DE69531958T2

DE69531958T2 - (1-3)-beta-d-glukon-bindungsprotein, antikörper der dieses protein erkennt undverwendung des proteins und antikörper

Info

Publication number: DE69531958T2
Application number: DE69531958T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tamura; Shigenori Tanaka
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2015-09-01
Also published as: EP0805161A1; US6156519A; CN1120847C; EP0805161A4; EP0805161B1; CN1185161A; JP3793573B2; DE69531958D1; WO1996006858A1

Description

Titel der Erfindung
Ein (1→3)-β-D-Glucan-Bindeprotein, ein Antikörper, der es erkennt, und seine Verwendung.
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein (1→3)-β-D-Glucan-Bindeprotein, das von Pfeilschwanzkrebs-Amöbozyten gewonnen wird, sowie einen Antikörper davon.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein (1→3)-β-D-Glucan-Prüfungsagens, das aus dem genannten Protein besteht, einen Kit, der aus dem genannten Protein und dem genannten Prüfungsagens besteht, einen Kit, der aus dem genannten Protein und dem genannten Antikörper besteht, und ein Verfahren zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan unter Verwendung des genannten Proteins.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Agens zur Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan, das aus dem Protein und einem Träger besteht, der an das Protein gebunden ist, sowie ein Verfahren zur Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan unter Verwendung des Entfernungsagens.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Aktivierung von Faktor G, der in Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat vorliegen kann, unter Verwendung des Proteins.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Prüfen von Endotoxin unter Verwendung des Proteins.
Hintergrund der Erfindung
1964 wurde die Koagulation oder Gelbildung von Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat (nachfolgend evtl. mit LAL abgekürzt) mit einer sehr geringen Menge eines intrazellulären Toxins aus gramnegativen Bakterien (kann nachfolgend evtl. mit Endotoxin (Et) oder Lipopolysaccharid (LPS) abgekürzt) entdeckt und man fand multiple Faktoren, Serinprotease-Vorläufer, einschließlich eines Et-(LPS)-empfindlichen Faktors (Faktor C), die an der Gelbildung beteiligt waren. Diese Reaktion umfasst einen Kaskadenmechanismus, der dem Koagulationssystem von Säugetierblut ähnelt; über ähnliche Mechanismen wurde auch in Verbindung mit anderen Invertebraten berichtet.
Während LAL bekanntlich mit einer sehr kleinen Menge von (1→3)-β-D-Glucan (nachfolgend evtl. mit β-Glucan abgekürzt) reagiert, um eine Gelbildung zusätzlich zu Et herbeizuführen, und man fand einen empfindlichen Faktor G, der β-Glucan erkennt. Es wurde die Einleitung einer Gelbildung sowie Et über einen völlig anderen Koagulationskaskadenweg (Faktor-G-System) als einen Faktor-C-Weg (Faktor-C-System) erläutert. Ferner ist β-Glucan ein konstruktives Pilzzellwand-Polysaccharid, wobei angenommen wird, dass dieser Weg mit dem Verteidigungssystem des lebenden Körpers sowie mit dem Faktor-C-System eng verwandt ist.
Bisher wurde über ein β-Glucan-Bindeprotein wie den Blutgerinnungsfaktor G vom Pfeilschwanzkrebs (FEBS Lett., 129, 318–321 (1981)), ein β-Glucan-Erkennungsprotein von der Seidenraupe (Prophenoloxidase) (J. Biol. Chem., 263, 12056-12062 (1988)), einen β-Glucan-Rezeptor von humanen Monozyten (J. Exp. Med., 173, 1511–1520 (1991)), einen Adjuvansrezeptor, der mit lokalisierter Opsoninbildung einhergeht (J. Immunol., 124, 3307–3315 (1985)), einen β-Glucan-Elicitor gegen Pflanzenzellen (J. Cell Biol., 78, 627 (1978)), ein von Streptococcus sobrinus abgeleitetes Glucan-Bindeprotein (Infect. Immun., 60 (12) 5291–5293 (1992)) und ein von der großen Wachsmotte (Galleria mellonella L.) abgeleitetes β-Glucan-spezifisches Lektin (Matha V., 64, 35- 42 (1990)) berichtet.
Offenbarung der vorliegenden Erfindung
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben den Gelbildungsfaktor in LAL untersucht und ein Protein gefunden, das sich an β-Glucan bindet, um die Aktivierung von Faktor G zu hemmen, und das Protein isoliert. Ferner haben die Autoren der vorliegenden Erfindung einen Antikörper gefunden, der das Protein selektiv erkennt.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung untersuchten daher die charakteristischen Merkmale dieser Proteine und des Antikörpers und stießen auf ihre Einsatzmöglichkeiten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neuartiges Protein, das sich an ein solches β-Glucan bindet, und seinen Antikörper bereitzustellen und sie für die Prüfung von β-Glucan und Endotoxin, Entfernung von β-Glucan und ferner für die Behandlung von Pilzinfektionen zu verwenden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein β-Glucan-Bindeprotein, das von Pfeilschwanzkrebs-Amöbozyten gewonnen wird, mit Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gereinigt wird, um eine einzige Bande zu erhalten, und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat und das sich an (1→3)-β-D-Glucan bindet, um einem Komplex zu bilden

(1) relative Molekülmasse: etwa 580 k Dalton (Gelfiltrationsverfahren unter nichtreduzierenden Bedingungen); und etwa 170 k Dalton (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen)
(2) Isoelektrischer Punkt: etwa 9,2
(3) UV-Absorptionsspektrum: Maximum bei 280 nm
(4) Solubilität: leicht in Wasser löslich
(5) Farbe: weiß

Die N-terminale Aminosäuresequenz lautet wie folgt:
Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro-Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Gly- Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp-Phe-Asn
(wobei Xaa eine der natürlich vorkommenden Aminosäuren repräsentiert).
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner den folgenden Antikörper, das folgende Glucan-Prüfungsagens und den folgenden Prüfungskit mit dem Antikörper, sowie ein Verfahren zur Prüfung von Glucan.

(1) Ein Antikörper, der das zuvor erwähnte Protein selektiv erkennt.
(2) Ein (1→3)-β-D-Glucan-Prüfungsagens bestehend aus dem zuvor erwähnten, optional markierten Protein.
(3) Ein (1→3)-β-D-Glucan-Prüfungskit bestehend aus dem zuvor erwähnten Protein und dem zuvor erwähnten, optional markierten Antikörper.
(4) Ein (1→3)-β-D-Glucan-Prüfungskit bestehend aus dem zuvor erwähnten Protein und dem genannten Prüfungsagens.
(5) Ein Verfahren zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan, umfassend das Reagieren des zuvor erwähnten Proteins mit (1→ 3)-β-D-Glucan in einer Probe, gefolgt von einem Nachweis des genannten Komplexes.
(6) Das oben (5) beschriebene Prüfungsverfahren, bei dem der Nachweis des zuvor erwähnten Komplexes mit dem zuvor erwähnten Antikörper oder mit einem markierten oder markierbaren Antikörper durchgeführt wird.
(7) Verfahren zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan, umfassend das Bilden eines Sandwich-Komplexes, wobei (1→3)-β-D-Glucan in einer Probe zwischen dem Protein (oder Varianten davon), immobilisiert oder immobilisierbar auf einer festen Phase, und dem Protein (oder Varianten davon) gehalten wird, das mit einer Markierungssubstanz markiert ist, Immobilisieren des genannten Komplexes auf der festen Phase, in dem Fall, dass das Protein (oder Varianten davon) auf der festen Phase immobilisiert werden kann, Trennen der festen Phase von einer flüssigen Phase und Nachweisen der markierten Substanz in einer der beiden Phasen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von (1→3)-β-D-Glucan als Agens zur Entfernung von Glucan und ein Verfahren zur Entfernung einer Probe, die ein solches Glucan enthält.

(8) Verwendung des Agens zur Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan, wobei das Protein auf einem Träger immobilisiert ist.
(9) Verfahren zur Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan, umfassend das Reagieren des zuvor erwähnten Proteins, das optional auf einem Träger immobilisiert ist, mit (1→3)-β-D-Glucan in einer Probe zur Bildung eines Komplexes, und Entfernen des genannten Komplexes aus der Probe.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der Aktivierung von Faktor G.

(10) Ein Verfahren zur Hemmung der Aktivierung von Faktor G, umfassend das Vermischen des Proteins mit Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat oder Vermischen einer Probe mit dem genannten Protein und anschließend Vermischen der genannten Probe mit Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat, um die Aktivierung von Faktor G zu hemmen, der in dem genannten Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat möglicherweise vorhanden ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prüfung von Endotoxin.

(11) Ein Verfahren zur Prüfung von Endotoxin, das in einer Probe enthalten ist, die (1→3)-β-D-Glucan enthält, durch Limulus-Reaktion unter Verwendung von Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat, umfassend das Vermischen der Probe mit dem Protein oder Vermischen des genannten Lysats mit dem genannten Protein vor der Limulus-Reaktion.

Diese erfindungsgemäßen ββ-Glucan-Bindeproteine (nachfolgend evtl. auch GBP genannt) können von Amöbozyten vom Pfeilschwanzkrebs wie Tachypleus tridentatus, Tachypleus gigas, Limulus polyphemus und Carcinos-corpius rotundicauda mit dem konventionellen Niederspannungsextraktionsverfahren extrahiert werden (z. B. J. Biochem., 80, 1101–1021 (1976)).
Praktischerweise werden Pfeilschwanzkrebs-Amöbozyten mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, vermischt, auf 0–4°C gekühlt, bei 0–4°C gerührt und extrahiert. Der Extrakt wird unter Kühlung zentrifugiert, um einen Überstand, Lysat, zu erhalten. Der resultierende Überstand, Lysat, enthält verschiedene Gerinnungsfaktoren, einschließlich Progerinnungsenzym, Koagulogen, Faktoren G, Faktor B, Faktor C, GBP und Anti-LPS-Faktor. Das Lysat wird auf eine Dextran-Sulfat-Sepharose-CL-6B-Affinitätssäule (Dextran-Sulfat, Sepharose CL-6B (Pharmacia)), äquilibriert mit 0,02–0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0–8,5, der 0–0,2 M NaCl enthält, mit einem bekannten Verfahren geladen (Anal. Biochem., 60, 149-152 (1974)) und mit dem genannten Puffer, der 0,2–0,5 M NaCl enthält, eluiert. Die Fraktionen, die GBP-Aktivität aufweisen, werden von dem Eluat aufgefangen, um eine Fraktion zu erhalten, die Faktor B, Faktor C und GBP enthält. Die Fraktionen werden lyophilisiert und durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt.
Die Gelfiltrationschromatographie wird mit einer Sephacryl S-300 HR (Hochauflösung) Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 0,02–0,08 M Tris-HCl-Puffer, pH 6,5–8,5, der 0,4–1 M NaCl enthält, oder mit einer Cellulofine GCL-2000m Säule (Seikagaku Corporation) durchgeführt. Die Elution findet mit einem Puffer statt, der zur Äquilibrierung verwendet wird, und ein ähnliches chromatographisches Verfahren wird vorzugsweise wenigstens zweimal wiederholt. Das Eluat aus der Gelfiltrationschromatographie wird fraktioniert und die GBP-Aktivität jeder Fraktion wird bestimmt, um die aktiven Fraktionen aufzufangen. Die Faktoren B und C und GBP werden durch die erste Chromatographie fast vollständig getrennt und gereinigtes GBP wird durch Rechromatographie mit ähnlichen Säulenbedingungen erhalten. Die resultierenden Fraktionen werden aufgefangen und lyophilisiert, um erfindungsgemäßes GBP zu erhalten. Das gereinigte GBP, das ein weißes Pulver und in Wasser leicht löslich ist, weist eine einzige Bande im Rahmen der Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf und hat die zuvor erwähnten physikochemischen Eigenschaften.
Das erfindungsgemäße GBP hat eine von den Autoren der Erfindung gefundene N-terminale Aminosäuresequenz und kann durch bekannte Verfahren der Gentechnik hergestellt werden, wie zum Beispiel die Herstellung von DNA-Primer von der genannten Sequenz, die Herstellung von DNA, die GBP kodiert, von einer cDNA-Bibliothek, die von Pfeilschwanzkrebs-Amöbozyten erhalten wird, und die Integration der DNA in einen Vektor, um eine Rekombinante zu erhalten, woraufhin die Expression mit bekannten Verfahren folgt.
Die GBP-Aktivität kann in der vorliegenden Erfindung durch Zugabe von 0,05 ml einer 50 pg/ml 0,01 M wässrigen NaOH-Lösung von Pachyman, die von Poria cocos mit dem Verfahren von Saito et al. präpariert wird (Agri. Biol. Chem., 32, 1261–1269 (1968)), zu jeder 0,05 ml Fraktion der oben erwähnten Chromatographie, eine 10-minütige Inkubation bei 37°C, Zugabe von 0,04 ml Faktor G, der von Amöbozytenlysat von Tachypleus tridentatus mit dem Verfahren von Obayashi et al. (Clin. Chim. Acta, 149, 55–65 (1985)) präpariert wird, 0,02 ml Progerinnungsenzym, jeweils 0,01 ml 1 M MgSO₄ und 2 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, und 0,02 ml 5 mM t-Butoxycarbonyl-L-leucyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanilid (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA) als Gerinnungsenzymsubstrat zu dem resultierenden Gemisch und eine 20-minütige Reaktion bei 37°C bestimmt werden. Das freigesetzte p-Nitroanilin wird durch Diazokupplung entwickelt und durch Absorbanz bei 545 nm bestimmt. Die Hemmungsaktivität wird anhand der relativen Aktivität bestimmt, die unter Verwendung von Wasser anstelle der Probe erhalten wird, um Faktor-G-Aktivität auf 100 (Kontrolle) einzustellen. Die Hemmung der Aktivierung von Faktor G ist der Bindung von GBP und β-Glucan zuzuschreiben (siehe an späterer Stelle beschriebene Beispiele). Folglich wird die Hemmungsaktivität von Faktor G als GBP-Aktivität genommen.
Ferner kann die Reinheit des erfindungsgemäßen GBP durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) bei pH 7,0–8,0 und 5-7,5% Gel oder bei pH 4–5 und 5-7,5% Gel oder durch SDS-PAGE (bei pH 7,0–8,0, 6–7,5% Gel und 0,1–0,2% SDS) oder durch Isoelektrische-Punkt-Elektrophorese (IEF) geprüft werden.
Die relative Molekülmasse von GBP kann durch SDS-PAGE, Gelfiltration mit Sephacryl 5–300 HR oder Cellulofine GCL-2000m, Präzipitationsgleichgewicht durch optisches Interferenzsystem, Sedimentationsprüfung mit Ultrazentrifugation, Viskosität, Lichtstreuung, Bestimmung des osmotischen Drucks mit Kollodiumfilm, Aminosäureanalyse oder Laserionenmassenspektrometrie bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße GBP ist jedoch eine Substanz mit Affinität zu β-Glucan mit einer spezifischen Struktur und hat eine höhere relative Molekülmasse als konventionelle Proteine, so dass es schwierig ist, exakte Werte in der physikalischen Analyse wie der Gelfiltration unter Verwendung eines unlöslichen Trägers mit Glucosidbindung oder Massenspektrometrie zu erhalten. Aus diesem Grund ist die Auswahl von Trägern und Bedingungen ohne diese Interferenzen erforderlich.
Das UV-Absorptionsspektrum des erfindungsgemäßen GBP ist in 7 dargestellt und zeigt eine maximale Absorption bei 280 nm.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von GBP der vorliegenden Erfindung ist in der Sequenztabelle bei Sequenz Nr. 1 dargestellt.
Das erfindungsgemäße GBP bindet sich an β-Glucan mit (1 →3)-β-D-Polyglucosid-Struktur und neutralisiert biochemische und immunopharmakologische Eigenschaften von β-Glucan, einschließlich der Fähigkeit zur Aktivierung von Pfeilschwanzkrebs-Faktor-G. Ferner neutralisiert das erfindungsgemäße GBP verzweigtkettiges (1→3)-β-D-Glucan mit intramolekularer Seitenkette wie (1→6)-β-D- oder (1→4)-β-D-, sowie geradkettiges ((1→3)-β-D-Glucan.
(Antikörper)
Ein Antikörper, der erfindungsgemäßes GBP selektiv erkennt (kann nachfolgend als Anti-GBP-Antikörper bezeichnet sein), kann mit gereinigtem GBP als Antigen erhalten werden und schließt Antiserum, polyklonalen Antikörper und monoklonalen Antikörper gegen das Antigen ein.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete polyklonale Antikörper kann durch Verabreichen des genannten Antigens an zu immunisierende Tiere wie Kaninchen und Ziegen und weiteres Reinigen des resultierenden Antiserums hergestellt werden. Die Verabreichung des genannten Antigens an zu immunisierende Tiere zusammen mit einem Adjuvans geschieht vorzugsweise zur Stimulierung von antikörperproduzierenden Zellen.
Die Herstellung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörpers kann durch intraperitoneale Verabreichung des genannten Antigens an Mäuse oder Ratten, Milzextraktion, Zellfusion von Zellen, die von der Milz gewonnen werden, und Myelomzellen, die ein Tumorzellstamm sind, um ein Hybridom zu bilden, erfolgen. Das erzeugte Hybridom wird kontinuierlich in vitro proliferiert und gescreent, um einen Zellstamm zu erhalten, der kontinuierlich einen spezifischen Antikörper gegen das zuvor erwähnte Antigen produziert. Der selektierte Zellstamm wird in vitro kultiviert oder in der Abdominalhöhle einer Maus in vivo kultiviert, um eine große Menge an monoklonalem Antikörper zu erhalten. Lymphknotenzellen und Lymphozyten in peripherem Blut, mit Ausnahme von Milzzellen, können für die Zellfusion verwendet werden. Myelomzellen werden vorzugsweise von einem homologen Zellstamm anstelle von xenogenen Zellen bezogen, um ein stabiles antikörperproduzierendes Hybridom zu erhalten.
Die Reinigung der resultierenden polyklonalen und monoklonalen Antikörper erfolgt durch Aussalzung mit neutralen Salzen wie Natriumsulfat und Ammoniumsulfat, Präzipitation mit gekühltem Alkohol, selektive Präzipitation mit Polyethylenglykol oder Isoelektrische-Punkt-Elektrophorese, dem Deabsorptionsverfahren mit einem Ionenaustauscher wie einem DEAE-Träger und CM-Träger, Protein-A- und Hydroxyapatit-Adsorptions-, Gelfiltrations- und Ultrazentrifugationsverfahren.
(Prüfverfahren)
Das erfindungsgemäße GBP bindet sich an β-Glucan mit (1 →3)-β-D-Polyglucosid-Struktur (nachfolgend evtl. (1→3)-β-D-Glucan genannt) und kann zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan durch Reagieren des genannten GBP mit (1→3)-β-D-Glucan in einer Probe, um einen Komplex zu bilden, und Nachweisen des genannten Komplexes verwendet werden.
Die Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise wie folgt erläutert werden:
Es wird ein Sandwich-Komplex bestehend aus (1→3)-β-D-Glucan, das in einer Probe zwischen GBP, immobilisiert oder immobilisierbar auf einer festen Phase, und einem markierten GBP gehalten wird, gebildet. Kann das Protein auf einer festen Phase immobilisiert werden, dann wird der genannte Komplex auf einer festen Phase immobilisiert, um die feste Phase von der flüssigen Phase zu trennen. Anschließend wird eine markierte Substanz in beiden Phasen gemäß den Eigenschaften der genannten markierten Substanz bestimmt, um (1→3)-β-D-Glucan zu prüfen.
Die Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan kann zum Beispiel wie folgt ablaufen: Zugabe einer Probe, die (1→3)-β-D-Glucan enthält, zu auf einer festen Phase immobilisiertem GBP, um das genannte GBP an (1→3)-β-D-Glucan zu binden, und gleichzeitige oder nachfolgende Zugabe von GBP, das zuvor mit einem Markierungsagens markiert wurde, um einen Sandwich-Komplex zu bilden, der aus dem genannten (1→3)-β-D-Glucan besteht, das zwischen dem genannten GBP und markiertem GBP gehalten wird, oder Vermischen des genannten markierten GBP mit einer Probe, die (1→3)-β-D-Glucan enthält, um eine gebundene Substanz aus dem genannten markierten GBP und (1→ 3)-β-D-Glucan zu erhalten, Zugeben der gebundenen Substanz zu GBP, das auf einer festen Phase immobilisiert ist, um den genannten Sandwich-Komplex zu bilden. Die mit dem genannten Komplex immobilisierte feste Phase und die flüssige Phase werden getrennt, und die markierte Substanz in den jeweiligen Phasen, zum Beispiel die markierte Substanz des auf einer festen Phase immobilisierten genannten Komplexes, wird nachgewiesen und mit einem für die genannte markierte Substanz geeigneten Verfahren geprüft.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete markierte GBP kann durch direkte Markierung mit einer Markierungssubstanz wie Enzyme (Peroxidase, Alkalinphosphatase, β-Galactosidase usw.), radioaktive Isotope (¹²⁵I, ¹³¹I und ³H), eine fluoreszierende Substanz (Fluorescein-Isothiocyanat und Umbelliferon usw.), eine chemilumineszierende Substanz (Luminol usw.) oder andere Substanzen (Biotin, Avidin, vorzugsweise Streptavidin usw.) mit einem bekannten Verfahren hergestellt werden.
Zur Markierung von GBP wird ein bekanntes Verfahren ausgewählt, das für die Markierungssubstanz geeignet ist, wie zum Beispiel das Glutaraldehydverfahren, Periodsäuren-Vernetzungsverfahren, Maleimid-Vernetzungsverfahren und Carbodiimidverfahren für die Enzymmarkierung, das Chloramin-T-Verfahren und Lactoperoxidaseverfahren für die Markierung radioaktiver Isotope (siehe Continued Biochemistry Experimental Studies, 5 Immuno-bio-chemical studies, Tokyo Kagaku Dozin, 1986, Europäische Patentspezifikation Nr. 0163041).
Das erfindungsgemäße GBP wird auf einer festen Phase wie einem festen unlöslichen Träger, z. B. Mikroplatte, Kügelchen, Röhrchen, Membranen, Gitter, Teströhrchen, Filterpapierbögen, Agarose, Polyacrylamide, Cellulose und Dextran, durch die Anwendung konventioneller physikalischer Adsorptions-, kovalenter Bindungs- oder Einschlussverfahren immobilisiert, die als Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms bekannt sind (Immobilized Enzymes, 1975, Kodansha Pub. Co., Ltd., S. 9–75). Es wird vor allem das einfache physikalische Adsorptionsverfahren bevorzugt. Der Ort ohne Bindung an GBP wird vorzugsweise mit Serumalbumin, Gelatine und Milchprotein blockiert.
Die erfindungsgemäße Prüfung wird ausführlich erläutert. GBP wird auf einer festen Phase durch verschiedene Verfahren immobilisiert. GBP wird zum Beispiel in einem Phosphat- oder Carbonatpuffer (pH 9–10) aufgelöst, zu einer festen Phase gegeben und 6–14 Stunden lang auf 4°C gehalten, um GBP zu immobilisieren. Nach dem Immobilisieren wird im Voraus eine Blockiermasse zugegeben, um Orte abzudecken, an denen GBP nicht immobilisiert ist. Die Blockiermasse beinhaltet Serumalbumin, Serum oder Milchprotein, das von Rindern isoliert wird.
Anschließend wird eine Probe, die (1→3)-β-D-Glucan enthält, zur zuvor erwähnten festen Phase mit immobilisiertem GBP gegeben, um (1→3)-β-D-Glucan an das genannte GBP zu binden. Proben, die (1→3)-β-D-Glucan enthalten, wie Blut oder Körperflüssigkeit von Menschen, Rindern, Ratten und Mäusen, und andere Proben, die später beschrieben werden, werden im unveränderten Zustand verwendet. Nach dem Binden von (1→3)-β-D-Glucan wird die feste Phase vorzugsweise mit einem Phosphatpuffer gewaschen, der Tween-Tenside und dergleichen enthält.
Ein markiertes GBP wird zur resultierenden festen Phase gegeben, die an (1→3)-β-D-Glucan gebunden ist, um die markierten Produkte zu erhalten. Durch diese Vorgehensweise wird ein Sandwich-Komplex erhalten, bei dem (1→3)-β-D-Glucan zwischen dem genannten GBP und dem genannten markierten GBP gehalten wird.
Anschließend wird die markierte Substanz in dem genannten Sandwich-Komplex quantitativ geprüft, um die Menge an (1→3)-β-D-Glucan zu ermitteln. Prüfverfahren für markierte Substanzen variieren mit den charakteristischen Merkmalen der markierten Substanz. Wird zum Beispiel Biotin als Markierungssubstanz verwendet, dann wird ein an Avidin oder Streptoavidin gebundenes Enzym zu einer festen Phase oder einen unlöslichen Träger mit Sandwich-Komplex gegeben, um das Enzym an den Komplex mit Hilfe von Avidin zu binden. Die Veränderungen des Substrats infolge der Enzymreaktion des genannten Enzyms können geprüft werden.
Eine Eichkurve, die die Beziehung zwischen Konzentrationen von (1→3)-β-D-Glucan und markierter Substanz darstellt, wird für die quantitative Prüfung von (1 →3)-β-D-Glucan in einer unbekannten Probe erstellt, wobei die Prüfungsergebnisse für die unbekannte Probe und die genannte Eichkurve verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren beinhaltet die Zugabe von markiertem GBP zu immobilisiertem (1→3)-β-D-Glucan (z. B. (1→3)-β-D-Glucan in Zellen oder Gewebe oder (1 →3)-β-D-Glucan, das physikalisch oder chemisch an unlösliche Träger gebunden ist), um einen Komplex aus dem genannten (1→ 3)-β-D-Glucan und dem genannten GBP zu bilden, woraufhin ein Nachweis oder eine quantitative Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan mit der markierten Substanz in dem Komplex folgt.
Darüber hinaus kann das Prüfverfahren der vorliegenden Erfindung die Zugabe von GBP, das mit einer Markierungssubstanz markiert ist, zum immobilisierten (1→ 3)-β-D-Glucan (z. B. (1→3)-β-D-Glucan, das in Zellen oder Gewebe vorliegt, und (1→3)-β-D-Glucan, das physikalisch oder chemisch an einen unlöslichen Träger gebunden ist), um einen Komplex aus dem genannten GBP und (1→3)-β-D-Glucan zu bilden, und den Nachweis oder die Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan mit markierter Substanz in dem Komplex umfassen.
Ferner kann das Prüfverfahren der vorliegenden Erfindung die Zugabe von GBP zu dem immobilisierten (1→3)-β-D-Glucan zur Bildung eines Komplexes aus dem genannten GBP und (1→ 3)-β-D-Glucan, die Zugabe eines Antikörpers, der selektiv GBP erkennt, die Markierung des genannten Antikörpers mit einer Substanz, die spezifisch den genannten Antikörper erkennt, und den Nachweis oder die Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan mit der genannten Substanz umfassen. Die Bildung des genannten Komplexes, die Zugabe des genannten Antikörpers, der im Voraus mit einer Markierungssubstanz markiert wird, und der anschließende Nachweis und die Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan mit der genannten markierten Substanz können ebenfalls erläutert werden.
Substanzen, die spezifisch den genannten Antikörper erkennen, schließen zum Beispiel eine Verbindung ein, die durch Markieren des Anti-Immunglobulin-Antikörpers mit Markierungssubstanzen (z. B. Biotin, Avidin, Enzym, Isotop, fluoreszierendes Pigment, chemilumineszierende Substanzen) mit einem bekannten Verfahren erhalten wird.
Der Prüfungskit der vorliegenden Erfindung besteht aus GBP und markiertem GBP. Das GBP muss vor der Prüfung mit dem Kit auf einer festen Phase immobilisiert werden. Der Vorgang kann jedoch übergangen werden, indem das genannte GBP im Voraus auf einer festen Phase immobilisiert wird.
Der erfindungsgemäße Kit besteht aus GBP und einem Antikörper, der GBP selektiv erkennt, kann jedoch noch mit markiertem Anti-Immunglobulin-Antikörper ergänzt werden.
Der erfindungsgemäße Kit besteht aus GBP und markiertem Anti-GBP-Antikörper.
Der erfindungsgemäße Kit kann ferner mit der zuvor erwähnten festen Phase, einem Reagens, das die markierte Substanz erkennt, einem Puffer und einer Standardsubstanz ergänzt werden.
(Entfernung)
In einer Probe enthaltenes (1→3)-β-D-Glucan kann entfernt werden durch Reagieren von erfindungsgemäßem GBP mit (1→3)-β-D-Glucan zur Bildung eines Komplexes und Isolieren und Entfernen des genannten Komplexes. Die Isolierung und Entfernung des genannten Komplexes kann durch die Anwendung eines bekannten Proteinisolierungsverfahrens erfolgen. Vorzugsweise wird ein Verfahren zum Inkontaktbringen eines Trägers, der immobilisiertes GBP aufweist, bevorzugter eines unlöslichen Trägers mit (1→3)-β-D-Glucan in der Probe zur Bildung eines Komplexes aus dem genannten GBP und (1→3)-β-D-Glucan und Isolieren und Entfernen des Komplexes durchgeführt.
Die verwendeten Träger können verschiedene Formen haben und z. B. Folien (Filter, Hohlfasern, Röhrchen und Flachfolien), Partikel, Gitter, Späne, Pulver und Mikroplatten sein. Vorzugsweise wird ein (1→3)-β-D-Glucanfreier Träger verwendet.
Die Bindung des Trägers an GBP erfolgt durch eine physikalische Bindung von GBP an Träger wie Polystyrol, Polypropylen und dergleichen oder eine chemische Bindung von GBP an Träger wie Polyamide, Cellulose, Agarose, Polyacrylamide, Dextrane, Vinylpolymere (poröse Copolymere von Glycidylmethacrylat und Ethylenglycoldimethacrylat). Die chemische Bindung beinhaltet das Diazo-Verfahren der Diazokupplungsreaktion unter Verwendung einer aromatischen Aminogruppe in dem Träger, das CNBr-Verfahren der Peptidbindung durch eine aktivierte Hydroxylgruppe in dem Träger mit CNBr, das Säureazidverfahren der Peptidbindung unter Verwendung von Hydrazinderivaten des Trägers, Alkylierungsverfahren zur Alkylierung von Protein unter Verwendung einer reaktiven Funktionsgruppe wie Halogen in dem Träger, ein Verfahren zur Vernetzung des Trägers und einer freien Aminogruppe im Protein unter Verwendung eines Vernetzungsmittels wie Glutaraldehyd, das mit der freien Aminogruppe reagiert, das Carbodiimidverfahren, Epoxidaktivierungsverfahren und ferner die Auswahl eines geeigneten Verfahrens aus bekannten Bindungsverfahren mittels eines Spacers für die Bindung von GBP.
Der Kontakt zwischen dem an GBP gebundenen Träger und einer Probe, die (1→3)-β-D-Glucan enthält, wird mit einem bekannten Fest-Flüssig-Kontaktverfahren hergestellt. Zum Entfernen von (1→3)-β-D-Glucan von Proben kann zum Beispiel wie folgt vorgegangen werden: Leiten einer Probe durch einen Träger in der Form eines Filters; Leiten einer Probe durch eine Säule, die mit Partikelträger gefüllt ist; Platzieren einer Probe in ein Well eines Trägers in der Form einer Mikroplatte, Stehenlassen über einen vorbestimmten Zeitraum, anschließend Isolieren der Probe; und Zugeben einer Probe in eine beliebige Trägerform; Schütteln über einen vorbestimmten Zeitraum oder Stehenlassen, gefolgt von einem konventionellen Fest-Flüssig-Separations-Isolationsverfahren (Filtration, Zentrifugation, Ansaugung und Dekantierung).
Bei der Et-Prüfung durch Limulus-Reaktion mit Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat wird das genannte GBP zu LAL oder einer Probe gegeben, um einen Komplex mit β-Glucan zu bilden und die Aktivierung eines β-Glucan-empfindlichen Faktors (Faktor G) zu hemmen. Folglich kann eine spezifische Prüfung von Et in der β-Glucan-haltigen Probe aufgrund der Faktor-C-Systemreaktion in LAL ohne β-Glucan-Einfluss stattfinden.
Wie oben erläutert wurde, kann das erfindungsgemäße GBP für den Nachweis und das Prüfungsreagens von β-Glucan und Et verwendet werden. Ferner ist β-Glucan ein konstruktives Pilzzellwand-Polysaccharid und das GBP kann die Proliferation von Pilzen durch eine Bindung an das genannte Polysaccharid beeinflussen. Folglich geht man davon aus, dass aus dem erfindungsgemäßen GBP ein Medikament und insbesondere Antipilzmittel entwickelt wird.
Die Verfahren zur Prüfung und Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan der vorliegenden Erfindung können für den Nachweis und die Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan angewendet werden, das in Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin und zerebrovaskulärer Flüssigkeit, parenteraler Medizin, Infusionslösungen, Wasser für Injektionszwecke und biologischen pharmazeutischen Präparaten enthalten ist.
Die Endotoxinprüfung der vorliegenden Erfindung ist für ähnliche Proben wie oben dargestellt für den Nachweis von in Proben enthaltenem Endotoxin geeignet.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 zeigt ein Elutionsmuster von Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat unter Anwendung von Sulfat-Sepharose-CL-6B-Säulenchromatographie gemäß Beispiel 1.
2 zeigt ein Sephacryl 5–300 HR Chromatographiemuster einer Fraktion mit GBP-Aktivität aus 1.
3 zeigt ein Sephacryl S-300 HR Rechromatogrammmuster einer Fraktion mit GBP-Aktivität aus 2.
4 zeigt eine angenommene relative Molekülmasse von erfindungsgemäßem GBP durch ein Gelfiltrationsverfahren mit Sephacryl S-300 HR.
5 zeigt eine angenommene relative Molekülmasse von erfindungsgemäßem GBP durch SDS-PAGE.
Die Bahnen A und B zeigen jeweils einen Molekülmassenmarker und die relative Molekülmasse von GBP unter reduzierenden Bedingungen.
6 zeigt den isolelektrischen Punkt von erfindungsgemäßem GBP durch eine Isoelektrische-Punkt-Elektrophorese.
Die Bahnen A und B zeigen jeweils den isoelektrischen Punkt von GBP und den des Markers.
7 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum von erfindungsgemäßem GBP.
8 zeigt die Fähigkeit zur Hemmung der Faktor-G-Aktivierung und Dosierungen von erfindungsgemäßem GBP.
9 zeigt eine Eichkurve der (1→3)-β-D-Glucan-Konzentration und Absorbanz durch das erfindungsgemäße Prüfverfahren.
Beste Art der Durchführung der vorliegenden Erfindung
Die beste Art der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben.
In den vorliegenden Beispielen wurden alle Glasinstrumente, die in den Experimenten verwendet wurden, zwei Stunden lang bei 250°C hitzesterilisiert, um sie von β-Glucan zu befreien. Einige Reagenzien wurden mit Aktivkohle behandelt und 20–90 Minuten lang bei 121°C autoklaviert, um sie von β-Glucan zu befreien. Die folgenden Verfahren wurden unter β-Glucan-freien Bedingungen durchgeführt.
1. Beispiel
Reinigung und physikochemische Eigenschaften von GBP. (1) Reinigung von GBP
Bei 4°C wurden 2,5 l Hämolymphe vom japanischen Pfeilschwanzkrebs (Tachypleus tridentatus) 10 Minuten lang bei 1500 UPM zentrifugiert. Zu etwa 50 g einer präzipitierten Fraktion von Blutzellen, Amöbozyten, wurden 500 ml 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gegeben und mit einem Homogenisator (PolytronR^RT 10, Kinematica Corp.) homogenisiert und extrahiert. Das resultierende Gemisch wurde bei 4°C und 10.000 × G 30 Minuten lang zentrifugiert, um 450 ml eines Überstands, Lysat, zu erhalten.
Das gesamte Lysat wurde auf eine Dextran-Sulfat-Sepharose CL-6B Säule (5 × 23 cm) aufgebracht, die mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) äquilibriert wurde, mit 1,0 l des gleichen Puffers gewaschen, mit 1,5 l 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,2 M NaCl enthielt, eluiert, anschließend mit 1,5 l 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,45 M NaCl enthielt, um Fraktionen von jeweils 10 ml zu erhalten. Die Aktivität eluierter Fraktionen wurde mit dem Verfahren von Obayashi et al. (Clin. Chim. Acta, 149, 55–65 (1985)) bestimmt. Die Aktivität von Progerinnungsenzym und den Faktoren B, C und G wurde mit einer Absorbanz bei 405 nm bestimmt und die Aktivität von Koagulogens wurde mit einer Absorbanz bei 360 nm bestimmt. Die GBP-Aktivität wurde mit dem später beschriebenen Verfahren bestimmt (siehe Beispiel 2-(4), Experiment 3, Wasser wurde anstelle von GBP als Kontrolle genommen). Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. GBP wurde in mit 0,45 M NaCl eluierten Fraktionen gefunden und erbrachte eine starke Hemmung der Aktivierung von Faktor G mit β-Glucan. Die 310 ml dieser Fraktion wurden in einen "Eggplant"-Kolben aufgenommen und lyophilisiert.
Die lyophilisierte Fraktion wurde in 25 ml Wasser aufgelöst, und das gesamte Volumen wurde auf eine Sephacryl S-300 HR Säule (2,2 × 95 cm) aufgebracht, die mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,5 M NaCl und 4 mM CaCl₂ enthielt, äquilibriert wurde, und bei einer Fließgeschwindigkeit von 18 ml/h eluiert, um Fraktionen von jeweils 2,5 ml zu erhalten. Die GBP-Aktivität wurde wie oben dargestellt bestimmt. Die für eine 50%ige Hemmung der Faktor-G-Aktivierung erforderliche Menge wurde als 100 Einheiten definiert. Im Folgenden wird die Einheit der GBP-Aktivität als "Einheiten" oder "U" bezeichnet. Die Aktivität der Faktoren B und C wurde mit dem Verfahren von Obayashi et al. (Clin. Chim. Acta, 149, 55–65 (1985)) bestimmt, indem die Absorbanz bei 545 nm ermittelt wurde. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Wie in 2 zu sehen ist, wurde GBP-Aktivität in den Fraktionen Nr. 70–88 gefunden (47,5 ml).
Die Fraktionen wurden lyophilisiert, in 8 ml Wasser erneut aufgelöst und wieder auf eine Sephacryl S-300 HR Säule (1,4 × 95 cm) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde, und bei einer Fließgeschwindigkeit von 4,5 ml/h eluiert, um Fraktionen von jeweils 0,93 ml zu erhalten. Die GBP-Aktivität wurde für jede Fraktion ermittelt; die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Wie in 3 zu sehen ist, wurde GBP-Aktivität in den Fraktionen Nr. 81–84 gefunden.
Wie zuvor erläutert wurde, kann GBP fast vollständig getrennt werden durch eine Behandlung mit Dextran-Sulfat-Sepharose-Affinitätschromatographie (1) und eine anschließende Gelfiltration mit Sephacryl S-300 HR für eine Trennung von Faktor B und C (2) und Rechromatographie mit einem ähnlichen Träger, um ein hochreines GBP zu gewinnen. Die spezifischen Aktivitäten im Reinigungsprozess sind in Tabelle 1 dargestellt. In Rohextrakt, Lysat, lag eine große Menge von Faktor G vor und eine Prüfung der GBP-Aktivität konnte nicht stattfinden. Mit den kombinierten Chromatographieverfahren wurde Faktor G getrennt, und zum ersten Mal wurde die Anwesenheit von GBP und seine Aktivität festgestellt. Darüber hinaus wird das genannte GBP in ähnlicher Weise vom Lysat anderer Pfeilschwanzkrebse (zum Beispiel Limulus polyphemus, Tachypleus gigas und Carcinoscorpius rotundicauda) präpariert.
1. Tabelle
(2) Physikochemische Eigenschaften von GBP
(1) Bestimmung der relativen Molekülmasse
In der zuvor erwähnten Sephacryl S-300 HR Säulenchromatographie (1,4 × 95 cm) mit einem Bettvolumen (Vt) von 146,2 ml wurden die Elutionsorte (Ve) von GBPaktiven Fraktionen berechnet, und der scheinbare Verteilungskoeffizient ((V_e – V₀/V_t – V₀), ausgedrückt als K_av) von jedem Protein im High Molecular Weight Gel Filtration Kit (produziert von Pharmacia) wurde gegenüber Logarithmen der relativen Molekülmasse graphisch dargestellt, um eine Eichkurve zu erhalten, um die relative Molekülmasse von GBP zu schätzen. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt und weisen auf eine relative Molekülmasse von GBP in GBP-aktiven Fraktionen von etwa 580 k Dalton hin.
In ein Zentrifugalfiltrationsröhrchen mit einem Volumen von 0,3 ml und einem relativen Molekülmassenbereich von 5000 (Ultrafree C3LCC, Millipore) wurden 0,3 ml des gereinigten GBP gegeben, das in dem zuvor erwähnten Verfahren erhalten wurde (1,9 × 10³ Einheiten/ml, Proteinkonzentration von 245,2 μg/ml), und 50 Minuten lang unter Kühlung bei 4°C bei 4500 × g zentrifugiert, um 0,03 ml Konzentrat zu erhalten. Das Konzentrat wurde mit Wasser vermischt, um ein Volumen von 0,3 ml zu erhalten. Die resultierende Lösung wurde einer Zentrifugalfiltration unter ähnlichen Bedingungen unterzogen, um ein Konzentrat von 0,03 ml zu erhalten. Die resultierende Probe wurde durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen mit 2-Mercaptoethanol gemäß dem Verfahren von Laemmli (Nature, 227, 680–685 (1970)) analysiert, mit Coomassie-Brillantblau R-250 gefärbt, um eine relative Molekülmasse von etwa 170 k Dalton wie in 5 dargestellt zu erhalten.
Als Marker wurden 6 Proteine (Boehringer Mannheim GmbH) verwendet.
α₂-Makroglobulin (170 k), β-Galactosidase (116, 4 k), Fructose-6-phosphokinase (85,2 k), Glutaminsäuredehydrogenase (55,6 k), Aldolase (39,2 k) und Triosephosphoisomerase (26,6 k).
(2) Bestimmung des isoelektrischen Punktes
Eine isoelektrische Fokussierung wurde mit PhastSystem^TM (Pharmacia) mit einem konventionellen Verfahren (In Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing of Proteins 236–240 (1984)) unter Verwendung eines PhastGel IEF Gradienten von 3-9 (Pharmacia) durchgeführt. Das Gel wurde nach der Elektrophorese mit Coomassie-Brillantblau R-250 gefärbt. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Wie in 6 zu sehen ist, wies GBP eine einzige Bande auf, die auf einen isoelektrischen Punkt (pI) von etwa 9,2 hindeutete.
Als Marker wurden 10 Proteine (Pharmacia) verwendet. Trypsinogen (pI 9,30), Linsen-Lektin-Basenbande (pI 8,65), Linsen-Lektin-Mediumbande (pI 8,45), Linsen-Lektin-Säurebande (pI 8,15), Myoglobin-Basenbande (pI 7,35), Myoglobin-Säurebande (pI 6,85), Rinder-Kohlensäureanhydrase B (pI 5,85), β-Lactoglobulin (pI 5,20), Sojabohnentrypsin-Inhibitor (pI 4,55) und Amyloglucosidase (pI 3,50).
(3) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von GBP
Die Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz erfolgte gemäß dem Verfahren von Matsudaira (J. Biol. Chem., 262, 10035–10038 (1987)). In 7,5%iges Plattengel wurden 0,01 ml GBP (1,7 × 10⁴ Einheiten/ml) für eine Bahn aufgebracht und bei einem konstanten elektrischen Strom von 30 mA einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel herausgeschnitten, 5 Minuten lang mit Wasser gewaschen und 15 Minuten lang in einen Transferpuffer (0,01 M 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS)/10% Methanol) eingetaucht. Anschließend wurde das Protein mit einer Transblotting-Sandwichvorrichtung bei 4°C 18 Stunden lang unter einer konstanten Spannung von 20 V von dem Gel zu einer Polyvinylidendifluorid-(PVDF)-Membran (Bio-Rad Lab) übertragen. Die PVDF-Membran wurde 5 Minuten lang mit Wasser gewaschen und mit 0,1% Coomassie-Brillantblau R-250/50% Methanol 5 Minuten lang gefärbt. Die gefärbte Membran wurde 3 mal mit Wasser gewaschen, 1 Stunde lang in einem Reinraum getrocknet und bei –35°C gehalten. Die anvisierte Bande wurde mit einem sterilisierten Messer geschnitten und mit einem konventionellen Verfahren mit einem Gasphasen-Aminosäuresequenzierungsautomaten (Shimazu, PPSQ-10) analysiert.
Es wurde die folgende N-terminale Aminosäuresequenz erhalten.
Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro-Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp-Phe-Asn
(wobei Xaa eine der natürlich vorkommenden Aminosäuren repräsentiert).
(4) UV-Spektrum und Eigenschaften von GBP
Die Prüfung des UV-Absorptionsspektrums der Fraktion ergab ein charakteristisches Spektrum mit einer maximalen Absorption bei 280 nm, wie in 7 dargestellt ist. Die Fraktion wurde lyophilisiert, um ein leicht wasserlösliches weißes Pulver zu erhalten.
2. Beispiel
Untersuchung der Wirkung von GBP
(1) Hemmungsaktivität gegenüber Faktor G
Jeweils 0,05 ml gereinigtes GBP (10, 20, 40, 60, 80 μg/ml), das im 1. Beispiel gewonnen wurde, wurden mit dem zuvor erwähnten Verfahren untersucht, um die Hemmungsaktivität gegenüber Faktor G (GBP-Aktivität) zu erhalten. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Wie in 8 zu sehen ist, war die GHP-Aktivität eindeutig von der Dosis abhängig.
(2) Veränderung der GBP-Aktivität durch Wärmebehandlung
Im 1. Beispiel gewonnenes gereinigtes GBP wurde 3 Minuten lang bei 100°C behandelt und 15 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde mit Wasser 10fach verdünnt. Die Hemmungsaktivität gegenüber Faktor G wurde in Bezug auf eine Portion von 0,05 ml der verdünnten Lösung vor und nach der Behandlung mit dem zuvor erwähnten Verfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 enthalten.
Tabelle 2
Aus Tabelle 2 ist zu entnehmen, dass GBP ein wärmeunbeständiges Protein ist (instabil gegenüber Wärme).
(3) Bindungsspezifität von GBP
Gerad- oder verzweigtkettiges ((1→3)-β-D-Glucan wurde zu 0,05 ml GBP (1,6 × 10⁴ Einheiten/ml) gegeben und die GBP-Aktivität wurde mit dem zuvor erwähnten Verfahren bestimmt. Die Restaktivität wurde bestimmt, um das Hemmungsverhältnis zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 enthalten. Die Quellen von gerad- und verzweigtkettigen (1→3)-β-D-Glucanen werden nachfolgend angegeben.
Geradkettiges (1→3)-ß-D-Glucan:
Pachyman (hergestellt mit dem in Agric. Biol. Chem., 32, 1261–1269 (1968)) beschriebenen Verfahren)
Curdlan (abgeleitet von Alcaligenes faecalis var. myxogenes, Wako Pure Chemicals Ltd.)
Carboxymethyliertes Curdlan (CMPS) (hergestellt mit dem in Phytochemistry, 1, 175–188 (1962) beschriebenen Verfahren, Substitutionsgrad 0,63).
Paramylon (abgeleitet von Euglena gracillis, hergestellt mit dem in Biochim. Biophys. Acta, 44, 161–163 (1960) beschriebenen Verfahren).
Verzweigtkettiges (1→3)-β-D-Glucan:
(1→6), (1→3)-β-D-Glucan: Schizophyllan (Sonifilan; Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), Lentinan (Ajinomoto Co., Ltd.), Laminaran (abgeleitet von Laminaras digitata, Sigma Corp.), Laminaran (abgeleitet von Eisenia araborea, Nakarai Tesque).
(1→4), (1→3)-β-D-Glucan: Lichenan (abgeleitet von Cetraria islandica, Sigma Corp.), Gersten-β-D-Glucan (Sigma Corp.)
Laminaran, carboxymethyliertes Curdlan, Schizophyllan (2 × 10^–6 g/ml), Lentinan (2 × 10^–8 g/ml), Lichenan und Gersten-β-D-Glucan wurden in destilliertem Wasser gelöst, Pachyman und Curdlan wurden in 0,1 M wässriger NaOH-Lösung gelöst, Paramylon, Schizophyllan (1 × 10^–9 g/ml) und Lentinan (2 × 10^–10 g/ml) wurden jeweils in 0,3 M wässriger NaOH-Lösung gelöst und für den Gebrauch mit destilliertem Wasser oder 0,01 M wässriger NaOH-Lösung angemessen verdünnt.
Tabelle 3
DW und NaOH repräsentieren Lösungsmittel für die Probe. DW und NaOH repräsentieren jeweils destilliertes Wasser und wässrige Natriumhydroxidlösung.
Zu 0,025 ml GBP (1,6 × 10² Einheiten/ml) wurden 0,025 ml verschiedener Polysaccharidlösungen außer β-Glucan gegeben und 10 Minuten lang bei 37°C erwärmt, 0,025 ml 100 pg/ml Pachyman wurden zugegeben und 10 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen. Anschließend wurden 0,04 ml Faktor G, 0,02 ml Progerinnungsenzym (ProCE) und 0,02 ml 5 mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA und jeweils 0,01 ml 1 M MgSO₄ und 2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zugegeben, 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, und die Restaktivität wurde ermittelt, um das Hemmungsverhältnis zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Quellen der verwendeten Polysaccharide werden nachfolgend angegeben.
(1→4)-β-D-Glucan: Carboxymethylcellulosenatriumsalz (Nakarai Tesque)
(1→6)-β-D-Glucan: Gyrophoran, abgeleitet von Gyrophora esculenta, hergestellt gemäß J. Ferment. Technol., 50, 388-396 (1971).
(1→6)-α-D-Glucan: Dextran (abgeleitet von Leuconostoc sp., relative Molekülmasse bis zu 40.000; Seikagaku Corporation).
(1→4), (1→6)-α-D-Glucan: Pullulan (abgeleitet von Pullularia pullulans, Hayashibara Biochemical).
(1→2), (1→3), (1→6)-α-D-Mannan: Hefe-α-D-Mannan (Sigma Corp.)
(1→3)-β-D-Xylan: (Polyglycosid von Xylose, abgeleitet von Caulerpa brachypus, hergestellt gemäß Nature, 187, 82–83 (1960)).
Carboxymethylcellulose, Dextran und Pullulan wurden in destilliertem Wasser gelöst, Gyrophoran wurde in 0,1 M wässriger NaOH-Lösung gelöst und α-D-Mannan und β-D-Xylan wurden jeweils in 0,3 M wässriger NaOH-Lösung gelöst. Die resultierenden Lösungen wurden vor der Verwendung mit destilliertem Wasser angemessen verdünnt.
Tabelle 4
DW und NaOH repräsentieren Lösungsmittel für die Probe. DW und NaOH repräsentieren jeweils destilliertes Wasser und wässrige Natriumhydroxidlösung.
Wie in Tabelle 3 dargestellt ist, wurde neben geradekettigem (1→3)-β-D-Glucan eine Hemmungsaktivität von GBP gegenüber verzweigtkettigem (1→3)-β-D-Glucan wie (1 6), (1→3)-β-D- und (1→4), (1→3)-β-D-Glucan und carboxymethyliertem (1→3)-β-D-Glucan beobachtet.
Ferner wurde die Bindungsaktivität mit (1→3)-β-D-Glucan, d. h. die Hemmungsaktivität gegenüber Faktor G von Polysacchariden mit einer anderen Struktur als (1→3)-β-D-Glucan durch vorherige Zugabe von GBP und Erwärmung bestimmt, gefolgt von der Zugabe von (1→3)-β-D-Glucan, um die Hemmung der (1→3)-β-Glucan-Bindung zu bestimmen. Wie in Tabelle 4 deutlich zu sehen ist, wurde in Carboxymethylcellulose ((1 4)-β-D-), Gyrophoran ((1→6)-β-D-), Dextran ((1→6)-α-D-), Pullulan ((1→4), (1→6)-α-D-), Hefen-α-Mannan ((1→2), (1 3), ((1→6)-α-D-) oder Xylan (Polyglycosid von Xylose, (1 3)-β-D-) keine Unterdrückung der Hemmungsaktivität beobachtet.
(4) Ausführliche Untersuchung der Faktor-G-Hemmungsaktivität von GBP

1. Experiment: Ein Gemisch aus 0,04 ml Faktor G, 0,02 ml Progerinnungsenzym (ProCE), jeweils 0,01 ml 1 M MgSO₄ und 2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 0,05 ml 50 pg/ml Pachyman (nachfolgend evtl. BG genannt) wurde 20 Minuten lang bei 37°C erwärmt und mit 0,05 ml GBP (1,6 × 10⁴ Einheiten/ml) und 0,02 ml 5 mM Substrat vermischt (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA: nachfolgend evtl. Sub genannt). Das Gemisch wurde 3 Minuten lang bei 37°C zur Reaktion gebracht, und das freigesetzte p-Nitroanilin wurde durch Diazokupplung mit einem bekannten Verfahren (Tamura, H et al. Thromb. Res. 27, 51–57 (1982)) entwickelt und die Absorbanz wurde bei 545 nm bestimmt.
2. Experiment: Zu 0,04 ml Faktor G wurden 0,05 ml GBP gegeben, 10 Minuten lang bei 37°C erwärmt, und 0,05 ml 50 pg/ml BG, 0,02 ml ProCE, jeweils 0,01 ml von 1 M MgSO₄ und 2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 0,02 ml 5 mM Sub wurden zugegeben und 20 Minuten lang bei 37°C zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde durch Diazokupplung in einer ähnlichen Weise wie im 1. Experiment entwickelt und die Absorbanz wurde bei 545 nm bestimmt.
3. Experiment: Zu 0,05 ml BG wurden 0,05 ml GBP gegeben und 10 Minuten lang bei 37°C erwärmt; anschließend wurden 0,04 ml Faktor G, jeweils 0,02 ml ProCE und 5 mM Sub, 0,01 ml 1 M MgSO₄ und 2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zugegeben und 20 Minuten lang bei 37°C zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde durch Diazokupplung in ähnlicher Weise wie im 1. Experiment entwickelt und die Absorbanz wurde bei 545 nm bestimmt.
4. Experiment: In ein Gemisch aus 0,04 ml Faktor G, jeweils 0,02 ml ProCE und 5 mM Sub, 0,05 ml 50 pg/ml BG, jeweils 0,01 ml 1M MgSO₄ und 2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wurden 0,05 GBP gegeben und 20 Minuten lang bei 37°C zur Reaktion gebracht. Das freigesetzte p-Nitroanilin wurde durch Diazokupplung in ähnlicher Weise wie im 1. Experiment entwickelt und die Absorbanz wurde bei 545 nm bestimmt.

In den Experimenten (1) bis (4) wurde anstelle von GBP Wasser verwendet, um Kontrollgruppen zu erhalten, und es wurde das Hemmungsverhältnis der Faktor-G-Aktivität () bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5
FG: Faktor G, BG: Pachyman ((1→3)-ββ-D-Glucan), ProCE: Proclotting-Enzym, GBP: eluierte Fraktion von Dextran-Sulfat-Sepharose CL-6B mit 0,45 M NaCl (einschließlich des erfindungsgemäßen Proteins). Sub: Substrat (Boc-Leu-Gly-ArgpNA).
Wie in Tabelle 5 dargestellt ist, wies das erfindungsgemäße Protein (GBP) eine deutliche Zunahme der Hemmungsaktivität gegenüber Faktor-G-Aktivierung durch vorheriges vermischen mit (1→3)-β-D-Glucan und Erwärmen bei 37°C auf. Diese Aktivität wird als eine direkte Bindung von (1→3)-β-D-Glucan und GBP angesehen, d. h. eine Hemmung von Faktor-G-Aktivierung durch lektinartige Interaktion und nicht durch koopetitive Hemmung von (1→3)-β-D-Glucan (BG) infolge einer direkten Bindung eines Inhibitors von Faktor-G-Aktivierung (wie niedrigmolekulares, wasserlösliches Polyglucosid ("Faktor-G-Aktivierungsinhibitor"; siehe WO 90/02951), zum Beispiel Laminaran-Oligosaccharid und Curdlan) und Faktor G. Dies unterstützt die direkte Bindung des erfindungsgemäßen Proteins (GBP) und (1→3)-ß-D-Glucan.
Diese Ergebnisse zeigen, dass GBP eine wichtige Rolle bei der Kontrolle und Regulierung eines Faktor-G-Systems, ausgelöst durch (1→3)-β-D-Glucan, des In-vivo-Transports von (1→3)-β-D-Glucan und der Wachstumshemmung von Pilzen spielt.
3. Beispiel
Herstellung und Reinigung von Antiserum gegen GBP Eine gleiche Menge von komplettem Freundschem Adjuvans (IATRON Laboratories Inc.) wurde mit 500 μl von 400 μg/ml gereinigter, wässriger GBP-Lösung vermischt und 2 männlichen JW-Kaninchen mit einem Körpergewicht von 1,8 kg subkutan injiziert. Ein ähnlicher Vorgang wurde zur Sensibilisierung 4 mal alle 2 Wochen wiederholt. Als Booster wurden 0,2 ml von 100 μg/ml wässriger GBP-Lösung intravenös injiziert. Eine Woche nach der letzten Injektion wurde den Kaninchen Vollblut entnommen, und das Blut wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Das Blut wurde 5 Minuten lang bei 2000 UPM zentrifugiert. Die resultierenden 60 ml Serum wurden zur Inaktivierung 30 Minuten lang auf 56°C erwärmt, und 0,06 g Natrium wurden als Azid-Konservierungsstoff auf ein Gewichtsvolumen von 0,1 zugegeben, um Antiserum zu erhalten. Der Antikörpertiter wurde mit dem Ouchterlony-Doppelimmundiffusionsverfahren bestimmt.
Ferner wurde das genannte Antiserum durch ein konventionelles Aussalzungsverfahren mit Ammoniumsulfat und Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A gereinigt, um gereinigtes Immunglobulin zu gewinnen.
4. Experiment
Quantitative Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan mit GBP Gereinigte wässrige GBP-Lösung (400 μg/ml) wurde 1000fach mit 0,1 M NaHCO₃ Puffer (pH 9,6) verdünnt, und jeweils 50 μl der verdünnten Lösung wurden portionsweise in eine β-Glucan-freie 96-Well-Mikroplatte (Toxipet plate, Seikagaku Corporation) gegossen und 12 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen, um das genannte GBP auf der festen Phase der Platte zu immobilisieren (adhärieren). Die genannte Lösung wurde angesaugt, die Wells wurden 3 mal mit PBS-Puffer (nachfolgend als PBS bezeichnet) gewaschen, anschließend wurden alle Wells mit PBS, der 5% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, blockiert und 2 Stunden lang bei 37°C erwärmt. Die Wells wurden 3 mal mit PBS gewaschen, der 0,1% Tween-20 (nachfolgend als PBS-TW bezeichnet) enthielt. In die gewaschenen Wells wurden 100 μl (1→3)-β-D-Glucan-Lösung (0,1, 1, 10, 100 und 1000 ng/ml) gegeben und 2 Stunden lang bei 37°C zur Reaktion gebracht. Die Wells wurden 3 mal mit PBS-TW gewaschen, 100 μl 0,2 μg/ml biotinmarkierter wässriger GBP-Lösung wurden zugegeben und 2 Stunden lang bei 37°C zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde mit 100 μl 1 μg/ml Peroxidase-(HRP)markiertem Streptavidin vermischt und 2 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen. Ferner wurden 100 μl Substratlösung (10 ml 50 mM Acetatpuffer (pH 5,0), der 10 mg Tetramethylbenzidin und 2 μl 30% H₂O₂ enthielt) zugegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde mit 50 μl 2 M Schwefelsäure vermischt, um die Reaktion zu beenden, und die Absorbanz wurde bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser (Wellreader SK601, Seikagaku Corporation) bestimmt, wobei eine Kontrolle bei 630 nm vorlag.
Die Dosisabhängigkeit von (1→3)-β-D-Glucan (Reaktivität mit GBP, Eichkurve) ist in 9 dargestellt.
5. Beispiel
Nachweis von (1→3)-β-D-Glucan mit GBP
In eine β-Glucan-freie 96-Well-Mikroplatte (Toxipet-Platte 96F, Seikagaku Corporation) wurden 100 μl einer Antigenlösung, die 1,5 μg eines Konjugats von (1→3)-β-D-Glucan und Rinderserumalbumin (BSA) enthielt (hergestellt gemäß dem in Agric. Biol. Chem., 54, 1953–1959 (1990) beschriebenen Verfahren), gegeben und 12 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen, um die Platte mit dem Antigen zu beschichten. Die Antigenlösung in den Wells wurde angesaugt. Die Wells wurden 3 mal mit PBS gewaschen, erneut mit PBS gefüllt, der 5% BSA enthielt (nachfolgend als Blockierlösung bezeichnet), und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Blockierlösung in den Wells wurde entfernt und die Wells wurden 3 mal mit PBS gewaschen, der 0,1% Tween-20 enthielt (nachfolgend als PBS-Tween-20 bezeichnet). In die Wells wurden 100 μl 1 μg/ml wässriger GBP-Lösung gegeben und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden mit PB5-Tween-20 gewaschen, mit Anti-GBP-Serum oder normalem Kaninchenserum gefüllt, das in einem Verhältnis von 1 : 5000, 1 : 10.000 und 1 : 50.000 verdünnt war, und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden mit PBS-Tween-20 gewaschen, mit Peroxidase-markiertem Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Serum gefüllt, das mit PBS in einem Verhältnis von 1 : 1000 verdünnt war, und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden mit PBS-Tween-20 gewaschen, mit 100 μl einer Substratlösung (10 ml 50 mmol/l Acetatpuffer mit Tetramethylbenzidin 10 mg und 2 μl 30% H₂O₂, pH 5,0) gefüllt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation wurde durch Zugabe von 50 μl 2 M H₂SO₄ beendet, und die Absorbanz wurde bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser (Wellreader SK601, Seikagaku Corporation) bestimmt, mit einer Kontrolle bei 660 nm.
Die direkte Bindung von GBP und (1→3)-β-D-Glucan wurde im Experiment wie oben dargestellt mit Anti-GBP-Serum nachgewiesen.
Die Ergebnisse der Reaktion von Kaninchen-Anti-GBP-Serum mit dem Komplex von (1→3)-β-D-Glucan und GBP sind in Tabelle 6 enthalten.
Tabelle 6
6. Beispiel
Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan mit GBP
Auf einen Glasfilter (Nr. 2) wurden 100 ml β-D-Glucanfreie Sepharose 4 B (Pharmacia) gegeben und unter Ansaugen mit 2 l destilliertem Wasser für Injektionszwecke (nachfolgend als DW bezeichnet) gewaschen. Die Lösung wurde in einen Hecher mit einem Volumen von 1 l gegeben und mit 200 ml DW vermischt. Das resultierende Gemisch wurde mit 10N NaOH unter Rühren mit einem Magnetrührer auf einen pH-Wert von 11-12 eingestellt, und 25 g Cyanogenbromid (CNBr) in 500 ml DW wurden allmählich zugegeben, bis sich der pH-Wert des Reaktionsgemischs nicht mehr änderte. Die resultierende CNBraktivierte Sepharose 4B wurde mit einem Glasfilter filtriert, mit 2 l kaltem Wasser und 1 l 0,1 M NaHCO₃ gewaschen. In 10 ml der aktivierten Sepharose 4B wurden 2 mg lyophilisiertes und pulverisiertes GBP gegeben, um eine Konzentration von 0,2 mg/ml zu erhalten, und 24 Stunden lang bei 4°C unter Rühren mit einem Rotator behandelt. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Restunreinheit, Imidocarbonat, in 0,2 M Tri-HCl-Puffer, pH 8,0, 5 Stunden lang inaktiviert. Zu 0,5 g GBPimmobilisierter Sepharose 4B wurde (1→3)-β-D-Glucan-Lösung (0,1, 1,0, 10 oder 100 μg/ml) gegeben und mit einem Multischüttler 8 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang bei 3000 UPM zentrifugiert. Zu 50 μl des resultierenden Überstands wurden 50 μl (1→3)-β-D-Glucan-spezifisches synthetisches Substrat (Gluspecy, Seikagaku Corporation) gegeben, um restliches (1→3)-β-D-Glucan in dem Überstand zu bestimmen. Ein ähnliches Experiment wurde ohne den Träger durchgeführt, um einen Kontrollwert von 100% zu erhalten, und das Entfernungsverhältnis von (1→3)-β-D-Glucan wurde berechnet. Die Ergebnisse der Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan mit GBPimmobilisiertem Träger sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7
Industrielle Anwendbarkeit
Wie zuvor erläutert wurde, weisen (1→3)-β-D-Glucan-Bindeprotein und ein Antikörper, der das Protein erkennt, spezifisch Endotoxin und (1→3)-β-D-Glucan in Proben nach oder entfernen (1→3)-β-D-Glucan effizient aus Proben. Das (1→3)-β-D-Glucan-Bindeprotein und der erfindungsgemäße Antikörper können als Nachweismittel und Entfernungsmittel dieser Substanz verwendet werden. Sie können daher zum Nachweisen und Entgiften dieser Substanzen in Proben verwendet werden.
Ferner kann das (1→3)-β-D-Glucan-Bindeprotein der vorliegenden Erfindung (1→3)-β-D-Glucan in Hauptkomponenten-Polysaccharid der Pilzzellwand binden und wird voraussichtlich als Medikament, insbesondere als Antipilzmittel, entwickelt.

Claims

Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es eine einzige Bande in der Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) zeigt, die die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat und sich an (1→3)-β-D-Glucan bindet, um einen Komplex zu bilden (1) relative Molekülmasse: etwa 580 k Dalton (Gelfiltrationsverfahren unter nichtreduzierenden Bedingungen); etwa 170 k Dalton (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen) (2) Isoelektrischer Punkt: etwa 9,2 (3) UV-Absorptionsspektrum: Maximum bei 280 nm (4) Solubilität: leicht in Wasser löslich (5) Farbe: weiß
Protein nach Anspruch 1 mit der folgenden N-terminalen Aminosäuresequenz: Lys-Ser-Gly-Phe-Ile-Leu-Thr-Ala-Pro-Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Gly-Arg-Asn-Asn-Arg-Leu-Asn-Leu-His-Leu-Phe-Asp-Ile-Asn-Thr-Asn-Gly-Phe-Xaa-Arg-Ile-Gly-Val-Lys-Asp-Gln-Asn-Asp-Phe-Asn (wobei Xaa eine der natürlich vorkommenden Aminosäuren repräsentiert).
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das genannte Protein von Pfeilschwanzkrebs-Ambbozyten abstammt.
Antikörper, der selektiv das Protein nach einem der Ansprüche 1–3 erkennt.
Agens zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan, das das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 beinhaltet.
Prüfungsagens nach Anspruch 5, wobei das genannte Protein mit einer Markierungssubstanz markiert wird.
Kit zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan, der das Protein nach einem der Ansprüche 1–3 und den Antikörper nach Anspruch 4 beinhaltet.
Prüfungskit nach Anspruch 7, wobei der Antikörper mit einer Markierungssubstanz markiert ist.
Kit zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan, der das Protein nach einem der Ansprüche 1–3 und das Prüfungsagens nach Anspruch 6 beinhaltet.
Verfahren zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan, umfassend das Reagieren des Proteins nach einem der Ansprüche 1–3 mit (1→3)-β-D-Glucan, das in einer Probe enthalten ist, um einen Komplex zu bilden, und Nachweisen des genannten Komplexes.
Prüfverfahren nach Anspruch 10, wobei der genannte Nachweis des Komplexes unter Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 4 erfolgt.
Prüfverfahren nach Anspruch 11, wobei der genannte Antikörper markiert ist oder markiert werden kann.
Verfahren zur Prüfung von (1→3)-β-D-Glucan, umfassend das Bilden eines Sandwich-Komplexes, wobei (1→3)-β-D-Glucan in einer Probe zwischen (a) dem Protein nach einem der Ansprüche 1–3, immobilisiert oder immobilisierbar auf einer festen Phase, und (b) dem Protein nach einem der Ansprüche 1-3 gehalten wird, das mit einer Markierungssubstanz markiert ist, Immobilisieren des genannten Komplexes auf der festen Phase, in dem Fall, dass das Protein auf der festen Phase immobilisiert werden kann, Trennen der festen Phase von einer flüssigen Phase und Nachweisen der markierten Substanz in einer der beiden Phasen.
Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als ein Agens zur Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Protein auf einem Träger immobilisiert ist.
Verfahren zur Entfernung von (1→3)-β-D-Glucan, umfassend das Reagieren des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit (1→3)-β-D-Glucan in einer Probe, um einen Komplex zu bilden, und Entfernen des genannten Komplexes aus der Probe.
Entfernungsverfahren nach Anspruch 16, wobei das Protein auf einem Träger immobilisiert wird.
Verfahren zur Hemmung der Aktivierung von Faktor G, umfassend das Vermischen des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat, oder Vermischen einer Probe mit dem genannten Protein und anschließend Vermischen der genannten Probe mit dem Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat, um die Aktivierung von Faktor G zu hemmen, der in dem genannten Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysast möglicherweise vorhanden ist.
Verfahren zur Prüfung von Endotoxin, das in einer Probe enthalten ist, die (1→3)-β-D-Glucan enthält, durch Limulus-Reaktion unter Verwendung von Pfeilschwanzkrebs-Amöbozytenlysat, umfassend das Vermischen der Probe mit dem Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, oder Vermischen des genannten Lysats mit dem genannten Protein vor der Limulus-Reaktion.