DE69910409T2

DE69910409T2 - Disaccharide-derivate

Info

Publication number: DE69910409T2
Application number: DE69910409T
Authority: DE
Inventors: Anthony Peter Sutton Coldfield LAMBERT; Thomas Stuart J. Sutton Coldfield ELLIOTT
Original assignee: Oxoid Ltd
Current assignee: Oxoid Ltd
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2019-05-27
Also published as: DE69910409D1; US20040137554A1; EP1112495A2; ES2205827T3; WO1999061913A2; WO1999061913A3; GB9811347D0; US20030096790A1; EP1112495B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft u. a. ein neues bakterielles Antigen, Zusammensetzungen und Kits zur Verwendung bei der Diagnose von bakteriellen Infektionen und ein Verfahren zur Diagnose einer bakteriellen Infektion sowie ein Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln einer bakteriellen Infektion.
Hintergrund der Erfindung
Die meisten Bakterien können in zwei Gruppen eingeteilt werden, Gram-positive (+ve) oder Gram-negative (–ve), in Abhängigkeit von der Art, in der die Bakterienzellen mit der Gram-Färbung reagieren, was wiederum von der Zusammensetzung der bakteriellen Hülle abhängt. Gram-positive Bakterien schließen viele wichtige Pathogene für Menschen und Tiere ein. Beispiele schließen Staphylococcus spp. wie Staph. aureus und Streptococcus spp. wie Strep. pyogenes ein.
Die Hülle Gram+ver Bakterien unterscheidet sich zwischen den Genera und zwischen den Spezies eines einzelnen Genus. Die typische Gram–+ve Hülle umfasst jedoch eine Lipidzellmembran, die von einer relativ festen Schale aus Peptidoglycan umgeben ist. Zusätzlich zu Phospholipiden und Glycolipiden umfasst die Lipidmembran auch Lipoteichonsäuren. Lipoteichonsäure (LTA) ist intensiv untersucht worden und detaillierte Übersichtsartikel sind von Fischer ("Physiology of Lipoteichoic acids in Bacteria" in Advances in Microbial Physiology 29, 233–302, 1988; und Med. Microbiol. Immunol. 183, 61–76, 1994) erstellt worden.
Im wesentlichen umfasst LTA eine hydrophile 1,3-verbundene Polyglycerophosphatkette, die kovalent mit einem hydrophoben Glycolipid verbunden ist. Für Staph. aureus umfasst die durchschnittliche LTA-Kette etwa 25 Glycerophosphatreste, von denen zwischen 30 und 80% (typischerweise etwa 70%) im allgemeinen mit einem D-Alanylrest an Position 2 substituiert sind und etwa 10% mit N-Acetylglucosaminresten substituiert sind. Eine typische Struktur eines üblichen LTA-Moleküls wird schematisch in 1 als Referenz gezeigt. LTA ist üblicherweise in der bakteriellen Membran lokalisiert, aber es wird auch während des Wachstums in das extrazelluläre Medium sekretiert.
Es ist bekannt, dass LTA in Menschen antigen ist, was es in der Theorie nahe legt, dass es möglich sein könnte, eine Diagnose einer Infektion durch Gram+ve-Bakterien durch serologische Verfahren durchzuführen, die auf die Detektion von Anti-LTA-Antikörpern in den Seren von Patienten abzielt. Vorhergehende Untersuchungen von Wergeland et al. (Jornal of Clinical Microbiol. 27, 1286–1291, 1989) haben jedoch gezeigt, dass "die Vorhersagewerte dieser Staphylococcus-Antikörper zu niedrig war, als dass sie von diagnostischem Wert wären" (d. h. die Antikörpertiter von Kontrollen und infizierten Subjekten konnten nicht in hinreichender Weise unterschieden werden, da gesunde, nicht infizierte Individuen ebenfalls Antikörper gegen LTA aufweisen).
Gram+ve-Bakterien verursachen eine Anzahl von Infektionen, insbesondere nosocomiale oder iatrogene Infektionen, die zur Zeit unter Umständen extrem schwierig zu diagnostizieren sind. Beispiele schließen mit einem zentralen venösen Katheter (CVC) assoziierte Infektionen, Knocheninfektion (besonders bei Hüftprothesen), kontinuierliche ambulante Peritonealdialyse (CAPD), bakterielle Endocarditis und cerebrospinale Flüssigkeitsshunts ein. Demgemäss wäre ein serodiagnostischer Test zur Detektion von Gram+ve-Infektionen, insbesondere in den oben genannten Fällen, hochgradig erwünscht, aber zur Zeit ist kein geeigneter Test erhältlich und die Diagnose beruht stattdessen auf der Fähigkeit, infizierende Organismen in Kultur zu isolieren. Solche Kulturtests sind sehr langsam und sie können unzuverlässig sein, falls der Patient eine Antibiotika-Behandlung erhalten hat.
Oltvoort et al. (1984 Carbohydrate Research 130, 147–163) beschreibt die chemische Synthese eines Lipoteichonsäureträger-Fragments, umfassend drei Glycerolphosphateinheiten (d. h. eine Verbindung, in der n = 3 und x = OH in 2 der vorliegenden Beschreibung ist). Die Autoren stellen fest, dass "die antigenen Eigenschaften von Membran-Teichonsäuren nicht von primärer physiologischer Bedeutung sind" und sind waren stattdessen an der Rolle der Lipoteichonsäuren als Trägermoleküle bei der Biosynthese von (bakteriellen) Zellwandteichonsäuren interessiert.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte Verbindung der Struktur
bereit, wobei n eine ganze Zahl von einschließlich 3 bis einschließlich 10 ist und X H, OH, Alkyl, Aryl, Amyl oder ein Aminosäurerest ist, fakultativ substituiert, oder ein Zuckerrest, fakultativ substituiert, und wobei R und R¹ hydrophobe Kohlenwasserstoff- oder Fettsäureketten sind und wobei R gleich R¹ oder dazu unterschiedlich sein kann, und wobei der Wert von n in einer einzelnen Probe eine einzelne ganze Zahl ist, wobei die Verbindung nicht eine Verbindung ist, in der n 3 und X OH ist.
Der Begriff "isoliert" soll im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verbindung anzeigen, dass, obwohl n zwischen einschließlich 3 bis einschließlich 10 für die Verbindungen innerhalb des Bereichs der Erfindung variieren kann, der Wert von n in jeder einzelnen Probe der isolierten Verbindung eine einzelne ganze Zahl ist. Während eine Herstellung von Kurzketten-LTA im Stand der Technik (Fischer 1993 Analytical Biochemistry 208, 49–56) genannt ist, haben die Zusammensetzungen gemäß dem Stand der Technik Fraktionen von gemischten Kettenlängen umfasst (d. h. verschiedene Werte von n).
Typischerweise weist n einen Wert zwischen 4 und 8 (inklusive) auf und wünschenswerterweise ist n = 6. Vorzugsweise ist X = H, OH, D-Alanyl oder N-Acetylglucosamin. Dem Fachmann ist klar, dass in der in 2 gezeigten Struktur die Identität von X unter den jeweiligen Wiederholungen variieren kann, so dass z. B., wenn n = 6 ist; X in vier Wiederholungseinheiten H sein kann, D-Alanyl in einer Einheit und N-Acetylglucosamin in einer anderen Einheit.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, in der mindestens 50 Gew.-% der vorliegenden bakteriellen Verbindungen eine Verbindung mit der Struktur
umfassen, wobei n eine ganze Zahl von einschließlich 3 bis einschließlich 10 ist und X H, OH, Alkyl, Aryl, Amyl oder ein Aminosäurerest ist, fakultativ substituiert, oder ein Zuckerrest, fakultativ substituiert, wobei R und R¹ hydrophobe Kohlenwasserstoff- oder Fettsäurereste sind und wobei R gleich R¹ oder dazu unterschiedlich sein kann, wobei die Verbindung nicht eine Verbindung ist, in der n 3 und X OH ist.
Der Begriff "im wesentlichen rein", wie er hierin in Bezug auf den zweiten Aspekt der Erfindung verwendet wird, soll anzeigen, dass aus den bakteriellen Komponenten, die in der Zusammensetzung vorliegen, die Verbindung mit einer Strukturformel gemäß 2 mindestens 50 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 70 Gew.-%, und am stärken bevorzugt mindestens 80 Gew.-%, umfasst. Der Fachmann wird erkennen, dass die Zusammensetzung andere Feststoffe umfassen kann, die nicht bakterielle Komponenten sind und zwar in größeren Mengen, wie z. B. Salze, Puffer und inerte Trägersubstanzen. Die Zusammensetzung kann jede zweckmäßige Form einnehmen, z. B. gefriergetrockneter Feststoff, wässrige Lösung, immobilisiert auf einem festen Träger (z. B. eine Testkitkomponente oder ähnliches). Die Zusammensetzung kann typischerweise eine isolierte Verbindung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfassen.
Wenn die Zusammensetzung eine Proteinkomponente umfasst (insbesondere ein von Bakterien abgeleitete Proteinkomponente), ist es bevorzugt, dass diese in einer nicht denaturierten Form vorliegt. In besonderen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung ein negatives Elektrospraymassenspektrum der Art, wie sie in den 6A–6C gezeigt ist, ergeben, mit einem starken Maximum bei einem m/z-Verhältnis von 2414.
Die Erfinder haben gefunden, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Antigene wirken können, die unerwarteterweise fähig sind, die Basis eines immunologischen Tests auf Infektion eines Subjekts durch Gram+ve-Bakterien zu sein.
Demgemäss stellt die Erfindung in einem dritten Aspekt ein Verfahren zum Testen von Gram+ve-bakteriellen Infektionen in einem Säugetiersubjekt, typischerweise einem menschlichen Subjekt, dar, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Inkontaktbringen einer Probe einer Körperflüssigkeit aus dem Individuum mit einer Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Struktur
wobei n eine ganze Zahl von einschließlich 3 bis einschließlich 10 ist und X H, OH, Alkyl, Aryl, Amyl oder ein Aminosäurerest ist, fakultativ substituiert, oder ein Zuckerrest, fakultativ substituiert, und wobei R und R¹ hydrophobe Kohlenwasserstoff- oder Fettsäureketten sind, wobei R gleich R¹ oder dazu unterschiedlich sein kann; und Nachweisen der Bindung von Antikörpern, falls vorhanden, in der Probe an die Zusammensetzung. Vorzugsweise ist die Probe der Körperflüssigkeit aus dem Patienten eine Blutprobe oder Serumprobe, obwohl andere Flüssigkeiten (wie z. B. Speichel, cerebrospinale Flüssigkeit oder Urin) auch verwendbar sein können. Zweckmäßigerweise wird eine Blutprobe von einem Subjekt behandelt (z. B. durch Zentrifugation), um eine Serumprobe zur Verwendung in den oben definierten Verfahren zu erhalten. Wünschenswerterweise umfasst das Verfahren die Detektion von IgG- und/oder IgM-Antikörpern, die vom Patienten als Reaktion auf die Infektion gebildet werden.
Zweckmäßigerweise ist die Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung bei Durchführung von Verfahren gemäß dem dritten Aspekt verwendbar, so dass die Zusammensetzung vorteilhafterweise in immobilisierter Form bereitgestellt werden kann, gebunden an eine feste Oberfläche wie einem Objektträger, einer Testkarte, eine kapillaren Füllkammer oder die Näpfe einer Mikrotiterplatte, oder auf der Oberfläche eines Latexbeads oder eines anderen teilchenförmigen Trägers. Verfahren zum Immobilisieren von Materialien auf festen Trägern sind dem Fachmann gut bekannt und schließen den Einsatz von entweder spezifischen oder nicht spezifischen Wechselwirkungen, einschließlich elektrostatischer oder hydrophober Wechselwirkung, Absorption, covalenter Bindung und ähnliches ein.
Es ergeben sich sofort viele Assay-Formate, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind. Besonders erwünscht und zweckmäßig ist ein Enzym-verbundenes immunosorbentes Assay-Format (ELISA), in der die Bindung von Antikörpern in der Probe an die Zusammensetzung durch Bindung eines Enzym-markierten zweiten Antikörpers detektiert wird, der dann durch die Menge eines gefärbten Produktes nachgewiesen wird, das bei Zugabe eines geeigneten Substrates erzeugt wird. Andere geeignete Assay-Formate schließen Radioimmunoassay- (RIA), Westernblot- und sogenannte "Rapid Assay"-Techniken ein.
Es wird angenommen, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Testen auf Infektionen geeignet ist, die durch eine Vielzahl von Gram+ve-Organismen, insbesondere Gram+ve-Cocci, wie Streptococcus spp. (insbesondere Streptococcus pyogenes und viridans streptococci), Staphylococcus spp. wie Staph. aureus (aber insbesondere die Coagulase-negativen Staphylococci ["CNS"], wie Staph. epidermidis), Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium verursacht werden.
Das Verfahren ist besonders bei der Diagnose auf das Vorliegen einer Infektion verwendbar, die mit zentralen venösen Kathetern, CAPD, prothetischen Vorrichtungen (z. B. Ersatzhüfte oder Knie), cerebrospinalen Flüssigkeitsshunts, Knocheninfektionen (z. B. Osteomyelitis, Discitis) oder Endocarditis assoziiert sind.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung einen diagnostischen Testkit zur Diagnose von Gram+ve-Infektionen in einem Säugetiersubjekt dar, wobei der Kit umfasst: einen festen Träger zum Durchführen des Tests; und eine Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung. Wünschenswerterweise kann die Zusammensetzung covalent an den festen Träger gekoppelt sein, oder sie kann darauf in irgendeiner anderen Weise (z. B. durch Absorption) immobilisiert sein. Als Alternative kann die Zusammensetzung in dem Kit als Lösung, Suspension oder trockenes Pulver bereit gestellt werden. Der feste Träger nimmt zweckmäßigerweise die Form einer konventionellen Assaykomponente ein, wie einer Mikrotiterplatte oder eines synthetischen Kunststoffmaterials oder eines Objektträgers oder eine Testoberfläche, die Pappe oder ein synthetisches Laminatmaterial umfasst.
Der Kit umfasst vorzugsweise einen oder mehrere aus einer Anzahl anderer Komponenten üblicher Art, wie Detektionsreagenzien (z. B. markierte Antikörper, Enzymsubstrate oder andere Substanzen zum Entwickeln einer Färbung), positive und negative Kontrollproben, Gebrauchsanweisungen usw.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung eine sterile Zusammensetzung zur Verwendung als Impfstoff in einem Säugetiersubjekt bereit; der Impfstoff umfasst dabei eine Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung. Zweckmäßigerweise wird der Impfstoff in Form einer einheitlichen Dosis bereit gestellt, die Größe der Dosis hängt von der Identität des Säugetiersubjekts ab. Zum Beispiel kann großen Tieren, wie Kühen oder Pferden, eine Dosis verabreicht werden, die 100 mg bis 1 g einer Substanz mit der in 2 gezeigten Struktur umfasst.
Im Vergleich dazu könnte eine angemessene Dosis (d. h. eine solche, die eine nachweisbare Immunantwort in dem Subjekt hervorruft) für einen Menschen im Bereich von 10–500 mg liegen. Es ist klar, dass wiederholte Dosen der Impfzusammensetzung verabreicht werden können, bis das Subjekt eine nachweisbare Immunantwort entwickelt hat. Ein zweckmäßiges Mittel zur Detektion einer Immunantwort besteht darin, das Vorliegen von Serumantikörpern zu bestimmen, die gegen das Impfstoffantigen gerichtet sind, wobei der Test im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt werden kann. Typischerweise wird der Impfstoff in einer Lösung zur Injektion bereitgestellt. Solche Lösungen umfassen üblicherweise eine Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt, in der das Lösungsmittel steriles Wasser oder eine sterile wässrige Lösung wie Saline oder Phosphat-gepufferte Saline ist. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann z. B. intramuskulär, intraperitoneal, subkutan oder intravenös verabreicht werden. Andere Phasen der Verabreichung (z. B. intranasal, oral) können auch möglich sein.
Für eine maximale Wirksamkeit kann der Impfstoff zusätzlich andere bakterielle Antigene umfassen, insbesondere solche aus Gram+ve-Bakterien, von denen bekannt ist, dass sie das Ziel einer Immunantwort sind. Zusätzlich kann der Impfstoff Adjuvans-Materialien, wie Alaun oder vollständiges oder unvollständiges Freundsches Adjuvans, immunostimulatorische Komplexe, Liposome und ähnliches umfassen.
Der Impfstoff hat eine Wirkung, die darin besteht, das Empfängersubjekt gegen eine Infektion durch eine oder mehrere Gram+ve-positive Bakterien zu schützen. Dieser Schutz kann vollständig sein (d. h. er verhindert, dass das Subjekt irgendwelche Symptome nach Exposition gegenüber Gram+ve-Pathogenen entwickelt) oder partiell (d. h. die Schwere der Erkrankung nach Exposition gegenüber dem Pathogen wird mehr oder weniger stark vermindert).
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten eines Immunoglobulins oder einer Antigen-bindenden Variante davon bereit, die eine spezifische Bindung für eine Verbindung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Screenen in einer Bank von Viren oder anderen Partikeln, die ein Immunglobulin oder eine Antigenbindende Variante davon auf ihrer Oberfläche präsentieren; und Selektieren derjenigen Bestandteile der Bibliothek, die ein Immunoglobulin oder eine Antigenbindende Variante davon, die an die Verbindung binden, präsentieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das Verfahren ein Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern bereit.
Ein geeignetes Verfahren zum Erhalten von Antikörpern gegen die in 2 gezeigte Verbindung wird z. B. in WO 92/01047 offenbart. Solche Screening-Verfahren sind dem Fachmann darüber hinaus gut bekannt.
Die Immunoglobuline mit spezifischer Bindungsaktivität für die in 2 gezeigte Verbindung könnten in vielfältiger Weise verwendbar sein. Die Immunoglobuline können konventionelle Antikörper (z. B. IgG, IgA, IgM usw.) sein oder sie könnten Varianten davon sein, wie Fab, Fv, scFv, bispezifische Antikörper, oder sie könnten chimere Proteine sein, die Antigen-bindende Teile von Antikörpermolekülen umfassen. Verfahren zur Herstellung von Varianten sind dem Fachmann gut bekannt. Solche Moleküle können in diagnostischen Kits verwendbar sein (z. B. als positive Kontrollproben) oder sie können für die passive Immunisierung eines Säugetiersubjects zum Verhindern oder zur Behandlung von Gram+ve-Infektionen verwendbar sein, und ein Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln einer Gram+ve-Infektion in einem Säugetiersubjekt auf eine solche Art stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Die Erfindung stellt darüber hinaus eine Zusammensetzung bereit, die ein Immunglobulin oder eine Antigen-bindende Variante davon umfasst, die eine spezifische Bindungsfähigkeit für eine Verbindung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung aufweist. Das Immunglobulin liegt vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form vor.
In einem siebten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Kultivierung eines Gram+ve-Bakteriums in einem Wachstumsmedium, um die Sekretion einer Verbindung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung in das Wachstumsmedium hervorzurufen; Separieren des Wachstumsmediums von den bakteriellen Zeilen; Fraktionierung des Wachstumsmediums und Isolieren der Fraktion, die, in im wesentlichen reiner Form, die Verbindung gemäß dem ersten Aspekt umfasst.
Geeignete Wachstumsbedingungen für das Bakterium sind für den Fachmann offensichtlich. Typischerweise umfassen diese eine Inkubation bei oder bei etwa 37°C unter Rühren. Das Wachstumsmedium kann ein komplexes Medium sein (z. B. Brain-Heart-Infusion oder BHI) oder ein chemisch definiertes Medium wie HHW, wie in den Beispielen detailliert beschrieben (was zu einer Vereinfachung der Fraktionierung und Aufreinigung der erwünschten Verbindung führen kann). Nach einer geeigneten Wachstumsperiode (z. B. 18 bis 36 h), während der die Verbindung der in 2 gezeigten Struktur aus den Bakterienzellen in das Medium freigesetzt wird, kann das Wachstumsmedium von den Zellen separiert werden, indem die Kultur durch eine Filtervorrichtung durchgeleitet wird (deren mittlerer Porendurchmesser klein genug ist, um die Bakterienzellen zurückzuhalten) oder stärker bevorzugt durch Zentrifugation. Die Kultur kann der Zentrifugation in Chargen unterworfen werden oder kontinuierlich, indem durch eine Zentrifuge mit kontinuierlichem Fluss geleitet wird.
Zweckmäßigerweise wird das Medium, sobald die Zellen entfernt worden sind, konzentriert. Wünschenswerterweise wird die Konzentration durch Gefriertrocknung und erneutes Lösen bzw. erneutes Suspendieren in einem reduzierten Volumen einer Flüssigkeit (wie z. B. destilliertes Wasser) erzielt. Zweckmäßigerweise wird eine 5- bis 20-fache Konzentration (üblicherweise 10-fach) erzielt. Nach der optimalen Konzentrierung wird das Medium fraktioniert.
Ein bevorzugtes Verfahren der Fraktionierung besteht in dem Inkontaktbringen des Mediums mit einer chromatographischen Trennvorrichtung. Eine große Anzahl von chromatographischen Trennvorrichtungen sind bekannt, einschließlich Ionenaustauschchromatographie. Wünschenswerterweise umfasst die chromatographische Trennung eine Gelpermeationschromatographie. Zweckmäßigerweise wird ein geeignetes Gelpermeationschromatographieharz in eine Säule gepackt und man erlaubt das Durchlaufen des Mediums durch die Säule. Ein Harz, von dem die Erfinder herausgefunden haben, dass es besonders geeignet ist, ist Superose 12 (erhältlich von Amersham Pharmacia), aber es ist eine große Anzahl von ähnlichen Harzen erhältlich, die für den erwünschten Zweck geeignet sein könnten.
Eine große Anzahl von Gram+ven Organismen kann zur Verwendung in dem Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung eingesetzt werden. Zweckmäßigerweise ist der Organismus nicht obligat anaerob. Bevorzugte Organismen sind Gram+ve-Cocci, wie Streptococci oder Staphylococci. Insbesondere sind Coagulase negative Staphylococci (CNS) bevorzugt, die schleimproduzierende Stämme oder nicht-schleimproduzierende Stämme sein können. Zweckmäßigerweise kann Staphylococcus epidermidis eingesetzt werden.
Die Erfinder haben gefunden, dass eine Anzahl von aus Patienten isolierten Stämmen bei der Herstellung der Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung besonders verwendbar sind. Diese Stämme sind alle einer Hinterlegung unterzogen worden (unter den Bedingungen des Budapester Vertrages), und zwar bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Vereinigtes Königreich), wie unten detailliert beschrieben:
Stamm 1 CAN 6KIII (Zugangsnummer NCIMB 40896, Datum der Hinterlegung: 18.09.1997)
Stamm 2 HAR 6KIV (Zugangsnummer NCIMB 40945, Datum der Hinterlegung: 22.04.1998)
Stamm 3 COS 6KV (Zugangsnummer NCIMB 40946, Datum der Hinterlegung: 22.04.1998)
Stamm 4 MIL 6LI (Zugangsnummer NCIMB 40947), Datum der Hinterlegung: 22.04.1998)
Stamm 5 HED 6LIII (Zugangsnummer NCIMB 40948, Datum der Hinterlegung: 22.04.1998)
Stamm 6 ONE 6KVI (Zugangsnummer NCIMB 40949, Datum der Hinterlegung: 22.04.1998)
Stamm 7 MAT 6LII (Zugangsnummer NCIMB 40950, Datum der Hinterlegung: 22.04.1998).
Die Stämme 1 bis 5 sind Stämme von Staph. epidermidis. Stamm 6 ist ein Stamm von Staph. haemolyticus und Stamm 7 ist ein Micrococcus kristinae-Stamm. Die Stämme 1, 3, 5 und 7 sind schleimproduzierende Stämme, und die Stämme 2, 4 und 6 sind nicht schleim-produzierend, wie durch Untersuchung auf Congo Rot-Medium eingeschätzt (beschrieben in Beispiel 1 unten).
Die Hinterlegungen wurden von den Erfindern der vorliegenden Erfindung für den Anmelder vorgenommen.
Ein besonderer Stamm oder (vorzugsweise) eine Kombination der obigen Stämme kann zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung verwendet werden.
Die Erfinder haben gefunden, dass es bevorzugt sein kann, die Zusammensetzung gemäß der Erfindung durch Vereinigen der Wachstumsmedien herzustellen, die aus der Kultivierung von mehreren unterschiedlichen Organismen, entweder separat oder (weniger bevorzugt) in einer gemischten Kultur, erhalten wurden. Die Erfinder haben gefunden, dass eine auf diese Art hergestellte Zusammensetzung unerwartet überlegene antigene Eigenschaften hat. Insbesondere stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die durch Vereinigen des Wachstumsmediums von Kulturen von zwei oder mehr beliebigen der Stämme 1–7 (die die oben angegebenen Zugangsnummern haben); Trennen des Wachstumsmediums von den Zellen; und Fraktionieren des Mediums wie oben definiert, erhalten wurde.
Die Erfindung wird nun durch illustrative Beispiele und mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben, in denen:
1 die chemische Struktur von konventionellen "Langketten"-Lipoteichonsäure-Molekülen zeigt;
2 die Struktur einer Kurzkettenverbindung zeigt, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorliegt;
3 einen Graph der Absorption gegen die Fraktionsnummer ist, der ein Elutionsprofil zeigt;
4A und 4B Streugraphen sind, die den IgG-Titer (4A) oder den IgM-Titer (4B) zeigen, wie gemessen durch BHI7 ELISA für Patienten mit CVC-Sepsis (linke Auftragung) oder von nicht infizierten Kontrollpatienten (rechte Auftragung);
5 ein Graph der richtig positiven Rate gegen die falsch positive Rate ist, der eine ROC- (Receiver Operator Characteristic) Analyse verschiedener Verfahren zur Diagnose von CVC-Sepsis zeigt;
6A–6C negative Elektrospraymassenspektren als Auftragung des Vorkommens gegen das Massen/Ladungsverhältnis (m/z) (untere Tafeln) und Dekonvolutionsauftragungen dieser Daten (obere Tafeln) zeigen, für Stamm 1 (6A), Stamm 3 (6B) und Stamm 4 (6C); und
7 ein Streugraph ist, der die Antikörpertiter von Seren aus infizierten Patienten (rautenförmige Symbole) oder nicht infizierten Kontrollen (Rechtecke) zeigt.
Die Erfinder haben einen direkten ELISA-Test entwickelt, um die Serumgehalte von IgG oder IgM zu messen, die mit dem Kurzketten-LTA reagieren, der aus Stämmen von Staph. epidermidis abgeleitet ist, die auf Polystyrolmikrotiterplatten beschichtet sind. Die Kurzketten-LTA wird aus den Überständen von Brain-Heart-Infusionsbrühekulturen von Staph. epidermidis-Stämmen extrahiert, die aus Patienten mit CVC-verbundener Sepsis isoliert wurden und durch Gelpermeationschromatographie teilweise gereinigt. Es wurden Versuche durchgeführt, um das diagnostische Potential des Assays zu untersuchen und das Antigen zu charakterisieren. Die Versuche schlossen Seren von Patienten mit infizierten Kathetern oder mit einer mit CVC verbundenen Sepsis ein, sowie Patienten mit Endocarditis und Kontrollpatienten mit einem CVC, aber ohne Infektion. Diese Untersuchung hat gezeigt, dass der Assay wesentlich höhere Gehalte an IgG und IgM im Serum von infizierten Patienten detektiert, als in Serum-Kontrollpatienten. Der Test bietet daher ein Mittel zum schnellen Anzeigen einer Gram+ven Infektion ohne die Notwendigkeit von positiven Blutkulturen. Der Test wird bei diesen und anderen Infektionen, bei denen positive Blutkulturen schwer zu erhalten sind, insbesondere nach Beginn einer Antibiotikatherapie, Anwendungen haben.
Beispiel 1 – Selektion von Antigenfraktionen zur Verwendung in ELISA
Der zum Beschichten der ELISA-Mikrotiterplatten verwendete Antigenextrakt wurde durch Screenen einer Anzahl zellulärer und extrazellulärer Fraktionen von Staph. epidermidis-Isolaten identifiziert, die von Patienten mit CVC-verbundener Sepsis erhalten wurden. Zwanzig verschiedener Stämme wurden auf das Auftreten von Kolonien auf einem Brain-Heart-Infusions-/Congo Rot/Saccharosemedium untersucht, um schleimproduzierende Stämme von Nichtschleimproduzierern zu unterscheiden. Die Erfinder haben gefunden, dass etwa 25% der Isolate keinen Schleim produzierten, und sie haben daher entschieden, keinen serodiagnostischen Test zu unternehmen, der ausschließlich auf der Schleimkomponente beruht. Anstelle dessen wurde Antigenmaterial, das allen Stämmen gemeinsam ist, aus dem Brain-Heart-Infusionsflüssigmedium gewonnen, in dem die Zellen gewachsen waren, und es wurde durch Gelpermeationschromatographie gereinigt.
Man ließ den Stamm in der Brain-Heart-Infusion (Oxid) für 18 h unter Schütteln bei 37°C wachsen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10.000 g, 10 min) entfernt und das Medium wurde durch Gefriertrocknung und Resuspension in Wasser 10-fach konzentriert. Proben des konzentrierten Kulturmediums (1 ml) wurden auf eine Superose 12 10/30 FPLC-Säule (Pharmacia) aufgebracht, mit Wasser bei 0,4 ml/min eluiert, wobei 0,8 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden einem Assay auf Hexose und Protein unter Verwendung von Phenol/Schwefelsäure (Dubois et al., 1956, Analytical Chemistry 28, 350–356) bzw. Lowry-Assays (Lowry et al., 1951 J. Biol. Chem. 193, 265–275) unterzogen.
3 zeigt ein typisches Elutionsprofil von Wachstumsmedium, das aus einem nicht-schleimproduzierenden S. epidermidis-Isolat gewonnen wurde. In 3 wird die Menge an Hexose (bestimmt durch Messung der Extinktion bei 492 nm, gefolgt von kolorimetrischem Assay) durch die offenen Symbole bezeichnet und die Menge an Protein (bestimmt durch Messung der Extinktion bei 692 nm) wird durch die teilweise gefüllten Symbole bezeichnet. Die großen Maxima des Materials in den Fraktionen 20–40 stellen Komponenten der Brain-Heart-Infusion dar und lagen auch im Elutionsprofil vor, wenn frische Brain-Heart-Infusion auf die Säule aufgebracht wurde (Daten nicht gezeigt). Die Fraktionen 10–15, die unmittelbar nach dem Leervolumen der Säule eluieren, enthalten Hexose, aber sehr wenig Protein. Anschließende chemische und immun-chemische Untersuchungen haben gezeigt, dass dieses Material mit LTA zu tun hat.
Obwohl vorläufige Studium mit Antigen durchgeführt wurden, das aus einem einzelnen Stamm hergestellt wurde, haben die Erfinder befürchtet, dass dieser Zusammensetzung möglicherweise antigene Schlüsseldeterminanten fehlen, die von anderen bakteriellen Stämmen produziert werden. Demgemäss wurde die Anzahl der Stämme, die zur Herstellung der in dem Assay eingesetzten Antigenzusammensetzung verwendet wurde, auf 7 erhöht. Diese sieben (Stämme 1 bis 7) wurden aus den 20 ursprünglich untersuchten ausgewählt und sie umfassten vier Schleimproduzierer und 3 Nichtschleimproduzierer. Diese Stämme sind alle zum Gegenstand einer Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag gemacht worden (Details der Zugangsnummern sind oben angegeben). Sie wurden so ausgewählt, dass Mitglieder aller Kolonientypen eingeschlossen waren, denen man bei den Untersuchungen begegnet war. Die Kulturüberstände von jedem Stamm wurden vereinigt, konzentriert und durch FPLC, wie oben beschrieben, fraktioniert. Die Fraktionen 10–15 wurden vereinigt und zum Beschichten der Näpfe verwendet. Dieses gereinigte vereinigte Antigen wurde als "BHI7" bezeichnet.
Im wesentlichen ähnliche Techniken können verwendet werden, um Antigen in einem industriellen Maßstab herzustellen, wenn das Verfahren einfach in einen größeren Maßstab überführt wird. Ein alternatives Herstellungsverfahren könnte auf einer Adaption des Verfahrens der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie (HIC) beruhen, die von Fischer offenbart ist (Analyt. Biochem. 1993, 208, 49–56). Dieses publizierte Verfahren beinhaltet die anfängliche Extraktion aus ganzen Zellen unter Verwendung von Phenol/Wasser, gefolgt von Aufreinigung durch HIC auf Octyl-Sepharose, aber da die Erfinder Antigen im Wachstumsmedium gefunden haben, wäre es bevorzugt, das Reinigungsverfahren direkt auf das Medium anzuwenden, indem (fakultativ) durch Gefriertrocknen konzentriert wird und das Medium direkt über eine HIC-Säule geleitet wird. Nur das Antigen sollte binden und kann dann mit einem linearen Propanolgradienten in 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 4,7, eluiert werden.
Beispiel 2: ELISA-System
Es wurde ein direktes ELISA-System zum Messung von IgG- oder IgM-Gehalten in dem Serum von Patienten entwickelt. Gereinigtes Antigen (BHI7), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde auf ELISA-Platten beschichtet, die dann gewaschen und mit Tween 20 geblockt wurden. Die geblockten Platten wurden leer bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Die Näpfe wurden sequentiell mit dem Serum von Patienten getestet (bei gedoppelten Verdünnungsreihen), gefolgt von Protein A-Peroxidase oder Ziege-Antihuman-IgG-Peroxidase-Konjugaten (zur Detektion von IgG) oder Ziege-Antihuman-IgM-Peroxidase-Konjugaten (zur Detektion von IgM), und sie wurden mit einem chromogenen Substrat (Tetramethylbenzidin/H₂O₂) entwickelt. Das detaillierte Protokoll ist wie folgt:
Die vereinigten Fraktionen 10–15 der FPLC-Aufreinigung wurden mit 100 Volumen Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer (0,05 M, pH 9,6) verdünnt und zum Beschichten von Mikrotiterplatten (Immulon 2, Dynatech) bei 4°C für 18 h (100 μl pro Napf) verwendet. Das Antigen wurde verworfen und die Näpfe wurden mit TBS-Tween (0,01 M Tris-HCl pH 7,4, NaCl 0,9 Gew.-% und 0,3 Vol.-% Tween-20) gewaschen, um vebleibendes Antigen zu entfernen. Ungebundene Stellen in den Näpfen wurden durch Inkubation im gleichen Puffer geblockt (1 h bei 4°C). 0,1 ml Proben der Seren von Patienten, geeigneterweise mit TBS-Tween verdünnt, wurden den Näpfen zugesetzt, und es wurde für 18 bei 4°C inkubiert. Nach Entfernen des Serums und Waschen mit TBS-Tween wurde gebundener IgG durch Zugabe von 100 μl Protein A-Meerrettichperoxidase-Konjugat (0,5 μg/ml in TBS-Tween; Sigma) für 2 h bei 4°C detektiert.
Nach Entfernen des Konjugats und Waschen mit TBS-Tween wurden 100 μl chromogenes Substrat zu jedem Napf zugegeben. Das Substrat enthielt 10 mg 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Sigma), gelöst in 1 ml Dimethylsulfoxid und verdünnt in 100 ml Natriumacetat/Citratpuffer (0,1 M, pH 6,0), enthaltend 10 μl H₂O₂ (20 Vol.-%). Nach hinreichender Entwicklung der Farbe (5 min bei 20°C) wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Schwefelsäure (1 M) zu jedem Napf gestoppt. Das gelb gefärbte Produkt in jedem Napf wurde bei 450 nm mit einem Anthos 2001-Plattenleser (Anthos Labtec Instruments) gemessen.
Beispiel 3: Auswertung des ELISA-Tests unter Verwendung der Seren aus Patienten
Der ELISA-Test wurde unter Verwendung der Seren aus den folgenden Gruppen von Patienten ausgewertet:
CVC-verbundene Sepsis aufgrund von Staph. epidermidis (n = 39)
Staph. epidermidis Endocarditis (n = 15)
Discitis-Infektion aufgrund von Staph. epidermidis (n = 14)
Kontrollen, d. h. Patienten mit CVCs, aber ohne Infektion (n = 33).
Die Erfinder haben als Endpunkt für die Titrationen diejenige Serumverdünnung verwendet, die die Farbproduktion in den Testnäpfen auf die der Kontrolle reduzierten, die ohne Serum entwickelt worden ist. In allen Assays lag die Extinktion solcher Kontrollnäpfe im Bereich 0,15–0,20.
Die Resultate für IgG-Titer, gemessen mit Protein A-Peroxidasekonjugat, werden in den Tabellen 1 und 2 unten zusammengefasst.
Tabelle 1: Vergleich der Mittelwerte und Standardabweichungen für IgG-Titer von infizierten Patienten und nicht-infizierten Kontrollen
Tabelle 2: Statistische Analyse der IgG-Titer (im Vergleich zu Kontrollen)
Die statistischen Tests zeigen einen signifikanten Unterschied in den IgG-Gehalten für sowohl die CVC-Sepsis als auch die Endocarditis-Patienten im Vergleich mit den Kontrollen. Für die Discitis-Patienten, die einen großen Bereich an Titern zeigen, ergibt nur der nicht-parametrische Mann-Whitney-Test einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollen.
Um das Wesen der Antikörperantwort weiter zu bestimmen, wurden auch Assays unter Verwendung alternativer Ziege-Antihuman-IgG- und -IgM-Peroxidasekonjugate durchgeführt, um IgG und IgM zu detektieren. Diese Assays wurden bei einzelnen Serumverdünnungen von 1 : 800 durchgeführt und die Ergebnisse als Menge der Farbe aufgezeichnet, die in dem Assay in 5 min entwickelt wurde. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 gezeigt. Die IgG-Gehalte, die mit den Antihuman-IgG-Konjugat detektiert wurden, entsprachen im allgemeinen denen, die mit Protein A-Konjugat erhalten wurden. Die IgM-Resultate waren niedriger als die IgG-Gehalte.
Tabelle 3: Mittlere Extinktion für Positiv- und Negativ-CVC-Sepisseren
Tabelle 4: Statistische Analyse (nicht gepaarter t-Test) der ELISA-Ergebnisse
Die 4A und 4B zeigen Streugraphen, die die ELISA-Titer für Serum IgG- bzw. IgM-Titer für infizierte Patienten (n = 48) und die Kontrollgruppe (n = 44) zeigen. Sowohl die IgG- als auch die IgM-Titer zeigen einen extrem signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten der positiven und der Kontrollgruppen. Die Streugraphen zeigen jedoch eine gewisse Überlappung in den Populationen, was besonders für IgM markant ist.
Die diagnostische Leistung der IgG- und IgM-ELISA-Tests kann mit anderen Verfahren zur Diagnose von CVC-Sepsis unter Verwendung der Daten und des Analysenverfahrens verglichen werden, was von Siegman-Igra et al. (Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35, 928–936) offenbart ist.
Siegman-Igra et al. (1997) verglichen die verschiedenen Verfahren zur Diagnose von Blutkreislaufinfektionen, die in Beziehung zu einem vaskulären Katheter standen, indem Receiver-Operator-Charakteristik-(ROC)-Auftragungen (Auftragungen der echten positiven Raten gegen die falschen positiven Raten) analysiert wurden. Zusammenfassende ROC-Kurven (berechnet durch Vereinigen der veröffentlichten Daten für jedes Verfahren) sind in 5 unter Verwendung der IgG- und IgM-ELISA-Titer aus den 4A und 4B gezeigt.
In 5 werden die verschiedenen diagnostischen Verfahren wie folgt bezeichnet:
Qualitative Kathetersegmentkulturen (offene Kreise); semi-quantitative Kathetersegmentkultur (offene Fünfecke); quantitative Kathetersegmentkulturen (offene Rechtecke); nicht gepaarte qualitative Blutkultur (gefüllte Kreise); und nicht gepaarte quantitative Blutkultur (gefüllte Dreiecke). Die Äquivalentdatenpunkte für den ELISA-Test sind für IgG und IgM als große, nicht verbundene gefüllte Kreise bzw. große, nicht verbundene gefüllte Rechtecke aufgetragen. Im wesentlichen gilt, je näher die Auftragungen an der linken oberen Ecke des Graphen liegen, desto zuverlässiger ist das diagnostische Verfahren.
Die Ergebnisse bestätigen, dass der IgG-ELISA-Test sehr wirksam bei der Diagnose von CVC-Sepsis ist, wobei seine Leistung sich vorteilhaft mit den besten publizierten Verfahren vergleicht (nicht gepaarte, quantitative Blutkultur).
Beispiel 4: Analyse der individuellen Stämme
Der Vergleich der individuellen Komponenten von BHI7 und deren Beitrag zur ELISA-Reaktion wurde durch Trennen auf Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht. Die Gele wurden entweder mit Silber gefärbt, um die Protein- und Polysaccharidbestandteile zu erkennen, oder sie wurden einem Immunoblotten und einer Reaktion mit Patientenseren unterzogen. Jeder der 7 Stämme, der verwendet wurde, um BHI7-Antigen zu erzeugen, wurde separat in Brain-Heart-Infusion angezogen, die Kulturmedien wurden gesammelt, 10-fach konzentriert, durch Gelpermeationschromatographie gereinigt und die Fraktionen 10–15 für die kombinierte BHI7-Präparation gesammelt.
Diese Ergebnisse (Daten nicht gezeigt) zeigten an, dass, obwohl die Antigen-Präparation von jedem Komponentenstamm von BHI7 eine gewisse Menge Proteine enthielt (detektiert als scharfe Banden auf Silber gefärbten Gelen), diese nicht stark antigen waren, wie durch Immunoblott bestimmt wurde. Die dominanten antigenen Komponenten wanderten als schnell bewegliches Material (d. h. niederes Molekulargewicht und negativ geladen) an der Front des Gels, und sie bildeten eine diffuse Bande von immunoreaktivem Material auf den Blotts. Es wurde wenig Material durch Silberfärbung auf den Gelen in dieser Region detektiert. Dies legt es nahe, dass das hauptsächlich antigene Material BHI7 weder ein Protein (das in kleinen Mengen vorlag, aber nicht immunoreaktiv war), noch ein Polysaccharid (das man durch Silberfärbung entdeckt hätte und das langsamer auf den Gelen wandern würde) ist.
Die einzelnen Beiträge jedes Stamms zu der Reaktivität auf BHI7 wurde durch Durchführung separater ELISA-Reaktionen mit selektierten Seren von CVC-Sepsis-Endocarditis-Patienten und Kontrollen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: IgG-EILISA-Titer^* unter Verwendung von BHI7 und Antigen aus individuellen Stämmen
Diese Ergebnisse zeigen, dass einige Stämme mehr Antigen als andere zur Gesamtreaktivität von BHI7 beitragen und dass die Fähigkeit des ELISAs, zwischen positiven und negativen Seren zu unterscheiden, von den Stämmen 1 bis 6 am besten geliefert wird.
Beispiel 5: Herstellung von Antigen aus Kulturen, die in definiertem Medium angezogen sind
Die chemische Identifizierung des in BHI7 vorliegenden Antigens würde durch das Vorliegen von aus dem Brain-Heart-Infusionsmedium stammenden Material in den Fraktionen 10 bis 15 aus der Gelpermeationschromatographiesäule kompliziert. Die Erfinder haben daher die Verwendung eines alternativen chemisch definierten Mediums (HHW) untersucht, das für das Wachstum von S. epidermidis (Hussain et al., 1992, J. Med. Microbiol. 37, 368–375) entwickelt wurde.
Das Antigen wurde in der gleichen Art wie für BHI7 unter Verwendung von sechs Stämmen (der Stamm 7 wurde ausgelassen), die in HHW angezogen wurden, hergestellt und dieses Material wurde als "HHW6" bezeichnet. Zu Vergleichszwecken haben die Erfinder auch zelluläres LTA aus ganzen Zellen von einem der 6 Stämme (Stamm 1), angezogen in HHW unter Verwendung eines Phenolextraktionsverfahrens (Coley et al., 1972, J. Gen. Micro. 73, 587–591) gereinigt. LTA wurde auf die Mikrotiterplatten bei einer Konzentration von 0,05 mg/ml beschichtet.
Die Leistung jeder Präparation (BHI7, HHW6 und des gereinigten LTA) im ELISA wurde mit einem Satz von 27 positiven CVC-Sepsisseren und 14 Kontrollseren verglichen. Die Seren wurden als einzelne Verdünnung von 1 : 800 auf jeder Platte getestet, so dass direkte Vergleiche des Ansprechens durchgeführt werden konnten. Jede Serumprobe wurde auf die Platten vor und nach Absorption mit Staph. epidermidis LTA aufgebracht. Die Absorption wurde durch Zugabe von 50 μl einer 10 mg/ml-Lösung von LTA zu 2 ml einer 1 : 800-Verdünnung der Seren in TTBS, Inkubation für 18 h bei 4°C und Zentrifugation zum Entfernen des Anti-LTA-Antikörpers/LTA-Immunkomplexes durchgeführt. Die statistischen Vergleiche der Mittelwerte der CVC-Sepsis und der Kontrollgruppen werden unten in den Tabellen 6 und 7 gezeigt.
Tabelle 6: Vergleich der mittleren Extinktionen von IgG ELISA für positive und negative CVC-Sepsis-Seren bei 1 : 800 Verdünnung
Tabelle 7: Statistische Analyse (nicht gepaarter t-Test) der ELISA-Ergebnisse, die in Tabelle 6 aufgelistet sind
Die Ergebnisse zeigen, dass drei verschiedene Antigenpräparationen (BHI7, HHW6 und LTA) jeweils einen signifikanten Unterschied in dem IgG ELISA-Ansprechen zwischen den CVC-Sepsis- und Kontrollseren ergaben. Das Ansprechen war nach einer einzelnen Absorption mit LTA wesentlich reduziert. Die Reduktion in der Extinktion in den Assays betrug 70% für BHI7, 44% für HHW6 und 83% für das LTA. Dies legt es nahe, dass LTA oder irgendeine antigenisch mit LTA verwandte Spezies die Hauptkomponente der BHI7 und HHW6-Antigenpräparationen war. Das Scheitern einer Absorption von mehr Antikörper an die BHI7- und HHW6-Präparationen legt es nahe, dass diese weitere antigene Determinanten enthielten, zusätzlich zu den auf dem gereinigten LTA der Einzelstämme vorliegenden.
Die gleichen Verfahren wurden auch verwendet, um Antigenpräparationen von jedem der sieben Stämme herzustellen, die individuell im HHW-Medium angezogen wurden.
Jeder der oben beschriebenen HHW-Antigenpräparationen wurde separat auf ihre Leistung im ELISA unter Anwendung der Standard-Assay-Bedingungen getestet, wie sie vorhergehend für BHI7- und HHW6-Antigene beschrieben sind. Die Fraktionen 10–15 jedes Elutionsprofils wurden separat vereinigt, gefriergetrocknet, um das Trockengewicht zu bestimmen und in Carbonatpuffer auf 0,01 mg/ml gelöst. Separate Chargen der ELISA-Platten wurden beschichtet und zur Untersuchung der Seren aus 50 Patienten mit CVC-Sepsis aufgrund von S. epidermidis und von 50 Kontrollen verwendet. Kommerziell erhältliche Präparationen von LTA aus Staph. aureus und eine Laborpräparation von zellulärem LTA aus Staph. epidermidis, hergestellt nach dem Verfahren von Fischer et al. (1983 Eur. J. Biochem. 133, 523–530) wurden zum Vergleich einbezogen. Die Mittelwert-Ergebnisse sind unten in Tabelle 8 gezeigt (M-W.P. = Mann-Whitney-Test).
Tabelle 8
Die Ergebnisse zeigen, dass das aus den Stämmen 1–4 und aus Stamm 6 hergestellte Antigen, und BHI7, jeweils eine bessere Leistung bringen als das kommerziell erhältliche Staph. aureus LTA und eine wesentlich bessere Leistung bringen als das aus Staph. epidermidis-Zellen extrahierte LTA. Die anschließende ROC-Analyse dieser Daten bestätigte, dass die HHW-Antigenpräparationen bessere Leistungen erbrachten als das kommerziell erhältliche Staph. aureus LTA, wenn diese zum Beschichten von ELISA-Platten für die Diagnose von CVC-Sepsis verwendet wurden. Die BHI7-Antigenleistung war besser als die irgendeiner der Komponentenstämme, wie durch ROC-Analyse abgeschätzt wurde.
Beispiel 6: Charakterisierung des Antigens
Ein indirekter Beleg für die Wirkung von extrahiertem LTA aus Staph. epidermidis beim BHI7-ELISA legt es nahe, dass das Antigen LTA oder eine mit LTA-Antigen verwandte Spezies enthielt. Es ist bislang keine strukturelle Bestimmung von LTA aus Staph. epidermidis berichtet worden, aber das LTA aus Staph. aureus besteht hauptsächlich aus 28 Glycerinphosphateinheiten, verbunden mit einem Glycolipid, wie in 1 gezeigt.
Eine Bestätigung durch direkte chemische Analyse des BHI7-Antigens konnte aufgrund des Vorliegens von kontaminierenden Gehalten von Komponenten, die aus dem Brain-Heart-Infusionsmedium stammen, nicht durchgeführt werden. Das extrazelluläre Antigen wurde daher aus dem Kulturmedium von Stamm 1 präpariert, gefolgt von Wachstum in chemisch definiertem Medium (HHW). Die chemische Natur dieses Materials wurde durch negative Elektrospray-Massenspektrometrie, ³¹P und ¹H-NMR und chemische Analyse des sauer hydrolysierten Materials untersucht.
Ausbeute an Antigen
Das Verfahren zur Antigenpräparation war exakt das für BHI7-Antigen beschriebene. Stamm 1 wurde in 2 l HHW bei 37°C für 18 h auf einem rotierenden Schüttler angezogen. Das Kulturmedium wurde durch Zentrifugation gewonnen, gefriergetrocknet und in Wasser auf das 10-fache der Ursprungskonzentration rekonstituiert. 1 ml Portionen wurden auf die Superose 12-Säule aufgetragen und in Wasser mit 0,2 ml/min unter Sammeln von 0,8 ml-Fraktionen eluiert. Die Fraktionen 10–15 wurden vereinigt und gefriergetrocknet. 45 ml vereinigte Fraktionen ergaben 5,5 mg Trockengewicht des Materials als weißes Pulver, entsprechend 58,7 mg/l Medium. Dieses Material wurde einer Vielzahl von Analysen unterworfen.
Beispiel 6.1: Physikalische Analyse
Negative Elektrospraymassenspektrometrie
Die Position der Elution des Antigens von der Superose 12 Gelpermeationssäule in den Fraktionen 10–15 unmittelbar nach dem Leervolumen (Fraktion 9) legt es nahe, dass das Material ein hohes Molekulargewicht aufwies (abgeschätzt als > 100.000 Daltons aus der Elution von Standardproteinmarkern). Obwohl konventionelle Massenspektrometrie nur die Analyse von Molekülen mit Ladung zu Masse Verhältnissen bis zu 1600 erlaubt, ermöglicht das Vorliegen einer Anzahl von negativen Ladungen (die vorliegen würden, falls das Material LTA wäre) die Analyse von Molekülen mit höherem Molekulargewicht. Die Elektrospray-Technik bricht die Moleküle nicht in Fragmente auf, sondern detektiert die relative Häufigkeit von Molekülen mit verschiedenen Massen/Ladungs-verhältnissen.
Dementsprechend wurden 1 mg des gereinigten Antigens einer negativen Elektrospray-MS unter Verwendung eines Hewlett Packard MS-Instruments (Modell 5989B) mit einer Hewlett Packard-Elektrosprayzusatzeinheit (Modell 59987A), die mit 10 μl Probe pro min arbeitet, unterworfen. Die Probe (etwa 0,1 mg) wurde in 2 ml Methanol/Wasser (95/5 Volumen/Volumen) mit 50 μl Ammoniak (0,88 s. g.) gelöst. Das Massenspektrum ist im unteren Rahmen der 6A gezeigt, in dem die x-Achse das Masse/negative Ladungsverhältnis (m/z) des Fragments zeigt und die y-Achse die Häufigkeit. Starke Peaks wurden bei m/z-Werten von 804 und 1206 detektiert.
Da der Unterschied zwischen diesen Fragmenten (402) jeweils ein exakter Teiler war, konnte das Spektrum einer Dekonvolution unterzogen werden, um ein genaues und unzweideutliches Molekulargewicht von 2415,16 atomaren Masseneinheiten zu ergeben (6A oberer Rahmen). Darüber hinaus müssen diese Fragmente, da große Fragmente von m/z 804 und 1206 detektiert wurden, negative Ladungen von –3 bzw. –2 tragen und das intakte Molekül hat eine Gesamtladung von –6. Diese genaue Bestimmung von sowohl der Molekularmasse als auch der gesamten negativen Ladung des Antigens war für seine strukturelle Bestimmung zentral. Dadurch wurde gezeigt, dass, falls das Antigen ein Molekül mit einer im Vergleich zu konventionellem Staph. aureus LTA analogen Struktur wäre, die Glycerinphosphat-Kettenlänge sehr viel kürzer sein müsste (d. h. insgesamt 6 Phosphateinheiten, jede mit einer negativen Ladung).
Anschließend wurde eine identische Analyse mit Antigen durchgeführt, das aus Kulturen der Stämme Nr. 3 und 4 hergestellt war, und im wesentlichen wurden identische Ergebnisse erzielt (6B und 6C).
³¹P und ¹H-NMR-Spektren
Gereinigtes Material wurde für die NMR-Analyse unter Verwendung eines 250 MHz Bruker-Instruments, das bei 20°C arbeitet, bereit gestellt. Das ³¹P-Spektrum wurde unter Verwendung von 2 mg Material in D₂O gelöst erhalten. Der chemische Shift des Phosphors wurde als parts per million (ppm), relativ zu einer internen Referenz von 80% Phosphorsäure gemessen (Daten der Kürze wegen nicht gezeigt).
Zwei Hauptsignale bei 6,33 und 3,01 ppm waren zusammen mit einer Anzahl kleiner Maxima sichtbar. Das Spektrum bestätigt das Vorliegen von Phosphor in dem Material und zeigt, dass Phosphoratome in einer Anzahl von verschiedenen magnetischen Umgebungen vorlagen. Ähnliche Ergebnisse sind für ³¹P-Spektrum von LTA aus einer Reihe von Organismen errichtet worden (Batley et al. 1987 Biochim. Biophys. Acta 901, 127–137). Es wird angenommen, dass die Aufsplittung der Maxima eine hohe Flexibilität in den Glycerinphosphatketten anzeigt und nicht unbedingt unterschiedliche chemische Bindungen der Phosphate. Eine Erklärung ist die Variation in den Substituenten an der 2-Position der Glycerineinheiten in der Poly(glycerinphosphat)-Kette, wobei Phosphatester an unsubstituierten Glycerinen ein Signal bei höherem ppm ergeben als Phosphat an Glycerineinheiten, die Alaninsubstituenten tragen.
Das ¹H-NMR-Spektrum wurde unter Verwendung von 2 mg Material erhalten, das in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst war. Der chemische Shift des Signals in ppm wurde in Relation zum DMSO-Signal bei 2,5 ppm gemessen (Daten der Kürze wegen nicht gezeigt).
Die bei 0,8 und 1,21 ppm erhaltenen Signale stammten typischerweise aus aliphatischen Protonen CH₃ und (CH₂)_n, die in Methylenketten vorliegen und denen ähnlich sind, die für Fettsäureketten der Glycolipideinheit von LTA beschrieben wurden (Batley et al. 1987, oben zitiert). Auf den Glycerineinheiten von LTA vorliegende Protonen würden in der Region 3,94–4,12 erscheinen. Unglücklicherweise enthielt dieser Bereich große Maxima bei 3,459 ppm von enthaltenem Wasser und bei 2,489 ppm von DMSO.
Beispiel 6.2: Chemische Analyse
Die Daten des Massenspektrums und der NMR des Antigens aus Stamm 1 legten eine LTA-Struktur nahe, die der von Staph. aureus anlog ist, aber mit einer wesentlich kürzeren Glycerinphosphatkettenlänge. Die chemische Analyse des Materials wurde unternommen, um das Vorliegen der strukturellen Komponente (d. h. Fettsäure, Glucose, Glycerin und Phosphat) zu bestätigen und um das Verhältnis jeder Komponente zu bestimmen.
Fettsäuren
Der Fettsäuregehalt wurde durch alkalische Methanolyse und Gas-Flüssig-Chromatographie (GC) bestimmt. 1 mg Material wurde in 1 ml 3,8 M NaOH in 50%igem wässrigen Methanol in einem Hydrolyseröhrchen aus Glas suspendiert. Das Röhrchen wird versiegelt und bei 100°C für 30 min inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Alle freigesetzten Fettsäuren wurden durch Zugabe von 6 ml 6 M HCl/Methanol (1 : 1) und Erhitzen auf 80°C für 10 min in die entsprechenden Fettsäuremethylester (FAMEs) überführt. Die FAMEs wurden mit 1 ml Hexan/Diethylether (1 : 1) extrahiert. Die obere Lösungsmittelschicht wurde entfernt und in ein Glasröhrchen überführt, das 3 ml 0,3 M NaOH enthielt. Nach Mischen durch wiederholte Inversion wurde die organische Phase gewonnen und in ein 2 ml Glasprobenröhrchen überführt. Das Lösungsmittel wurde durch Passage von Stickstoffgas in das Röhrchen bei Raumtemperatur bis zur Trockne abgezogen.
Zur quantitativen Analyse durch GC wurde die Probe in 100 μl Hexan gelöst und 1 μl wurde auf eine Hewlett Packard HP-1-Kapillarsäule (vernetztes Methylsilicongummi (ID 0,32 mm, Filmdicke 0,17 μm, Länge 25 m) auf einem Unicam 610 Serie GC, aufgeladen, das mit 1 : 50 Probenaufsplittung und einem Flammenionisationsdetektor arbeitet. Die Säulentemperatur wurde so programmiert, dass 150°C für 4 min gehalten wurden und dann die Temperatur bis auf 250°C um 4°C pro min erhöht wurde und dann für 2 min bei dieser Temperatur gehalten wurde. Die Gasphase umfasste Helium bei 6,5 psi mit Stickstoff als Makeup-Gas. Der Flammionisationsdetektor verwendete Wasserstoff und Luft, die Injektortemperatur wurde auf 200°C gesetzt und die Detektortemperatur wurde auf 280°C gesetzt. Die Fettsäuren wurden identifiziert und quantitativ abgeschätzt, indem mit dem Profil verglichen wurde, das für 1 μl eines bakteriellen Standard-FAME-Mixes erhalten wurde, das 26 bakterielle FAMEs (Matreya Inc.), verdünnt in Hexan auf eine Konzentration von 5 μg/μl, enthielt. Die Integrationswerte wurden für jedes Maximum berechnet und die Gesamtmenge der Fettsäure in der Originalprobe wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9: Fettsäurezusammensetzung des gereinigten Antigens aus dem Stamm 1, angezogen in HHW
Die Gesamtmenge der in dem Antigen vorliegenden Fettsäuren betrug 35,9 μg/mg. Die Fettsäureanalyse des Gesamtzellpellets aus Stamm 1, der in HHW angezogen war, ergab ein ähnliches Profil, im Vergleich zu dem von gereinigtem Antigen, wodurch gezeigt wird, dass die Fettsäuren typisch für die Gesamtlipide des Organismus sind und gegenüber den für Staph. epidermidis (Behme et al. 1996 J. Clin. Micro. 34, 3075–3084) beschriebenen sehr ähnlich sind.
Saure Hydrolyse des Antigens für die Analyse des Hexose-, Phosphat- und Glyceringehalts
Eine 2,4 mg Probe des gereinigten Antigens wurde in 0,3 ml 2 M Trifluoressigsäure (TFA) gelöst, das Röhrchen wurde versiegelt und auf 100°C für 18 h erhitzt. Bei erstmaligen Zusätzen des TFAs bildet sich ein weißes Präzipitat. Nach Hydrolyse wurde das TFA durch wiederholtes Trocknen unter Vakuum nach Zugabe von Wasser entfernt. Die Hydrolyseprodukte wurden dann in 0,24 ml Wasser gelöst, um ein Konzentrationsäquivalent von 10 mg/ml des Originalantigens zu ergeben. Die Proben dieses TFA-Hydrolysats wurden verschiedenen Analysen unterworfen, um die Art der vorliegenden Hexose zu bestimmen (als Alditolacetat durch GC) und die relativen Mengen an Hexose, Phosphat und Glycerin durch quantitative colorimetrische Assays. Ein leeres Hydrolyseröhrchen wurde mit TFA in der gleichen Weise behandelt wie die Probe, und dieses wurde in allen Assays als Kontrolle verwendet (Hydrolyseleerwert).
Überführung von Hexosen in Alditolacetate und Analyse durch GC
Die Überführung von Hexosen in dem TFA-Hydrolysat in Alditolacetate und deren Identifizierung durch GC wurde durchgeführt, um zu bestimmen, welche Zucker vorlagen (Takayama & Kilburn 1989 Antimicrobial Agents and Chemotherapy 33, 1493–1499). Das Verfahren ergab aufgrund der Verluste bei Konversion und Wiedergewinnung der Alditolacetate keine exakten Abschätzungen. 0,1 ml des TFA-Hydrolysats (äquivalent zu 1 mg Antigen) wurden in ein Glasröhrchen mit 50 μl 3 M NH₄OH eingefüllt. 3 mg Natriumborhydrid wurden zugesetzt und man ließ die Lösung bei 22°C für 18 h im Dunklen. 1 Tropfen Eisessig wurde zugesetzt, um den Überschuss von Borhydrid zu zersetzen. Das Borat wurde durch Zugabe von Methanol (0,5 ml) in das Methylderivat überführt und durch Rotationsverdampfung bei 50°C zur Trockne abgezogen. Es wurde eine weitere Methanolmenge zugesetzt (0,5 ml) und die Probe wurde erneut bis zur Trockenheit abgezogen. Essigsäureanhydrid (0,1 ml) wurde dann der trockenen Alditolprobe zugesetzt, das Röhrchen wurde versiegelt und im Autoklaven bei 121°C für 3 h erhitzt. Das überschüssige Essigsäureanhydrid wurde durch Zugabe von Wasser (0,4 ml) zerstört und die Alditolacetate wurden durch Passage durch eine Sep-Pak C18-Patrone (Waters Associates Inc.) gereinigt. Die Patrone wurde durch Waschen mit Acetonitril (2 ml), gefolgt von Wasser (1 ml), vorbereitet. Die Probe wurde auf die Patrone aufgeladen, mit 10% Acetonitril (2 ml) gewaschen und in 40% Acetonitril (2 ml) eluiert. Die eluierten Alditolacetat wurden bis zur Trockne einer Rotationsverdampfung unterzogen, in Chloroform (0,10 ml) gelöst und durch GC analysiert.
Es wurde 1 μl auf eine Supelco SP-2380 Kapillarsäule (ID 0,25 mm, Filmdicke 0,2 μm, Länge 30 m) auf einem Unicam 610 Serie GC aufgeladen; der mit einer 1 : 100 Probenaufsplittung und einem Flammionisationsdetektor arbeitet. Die Säulentemperatur wurde bei 250°C gehalten. Die Gasphase umfasste Helium bei 6,5 psi mit Stickstoff als Makeup-Gas (Flussrate 25,05 cm/s). Der Flammionisationsdetektor verwendete Wasserstoff und Luft, die Injektortemperatur wurde auf 200°C gesetzt und die Detektortemperatur wurde auf 280°C gesetzt. Eine Mischung (1 μl) der Alditolacetate von Mannitol, Galactitol, Glucitol und Insositol (Supelco, 5 mg/ml, gesamt in Chloroform) wurde als Standard verwendet und ergab Retentionszeiten von 7,91, 8,66, 9,38 bzw. 10,37. Die Probe ergab ein Hauptmaximum bei der Retentionszeit 9,383 min, das als Glucitol identifiziert wurde. Zusätzlich wurden neun kleinere Maxima auf dem Chromatogramm detektiert. Es wurde jedoch ein identisches Muster dieser Nebenmaxima (aber ohne das Glucitolacetat-Maxima bei 9,38 min) durch Analyse des Hydrolyseleerwertes erhalten, der auf die gleiche Art der Alditolacetatpräparation verarbeitet worden war. Es wurde daher angenommen, dass das Antigen Glucose als Haupthexosekomponente enthält, eine quantitative Abschätzung wurde jedoch als ungenau betrachtet.
Hexoseabschätzung durch Phenolschwefelsäure-Assay
Der Assay der Gesamthexose in dem TFA-Hydrolysat wurde unter Verwendung des Phenolschwefelsäurereagenzes (Dubois et al. 1956, oben zitiert) durchgeführt. Die gemessenen Volumina einer Standardglucoselösung (1 μg/μl) wurden in Glasröhrchen gefüllt, um einen Bereich von 0 bis 50 μg Glucose pro Röhrchen zu ergeben, woraufhin die Volumina mit Wasser auf 0,2 ml eingestellt wurden. 10 μl und 20 μl Proben des TFA-Hydrolysats und des Leerwerthydrolysats wurden in separate Röhrchen eingefüllt und die Volumina wurden mit Wasser auf 0,2 ml eingestellt. 50 μl einer 8% Gew./Vol. wässrigen Phenollösung wurden jedem Röhrchen zugesetzt, gefolgt von 0,5 ml konzentrierte Schwefelsäure. Man ließ die Röhrchen für 10 min stehen und transferierte sie dann in ein Wasserbad bei 30°C für 20 min. Die Extinktion wurde dann bei 492 nm gemessen und die Menge der Hexose (als Glucose), die in der Probe vorliegt, wurde aus der Standardglucose-Kalibrierungskurve berechnet. 20 μl des TFA-Probenhydrolysats enthielten 16,7 μg Glucose, äquivalent zu 83,5 μg Glucose pro mg Antigen.
Phosphorassay
In dem Proben-TFA-Hydrolysat vorliegender Phosphor wurde als Phosphat nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Freisetzung des Phosphats von den verbleibenden Glycerinphosphatenresten gemessen (Ames 1966 Methods in Enzymology 8, 115–118). 0,1 ml Proben des TFA-Hydrolysats und des Hydrolyseleerwertes wurden mit 10 μl einer wässrigen Lösung (1 mg/ml) alkalischer Phosphatase (Kälberdarmphosphomonoesterase, Sigma) für 2 h bei Raumtemperatur behandelt. 5 μl und 10 μl Proben wurden dann in Glasröhrchen gefüllt, wobei getrennte Röhrchen 1 μl bis 5 μg Phosphor aus einer Standardlösung enthielten, die 10 μg/ml Phosphor enthielt (hergestellt durch Einstellen einer Stammlösung von 87,8 mg KH₂PO₄ in 100 ml Wasser und Verdünnen von 5 ml dieser Lösung auf 100 ml mit Wasser). Das Farbreagenz wurde durch Mischen von 3 M Schwefelsäure (10 ml) mit 2,5% Gew./Vol. Ammoniummolybdat (10 ml) und Zugabe von 1 g Ascorbinsäure hergestellt. 1 ml des Farbreagenzes wurden jedem Röhrchen zugesetzt, und es wurde für 1,5 h bei 37°C inkubiert. Die Extinktion wurde bei 750 nm abgelesen und der Gesamtphosphorgehalt der Probe wurde aus der Standardkurve berechnet. 10 μl TFA-Hydrolysat enthielten 3 μg Phosphor, äquivalent zu 30 μg Phosphor pro mg Antigen.
Glycerinassay
Der Glyceringehalt des TFA-Hydrolysats wurde durch Periodatoxidation und Messung des Formaldehyds, freigesetzt mit Chromotropsäure (Ames 1966, wie oben zitiert) bestimmt. 0,1 ml Glycerinstandard, enthaltend 2 μg bis 20 μg Glycerin, 10 μl TFA-Hydrolysat oder Leerwerthydrolysat wurden in separate Glasröhrchen gegeben. 20 μl konzentrierte Schwefelsäure wurden zugegeben, gefolgt von 20 μl 0,1 M wässrigem Natriumperiodat. Man ließ die Röhrchen bei Raumtemperatur 5 min stehen. 20 μl 10% Gew./Vol. wässriges Natriumbisulfit wurden zugesetzt, gefolgt von 0,5 ml Chromotropsäurelösung (enthaltend 0,1 g Chromotropsäure in 10 ml Wasser und 45 ml konzentrierter Schwefelsäure). Die Röhrchen wurden für 30 min auf 100°C erhitzt, abgekühlt, und es wurden 50 μl gesättigte wässrige Thioharnstofflösung zugesetzt. Die Extinktion wurde dann bei 570 nm gemessen. Die Menge an Glycerin in dem TFA-Hydrolysat wurde aus der Standardkurve berechnet. 10 μl TFA-Hydrolysat enthielten 6,4 μg Glycerin, äquivalent mit 67 μg Glycerin per mg Antigen.
Verhältnis der Bestandteile des Antigens
Die Kombination der Ergebnisse der chemischen Analysen ergab die folgenden Verhältnisse:
Dies wiederum legt ein molares Verhältnis nahe von:
5 Glycerineinheiten : 7 Phosphor (als Phosphat) : 2 Fettsäuren : 3 Glucose
Trotz der bei der Analyse wahrscheinlichen Fehler (die als +/–10% in Bezug auf Volumen- und Gewichtsmessungen abgeschätzt werden) und dem möglichen Verlust von Material während der TFA-Hydrolyse, legen diese Ergebnisse das Vorliegen eines Kurzketten-LTA-Moleküls, das ein Glycolipid (z. B. Diacylgentiobiosylglycerin) mit einer Glycerinphosphat-Kettenlänge von sechs Einheiten (analog dem konventionellen Langketten-LTA) in dem Antigen in starker Weise nahe. Die chemische Analyse erfasst nicht das gesamte in dem Antigen auf einer Gewichtsbasis vorliegende Material. Dies liegt teilweise an Verlusten während der Hydrolyse, aber auch an dem Vorliegen anderer Komponenten des LTAs, die nicht analysiert wurden (z. B. Alanylester oder N-Acetylglucosaminsubstituenten auf der Glycerinphosphatkette). Das negative Elektrospray-Massenspektrum ergab eine genaue Masse von 2415 mit sechs negativen Ladungen. Die Molekularmasse, basierend auf der chemischen Analyse, würde 1892 betragen:
Tabelle 10
Daher müssen zusätzliche Masseneinheiten von 723 (2415–1892) gefunden werden, um das Molekulargewicht von 2415 zu ergeben. Die wahrscheinlichsten Kandidatenkomponenten, die noch nicht analysiert worden sind (N-Acetylglucosamin und D-Alanin) weisen Massen von 203 bzw. 61 auf. Mit sechs potenziellen Glycerineinheiten, die für die Substitution zur Verfügung stehen, könnte eine Kombination dieser zusätzlichen Komponenten für das zusätzliche Molekulargewicht verantwortlich sein. Das Verhalten des Antigens als Spezies hohen Molekulargewichts auf der Gelpermeationschromatographie wird durch die Bildung von Micellen bei einer Konzentration über 5 μM erklärt (Wicken et al. 1986, J. Bact. 166, 72–77).
Beispiel 7: Optimiertes ELISA-Protokoll
Die Erfinder haben ein standardisiertes Protokoll zur Herstellung des BHI7-Antigens erstellt und ein schnelles optimiertes ELISA-Protokoll für die serodiagnostische Detektion von Gram+ven Infektionen. Die Details dieser Protokolle sind unten erläutert.
Protokoll zur Herstellung des Antigens:
Die 7 Stämme von Staphylococcus epidermidis und verwandte Organismen werden auf getrennten Brain-Heart-Infusionsplatten (Oxoid) erhalten. Diese werden bei 4°C gelagert, wobei sie in 4-wöchigen Intervallen auf frische Platten subkultiviert werden. die Platten werden auf die Reinheit der Kultur getestet, indem das Aussehen der Kolonien und die Gram-Färbung nach jeder Subkultur geprüft werden.

1. Präpariere separate Startkulturen für jeden Stamm durch Inokulierung von 2–3 Kolonien der jeweiligen Erhaltungsplatten in 20 ml Brain-Heart-Infusionsbrühe (Oxoid) in 100 ml konischen Kolben. Inkubiere die Kulturbrühen für 18 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler (200 U/min).
2. Inokuliere 1 ml jeder Startkultur in separate 500 ml konische Kolben, die 200 ml Brain-Heart-Infusion enthalten (verwende für jeden Stamm einen separaten Kulturkolben). Inkubiere die Kolben für 18 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler (200 U/min).
3. Prüfe jede Kultur auf Reinheit, indem auf Brain-Heart-Infusionsplatten ausgestrichen wird, bei 37°C für 18 h inkubiert wird, das Aussehen der Kolonien überprüft und typische Kolonien einer Gram-Färbung unterzogen werden. [Die Ergebnisse dieses Tests auf Kulturreinheit sind verfügbar, während die folgenden Phasen im Ablauf sind. Die Charge an gereinigtem Antigen sollte nur dann weiter verwendet werden, wenn ale Kulturen rein sind.]
4. Zentrifuge jede der 200 ml-Kulturen (10.000 g, 10 min) und vereinige die Überstände (1400 ml Gesamtvolumen). Gefriere den vereinigten Überstand in einem geeigneten Gefäß zur Gefriertrocknung (z. B. 100 ml-Portionen in 500 ml-Kolben) und entferne das Wasser durch Gefriertrocknen. Diese Phase kann in verschiedenen Chargen durchgeführt werden, abhängig von der Kapazität des Gerätes zum Gefriertrocknen. Die Chargen des gefrorenen vereinigten Kulturmediums können vor der Gefriertrocknung bei –20°C gelagert werden.
5. Löse das gefriergetrocknete Material auf 1/10 des ursprünglichen Volumens in Wasser (z. B. 10 ml für jede 100 ml des vereinigten Kulturmediums). Lagere dieses konzentrierte vereinigte Kulturmedium in separaten 1,5 ml Portionen (z. B. 1,5 ml konisches Kunststoff Eppendorf-Röhrchen) vor der darauffolgenden Gelpermeationsphase bei –20°C.
6. Taue ein Eppendorf-Röhrchen des gefrorenen konzentrierten Kulturmediums auf, erwärme es auf 20°C, um so viel unlösliches Material wie möglich zu lösen, zentrifugiere in einem Kunststoffröhrchen für 2 min bei 13.500 g in einer Mikrofuge, um alles verbleibende unlösliche Material abzulagern.
7. Bringe 1 ml der Überstandsflüssigkeit auf eine Superose 12-vorgepackte HR 10/30 FPLC-Säule (Pharmacia) auf, die mit Wasser equilibriert ist. Eluiere mit Wasser bei 0,4 ml/min, wobei 50 Fraktionen von jeweils 0,8 ml gesammelt werden. Vereinige die Fraktionen von einschließlich 10 bis einschließlich 15 und lagere sie bei –20°C, bis sie zum Beschichten der ELISA-Platten benötigt werden. 1 ml dieses gereinigten Materials ist genug, um 10 separate 96-Napf ELISA-Platten zu beschichten. Es sollte in geeigneten Volumina (z. B. 1 ml) in gefrorener Form gelagert werden, je nachdem, welche Anzahl von Platten pro Charge beschichtet werden soll.

Protokoll für die Beschichtung und das Blocken der ELISA-Platten

1. Taue ein Röhrchen mit gefrorenem gereinigten Antigen aus Phase 7 des Antigenpräparationsprotokolls auf (z. B. 1 ml) und verdünne es mit 100 Volumen (z. B. 100 ml) Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer (0,05 M, pH 9,6). Bringe 0,1 ml dieses verdünnten Antigens in jeden Napf der 96-Naph-Polystyrol-Mikrotiterplatten (Immulon 2, Dynatech) und lasse sie mit einer Lage Aluminiumfolie abgedeckt bei 4°C für 18 h stehen.
2. Entferne das Antigen aus den Näpfen durch schnelles Umdrehen und Schütteln der Platte über einem Abfluss. Klopfe die leere umgedrehte Platte vorsichtig auf einer Lage trockener Papiertücher aus, um alle Spuren der Flüssigkeit zu entfernen. Bringe die Platte wieder in die korrekte Orientierung und tauche die gesamte Platte in einen geeigneten Container ein, der mit TBS-Tweenlösung gefüllt ist (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,9% Gew./Vol., 0,3% Vol./Vol. Tween 20). Entferne die Platte aus dem Container, wobei sicherzustellen ist, dass jeder Napf vollständig mit Lösung gefüllt ist. Entferne die TBS-Tweenlösung sofort durch Umdrehen der Platte über dem Abfluss und wiederhole das Verfahren des Füllens der Näpfe mit TBS-Tween durch Eintauchen in den Container für weitere drei Mal, um alle Spuren des verbleibenden ungebundenen Antigens zu entfernen. Decke die gefüllten Platten mit Aluminiumfolie ab und lasse sie 1 h bei 4°C stehen.
3. Entferne die TBS-Tweenlösung aus den Näpfen, indem die Platte umgedreht wird und die leere umgedrehte Platte vorsichtig auf einer Lage trockener Papiertücher ausgeklopft wird, um alle Spuren der Flüssigkeit zu entfernen. Versiegle die Antigen-beschichteten geblockten Platten in einer markierten Polyethylentasche und lagere sie bei –20°C, bis sie für einen Assay benötigt werden.

Protokoll für ELISA:

1. Entferne eine beschichtete geblockte ELISA-Platte aus dem Gefrierschrank (Phase 3 des Protokolls zum Beschichten und Blocken der Platten) und lasse sie Raumtemperatur erreichen.
2. Stelle 1 : 6400-Verdünnungen der Positiv- und Negativkontrollseren und jedes zu testenden Patientenserums in TBS-Tweenlösung (0,01 M Tris-HCl pH 7,4, NaCl 0,9% Gew./Vol., 0,3% Vol./Vol. Tween 20) her.
3. Fülle 0,1 ml der verdünnten Seren (zweifach) in die Näpfe der ELISA-Platte.
4. Decke die Platte mit einer Aluminiumfolie ab und lasse sie für 2 h bei 37°C stehen.
5. Entferne die Serumverdünnungen der Näpfe durch schnelles Umdrehen und Ausschütteln der Platte über einem Abfluss. Klopfe die leere umgedrehte Platte vorsichtig auf einer Lage trockener Papiertücher aus, um alle Spuren der Flüssigkeit zu entfernen. Bringe die Platte wieder die korrekte Orientierung und tauche die gesamte Platte in einen geeigneten Container ein, der mit TBS-Tweenlösung gefüllt ist (0,01 M Tris-HCL pH 7,4, NaCl 0,9% Gew./Vol., 0,3% Vol./Vol. Tween-20). Entferne die Platte aus dem Container, wobei sicherzustellen ist, dass jeder Napf komplett mit Lösung gefüllt ist. Entferne die TBS-Tweenlösung sofort durch Umdrehen der Platte über dem Abfluss und wiederhole das Verfahren des Füllens der Näpfe mit TBS-Tween durch Umdrehen in dem Container für weitere drei Mal, um alle Spuren des verbleibenden ungebundenen Antigens zu entfernen. Klopfe die leere umgedrehte Platte vorsichtig auf eine Lage trockener Papiertücher aus, um alle Spuren der Flüssigkeit zu entfernen. [Dieses manuelle Verfahren zum Waschen der Platte kann durch ein geeignetes Waschprotokoll unter Verwendung eines automatisierten Plattenwaschers mit TBS-Tweenlösung ersetzt werden.]
6. Stelle eine Lösung des ausgewählten Konjugatreagenz in TBS-Tween her: entweder 0,5 μg/ml Protein A-Meerrettichperoxidasekonjugat (Sigma) oder Ziege-Antihuman-IgG-Peroxidase (Sigma) mit der vom Hersteller für ELISA empfohlenen Verdünnung.
7. Fülle 0,1 ml der ausgewählten verdünnten Konjugatlösung in alle Näpfe der Platte. Decke mit Aluminiumfolie ab und lasse für 30 min (Protein A-Peroxidase) oder 1 h (Antihuman-IgG-Peroxidase) bei 37°C stehen.
8. Entferne die Konjugatlösung aus den Näpfen der Platte und wasche mit TBS-Tweenlösung, wie in 5) oben beschrieben.
9. Stelle eine Lösung des chromogenen Peroxidasesubstrats durch Lösen von 10 mg 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Sigma) in 1 ml Dimethylsulfoxid her und verdünne mit 100 ml Natriumacetat/Citratpuffer (0,1 M, pH 6,0), enthaltend 10 μl H₂O₂ (20% Vol./Vol.). Es ist sicherzustellen, dass die Lösung 37°C aufweist. Fülle 0,1 ml dieser Lösung in jeden Napf der Platte. Man lässt die blaue Farbe für 25 min entwickeln und dann wird die Reaktion unter Zugabe von 100 μl Schwefelsäure (1 M) in jeden Napf gestoppt. Dies erzeugt eine stabile gelbe Lösung, die innerhalb von 1 h durch einen Plattenleser ausgemessen werden sollte.
10. Messe die Extinktion des gelb-gefärbten Produktes in jedem Napf bei 450 nm mit einem geeigneten Plattenleser (z. B. Anthis 2001, Anthos Labtec Instruments).
11. Subtrahiere den mittleren Extinktionswert der Negativkontrolle von dem der Positivkontrolle für jede der Testproben. Berechne das Verhältnis der Extinktionen für jede Testprobe im Vergleich zu der der Positivkontrolle (die einen mit 100.000 definierten Titer aufweist) und multipliziere das Verhältnis mit 100.000. Dies gibt den standardisierten Titer für jede Probe.

Es wurde gefunden, dass eine Serumverdünnung von 1 : 6400 eine gute Unterscheidung zwischen Seren von infizierten und nicht-infizierten Patienten ermöglicht (im Falle der Endocarditis oder CVC-Sepsis). Eine ähnliche Verdünnung sollte auch zum Testen von Seren aus Patienten geeignet sein, die einen prosthetischen Hüftersatz haben, obwohl leichte Variationen (z. B. +/–10–15%) im Verdünnungsfaktor erwünscht sein können, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
Die Verwendung einer einzelnen Verdünnung vermeidet die Notwendigkeit von seriellen Serumverdünnungen über die ELISA-Platte. Dies führt zu einer wesentlich schnelleren Durchführbarkeit des optimierten ELISAs und ermöglicht es, dass mehr Seren auf einer Einzel-ELISA-Platte getestet werden können.
Als eine Alternative zu der oben beschriebenen Titerberechnung kann es wünschenswert sein, den O. D. der Testseren mit einer Kalibrierungskurve des O. D. zu vergleichen, die durch bekannte Verdünnungen eines Positivkontrollserums erhalten wurde.
Das oben beschriebene optimierte ELISA-Protokoll wurde zum Testen von Seren aus Patienten mit CVC-Sepsis oder von Seren aus der Kontrollgruppe von Patienten verwendet. Die Daten sind in dem Streugraph in 7 gezeigt. Die Ergebnisse sind sehr klar. Der mittlere Titer für Positivseren (n = 40) war 10.429, während der für Kontrollseren (n = 40) 865 betrug (p < 0,0001). Es ist festzuhalten, dass vier Kontrollseren hohe Titer aufwiesen. Dies lag vermutlich daran, dass eine geringfügige, nicht diagnostizierte Gram-positive Infektion (z. B. eine lokale Hautinfektion) vorlag oder daran, dass eine zurückliegende, nicht entdeckte Exposition gegenüber Gram-positiven Organismen stattgefunden hatte. Die niedrigen Titer in einigen der Testseren können vermutlich durch die Gesundheit der Individuen erklärt werden, von denen viele ein geschwächtes Immunsystem aufwiesen oder immunosupprimiert waren, infolge ihres Zustandes oder ihrer Behandlung.

Claims

Isolierte Verbindung mit der Struktur
wobei n eine ganze Zahl von einschließlich 3 bis einschließlich 10 ist und X H, OH, Alkyl, Aryl, Amyl oder ein Aminosäurerest ist, fakultativ substituiert, oder ein Zuckerrest, fakultativ substituiert, und wobei R und R¹ hydrophobe Kohlenwasserstoff- oder Fettsäureketten sind und wobei R gleich R¹ oder dazu unterschiedlich sein kann, und wobei der Wert von n in einer einzelnen Probe eine einzelne ganze Zahl ist, wobei die Verbindung nicht eine Verbindung ist, in der n 3 und X OH ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei n = 6 ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei X = H, OH, D-Alanyl oder N-Acetylglucosamin ist.
Zusammensetzung, in der in Bezug auf die vorliegenden bakteriellen Komponenten mindestens 50 Gew.-% von einer Verbindung mit der Struktur
umfaßt wird, wobei n eine ganze Zahl von einschließlich 3 bis einschließlich 10 ist und X H, OH, Alkyl, Aryl, Amyl oder ein Aminosäurerest ist, fakultativ substituiert, oder ein Zuckerrest, fakultativ substituiert, und wobei R und R¹ hydrophobe Kohlenwasserstoff- oder Fettsäureketten sind und wobei R gleich R¹ oder dazu unterschiedlich sein kann, wobei die Verbindung nicht eine Verbindung ist, in der n 3 und X OH ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 in Form eines gefriergetrockneten Feststoffes, einer wäßrigen Lösung oder immobilisiert auf einem festen Träger.
Verfahren zum Testen auf eine Infektion durch Gram positive Bakterien in einem Säugetier, typischerweise in einem menschlichen Individuum, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: in Kontakt bringen einer Probe einer Körperflüssigkeit aus dem Individuum mit einer Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung mit der Struktur
wobei n eine ganze Zahl von einschließlich 3 bis einschließlich 10 ist und X H, OH, Alkyl, Aryl, Amyl oder ein Aminosäurerest ist, fakultativ substituiert, oder ein Zuckerrest, fakultativ substituiert, und wobei R und R¹ hydrophobe Kohlenwasserstoff- oder Fettsäureketten sind, wobei R gleich R¹ oder dazu unterschiedlich sein kann; und Nachweisen der Bindung von Antikörpern, falls vorhanden, in der Probe an die Zusammensetzung.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Probe der Körperflüssigkeit, die von dem Individuum erhalten wurde, Vollblut, Serum, Urin oder Speichel umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, umfassend den Nachweis der Bindung von IgG-Antikörpern in der Probe an die Zusammensetzung.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6, 7 oder 8, wobei das Testverfahren die Durchführung eines enzymgebundenen immunosorbenten Assays (ELISA), einen Radioimmunoassay (RIA) oder einen Western-Blot umfaßt.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 9 zum Testen auf eine Infektion, die von Gram positiven Kokken verursacht wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 10 zum Testen auf eine Infektion, die von einem Streptokokkus, einem Staphylokokkus oder einem Enterokokkus verursacht wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 11 zur Diagnose des Vorliegens einer Gram positiven Infektion, die mit einem zentralen venösen Katheter, einem cerebrospinalen Flüssigkeitsnebenschluß oder einer prothetischen Vorrichtung verbunden ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 12, wobei die Zusammensetzung eine solche gemäß Anspruch 4 oder 5 ist.
Diagnostischer Testkit zur Diagnose auf das Vorliegen einer Gram positiven Infektion in einem Säugetierindividuum, wobei der Kit umfaßt: einen festen Träger zum Durchführen eines diagnostischen Tests und eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 oder 5.
Kit gemäß Anspruch 14, der darüber hinaus eines oder mehrere der folgenden umfaßt: markierter Antikörper; Enzymsubstrat; Kontrollprobe; Puffer und Gebrauchsanweisung.
Sterile Impfzusammensetzung zur Verwendung gegen eine Gram positive Infektion in einem Säugetierindividuum, wobei der Impfstoff eine isolierte Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt oder eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 oder 5.
Isoliertes Immunoglobulinmolekül oder eine Variante davon, die spezifisch an eine Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 bindet.
Isolierte eukaryotische Zelle, die ein Immunoglobulinmolekül oder eine Variante davon gemäß Anspruch 17 produziert.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: Kultivierung eines Gram positiven Bakteriums in einem Wachstumsmedium, um die Sekretion einer Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 durch das Bakterium in das Wachstumsmedium hervorzurufen; Separieren des Wachstumsmediums von den bakteriellen Zellen; Fraktionierung des Wachstumsmediums und Isolieren der Fraktion, die, in im wesentlichen reiner Form, die Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
Staphylokokkus epidermis-Stamm CAN 6KIII, hinterlegt unter der Zugangsnummer NCIMB 40896.
Staphylokokkus epidermis-Stamm HAR 6KIV, hinterlegt unter der Zugangsnummer NCIMB 40945.
Staphylokokkus epidermis-Stamm COS 6KV, hinterlegt unter der Zugangsnummer NCIMB 40946.
Staphylokokkus epidermis-Stamm MIL 6LI, hinterlegt unter der Zugangsnummer NCIMB 40947.
Staphylokokkus epidermis-Stamm HED 6LI, hinterlegt unter der Zugangsnummer NCIMB 40948.
Staphylokokkus haemolyticus-Stamm ONE 6KVI, hinterlegt unter der Zugangsnummer NCIMB 40949.
Microkokkus kristinae-Stamm MAT 6LII, hinterlegt unter der Zugangsnummer NCIMB 40950.
Verfahren gemäß Anspruch 19, umfassend den Schritt der Kultivierung von einem oder mehreren Organismen, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: Staphylokokkus epidermis-Stamm CAN 6KIII; Staphylokokkus epidermis-Stamm HAR 6KIV; Staphylokokkus epidermis-Stamm COS 6KV; Staphylokokkus epidermis-Stamm MIL 6LI; Staphylokokkus epldermis-Stamm HED 6LI; Staphylokokkus haemolyticus-Stamm ONE 6KVI; Microkokkus kristinae-Stamm MAT 6LII.
Verfahren zum Erhalten eines Immunoglobulins oder einer Antigen-bindenden Variante davon mit spezifischer Bindung an eine Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: Screenen einer Bank von Viren oder anderen Partikeln, die ein Immunoglobulin oder eine Antigenbindende Variante davon auf ihrer Oberfläche präsentieren; und Selektieren derjenigen Bestandteile der Bibliothek, die ein Immunoglobulin oder eine Antigen-bindende Variante davon, die an die Verbindung binden, präsentieren.
Impfstoff zum Induzieren von Antikörpern in einem Säugetierindividuum, wobei der Impfstoff eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 und einen physiologisch verträglichen Hilfsstoff, Träger oder Verdünner umfaßt.
Verwendung eines isolierten Immunoglobulins mit spezifischer Bindungsaktivität für eine Verbindung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments, um einem Säugetierindividuum passive Immunisierung zu verleihen, um eine Gram positive bakterielle Infektion zu verhindern und/oder zu behandeln.