellenimpfung geschieht. Diese Methoden sind mit einer nicht unbeträchtlichen Gefährdung der Patienten verbunden.

Es stellt sich damit zunächst die Aufgabe, Antigene anzugeben, die chemisch genau definierbar, weitgehend rein und gleichzeitig für diagnostische, therapeutische und prophylaktische Zwecke eingesetzt werden können.

Erfindungsgemäß wurde es möglich, aus allen DNS-haltigen Organismen eine Anligengruppe zu isolieren, die jeweils spezifische Antigendclcrminanten für den Organismus, aus dem sie isoliert wird, aufweist.

Der Gegenstand der Anmeldung ist durch die Ansprüche 1—4 gekennzeichnet.

Bei den Antigengruppen handelt es sich um Peptidkomplexe aus DNS-haltigen Organismen, die folgendermaßen charakterisiert sind:

a) ein Molekulargewicht kleiner als 5000

b) Bildung einer Ribonucleinsäureverbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 9 000-20 000, die bei der Gelelektrophorese und der Acetatfolienelektrophorese eine singuläre, einheitliche Bande ergibt,

c) vorzugsweise intrazelluläres Vorkommen,

d) einen Calcium-Gehalt,

e) eine Fällungsreaktion mitTerbium(III)-Ionen,

f) sehr gute Wasserlöslichkeit,

g) einen mittleren Gehalt an Aspargin- und Glutaminsäure von etwa 30 Mol-% (bezogen auf den Gesamtaminosäuregehalt),

h) ein Molverhältnis (Asparginsäure +Glutaminsäure)

zu (Lysin + Arginin) größer als I,
i) eine herkunftspezifische Aminosäurezusammensetzung,

k) antigene Wirkung und
1) Verursachung von Resistenzsteigerung.

Peptidkomplexe der erfindungsgemäßen Art werden aus einer an sich bekannten P.ibonucleoproteinfraktion (RNP) hergestellt. Die RNP wird wie folgt gewonnen (vgl. Wilhelm, G, Seiher, Biophysik, 1973, S. 69-78 und 257-265):

a) Die Organismen oder deren Teile werden in nativem oder denaturiertem Zustand in 0,2-m Phosphatpuffer, pH 7,2, homogenisier!,

n) das Homogenisat wird zentrifugiert,

c) der Oberstand wird mit Phosphatpuffer beladener DEAE-Zellulose verrührt und in eine Säule gefüllt

d) die beladene DEAE-Zellulose wird so lange mit 0,2-m Phosphatpuffer eluiert, bis die Extinktion des Eluats bei 280 nm unter 0,1 liegt anschließend wird mit 0,1-m Essigsäure-Acetatlösung, pH 3,2, weiter eluiert bis die Extinktion des Eluats bei 280 nm wieder unter 0,1 liegt dann wird mit einer 3 Gew.-% NaCl-haltigen 0,1-m Essigsäure-Acetatlösung, pH 3,2, eluiert und die mit der NaCl-Front im Eluat erscheinende Ribonucleoproteinfraktion (RNP) gesammelt gegen Wasser dialysiert, eingeengt und lyophilisiert

Gemäß Erfindung können die Peptidkomplexe unter anderen in drei verschiedenen Verfahrensweisen gewonnen werden. Die angedeuteten Gewinnungsmöglichkeiten stelion keine Einschränkung dar. Unter Umständen ist es nach jeweiliger Sequenzanalyse auch möglich, die Peptidkomplexe, wie aus der Aminosäurentechnologie bekannt synthetisch zu gewinnen.

Im folgenden werden daher nur drei mögliche Verfahrensweisen beschrieben:

I. Das lyophilisierte, in Wasser gelöste RNP wird mit Phenol versetzt, auf etwa 95—100⁰C erhitzt, nach dem Abkühlen bis zur Phasentrennung zentrifugiert, die Phenolphase mit Wasser versetzt, dann mit Äther wiederholt ausgeschüttelt. Der wäßrige Rückstand wird lyophilisiert.

II. Das in Wasser gelöste RNP wird einer Hochspannungselektrophorese unterworfen und der Peptidkomplex in üblicher Weise isoliert. III. Aus dem in Wasser gelösten RNP wird dünnschichtchromatographisch der Peptidkomplex isoliert.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Arzneimittel, enthaltend einen Peptidkomplex gemäß Erfindung in einem üblichen pharmazeutischen Träger, gegebenenfalls in Verbindung mit üblichen pharmazeutischen Additiven.

Die erfindungsgemäßen Peptidkomplexe können gemäß den im folgenden beschriebenen Verfahren gewonnen werden. Die in den Beispielen angegebenen Teile sind, falls sie nicht ausdrücklich als Volumenanteile gekennzeichnet sind, Gewichtsteile.

Beispiel I

Native oder denaturierte Bakterien, Pilze, Pflanzen, menschliches oder tierisches Gewebe werden in Ultra-Turrax und Potterhomogenisator in 0,2molarem Phosphatpuffer, pH 7,2, homogenisiert. Das Homogenisat wird danach zentrifugiert, bis der Überstand klar ist. Der Überstand wird 30 Minuten mit Phosphatpuffer beladener DEAE-Zellulose gerührt. Die DEAE-Zellulose wird drei bis fünf Mal mit 0,2molarem Phosphatpuffer gewaschen und die Waschlösung jeweils verworfen. Sodann wird die beladene DEAE-Zellulose in eine Säule gefüllt und mit obigem Phosphatpuffer gewaschen, bis die Extinktion bei 280 ηm unter 0,1 abgesunken ist. Danach wird mit 0,1 molarer Essigsäure-Acetatlösung, pH 3,2, weitergewaschen, bis die Extinktion unter 0,1 abgesunken ist. Danach wird der Essigsäurelösung 3% NaCI zugefügt und die mit der NaCl-Front im Eluat erscheinende Ribonucleoproteinfraktion gesammelt. Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser wird die Ribonucleoproteinfraktion eingeengt und lyophilisiert Die Ausbeute ist unterschiedlich. Sie beträgt für 30 g Bakterien und Pilze ungefähr 30 mg, bei pflanzlichen, tierischen und menschlichen Geweben ist sie von der Zellart abhängig.

Das Ribonucleoprotein (RNP) wird dann einer modifizierten Phenolextraktion nach Westphal (Z. Naturforschung 7b [1952], 148—155) unterworfen. Dabei arbeitet man wie folgt: Das RNP wird in aqua

ίο dest. (ca. 1,5 ml H₃O auf 10 mg RNP) gelöst Zu dieser Lösung wird die halbe Menge an verflüssigtem Phenol p. a. zugesetzt (10 ml aqua dest. + 5 ml Phenol). Dieses Gemisch wird unter Rühren etwa 10 Minuten auf 95— 100⁰C erhitzt Anschließend kühlt man ab auf ca.

2—3°C Man zentrifugiert das Gemisch bis zur exakten Trennung der Phasen. Die H₂O-Phase enthält RNS + Bruchstücke + Aminosäuren. Die mit H2O gesättigte Phenolphase enthält den Peptidkomplex. Die Phenolphase wird mit dem halben Volumen an frischem

2(i aqua dest. versetzt und mit drei- bis fünffachem Überschuß an Äther ausgeschüttelt Dieser Vorgang wird dem gesamten Ablauf nach zweimal wiederholt. Nach der Phenoleliminierung wird der wäßrige Rückstand, welcher jetzt das gereinigte Peptid beinhal-

ji tet gewünschtenfalls durch ein Sterilfilter (Millipore) gepreßt und gefriergetrocknet. Ausbeute der Extraktion: ca. 1 —1,5% Peptidkomplex bezogen auf RNP. Die Ätherphase wird nach der Trennung in der Schüttelbirne verworfen.

Beispiel 2

Die erfindungsgemäßen Peptidkomplexe können aus dem beispielsweise gemäß Beispiel 1 erhaltenen Ribonucleoprotein (RNP) auch durch Hochspannungs-

ii elektrophorese gewonnen werden.

Die RNP-Lösung wird hierzu auf Whatman Nr. I-Elektrophoresepapier aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgt in 0,1 molarem Eisessig-Pyridin-Puffer, pH 5,7, mit 50 V/cm über 30 Minuten. Nach Anfärbung von

κι Randstreifen wird die mit Amidoschwarz und Ninhydrin färbbare Bande ausgeschnitten und mit destilliertem Wasser eluiert.

Die so elüierten Peptidkomplexe sind in destilliertem Wasser und physiologischen Salzlösungen sehr gut

ii löslich. Die Peptidkomplexe können über Sephadex und bakteriendichte Filter ohne Wirkungsverlust filtriert werden.

Beispiel 3

in Herstellung durch präparative Dünnschichtchromatographie.

Die RNP-Lösung wird auf eine präparative Kieselgelplatte aufgetragen und aufsteigend in einem Gemisch von Chloroform/Methanol/Eisessig (3:2:1) etwa 1 —2

,i Stunden chromatographiert. Nach Trocknung der Platte wird ein Randstreifen mit Ninhydrin und ein zweiter abgetrennter Randstreifen mit Amidoschwarz angefärbt. Aus der jeweils gefärbten Bande wird der gewünschte Peptidkomplex eluiert und aus dem Eluat

ho gewonnen.

Gemäß den obigen Herstellungsbeispielen 1—3 gewonnene Peptidkomplexe sind herkunftsspezifisch. Je nachdem, aus welchem Organismus sie gewonnen wurden, unterscheiden sie sich in der Aminosäurezu-

(vi sammensetzung. In der nachfolgenden Tabelle sind die ungefähren Aminosäureanalysen einiger erfindungsgemäßer Peptidkomplexe verschiedener Organismen zusammengefaßt:

Tabelle 1

Aminosäurenanalysen verschiedener Peptide (in μτηοΐ)

	Mycobact. Ibc.	B. pertussis	E.coli	S. typhi	Str. [.yog.	Humane
						Lymphozyten
Asparaginsäure	0,035	0,067	0,038	0,0049	0,042	0,025
Threonin	0,013	0,025	0,019	0,0026	0,024	0,010
Serin	0,017	0,031	0,043	0,0090	0,020	0,017
Glutaminsäure	0,035	0,074	0,092	0,0114	0,076	0,025
Prolin	0,018	0,024	-	-	-	0,017
Glycin	0,032	0,082	0,049	0,0540	0,025	0,020
Alanin	0,030	0,074	0,03f,	0,0043	0,035	0,015
Valin	0,011	0,040	0,023	-	0,024	0,015
Isoleucin	-	-	0,021	-	0,019	-
Leucin	0,016	0,029	0,018	-	0,026	0,025
Phenylalanin	-	-	-	-	-	0,010
Lysin	-	0,026	0,016	-	0,024	0,010
Arginin	-	-	0,014	-	-	0,015

Daraus würde sich etwa folgende Aminosäurenverteilung in den Peptidkomplexen ergeben:

Tabelle 2

Wahrscheinliche Aminosäurenzusammensetzung der Peptide

	Mycobacl.	B. pertussis	E.coli	S. typhi	2	Str. pyog.	Humane
	tbc.				1		Lymphozyten
Asparaginsäure	2	3	2	1 bzw.	3	2	3
Threonin	1	1	1	1?	4	1	1
Serin	1	1	2	2 bzw.	0	1	2
Glutaminsäure	2	3	5	2 bzw.	21	4	3
Prolin	1	1	0	0	1-2	0	2
Glycin	2	3	2-3	11 bzw.	0	1	2-3
Alanin	2	3	2	1 bzw.	0	2	2
Valin	1?	1-2	1	0	0	1	2
Isoleucin	0	0	1	0	0	1	0
Leucin	1	1	I	0	0	1	2
Phenylalanin	0	0	0	0	0	0	1
Lysin	0	1	1	0	1	1
Arginin	0	0	1?	0	0	2

Die aus den verschiedenen Organismen auf dem in den obigen Herstellungsbeispielen beschriebenen Weg isolierten Peptidkomplexe können z. B. zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern, zum Nachweis von spezifischen Antikörpern, zum Nachweis einer spezifischen verzögerten Immunitätslage und zur Resistenzsteigerung gegen Infektionserkrankungen sowie zur Übertragung einer spezifischen verzögerten Immunität (Transferfaktor-Eigenschaft) verwendet werden. Dazu die folgenden Anwendungsbeispiele:

Anwendungsbeispiel A

Zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern werden die aus verschiedenen Organismen isolierten — wie oben beschrieben — Peptidkomplexe an Kaninchen verabreicht. Hierbei werden 10—100 μg Peptidkomplex in O,l°/oiger NaCl gelöst und im Verhältnis 1:1 mit Freundschem Adjuvans emulgiert. Die Dosis wird zu vier gleichen Teilen in die Pfoten der Tiere injiziert.

Nach vierzehn Tagen werden 10 μg Peptidkomplex intravenös zur Boosterung verabreicht. Das Serum der Tiere wird auf Antikörperbildung im Ouchterlonytest überprüft. Die Boosterung wird in achttätigen Abständen wiederholt, bis gut sichtbare Ouchterlonyreaktionen zu beobachten sind. Hierzu genügen meist ein bis drei Boosterinjektionen. Im Ouchterlonytest werden die gebildeten Antikörper auf Spezifität überprüft. Die Überprüfung ergibt, daß die aus verschiedenen Organis-

men isolierten Peptidkomplexe spezifische Antikörper hervorrufen. Auffällig ist z. B. bei Pcptidkomplcxcn aus Bakterien, daß keine Typ- oder Gruppenspezifität besteht.

Anwendungsbeispiel B

Aus hitzeabgetöteten, lyophilisierten Tuberkelbakterien (Mycobacterium tuberculosis, typus humanus oder bovinus) wird gemäß dem Verfahren nach Beispiel 1 —3 der erfindungsgemäße Peptidkomplex gewonnen. Er ist sehr gut löslich in Wasser und in mit Blutserum isoosmotischen Salzlösungen. Er ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Alkohol, Äther, Chloroform und ist praktisch frei von Nukleinsäuren, Polysacchariden und Lipiden.

Aus der Aminosäurezusammensetzung gemäß Tabelle 1 errechnet sich ein Molekulargewicht von etwa 1200. Bei Messung in Massenspektrographen ergibt sich ein Molekularpiek bei 1152. Weitere Eigenschaften:

— Der Peptidkomplex läßt sich durch eine UM2-Membran der Firma Amicon filtrieren.

— Der Peptidkomplex enthält Calcium in einer Menge von ungefähr 1 Mol/Mol Peptid. Das Calcium ist relativ fest gebunden und liegt wahrscheinlich in Komplexbindung vor.

— Der Peptidkomplex wandert bei der Dünnschichtchromatographie mit Chloroform, Methanol, Ammoniak 2 :2 :1 als Laufmittel einheitlich.

— Der Komplex wird auch durch mehrstündiges Erhitzen auf 10O⁰C in wäßrigen Lösungen bei neutralen pH-Werten nicht in seiner Antigenität beeinflußt.

— Der Komplex wird durch Erhitzen auf 100⁰C in 1 η-Essigsäure für 2 Stunden nicht wesentlich in seiner Antigenität beeinflußt.

— Der Komplex wird teilweise durch Zugabe von Terbium(!ll)-Chlorid-Ix)sungen in hohen Verdünnungen gefällt. Er wird hierbei schwerer löslich in wäßrigen Lösungen.

Der Peptidkomplex wird bei Meerschweinchen gegen gereinigtes Tuberkulin standardisiert. Fin ng entspricht etwa einer Tuberkulineinheit (gereinigtes Tuberkulin der Farbwerke I loechst AG).

Zur Intraciitantestung wird der Peptidkomplex in 05% NaCl-Lösung gelöst. Erhitzen auf 100⁰C hat keinen Einfluß auf die Wirksamkeit Der gelöste Peptidkomplex ist mehrere Monate lang ohne Wirkungsverluste stabil Die Testung erfolgt mit in Zehnerpotenzen abgestuften Konzentrationen. Es werden jeweils 0.1 ml streng intracutan injiziert. Die Ablesung erfolgt nach 24, 48 und 72 Stunden durch Ausmessen des Infiltrats.

Bei der Testung mit Ing und 10ng kann die Möglichkeit des Bestehens einer aktiven Tuberkulose (extrapulmonale und pulmonale Formen) des Kindes mit großer Sicherheit innerhalb von 48 Stunden erkannt werden. Mit 0,1 ng und 1 ng ist die Möglichkeit des Bestehens einer extrapulmonalen Tuberkulose bei Kindern und Erwachsenen innerhalb von 48 Stunden mit großer Sicherheit erkennbar. BCG-geimpfte Kinder bleiben bei Testung mit 1 ng zu einem großen Prozentsatz negativ. Es ergibt sich ein hoher Trenneffekt zwischen BCG-gehnpften und tatsächlich an Tuberkulose erkrankten Personen. Bereits kleine Infiltrate sind als spezifisch anzusehen. Dies konnte bei einem Infiltrat von 3 mm Durchmesser, das mit 0,1 ng ausgelöst wurde, histologisch nachgewiesen werden.

Nicht infizierte Personen entwickeln keine Reaktion. Unspezifische Reaktionen wurden nicht beobachtet.

Erwachsene mit tertiärer Lungentuberkulose zeigen

in fortgeschrittenen Stadien schwächere Reaktionen gegenüber Patienten in weniger fortgeschrittenen Stadien. Patienten mit einer tuberkulösen Pleuritis entwickeln schwächere Reaktionen als Patienten mit Lungentuberkulose ohne Pleuritis. Die mit dem Peptidkomplex ausgelösten Reaktionen sind in der

κι Konzentrationsabhängigkeit und der Reaktionsstärke nicht identisch mit den durch gereinigtes Tuberkulin hervorgerufenen Reaktionen. ■

Vorteile der Testung mit dem Peptidkomplex:

1. Schnellerer Verlauf der verzögerten Immunreaktion; die Ablesung ist hierdurch nach 24 Std. optimal.

2. Eine Testung mit 1 ng Peptid erlaubt in mindestens 75% der Fälle, das Bestehen einer aktiven Tuberkulose bei Kindern innerhalb von 24 Std. zu erkennen.

3. 2 Testungen mit 1 ng und 10 ng Peptid erlauben mit einem hohen Grad an Sicherheit, die Möglichkeit einer Tuberkulose-Infektion beim Kind unabhängig

' von der Tuberkuloseform zu erkennen. 4. Die hohe Empfindlichkeit von Patienten mit extrapulmonalen Tuberkuloseformen gegen das Peptid erlaubt eine rasche und sichere Diagnostik dieser Tuberkuloseformen.

5. Die hohe Trenneigenschaft zwischen BCG-Geimpften und erkrankten Personen erspart einen unnötigen diagnostischen Aufwand, insbesondere Röntgenuntersuchungen.

6. Es konnten keine unspezifischen Nebenreaktionen außer einer flüchtigen leichten Rötung von bis zu 1 Std. Dauer nach der Injektion beobachtet werden.

Aus den angeführten Gründen ist das Peptid dem Tuberkulin auch in seiner gereinigten Form überlegen. Das Peptid erfüllt als singuläres, hochpotentes Antigen alle Ansprüche, die an einen Teststoff für die Erkennung einer Tuberkuloseinfektion zu stellen sind. Man kann es als das lang gesuchte, reine Prinzip der Tuberlulosetestsloffe ansprechen.

₄- Anwendungsbeispiel C

Messung der Stimulierbarkeit von Lymphozyten im Lymphozytentransformationstest nach Harztman und Mitarbeitern (Transplantation 11 [1971], 268—273). Im Lymphozytentransformationstest bewirkt der gemäß Beispiel 1—3 gewonnene Peptidkomplex eine dosisabhängige Stimulation der Lymphozyten von tuberkulinpositiven, natürlich infizierten Personen in einem Bereich von 1 μg bis 10 pg. Oligopeptidkomplex pro Kultur. Lymphozyten von tuberkulinnegativen Personen werden nicht stimuliert. Eine unspezifische Basisstimulation, wie sie durch gereinigtes Tuberkulin ausgelöst wird (Proc. Nat Acad. Sei USA VoL 71 [1974], 1178—82), ist nicht nachweisbar. Im Gegensatz zu den Lymphozyten von natürlich infizierten Personen, waren

Mi Lymphozyten von BCG-geimpften Personen nicht meßbar stimulierbar. Lymphozyten von Personen mit einer tuberkulösen Pleuritis waren ebenfalls nicht meßbar stimulierbar.

_b5 Anwendungsbeispiel D

Serumproben von Leptrakranken, Tuberkulosekranken oder auf Tuberkulin positiv reagierenden, gesunden Personen, sowie auf Tuberkulin negativ reagierenden

Personen wurden im Mikroouchterlonyltest auf humorale Antikörper untersucht gegen den aus Mycobacterium Tuberkulosis isolierten Peptidkomplex, untersucht. Bei auf Tuberkulin negativ und positiv reagierenden gesunden Personen ergaben sich keine Reaktionen. Bei an Tuberkulose erkrankten Personen kam es nur vereinzelt zu Präzipitationsreaktionen. Diese Seren stammten ausschließlich von Patienten mit fortgeschrittenen tertiären Lungentuberkulosen. Bei Leprakranken mit einer lepramatösen Verlaufsform ergaben sich auffallend starke Präzipitationsreaktionen, während Leprakranke mit einer tuberkuloiden Verlaufsform nur schwache oder keine Reaktionen aufwiesen.

Gemäß vorstehenden Beispielen B—D sind dennoch exakte in vitro-Messungen der verzögerten Immunität bei Tuberkulose und Lepra möglich. Dies stellt einen großen Fortschritt dar. Der Peptidkomplex kann zur Resistenzsteigerung gegen eine Infektion mit Hycobacterium tuberculosis eingesetzt werden. Wegen der gemeinsamen Antigendeterminante mit Mycobacterium leprae kann der erfindungsgemäße Oligopeptidkomplex für eine Resistenzsteigerung gegen eine Infektion mit Mycobacterium leprae vorgesehen werden.

Anwendungsbeispiel E

Pertussis (Keuchhusten) ist, gemessen an Letalität und Komplikationen, bis heute eine der gefährlichsten Infektionskrankheiten des Kindesalters. Besonders gefährdet sind Kinder in den ersten sechs bis acht Lebensmonaten. Die Impfung mit ganzen Bordetella pertussis-Keimen ist gefährlicher als viele andere Impfungen. Man ist gezwungen, mit den resistenzsteigernden Faktoren alle Inhaltsstoffe der Keime zu verabreichen, d. h. Stoffe, die zum Teil toxisch sind und eine Vielzahl von Antigenen enthalten, die keine Beziehung zur Resistenz aufweisen, jedoch keine unerwünschten Reaktionen des Organismus bewirken.

Es wurde nun gefunden, daß man diese Nachteile vermeiden und eine Resistenzsteigerung dadurch erreichen kann, daß man einen aus Bordetella pertussis-Keimen gewonnenen kleinmolekularen Peplidkomplex gemäß Erfindung zur Impfung verwendet.

Die Isolierung des erfindungsgemäßen Peptidkomplexes aus Bordetella pertussis-Keimen wird vorgenommen, indem man die hitzeabgetöteten Bordetella Pertussis-Keime homogenisiert und die so erhaltene Aufbereitung von ihren Festbestandteilen durch Zentrifugieren, Filtrieren mit geeigneten Filtern oder Sedimentieren weitgehendst trennt. Im Anschluß daran kann die erhaltene flüssige Phase einem Trennverfahren unterworfen werden, wie es in den Beispielen 1—3 erläutert wurde. Aus 30 g lyophi|isierten_: hit?eabgetöteten Bakterien ergeben sich etwa 30 mg Peptidkomplex-Substanz in lyophilisierter Form.

Die Aminosäurenzusammensetzung des gewonnenen Peptidkomplexes ergibt sich gemäß Tabelle 1. Hieraus errechnet sich ein wahrscheinliches Molekulargewicht von 1760 (mit 1 Valin) bzw. 1880 (mit 2 Valin). Weitere Eigenschaften:

— Das Peptid IaBt sich durch eine UM2-Membran der Firma Amicon filtrieren.

— Das Peptid enthält Calcium in einer Menge von ungefähr 1 Mol/Mol Peptid. Das Galcium ist relativ fest gebunden und liegt wahrscheinlich in Komplexbindung vor.

— Das Peptid erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie mit dem Laufmittel Chloroform, Metha nol, Ammoniak 2 :2 :1 als einheitliche Substanz.

— Das Peptid ist stabil gegen Erhitzen auf 100⁰C in wäßrigen Lösungen.

— Das Peptid wird durch Zugabe von Terbium(III)-■; Chlorid-Lösungen in hoher Verdünnung gefällt. Es wird hierbei unlöslich in wäßrigen Lösungen.

— Das Peptid ist praktisch frei von Nucleinsäuren, Polysacchariden und Lipiden.

— Das Peptid ist sehr gut löslich in Wasser und in mit ίο Blutserum isoosmotischen Salzlösungen. Es ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Alkohol, Äther, Chloroform.

Der aus Bordetella pertussis Bakterien isolierte

π Peptidkomplex wurde in 0,9% NaCl-Lösung gelöst und die jeweilige zur Impfung verwendete Konzentration 1 :1 mit kompletten Freundschen Adjuvans versetzt.

Weiße Mäuse von 17 bis 22 Gramm erhalten eine intramuskuläre Injektion des Peptidkomplexes (z. B.

>o 1 μg/Maus, 0,1 μg pro Maus, 0,01 μg pro Maus). Nach 14 Tagen erfolgt eine intracerebrale Challenge-Infektion mit Bordetella pertussis Keimen nach den Vorschriften des Europäischen Arzneibuches für die Impfstoffprüfung. Die Absterbekurve zeigt eine dosisabhängige Resistenzsteigerung. Bei 1 μg pro Maus Peptidkomplex aus Bordetella pertussis ist die resistenzsteigernde Wirkung bereits ausgezeichnet Sie entspricht der Schutzdosis von 0,1 IE des handelsüblichen Pertussisimpfstoffes, der abgetötete Bakterien enthält, ohne

jo dessen bereits erwähnte Nachteile aufzuweisen.

Die neuartige Impfung gegen eine Bordetella pertussis-Infektion stellt einen großen Fortschritt dar. Die Gefährdungen des bisherigen Impfstoffes werden vei mieden. Die Impfung kann in das frühe Säuglings-

r> alter vorgeschoben werden und damit in die Zeit der höchsten Gefährdung. Der neue Impfstoff ist außerordentlich stabil gegen Temperatureinflüsse und ist über lange Zeit (Monate und Jahre) haltbar. Er stellt ein resistenzsteigerndes Prinzip ohne schädliche Begleit substanzen dar. Der neue Impfstoff entspricht somit allen Kriterien eines idealen Impfstoffes gegen eine bakterielle Infektion.

Mit der Methodik der Beispiele 1—3 können aus vielen anderen Bakterien und anderen DNS-haltigen Organismen Peptidkomplexe isoliert werden, die sich als hochpotente, für den jeweiligen Organismus spezifische Antigene erweisen. Die Peptide sind jeweils durch eine charakteristische Aminosäurezusammensetzung gekennzeichnet Es ist dabei offensichtlich, daß die bei Pertussis und Tuberkulosis (vgl. Beispiele B-E) beobachtete Resistenzsteigerung nur ein Beispiel für die spezifisch resistenzsteigernde Eigenschaft der spezifischen Peptide dieser Gruppe ist

.. Anwendungsbeispiel F

Der spezifische aus Streptokokken isolierte Peptidkomplex wird in 0,9%iger NaQ gelöst Bei intracutaner Injektion von 10 bis 100 ng Peptidkomplex treten bevorzugt bei Patienten mit rheumatischem Fieber und ω einer akuten, diffusen Glomerulonephritis verzögerte Hautreaktionen auf, die sich im Auftreten und in ihrer Stärke von Reaktionen gesunder Kontrollpersonen unterscheiden.

Anwendungsbeispiel G

Mit dem spezifischen aus Streptokokken (Streptococcus pyogenus) isolierten Peptidkomplex treten im Ouchterlonytest positive Reaktionen mit dem Serum

il

von Patienten mit einem rheumatischen Fieber und einer akuten diffusen Glomerulonephritis auf. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z. B. mit dem Laser-Nephelometer der Firma Behringwerke AG, Marburg, bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 μΐ Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z.B. 10 ng, 100 ng, 1 μg) gegeben.

Anwendungsbeispiel H

Der spezifische aus Escherichia coli isolierte Peptidkomplex wird in 0,9%iger NaCI gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive Reaktionen im Serum von Patienten, die an einer Colitis ulcerosa erkrankt sind, beobachtet. Bei gesunden Personen (z. B. Blutspenderseren) werden nur vereinzelt schwache Reaktionen beobachtet. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z. B. mit dem Laser-Nephelometer der Firma Behring bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 μΙ Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z.B. 10 ng, 100 ng, 1 μg) gegeben.

Anwendungsbeispiel I

Der spezifische aus Salmonella typhi Bakterien isolierte Peptidkomplex wird in 0,9%iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive Reaktionen im Serum von Patienten beobachtet, die an Typhus erkrankt waren oder bereits zwei bis drei Wochen an Typhus erkrankt sind. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z. B. mit dem Laser-Nephelometer bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 μΙ Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z.B. 10 ng, 100 ng, 1 μg) gegeben.

Anwendungsbeispiel K

Der spezifische aus Candida albicans Pilzen isolierte Peptidkomplex wird in 0,9%iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden positive Reaktionen im Serum von Patienten beobachtet, die an einer Candida albicans-Infektion erkrankt sind oder waren. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z. B. mit dem Laser-Nephelometer bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 μΐ Serum unterschiedliche Mengen Peptidkomplex (z. B. 10 ng, 100 ng, 1 μg) gegeben.

Anwendungsbeispiel L

Aus Synovia, die durch Operation aus dem entzündeten Gelenk von Patienten, die an einer rheumatischen Arthritis erkrankt sind, gewonnen wird, wird ein Peptidkomplex auf den in den Beispielen 1 — 3 genannten Weg gewonnen. Der Peptidkomplex wird in 0,9%iger NaCl gelöst. Im Ouchterlonytest werden im Serum von an rheumatoider Arthritis erkrankten Personen positive Reaktionen beobachtet. Quantitativ kann der Antikörperspiegel z. B. mit dem Laser-Nephelometer bestimmt werden. Hierzu werden zu 200 μΙ Serum unterschiedliche Mengen Peptid (z.B. 10 ng, 100 ng, I μg) gegeben.

Anwendungsbeispiel M

Aus Blastenzellen von Patienten, die an einer akuten lymphatischen Leukämie erkrankt sind, wird ein Peptidkomplex auf dem in den Beispielen 1—3 genannten Weg gewonnen. Zur Kontrolle wird aus

κι normalen Lymphocyten ebenfalls ein Peptidkomplex gewonnen. Die beiden Peptidkomplexe werden in 0,9%iger NaCI gelöst. 10 ng bis ^g der beiden Peptidkomplexe werden in 0,1 ml Lösung streng intracutan injiziert. Die Verabreichung erfolgt an der

ii Innenseite der Vorderarme, wobei der Peptidkomplex aus Blastenzellen jeweils auf den rechten Arm und der Peptidkomplex aus normalen Lymphocyten jeweils auf den linken Arm appliziert wird. Als positive Reaktion wird das Auftreten einer typischen verzögerten

-¹Ii Reaktion bezeichnet. Während mit dem aus normalen Lymphocyten gewonnenen Peptidkomplex keine positiven Reaktionen beobachtet werden können, verursacht der aus Blasten isolierte Komplex bei einem Teil der Probanden verzögerte Reaktionen. Die verzögerten

_') Reaktionen lassen eine charakteristische Verteilung erkennen. Sie treten in großer Häufigkeit bei Personen auf, die in Kontakt zu an akuter lymphatischer Leukämie erkrankter Patienten stehen.

_Jn Anwendungsbeispiel N

Gewinnt man den erfindungsgemäßen Peptidkomplex gemäß den Beispielen 1—3 aus Lymphozyten eines menschlichen Organismus, der gegen ein bestimmtes Antigen, z. B. Tuberkulin, eine verzögerte Immunität

π aufweist, und injiziert diesen Peptidkomplex einem anderen Menschen, der keine verzögerte Immunität gegen das genannte Antigen aufweist, so löst der vorgenannte Peptidkomplex eine verzögerte Immunität bei dem bisher nicht immunen Menschen aus, die gegen

in das genannten Antigen gerichtet ist. Der Peptidkomplex aus Lymphozyten besitzt somit Transferfaktor-Eigenschaften für die verzögerte ImmunitäL

Anwendungsbeispiel O

Die spezifischen Peptidkomplexe werden nach der Methode von Hunter (Fundstelle: Hunter, W. M. Radioimmunoassay in: Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunocheniistry, Chapter 17. Sec.

>n Edition. Blackwell Scientific Publications, Oxford-London-Edinbourgh-Melbourne, 1973) mit '-⁵) gekoppelt. Mit den radioaktiv markierten Peptidkomplexen werden jeweils für den eingesetzten Peptidkomplex spezifische Radioimmunoassays durchgeführt.

Claims

Patentansprüche:

1. Peptidkomplexe, erhältlich aus desoxyribonucleinsäurehaltigen Organismen, wobei

a) die Organismei. und/oder deren Teile in nativem oder denaturiertem Zustand in 0,2-m-Phosphatpuffer, pH 7,2, homogenisiert werden,

b) das Homogenisat zentrifugiert wird,

c) der Überstand mit Phosphatpuffer beladener DEAE-Zellulose verrührt und in eine Säule gefüllt wird,

d) die beladene DEAE-Zellulose so lange mit 0,2molarem Phosphatpuffer eluiert wird, bis die Extinktion des Eluats bei 280 nm unter 0,1 liegt, anschließend mit 0,1-m Essigsäure-Acetatlösung, pH 3,2, weiter eluiert wird, bis die Extinktion des Eluats bei 280 nm wieder unter 0,1 liegt, dann mit einer 3% NaCl-haltigen 0,1-m Essigsäure-Acetatlösung, pH 3,2, eluiert ²" und die mit der NaCl-Front im Eluat erscheinende Ribonucleoproteidfraktion (RNP) gesammelt, gegen Wasser dialysiert, eingeengt und lyophilisiert wird,

d a d u r c h g e k e η η z e i c h η e t, daß man

!) das lyophilisierte in Wasser gelöste RNP mit Phenol versetzt, auf etwa 95-100⁰C erhitzt, nach dem Abkühlen bis zur Phasentrennung zentrifugiert, die Phenolphase mit Wasser versetzt, dann mit Äther wiederholt ausschüttelt und den wäßrigen Rückstand lyophilisiert; oder

II) das in Wa&ser gelöste RNP einer Hochspannungselektrophorese unterwirft und den Peptidkomplex in üblicher Weise isoliert oder
III) aas dem in Wasser gelösten RNP dünnschichtchromatographisch den Peptidkomplex isoliert.