DE2652684C3

DE2652684C3 - Wasserlösliches Protein (Antigen) aus β-hämolysierenden Streptokokken der Gruppe A

Info

Publication number: DE2652684C3
Application number: DE19762652684
Authority: DE
Inventors: Gerhard Thornwood N.Y. Treser
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-11-19
Filing date: 1976-11-19
Publication date: 1982-03-25
Also published as: DE2652684A1; DE2652684B2

Description

a) Dispergieren von Streptokokken der Gruppe A in Wasser von neutralem pH-Wert;

b) Aufbrechen der Zellen der Streptokokken durch Druckbehandlung oder Ultraschallbe- '' handlung der Mischung, wobei die Temperatur der Mischung unter 70⁰C, vorzugsweise bei 30°C gehalten wird;

c) Abtrennen der wasserunlöslichen Zellfragmente aus der Flüssigkeit; ^:"

d) Gewinnen des Proteins aus dem Überstand von c) nach Entfernen der Nucleinsäuren daraus. Dialyse gegen destilliertes Wasser und Gefriertrocknen der Lösung des Proteins; und

e) Reinigen des nach d) erhaltenen Lyophihsats "' durch zweimaliges Fällen bei einer 60%igen Ammoniumsulfatkonzentration und Dialyse gegen neutralen Phosphatpuffer.

2. Wasserlösliches Protein nach Anspruch 1, »> dadurch gekennzeichnet, daß in Verfahrensstufe e) die Reinigung durch Säulenchromatographie an Bio-Gel A5® oder durch Elektrophorese an PoIyacrylamidgel durchgeführt wird.

3. Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen r> Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die im Anspruch 1 angegebenen Verfahrensschritte a) bis e) in der angegebenen Weise und Reihenfolge durchgeführt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- -w zeichnet, daß die Verfahrensschritte e) der in Anspruch 2 angegebenen Weise durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft ein wasserlösliches Protein (Antigen) aus beta-hämolysierenden Streptokokken der Gruppe A, das immunologisch mit Antikörpern im Serum eines sich von akuter Glomerulonephritis erholenden Patienten und mit Antikörpern von Menschen, die zuvor Streptokokken der Gruppe A ausgesetzt waren, reagiert. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren dieses Antigens.

Es besteht allgemeine Übereinstimmung, daß Streptokokken der Gruppe A die Ursache der meisten Fälle von akuter Glomerulonephritis sind und daß die akute Poststreptokokken-Gloinerulonephritis die Folge einer komplementbindenden Antigen-Antikörperreaktion ist. Während der Frühphase der Streptokokkeninfektion sind die Glomerulum-Basismembranen nur teilweise mit Antikörper(IgG) und Komplement (ß IC) bedeckt. Nach etwa 10 Tagen sind alle Basismembranen und Teile der Mesangium-Flächen mit Antikörper und Komplement bedeckt Es wurde gefunden, daß der Antikörper in der Glomerulonephritis gegen ein Antigen gerichtet ist, das in den allerersten Tagen der Krankheit nur in ungesättigter Form vorliegt und dann rasch mit Antikörper abgesättigt wird und durch markierten spezifischen Antikörper nicht langer nachgewiesen werden kann.

Wie angegeben, scheint ein Antigen mit der akuten Poststreptokokken-GIomerulonephritis (AGN) in Beziehung zu stehen, wo es eine Antikörperreaktion erzeugt, die möglicherweise zum Krankheitsprozeß führt. Jedoch kann ein Antikörper gegen dieser. Stoff in vielen »normalen« Individuen vorhanden sein, die möglicherweise geringsten Mengen dieses Antigens ausgesetzt waren, was zur Antikörperbildung geführt hat, jedoch nicht notwendigerweise zur Krankheit oder nur einer milden Form der Krankheit, die gewöhnlich klinisch nicht aufgefunden wird.

Aus früheren Untersuchungen folgt, daß ein Antigen anfangs subendothelial und in dem nicht mit Antikörper gesättigten Mesangium vorhanden ist. Es kann die Grenzschicht (Schranke) der Basalmembran nicht durchdringen, bevor es mit Antikörper und Komplement komplex gebunden ist, wobei letzteres die Permeabilität der Basalmembran erhöht und ermöglicht, daß die Immun-Komplexe in und durch die Membran hindurchdringen und gegebenenfalls subepitheliale Immunaggregate bilden. Es scheint, daß das Antigen wegen seiner Molekülgröße die Grenzschicht nicht durchdringen kann. Außerdem zieht es seinen eigenen spezifischen Antikörper an, wenn dieser verfügbar wird; Komplexe werden unmittelbar unter der Basalmembran gebildet, und es folgen durch das Komplement hervorgerufene Membranveränderungen und ein Eindringen der Immun-Komplexe.

Das Antigen scheint den meisten, wenn nicht allen Streptokokken der Gruppe A nach Lancefields Klassifizierung (Harvey Lect. 36: 251, 1940) gemeinsam zu sein. Weiterhin wird das Antigen nur freigesetzt, wenn die Streptokokken aufgebrochen werden. Es scheint kein Exozym zu sein, das von den Streptokokken ausgeschieden würde, solange sie intakt sind.

Frühere Versuche, das Antigen wirksam und in relativ hoher Konzentration zu isolieren, verliefen unbefriedigend (Treser, G.; Semar, M.; Ty, A.; Sagel. I.; Franklin, M. A.; und Lange, K.; J. Clin. Invest. 49: 762, 1970). Beispielsweise wurden von Patienten mit AGN isolierte Streptokokken der Gruppe A 20 Stunden bei 37°C in einem geeigneten Medium gezüchtet, das Medium wurde dann entfernt, und die Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung und in einem Phosphat-Puffer gewaschen. Die intakten Streptokokkenzellen wurden durch fünfmaliges Einfrieren-Auftauen in einer Trockeneis-Acetonmischung aufgebrochen, um eine überstehende Flüssigkeit und Zellfraktionen zu erhalten. Diese Methode hat sich wegen kleiner Ausbeuten als nachteilig erwiesen. Diese so erhaltene, Antigen enthaltende Substanz, war hochgradig unrein und enthielt ein lösliches Komponentengemisch von einem Molekulargewicht von etwa 120 000 und enthielt außerdem 1,5% Hexose und 10,95% Gesamtüpide.

Aus der US-PS 38 10 819 ist eine als Antigen wirksame Substanz bekannt, die aus liämolytischen Streptokokken nach Zerstörung der Zellen auf mechanische Weise (Mahlen) oder durch Enzymauflösung gewonnen wird, indem ein wäßriger zellfreier Extrakt der Zellen mittels einer 50 bis 80% gesättigten Ammoniumsulfatlösung ausgesalzen wird. Der gewon-

nene Stoff wird bei 5³C und einen pH von 5 innerhalb von 24 Stunden inaktiviert, ist jedoch bei pH 7 bis 8 verhältnismäßig stabil und verträgt Einfrieren für etwa

1 Monat.

Die oben erwähnten, in der Literatur beschriebenen Antigene aus hämolysierenden Streptokokken unterscheiden sich voneinander und auch von einem anderen, in der US-PS 34 80 610 beschriebenen »M-Antigen«, welches an die Zellwände von hämolysierenden Streptokokken gebunden ist und wasserunlöslich zu sein scheint. Danach enthalten also beta-hämolysierende Streptokokken verschiedene, als Antigen wirksame Stoffe, und es stellt sich die Aufgabe, aus beta-hämolysierenden Streptokokken ein Antigen in verhältnismäßig großen Mengen und hoher Konzentration und Reinheit zu gewinnen, welches immunologisch mit Antikörpern im Serum eines sich von akuter Glomerulonephritis (AGN) erholenden Patienten reagiert und vielen, wenn nicht allen Gruppen A Streptokokken gemeinsam ist und offenbar nicht von der Zellwand sondern dem Cytoplasma kommt, oder der innersten Lage, der Plasmamembran, die das Cytoplasma umschließt, anhaftet.

Die gestellte Aufgabe wird gelöst durch das wasserlösliche Protein (Antigen) gemäß Anspruch l.das durch die im Anspruch 1 angegebenen Verfahrensschritte erhalten wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zusätzlich die in Anspruch 2 angegebenen Verfahrensschritte angew andt.

Das erfindungsgemäße wasserlösliche Protein ist ein Antigen und gekennzeichnet durch besondere Eigenschaften und durch die Abwesenheit anderer bestimmter Eigenschaften, wie hiernach erläutert. Es unterscheidet sich von dem in der US-PS 34 80 610 beschriebenen »M-Antigen« durch seine Masserlöslichkeit, von der aus J. Clin. Invest. 49, 762 bekannten Antigen enthaltenden Substanz dadurch, daß es ein reines Protein ist, also keine Hexose und Lipide enthält, und von dem aus US-PS 38 10 819 bekannten Antigen dadurch, daß es bereits mit 33% gesättigter Ammoniumsulfatlösung ausgefällt wird, statt zwischen 50 und 80%, und bei pH 5 und 5°C mehr als 24 Stunden ohne Aktivitätsverlust beständig ist und bei pH 7,2 in einem Phosphatsalzpuffer bei etwa -70⁰C oder auch etwa — 20⁰C für mehr als

2 lahre ohne Aktivitätsverlust haltbar ist. Das erfindungsgemäße Antigen ist ein neuer Stoff, der durch eine Anzahl im folgenden angegebener Parameter und im übrigen durch das zu seiner Herstellung dienende Verfahren gekennzeichnet ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Streptokokken der Gruppe A in einem wäßrigen Medium bei etwa neutralem pH suspendiert, und die erhaltene Mischung wird mit mechanischer Energie beaufschlagt, während die Temperatur der Mischung unter 7O⁰C, vorzugsweise bei etwa 3O⁰C gehalten wird. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit, die das gewünschte Antigen enthält, wird dann von den wasserunlöslichen Zellbestandteilen getrennt.

Die mechanische Energie kann der erhaltenen Mischung zugeführt werden, indem man die Mischung in ein Druckgefäß bringt, den Druck im Gefäß auf etwa 1410kp/cm² bis etwa 3520 kp/cm², insbesondere etwa 2460 (20 000 bis etwa 50 000 psi), erhöht und dann plötzlich den Druck auf Atmosphärendruck verringert. Wie angegeben, muß das so vorgenommen werden, daß die Temperatur der erhaltenen Mischung unter 70⁰C bleibt. Eine ausreichende Temperaturregelung kann erreicht werden durch indirekten Wärmeaustausch eines in den Wänden des Gefäßes vorhandenen geeigneten Kühlmittels mit der Mischung. Eine typische Apparatur für diesen Zweck ist ein gekühlter Zell-Fraktiona;orTyp RF-I Sorvall-Ribi.

Ein anderes mögliches, jedoch weniger vorteilhaftes Mittel zum Aufbrechen der Streptokokken ist Ultraschall. Hier muß wiederum die Denaturierung durch zu hohe Temperaturen (über 70° C) vermieden werden. Eine typische UltraschallqueHe ist ein Apparat mit der Bezeichnung Ultrasonifer, Modell W 140 D, Hersteller Heat Systems Ultrasonic Ina, der eine Maximalleistung von 20 000 Cyclen pro Sekunde während 10 Minuten hat.

Die erhaltene überstehende Flüssigkeit, welche das Antigen enthält, wird dann von den wasserunlöslichen Zellfragmenten getrennt. Das Antigen wird nach Ausfällen der Nucleinsäuren weiter gereinigt durch Saulenchromatographie der Flüssigkeit. Eine Säulenfüllung von Bio-Gel® A5m, Korngröße 0,149 bis 0,074 mm (100 bis 200 mesh), Fraktionierungsbereich 10 000 bis 5 000 000, Agarosekonzentration 6%; Sepharose® 6B, Fraktioniei ungsbe-eich von 10⁵ bis 4 χ 10^b, Agarosekonzentration 6%; oder andere geeignete Media können zum Fraktionieren der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen überstehenden Flüssigkeit benutzt werden. Die Aktivität, welche den Antikörper aus färbenden Seren von Patienten, die AGN überstanden haben und sich davon erholen, präabsorbiert, ist dann auf eine oder wenige aufeinander folgende Reagenzgläser des Eluats begrenzt, während folgende Fraktionen keine solche Wirkung zeigen.

Ähnlich enthält, wenn die wie oben erhaltene überstehende Flüssigkeit der Acrylamidgel-EleKtrophorese unterworfen wird, nur ein kleiner Bereich nahe der Anode die präabsorbierende Substanz. So ermöglichen diese und andere ähnliche Verfahren eine weitere Reinigung der Substanz.

Wenn die Substanz in Agarose-Doppelimmunodiffusionsplatten den Seren von Patienten gegenübergestellt wird, die sich von AGN erholen, reagiert sie unter Bildung einer Präcipitationslinie.

Wie oben angegeben ist das Antigen ein Protein. Es ist gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften und durch die Abwesenheit bestimmter Eigenschaften:
wasserlöslich;

nicht inaktiviert durch Veränderungen des pH-Wertes zwischen 3 und 9;

Aktivität wird durch Erwärmen auf 70⁰C und darüber zerstört;

durch eine semi-permeable Membran nicht dialysierbar; enthält keine freien Nucleinsäuren (wird nicht gefällt durch Streptomycinsulfat);

nicht inaktiviert durch Ribonuclease oder Desoxyribonuclease;

gefällt durch 60% Sättigung mit (NH₄J₂SO₄ Lösung;
reagiert nicht mit 3,5-Dihydroxytoluol (Orcinol);
nicht immunologisch identisch mit Streptolysin, Streptodornase, Streptokinase oder Hyaluronidase, wie sich durch die Nichtidentität mit den Präcipitationslinien zwischen diesen Substanzen und dem Serum eines sich von AGN erholenden Patienten und der Präcipitationslinie, die zv/ischen dem Antigen und dem Serum des Patienten gebildet wird, erweist.

Das Antigen bildet leicht Antikörper, wenn es in Kaninchen oder andere geeignete Wirte injiziert wird, wie in einem der folgenden Beispiele erläutert. Immunologisch identische Antikörper zu diesem Anti-

gen können im Serum von Patienten, die sich von AGN erholen, und, wie oben erwähnt, auch in normalen Individuen gefunden werden.

lmmun-Gammaglobulin in Seren von AGN-Konvaleszenten, das mit Fluorescein markiert ist, färbt Stellen auf Glomerula, die von Patienten mit Glomerulonephritis erhalten wurden, während der Frühphase der Krankheit, was die Anwesenheit von freiem Antigen zeigt Wenn solche Seren zuvor mit der hier beschriebenen Streptokokken-Substanz präabsorbiert wurden, färben sie die Glomerula nicht länger, da die Streptokokken-Substanz anscheinend das Antigen enthält, das mit dem Antikörper im Serum des AGN-Konvaleszenten reagiert

Das Antigen ist möglicherweise in allen beta-hämolysierenden Streptokokken der Gruppe A enthalten, jedoch enthalten solche, die nephritogen sind, d. h. in einem geeigneten Wirt akute Glomerulonephritis erzeugend, die Substanz in größeren Mengen als nicht-nephritogene Streptokokken der Gruppe A tragen. Wenn dieses Antigen, was der Fall zu sein scheint, das akute Poststreptokokken-Glomerulonephritis (AGN) erzeugende Antigen ist, kann eine Injektion kleiner Mengen der Substanz als ein Vaccin geeignet sein, das schützende Antikörper ohne Erregung der Krankheit erzeugt.

Die Erfindung wird weiter erläutert durch die folgenden Ausführungsbeispiele.

Beispiel 1

Stämme von beta-hämolysierenden Streptokokken der Gruppe A, die ζί '.-"-schiedenen M-Typen und T-Typen gehören, werden von Patienten mit akuter Poststreptokokken-Glomerulonephritis oder Patienten mit Infektionen mit Streptokokken der Gruppe A isoliert. Die Streptokokken werden in 8 bis 12 Litern Todd-Hewitt-Boullion 18 Stunden gezüchtet und mit dem kontinuierlichen Flußsystem einer Zentrifuge Typ Sorvall RC-I (Hersteller Ivan Sorvall, Inc., Norwalk, Connecticut, USA) geerntet. Die sedimentierten Zellen ■ werden dreimal mit phosphat-gepufferter Salzlösung von pH 7,2 (PBS) gewaschen. Nach dem Suspendieren der gewaschenen Zellen in einem entsprechenden Volumen von destilliertem Wasser werden sie aufgebrochen durch explosive Dekompression im Ribi Zell-Frak- ■ tionator (Hersteller Ivan Sorvall, Inc., Norwalk, Connecticut) bei einem Druck von 2460 kp/cm^ (35 000 psi). Die Zellsuspension wird mit 16 000 Umdrehungen pro Minute 1 Stunde in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wird je dreimal mit PBS und destilliertem Wasser gewaschen und lyophilisiert. Die überstehende Flüssigkeit, die im folgenden als RCS (ruptured streptococci! cell supernatants) bezeichnet wird, liefert das Arbeitsmaterial.

Aus dem RCS werden Nucleinsäuren durch Zugabe von einem Teil 0,2 M Streptomycinsulfat (Hersteller Calbiochem, San Diego, Californien, USA) zu neun Teilen des RCS entfernt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 4⁰C inkubiert, und die gefällten Nucleinsäuren werden durch 30 Minuten Zentrifugieren mit 12 000 Umdrehungen pro Minute entfernt. Das klare RCS wird gründlich gegen destilliertes Wasser dialysiert und loyphilisiert. Das RCS wird durch 60% Sättigung mit Ammoniumsulfat gefällt. Die Fällung wird in Wasser gelöst und ein zweites Mal mit dei gleichen Sättigung von Ammoniumsulfat gefällt. Diese Fällung wird in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst und über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Die Gegenwart des Antigens im Streptokokken-RCS wird durch eine Absorptionsmethode nachgewiesen. 1,0 mg des Iyophilisierten RCS oder von anderen zu untersuchenden Fraktionen wird zu 0,1 ml der mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Immunoglobuün-G-Fraktionen der zu untersuchenden Seren hinzugefügt.

Die Mischung wird 1 Stunde bei 37⁰C und über Nacht bei 4°C inkubiert. Das unlösliche Material wird durch 30 Minuten Zentrifugieren bei 12 000 Umdrehungen pro Minute entfernt, und die klaren Lösungen werden zum Färben der Nierenschnitte benutzt Wenn die markierten Seren Nierenbiopsien von Patienten mit früher akuter Poststreptokokken-Glomerulonephritis färben, enthalten sie einen Antikörper gegen bestimmte Teile des Biopsie-Präparats. Wenn diese Seren jedoch die Nieren-Biopsien nicht mehr färben, nachdem die überstehende streptokokkale Flüssigkeit oder deren Fraktionen zugeführt wurden, hat eine Präabsorption des färbenden Antikörpers durch ein Antigen stattgefunden, das damit als immunologisch identisch mit dem Antigen auf der Nieren-Biopsie identifiziert ist.

Beispiel 2

Das erhaltene lyophilisierte Material, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird durch Säulenchromatographie weiter gereinigi. Eine 2,5 χ 100 cm Säule wird gefüllt mit Bio-Gel® A-5 (Hersteller Bio-Rad Laboratories, Rockville Center, New York, USA), das vorgequollen und in einer Lösung suspendiert ist, die 0,02% Natriumazid und 0,001 M tris Puffer (Trishydroxymethylaminomethan und HCl) und 0,001 M EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) enthält. Zum Packen der Säule und als Elutionsflüssigkeit wird 0,1 M tris Puffer, pH 7.2 verwendet. 300 mg der mit Ammoniumsulfat gefällten RCS-Substanz werden auf die Säule gegeben. Die Durchflußgeschwindigkeiten sollten in der Größenordnung von 20 bis 24 ml/Std. liegen. Fraktionen von 4,0 ml werden mit Hilfe eines automatischen Fraktionssammlers aufgefangen. Die Fraktionen werden auf Protein analysiert. Eine Fraktion oder vereinigte gereinigte lyophilisierte bakterielle Fraktionen werden gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das gereinigte lyophilisierte Material wird dann in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise auf Antigen-Aktivität getestet.

Beispiel 3

Das gemäß Beispiel erhaltene lyophilisierte Material wird der analytischen Elektrophorese an Polyacrylamidgel (75% Gel) nach der Vorschrift von Davis unterworfen (Davis, B. ]. Ann. N. Y. Acad. Sei. 121: 404-427, 1964). Es werden Proben von 300 μίτι eingesetzt. Proteinbanden werden nachgewiesen, indem man die Gele mit einer 0,l%igen Lösung von Amido Schwarz in 7%iger Essigsäure 1 Stunde färbt und anschließend in 7%iger Essigsäure entfärbt. Für Elutionsuntersuchungen werden zahlreiche Polyacrylamidsäulen gleichzeitig unter identischen Bedingungen hergestellt, und eine von ihnen mit Amido Schwarz gefärbt. Die entsprechenden Banden werden ausgeschnitten, vereinigt, zerkleinert, 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt und durch Filterpapier Whatman Nr. 1 gefiltert. Das Filtrat wird gegen mehrfach gewechseltes destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Dieses Material wird für die Präabsorption, wie in Beispiel 1 beschrieben, benutzt. Man isoliert so eine stärker gereinigte Antigen-Substanz.

Beispiel 4
(nachgereichte Anwendung)

Eine Streptokokken-Kultur eines Gruppe A Streptokkokus (Patient Schwalb) wurde 18 Stunden bei 37°C in Todd-Hewitt-Medium inkubiert. Dann wurden die Zeilen durch Druckbehandlung mit 2470 kp/cm² aufgebrochen, die Nukleinsäuren durch Fällung mit Streplomycinsulfat abgetrennt und anschließend das gewünschte wasserlösliche Protein (Antigen) mittels 60%ig gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt und das ausgefällte Antigen durch Gefriertrocknen als weißes Pulver gewonnen. Dieses Antigen wurde benutzt zum Immunisieren von neun Kaninchen, in denen das Antigen Antikörper bildete. Diese Kaninchensera wurden dann als Kontrollsera in Bestimmungen von AGN-Antikörpem in Seren von Patienten verwendet.

Die Immunisierung der Kaninchen wurde jeweils in gleicher Weise wie beim folgenden Beispiel und mit den gleichen Ergebnissen vorgenommen: Versuchstier K 26: Kaninchen, weiß, weiblich. Gewicht 2,1 kg. Immunisierungsverlauf:

I ,i-j

KCS Ann

kol'IKT I III¹

RCS-Antikörper/Titcr

Subkutane Injektion in 2 Fußsohlen
und unter die Haut .mi ! iais von
2 mg des oben angegebenen Antigen-Pulvers in 1 ml komplettem
Freund Adjuvant

10	■\n/ah!	1 :4
12		1 :8
	7	Kein
		Titer
Normale Kleinkinder	12	3
(unter 4 Monaten)
Normale Kleinkinder	122	9
(über 4 Monate)	166
Normale Kinder	51	34
Normale Erwachsene	42	35
Si rcptokokken-Infektionen	28	3
Aku'ic Glomerulonephritis		3
Chronische Glomerulone-	52	4
phritis	33
Nephrosis	19	31
davon Kinder	19
davon Erwachsene	12

Subkutane lniekiioii von 4,0 mg des pulverlomiigen Antigens in 1 ml komplettem Freund Adjuvant, wie am Tag 5

Subkutane Injektion von 8 mg Anligen-Pulver in 1 ml komplettem Freund Adjuvant, wie am Ta μ 5

1 : J2

1:12«

I :25b

Der RCS-Antikörper-Titer wird bestimmt nach der Mikro-Koniplemen'.-Fixations-Methode von Taka/i, indem ein hämolytisches System (z. B. Schaferythrocten und Antischafhämolysin), das ein Komplement benötigt, mit dem Antigen und dem zu untersuchenden Serum versetzt wird, welches Komplement bindet, wenn es Antikörper enthält.

Beispiel 5 (nachgereichte Anwendung)

Das gemäß Beispiel 2 oder Beispiel 3 erhaltene erfindungsgemäße gereinigte lyophilisierte Material (Antigen) wurde für diagnostische Zwecke benutzt, um die Anwesenheit und Menge von Antikörper zu diesem spezifischen Antigen zu bestimmen, woraus Schlüsse auf eine vorliegende oder frühere AGN gezogen werden können.

Zu diesem Zweck wurde eine Mikrokomplement-Fixationsmethode mit einem Schafzellen-Antischafzellcn-Hämolysesystem als Indikator und Mengen von jeweils 25 μ! des Patientenserums und dem Antigen als Testsystem verwendet.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben:

Titcr
/wischen
1 :2- 1 : Ib

Tiler über 1:1b

67
122
29
15
13

17

10

42
25

54
73
56
35
46

32
30
37

21 9 19 24 11

4 4 0

Wie ersichtlich steigt die Zahl der normalen Patienten mit höherem Titer mit dem Alter, was mit der über einen längeren Zeitraum größeren Wahrscheinlichkeit einer Streptokokken-Infektion zusammenhängt- Bei akuten Streptokokken-Infektionen finden sich die höchsten Titer-Werte, welche nach dem Abklingen der Krankheit wieder

zurückgehen, jedoch keinesfalls auf Null.

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserlösliches Protein aus beta-hämolysierenden Streptokokken rfer Gruppe A, das immunolo- ". gisch mit Antikörpern im Serum eines sich von akuter Glomerulonephritis erholenden Patienten und mit Antikörpern von Menschen, die zuvor Streptokokken der Gruppe A ausgesetzt waren, reagiert, erhalten durch die folgenden Verfahrens- ι» schritte: